Ảnh hưởng của vi sinh vật tới thực vật

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS.
Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học-
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài
“Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các
vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc
Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh
học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020”do Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia
nghiên cứu, hoàn thành luận văn theo hướng nghiên cứu của đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng
dụng - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt là TS. Lê Thị Thu Hiền và KS. Vũ Hải
Chi đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu
sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn
thành luận văn.
Học viên

Nguyễn Thị Mai Hương
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
AS Acetosyringone
ATP Adenosine triphosphate
bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleoside triphosphate

ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
EtBr Ethidium bromide
xylB Xylanase B
Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene
IM Induction medium
kb Kilo base
kDa Kilo Dalton
LB Luria – Bertani
LC Luria – Complete
MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid
PCR Polymerase Chain Reaction
RNase Ribonuclease
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris – acetate – EDTA
vir Virulence region
2
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................. 3
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 5
Chương 1 – TỔNG QUAN ........................................................................................ 7
1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi ..................... 7
1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan ........................................................... 7
1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi ....................................... 9
1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A.
tumefaciens ............................................................................................................. 10
1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc .................................................................................. 10
1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm ..... 12
1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens ...................................... 17

1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger ................................................ 17
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 24
2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................... 24
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................... 24
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................ 24
** Các nguyên tố vi lượng: 100 mg ZnSO4. 7H2O; 100 mg H3BO3; 100 mg MnSO4.
H2O; 100 mg CuSO4. 5H2O; 100 mg Na2MoO4. 2H2O; bổ sung H2O đến 100 ml,
khử trùng. ................................................................................................................. 26
2.1.3. Thiết bị .......................................................................................................... 26
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 26
2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen ..................................................... 26
2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens ................................................ 30
2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose .................................................... 32
2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR .......................................................................... 33
2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ ........................................... 34
2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn .............................. 36
2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng ......... 37
3
2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger ..................................... 38
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................. 40
3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian ............................................................. 43
3.1.2. Lắp ghép cấu trúc GluA promoter + hph gene + TrypC terminator vào vector
trung gian ................................................................................................................ 49
3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian
(pKS_xylB_hph) ...................................................................................................... 55
3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph ............................ 56
3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung
gian vào Ti plasmid .................................................................................................. 56
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid .......... 57
3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph ..... 61

3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens ......................................... 61
3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium .............................. 61
3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A.
tumefaciens .............................................................................................................. 63
3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm ........................................................................................ 63
3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh .............................. 66
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 68
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 70
4
MỞ ĐẦU
Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật
ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều
ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng dụng
quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt
của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, từ đó
cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra, xylanase còn được
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng trong công
nghiệp sản xuất giấy… [22, 29].
Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong
đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao
và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và
phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được
quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành
nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ
nhiều năm nay trên thế giới [9, 11].
Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất
thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme
xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ
chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen

vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của
nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như
enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép
chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn,
nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22].
Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được
sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống
5
chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được
nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9].
Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector
biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc”
Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và
Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế
Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên
cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công
tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger.
Nội dung nghiên cứu
- Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector
pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng
hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA
promoter + hph gene + TrypC terminator).
- Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300
mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng
hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA
promoter + hph gene + TrypC terminator.
- Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện

pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc.
- Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens.
6
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi
1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan
Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C.
3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase thủy
phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các xylo –
oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó hoàn
toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn,
nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium,
Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola,
Talaromyces…[22].
Hình 1. 1: Cấu trúc hóa học của xylan
Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật
và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28].
Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành
pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29]. Xylan cũng là một
trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm
30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gỗ mềm ở
vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô [29].
7
Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trong thức ăn
chăn nuôi [28].
Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Xylan là polymer không đồng
nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằng liên kết
ß – 1,4 – glycoside. Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4 – 0
– methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không

đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng bởi những khó
khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà không bị biến đổi
hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết của nó với các
thành phần khác [18, 23, 29].
Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật tiết
ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ hơn
một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc
chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D –
xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid
nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37),
lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của
enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng
hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và esterase chẳng hạn như
acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh
acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công thức O – acetyl – 4 –
O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O – methylglucuroxylan tìm thấy trong
cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác
[13].
Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase
tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11
dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung
có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân
8
cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn
(khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29].
Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và sinh
vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển, côn
trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13, 29].
Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase với hàm
lượng cao [13, 29]. Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được tách chiết từ nấm

gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thực vật nói chung
[29]. Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan cũng có thể
phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß – glucosid) giữa hai
enzyme celllulase và xylanase. Một số loài Bacillus chỉ tiết ra xylanase, trong khi
nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạo thành xylanase
thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một số loài thuộc
Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29]. Do đó, để ứng dụng xylanase đạt hiệu
quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động và bền vững với
nhiệt độ. Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiên cứu rộng rãi trên
toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trong nhiều ngành công
nghiệp [13, 30].
1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi
Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase hỗ trợ quá
trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất độc
hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong công
nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính của
bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu
[20, 29].
Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ
9
nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ
vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27].
Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ăn
chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và
phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên
toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27].
Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ
sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được tách
dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân tích [13].

Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa
xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho
các ngành sản xuất công nghiệp.
1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua
A. tumefaciens
1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc
Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước
tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi
Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại
sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus
là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A.
oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu
đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản
phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một
số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã
được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid
gluconic [33].
Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến
trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản
10
xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh,
rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A.
niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số
chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp
gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp.
Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực
vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất
lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối
thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu
được quan tâm nhất. Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngành sản

xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp bằng
kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31]. A. niger là loài có
khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thành vật chủ
để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31].
Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián
tiếp. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethylene
glycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợi
nấm. Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví
dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn. Tuy nhiên, các kỹ
thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng
thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có
thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra hiện
tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao [12].
Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách
gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp này đã và đang được
nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12].
11
1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm
1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens
Trong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm
một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức.
Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống
như tế bào ung thư ác tính ở động vật.
Hình 1. 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18]
Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di
truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính
hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác
của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica. Loại khối u cảm ứng được
biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [1].
Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí

sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng
chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để
biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ
tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở
cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18].
Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay
và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A.
tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào
nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [18,
19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp dụng để
chuyển gen vào tế bào người [26].
12
Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng
phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình
nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp
chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn
không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA
nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình
trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) [12, 26]. T –
DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc
vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29].
1.2.2.1. Ti plasmid
Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 150 kb
– 200 kb. Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome
của tế bào chủ. Đó là đoạn T – DNA [19, 26]. T – DNA được xác định bởi trình tự ở
hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng
biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [12, 26].
Trên T – DNA có các gen tạo khối u. Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của
tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin. Đây là các hợp
chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [12, 26].

Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách
thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong
muốn. Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gen sẽ phát
triển bình thường [1, 22]. Gen tổng hợp opine cần thiết để tổng hợp opine [12, 26].
Hợp chất này không được tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ được tổng hợp trong
tế bào vật chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt
động trong tế bào nhân chuẩn [2]. Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra
năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [12, 26].
Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và gen sinh tổng
hợp opine. Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác nhau cùng
tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [11]. Khi xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, các
13
gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào chủ và khối u được tạo
thành do sự hình thành auxin và cytokinin. Đây là các chất gây nên sự phân chia tế
bào liên tục [2, 12], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các
khối u. Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các gen vir sẽ quyết định hình thái khối u.
Bên cạnh những gen chức năng, Ti plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm,
ví dụ: Một loại u tạo octopine và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2
loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine. Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác
nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin
[1].
Agrobacterium tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương.
Thực vật bị thương sẽ ứa ra hợp chất amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là
những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động. Khi vi khuẩn
tiến đến vết thương trên cây, chúng tấn công vào bề mặt và tổng hợp các sợi
cellulose, đồng thời thực vật tiết ra các hợp chất phenol, chẳng hạn như
acetosyringone (AS), một hợp chất thường được sử dụng để cảm ứng gen vir. Một hệ
thống điều hòa gồm hai thành phần cấu thành từ protein độc virA và virG được hoạt
hóa nhờ sự có mặt của AS. Protein nhiễm sắc thể, chvE tương tác với virA làm tăng
mức độ biểu hiện của gen vir trong môi trường có hợp chất monosaccharide. AS kích

thích virA, một thụ thể liên kết màng, và virA kích thích virG. VirG bị kích thích sẽ
tương tác với các yếu tố kích thích trên đoạn khởi đầu (promoter) điều khiển khung
đọc (operon) của virA, virB, virC, virD, virE và virG và kết quả là làm tăng mức độ
biểu hiện [12, 26].
.
14
Hình 1. 3: Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào thực vật [19]
VirC và virD đều bị endonuclease phân cắt, hai gen này liên kết với biên phải
của T – DNA và cắt T – DNA sợi đơn ra khỏi Ti plasmid. Ngay lập tức trình tự này
liên kết với virE2 để tránh tác dụng của endonuclease và hiện tượng tự bắt cặp lại.
VirB2 – B11 hình thành T – pilus và kích thích virE2 đã được bao bọc bởi T – DNA
dạng sợi đơn chuyển sang tế bào đích [12, 26]. Trong tế bào chủ, T – DNA sẽ hoạt
động cùng gen nhân và mã hóa ra hormon và opine. Hormon kích thích sự phát triển
của tế bào chủ, opine là nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên,
cho đến nay người ta vẫn chưa biết được đầy đủ cơ chế chính xác của quá trình này
[26]. Trong tế bào vật chủ, đầu cùng C của virE2 hướng tới DNA trong nhân và sẽ
hòa nhập vào hệ gen của tế bào chủ. Nếu không có trình tự tương đồng giữa trình tự
gen của tế bào chủ và T – DNA được chuyển, T – DNA sẽ hòa nhập một cách ngẫu
nhiên vào hệ gen của tế bào chủ. Tuy nhiên, nếu những đoạn gen mà có độ tương cao
với hệ gen của tế bào chủ, chúng sẽ tái tổ hợp tương đồng. Tần suất tái tổ hợp tương
15
Tế bào chủ
Nhân
Vết thương
thành tế bào
thực vât
Vết thương
thành tế bào
thực vât
T-DNA

đa hòa nhập
Tế bào chất
Preotein tương tác
với virD2
Preotein
tương tác
Phức hợp T
Phức hợp T
hoàn thiện
đồng khác nhau khi chuyển những đoạn gen có kích thước khác nhau, nhưng hiệu
quả chuyển gen sẽ tăng khi giảm tỷ lệ các đoạn tương đồng [26].
Hiện nay người ta đã thành công trong việc cải biến Ti plasmid bằng cách cắt
bỏ hấu hết các đoạn gen gây phát triển khối u, chỉ để lại đoạn gen vir và phần T –
DNA tối thiểu mang điểm ghép gen. Loại vector này đang được sử dụng rất hiệu quả
trong việc đưa DNA lạ vào tế bào vật chủ [1].
1.2.2.2. Các hệ thống vector dùng trong chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
* Vector liên hợp (cointegrate)
Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn. Giải
pháp cho việc này là chuyển vùng T – DNA lên một vector nhỏ hơn. Điều này là
hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ. Hệ thống
này gọi là hệ thống vector liên kết. Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng
T – DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh). Gen
sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần thiết
cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của plasmid
trong A. tumefaciens.
Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của một
vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những phần sau: i) Một vị trí
thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI), thường
là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli; ii) Gen chỉ thị có tính kháng
kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn

lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn khởi đầu của E. coli, không hoạt động
ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi
nhờ như một hành khách vào trong tế bào thực vật [1].
* Vector nhị thể (binary vector)
Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng
biệt: Ti plasmid và vector T – DNA
Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể
được thiết kế bao gồm các phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi
16
đầu tái bản hoạt động cả ở E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động
được ở cả vi khuẩn và thực vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT,
trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen
trực tiếp; v) Đoạn T – DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt
buộc phải có. Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận
chuyển T – DNA [1, 19].
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại vector vận
tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir
đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ trợ được cải biến
từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát
triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật [1].
Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp
thông Agrobacterium vào nhiều loài nấm mốc khác nhau [1, 9, 11].
1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens
1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger
Nhờ khả năng chuyển DNA sang tế bào vật chủ và phổ vật chủ rộng mà chuyển
gen nhờ A. tumefaciens trở thành kỹ thuật thông dụng để chuyển gen vào nhiều đối
tượng khác nhau, ví dụ: thực vật, vi sinh vật [22, 26]. Nhiều loài thực vật chuyển gen
nhờ Agrobacterium, trong đó chiếm số lượng lớn là các cây nông nghiệp, chẳng hạn
như khoai tây, cà chua, đậu tương, cây bông và cây lúa đã mang lại năng suất và chất
lượng cao, chống chịu với sâu bệnh [3, 9]. Đối với vi sinh vật, nấm men

Saccharomyces serevisiae là đối tượng được sử dụng phổ biến nhưng lại không phải
là vật chủ tối ưu để chuyển gen nhờ Agrobacterium. Hiệu suất chuyển gen nhờ
Agrobacterium vào nấm men thấp hơn so với chuyển gen vào thực vật và thấp hơn so
với các phương pháp truyền thống, ví dụ: xung điện [9].
Chuyển gen thông qua Agrobacterium đã được Nyilasi ứng dụng để chuyển gen
kháng hygromycin B vào Zygomycetes [15]. Agrobacterium cũng được sử dụng để
chuyển gen vào nấm sợi, chẳng hạn như: Aspergillus, Fusarium, Penicillium,
17
Trichoderm, Neurospora, trong đó phổ biến nhất là các loài Aspergillus, bao gồm: A.
awamori, A. nidulans, A. niger [22].
Bảng 1. 1: Các loài nấm được dùng trong chuyển gen thông qua
Agrobacterium [9]
Ngành Phân ngành Lớp Bộ Họ Loài
Myxomycota
Eumycota Mastigomycoina
Zygomycotina
Ascomycotina Ascomycetes Eurotiales Eurotiaceae Aspergillus nidulans
Sphaeriales Sordariaceae Neurospora crassa
Basidiomycotina Homobasidiomycetes Agaricales Agaricaceae Agaricus bisporus
Tricholomataceae Pleurotus ostreatus
Deuteromycotiana Deuteromycetes Hyphomycetes Aspergillus niger
Aspergillus awamori
Fusarium solani
Fusarium graminearum
Trichoderma reesei
Coelomycetes Melanconiaceae Colletotrichuni gloeosporioides
Chuyển gen vào nấm mốc gián tiếp thông qua A. tumefaciens gồm một số bước
sau: i) trước hết gen cần chuyển phải được nối ghép với một vector tách dòng của A.
tumefaciens; ii) gen mong muốn phải được nối ghép vào giữa biên phải và biên trái
của vector tách dòng để lợi dụng cơ chế chuyển gen của loài vi khuẩn này; iii) vector

tái tổ hợp mang gen mong muốn phải được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens có
mang các vùng gen độc trong DNA của chúng, các gen độc sẽ cảm ứng vi khuẩn
chuyển gen quan tâm sang tế bào chủ khi có mặt các chất cảm ứng; iv) chủng vi
khuẩn chuyển gen sẽ được tiến hành nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger trong môi
trường có bổ sung chất cảm ứng AS; v) nấm chuyển gen được chọn lọc và phân biệt
với nấm không được chuyển gen dựa trên đặc tính của đoạn DNA được chuyển vào
nấm hoặc dựa trên sự biểu hiện của gen được chuyển. Nấm chuyển gen tiếp tục được
nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để làm ổn định nguồn gen [11, 22].
18
Như vậy, phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông qua Agrobacterium
không khác nhiều so với phương pháp chuyển gen vào thực vật. Đó là chúng đều cần
một sinh vật chuyển gen gián tiếp, một Ti plasmid tái tổ hợp đã ghép nối đoạn gen
mong muốn, và đều phải có mặt chất cảm ứng… Tuy nhiên, với nấm mốc, quá trình
chuyển T- DNA nhờ Agrobacterium được thực hiện thông qua quá trình nuôi chung
(nuôi nhiễm) trên một giá thể đặc biệt là các màng lọc để thuận lợi cho việc chuyển
màng sang môi trường chọn lọc thể chuyển gen [9].
1.2.3.2. Thuận lợi và khó khăn
* Thuận lợi
Chuyển gen vào nấm mốc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có nhiều ưu điểm
và thuận lợi so với các các phương pháp truyền thống ví dụ: xung điện, PEG, bởi các
lý do sau:
• Nguyên liệu từ nấm để nuôi nhiễm cùng với A. tumefaciens vô cùng đa dạng.
Chúng có thể là bào tử, là thể nguyên sinh, hạt cầu, thể sợi nấm hay bào tử nảy
mầm và thậm chí cả cặn tế bào [9, 11, 16]. Nhờ ưu điểm này đã loại bỏ được
những trở ngại khi tái sinh thể nguyên sinh khi sử dụng kỹ thuật PEG. Phương
pháp chuyển gen truyền thống vào Mucor dựa trên phương pháp PEG đòi hỏi
phải có thể nguyên sinh hình thành từ khuẩn ty. Mặc dù hiệu suất chuyển gen
cao, nhưng trên thực tế, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn enzyme để
chuẩn bị thể nguyên sinh [18]. Hơn nữa, hiệu suất tái sinh thể nguyên sinh
thường gặp nhiều khó khăn và ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố chẳng hạn như

điều kiện sinh trưởng của bào tử nảy mầm (thành phần môi trường, thời gian
nuôi cấy). Ngoài ra, phương pháp chuyển gen nhờ thể nguyên sinh phải không
những đòi hỏi phải tối ứu đối với các enzyme dùng để chuẩn bị thể nguyên
sinh [11] mà còn tốn thời gian và tiền của [17].
• Tần suất chuyển gen cao: Hầu hết chuyển gen vào nấm thông qua
Agrobacterium có tần suất cao hơn so với các phương pháp truyền thống [9,
11, 16]. Chuyển gen vào A. awamori thông qua Agrobacterium có hiệu suất
cao gấp 400 lần so với các phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng PEG [9];
19
Với vật chủ là Colletotrichum gloeosporioides, hiệu suất chuyển gen nhờ
Agrobacteium cao gấp 5 – 10 so với chuyển gen nhờ tế bào trần; Với một số
vật chủ khác, chẳng hạn như Neurospora crassa, Trichoderma reesei, hiệu
suất chuyển gen nhờ Agrobacterium tương tự với hiệu suất chuyển gen nhờ
tế bào trần đã được tối ưu [9]. Tương tự, chuyển gen vào A. fumigatus thông
qua vi khuẩn Agrobacterium, hiệu suất chuyển gen cao gấp 2 lần so với
chuyển gen nhờ các hạt cầu [16].
• Chuyển được những đoạn DNA có kích thước lớn. So với các phương pháp
cũ chuyển gen vào tế bào trần chỉ có thể chuyển được những đoạn DNA có
kích thước khoảng 40 kb, đoạn DNA ngoại lai nhỏ nhất có thể chuyển vào tế
bào thực vật nhờ A. tumefaciens có thể lên đến 150 kb [9].
• Các thể chuyển gen nhờ Agrobacterium thu được đều có copy duy nhất, và
gen được chuyển hòa nhập một cách ngẫu nhiên vào genome của tế bào chủ
[11, 16].
• Phương pháp chuyển gen vào nấm mốc thông Agrobacterium là phương
pháp nền tảng trong sản xuất thực phẩm bởi các chủng nấm mốc không chứa
các yếu tố kháng kháng sinh vi khuẩn [9].
Ngoài ra, chuyển gen nhờ Agrobacterium là phương pháp thuận lợi để nghiên
cứu chức năng của gen, nghiên cứu tạo gen đột biến [11, 29].
* Khó khăn
Bên cạnh những thuận lợi trên, chuyển gen vào nấm mốc thông qua A.

tumefaciens cũng có bất lợi đó là không thích hợp để tạo ra chủng vi sinh vật nhằm
thu lượng lớn sản phẩm protien do chỉ hòa nhập một sao duy nhất T – DNA trong khi
cần nhiều bản sao để biểu hiện ra sản phẩm của gen. Tuy nhiên, nhược điểm này có
thể khắc phục dễ dàng nhờ chuyển lượng lớn phân tử T – DNA có mang gen mong
muốn hoặc thay đổi điều kiện khi nuôi nhiễm hoặc thay đổi gen chọn lọc [11]. Như
vậy, rõ ràng hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen
hiệu quả, đơn giản và là một công cụ hữu ích để chuyển gen vào nấm mốc [9, 11, 12,
16].
20
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nấm mốc thông qua
Agrobacterium
Chuyển gen vào nấm thông qua A. tumefaciens là phương pháp được áp dụng
phổ biến bởi tính ổn định, đơn giản và hiệu suất cao [13, 16]. Tuy nhiên, hiệu suất
chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium cũng khác nhau khi sử dụng các loài
nấm khác nhau. Do đó, để hiệu suất chuyển gen đạt được cao nhất, các yếu tố ảnh
hưởng đến quá trình chuyển gen cần được tối ưu hóa [18].
• Nguyên liệu nấm
Một trong những thuận lợi của phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium là
nguyên liệu ban đầu dùng cho chuyển gen gen rất đa dạng. Nguyên liệu để nuôi
chung với A. tumefaciens có thể là bào tử, thể nguyên sinh, thể sợi nấm… đều có thể
chuyển gen thành công và hiệu suất chuyển gen ở các trường hợp này là ngang nhau.
Trong khi một số loài nấm lại yêu cầu các nguyên liệu rất cụ thể. Một số loài thuộc
zygomycetes chẳng hạn như Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides, chỉ xuất hiện thể
chuyển gen nếu nguyên liệu ban đầu là thể nguyên sinh; với loài Coccidioides
immitis chuyển gen chỉ có thể sử dụng bào tử mầm; hiệu suất chuyển gen ở Agaricus
bisporus khi dùng bào tử mầm làm nguyên liệu ban đầu sẽ cao hơn so với dùng thể
sợi nấm [12].
Một nhân tố khác ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển gen vào nấm là thời gian bảo
quản bào tử nấm. Nguyên liệu được bảo quản trong thời gian dài sẽ giảm hiệu quả
chuyển gen trong quá trình nuôi nhiễm hoặc giảm tỷ lệ nảy mầm của bào tử so với

nguyên liệu mới [12].
• Agrobacterium và tế bào chủ
Chủng giống sử dụng cho cho chuyển gen thông qua Agrobacterium cũng rất đa
dạng, ví dụ: LBA 4404, EHA 105, LBA 1100. Hiệu suất chuyển gen khi sử dụng các
chủng trên là như nhau nên thật khó để kết luận được sử dụng chủng nào là tốt nhất.
Mỗi chủng nấm mang lại hiệu quả khác nhau với tế bào chủ khác nhau. Ngoài ra, với
cùng một hiệu suất chuyển gen cũng rất đa dạng khi chuyển gen vào nấm được phân
21
lập theo những cách khác nhau. Bởi vậy, không thể đưa ra kết luận chủng
Agrobacterium nào thích hợp để chuyển gen vào nấm [12].
• Nồng độ chất cảm ứng
Trong hầu hết các nghiên cứu, AS được bổ sung trong giai đoạn nuôi nhiễm bởi
đây là hợp chất cảm ứng gen vir cần thiết cho việc chuyển T – DNA. Nhưng trong
quá trình nuôi cấy Agrobacterium không cần thiết bổ sung AS, nhiều trường hợp còn
dẫn đến giảm hiệu suất biến nạp, chẳng hạn như đối với vật chủ là Fusarium
oxysporum, Magnaporthe grisea [11, 12].
• Tỷ lệ nuôi nhiễm
Yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chuyển gen là tỷ lệ nuôi nhiễm giữa vi
khuẩn Agrobacterium và nấm mốc. Cần xác định tỷ lệ thích hợp cho mỗi chủng nấm
[11]. Tăng tế bào Agrobacterium hoặc nấm có thể làm tăng hiệu suất chuyển gen.
Tuy nhiên, cả hai yếu tố trên đều phải có những giới hạn nồng độ nhất định. Nếu bổ
sung quá nhiều A. tumefaciens, hiệu suất chuyển gen có thể giảm do cạnh tranh dinh
dưỡng và mật độ vi khuẩn quá dày, hơn nữa sẽ gặp khó khăn trong việc giết chết
Agrobacterium khi chuyển sang môi trường chọn lọc thể nấm chuyển gen. Ngược lại,
quá nhiều bào tử nấm, việc phân lập từng tế bào sau quá trình nuôi nhiễm sẽ gặp
nhiều khó khăn [12]. Do vậy, quá trình nuôi nhiễm có thể thử nghiệm nhiều tỷ lệ
khác nhau để chọn được tỷ lệ phù hợp sao cho hiệu suất cao nhất [11].
• Điều kiện cùng nuôi nhiễm
Điều kiện cùng nuôi nhiễm là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng
đến hiệu suất chuyển gen. Điều kiện nuôi nhiễm nấm và Agrobacterium bao gồm thời

gian, nhiệt độ và màng lọc. Nhiệt độ nuôi nhiễm có thể từ 22° – 37°C, song nhiệt độ
tối ưu cho quá trình nuôi nhiễm từ 22° – 25°C, trong thời gian từ 2 – 3 ngày. Ngoài
ra, nhiều loại màng lọc khác nhau như cellulose, nitrocellulose, Hybond N+ cũng sẽ
cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [11, 12].
Ngoài các yếu tố trên, còn một số các yếu khác cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu
suất chuyển gen chẳng hạn như nồng độ chất kháng sinh, hoặc cũng có thể do Quy
22
trình chuyển gen không phù hợp với tế bào chủ. Do vậy, để đạt hiệu suất chuyển gen
cao nhất, điều kiện chuyển gen cần phải được tối ưu [12].
23
Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Nguyên liệu
• Vector và chủng giống
 Vector tách dòng pJET1.2/Blunt của hãng Fermentas; Vector pBluescript II
KS (–) của hãng Stratagene; Vector biểu hiện Vector pCAMBIA1300. Các
vector này được lưu giữ tại Phòng công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công
nghệ sinh học. Vector biểu hiện pAN7.1 – GluA do Phòng Công nghệ sinh
học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
 Các chủng vi sinh vật: Agrobacterium tumefaciens CV58C1 – pGV2260 của
hãng Clontech (Mỹ); E. coli DH5α và E. coli DH10b của hãng Gibco BRL
Life Technology (Mỹ). Các chủng giống này được lưu giữ tại Phòng Công
nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học.
 A. niger VTCC – F – 017; gen mã hóa xylanase phân lập từ A. niger do Phòng
công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
• Các cặp mồi dùng trong PCR:
 Cặp mồi đặc hiệu cho hph:
hph1: 5’ – TTC GAT GTA GGA GGG CGT GGA T – 3’
hph2: 5’ – CGC GTC TGC TGC TCC ATA CAA G – 3’
 Mồi đặc hiệu cho xylB:

XylBF: 5’ – GAA GGA TCC GAA TAT GCT CAC CAA G – 3’
XylBR: 5’ – TCA GCA GGA TCC TAC TGA ACA GTG – 3’
SeqXylF: 5’ – TCCGAAGTAGGTAGAGCGAGTA – 3’
2.1.2. Hóa chất
 Enzyme giới hạn: Sma I, Hind III, Eco RI, Eco RV, Bgl II, Not I, Nco I, Kpn I
của hãng Fermentas và Biolab.
24
1
 Các hoá chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq
polymerase); Kit tinh sạch sản phẩm PCR GeneJET
TM
Gel Extraction Ki; Kit
tinh sạch DNA plasmid Wizard®SV của hãng Promega (Mỹ). Kit tách dòng
CloneJET
TM
PCR Cloning Kit của hãng Fermentas.
 Các hoá chất dùng để tách DNA tổng số, DNA plasmid của các hãng
Amersham Bioscience (Anh), Sigma (Mỹ), Merck (Đức).
 Các chất kháng sinh: ampicillin; kanamycin; rifamycin; cefotaxim;
hygromycin B
 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Bảng 2. 1: Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật
Môi
trường/1l
LB YEB SOC LC IM
Cao nấm
men
5 g 10 g 5 g 5 g -
Tripton 10 g - 20 g 10 g -
Pepton - 10 g - - -

NaCl 10 g 5 g 10 mM 8 g -
Agar 15 g 15 g - 15 g 15 g
Hóa chất
khác
-
Saccharose: 5 g
MgSO
4
.7H
2
O:
2 mM
KCl: 2,5 mM
MgSO
4
:10 mM
MgCl
2
: 10 mM
Glucose: 20 mM
- 0, 8 ml K
2
HPO
4
1,25 M,
pH: 4,8
20 ml MN* buffer (30
gMgSO
4
. 7H

2
O; 15 g
NaCl)
1 ml CaCl
2
. 2 H2O 1%
10 ml FeSO
4
0,01%
5 ml các nguyên tố vi
lượng**
2,5 ml NH
4
NO
3
20%
10 ml Glycerol 50%
40 ml MES 1 M, pH: 5,5
5 ml glucose 20%
* MN buffer: 30 g MgSO
4
. 7H
2
O; 15 g NaCl, 1 l H
2
O
25