Khảo Sát Sự Thay Đổi Chất Lượng Rượu Vang Nếp Trắng Sử Dụng Chế Phẩm Enzyme Amylase Và Protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

CHÂU TUẤN KHƯƠNG

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG NẾP
TRẮNG SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME AMYLASE VÀ
PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG NẾP
TRẮNG SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME AMYLASE VÀ
PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT

Giáo viên hướng dẫn:
T.S Nguyễn Công Hà

Sinh viên thực hiện:

Châu Tuấn Khương
MSSV: 2060313
Lớp: CNTP K32

Cần Thơ, 2010


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài “KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI CHẤT
LƯỢNG RƯỢU VANG NẾP TRẮNG SỬ DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME
AMYLASE VÀ PROTEASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT”, do Châu Tuấn
Khương thực hiện đã được hội đồng chấm luận văn thông qua.

Giáo viên hướng dẫn

Giáo viên phản biện

T.S Nguyễn Công Hà

Cần thơ, ngày tháng

năm 2010

Chủ tịch hội đồng

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

i


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt
những kinh nghiệm quí báu để tôi thực hiện tốt luận văn tốt nghiệp này.
Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Anh - học viên Thạc Sĩ
khóa 14 đã tận tình giúp đỡ tôi về kiến thức chuyên môn cũng như về tài chính trong
suốt thời gian làm luận văn.
Thành thật biết ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm - khoa Nông nghiệp
và Sinh học Ứng dụng – trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt những
kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường.
Chân thành cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm, bạn Nguyễn Thị Cẩm Hường và các
bạn sinh viên khác lớp Công nghệ thực phẩm khóa 32 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo
điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.
Sinh viên thực hiện

Châu Tuấn Khương

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

ii


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

TÓM TẮT
Đề tài tiến hành khảo sát sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng của 2 loại rượu sử dụng
chế phẩm enzyme Amylase và Protease là mẫu Papain và mẫu Bromelain trong giai
đoạn lên men chính và giai đoạn bảo quản, đồng thời so sánh với loại rượu sản xuất
theo kiểu cổ truyền là mẫu Truyền thống. Kết quả cho thấy, trong giai đoạn lên men
chính sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng giữa 2 mẫu Papain và Bromelain không có
sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%, nhưng trong giai đoạn lên men phụ thì các chỉ tiêu ở
mẫu Bromelain cho thấy có sự khác biệt so với mẫu Papain, cụ thể là các chỉ tiêu về
độ Brix, đường khử còn lại, acid tổng số và hàm lượng ester sinh ra. Thời gian kết
thúc quá trình lên men chính là 6 ngày; sản phẩm thu được đạt độ cồn trong khoảng
11-12% v/v; sau 2 tháng lên men phụ sản phẩm có độ trong rất tốt; furfurol không
thấy xuất hiện trong suốt quá trình lên men chính và bảo quản. Khi so sánh mẫu
Truyền thống với mẫu Bromelain và Papain, trong giai đoạn lên men chính và giai
đoạn bảo quản, các chỉ tiêu về pH, độ Brix, đường khử còn lại, acid tổng số và hàm
lượng ester sinh ra đều có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iii


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
TRANG XÁC NHẬN ............................................................................................... i

LỜI CẢM TẠ........................................................................................................... ii
TÓM TẮT ............................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ vii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. viii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề.....................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu.....................................................................................1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................2
2.1 Giới thiệu về gạo nếp................................................................................... 2
2.1.1 Nguồn gốc ......................................................................................... 2
2.1.2 Thành phần hóa học .......................................................................... 2
2.2 Enzyme amylase .......................................................................................... 3
2.2.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của - amylase và glucoamylase ......... 4
2.2.1.1 α-amylase (EC 3.2.1.1) ...................................................... 4
2.2.1.2 -amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3) ............................. 6
2.2.2 Hoạt lực của enzyme amylase...........................................................7
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase ............. 8
2.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng........................... 8
2.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ........................................ 8
2.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ .....................................................10
2.2.3.4 Ảnh hưởng của pH ............................................................ 11
2.2.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa............................................ 11
2.2.3.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm ........................................... 12
2.3 Enzyme protease ........................................................................................ 13
2.3.1 Papain (E.C.3.4.4.10) ..................................................................... 13
2.3.1.1 Hoạt tính enzyme papain và cơ chế tác dụng..................... 13
2.3.1.2 Chất hoạt hóa và kìm hãm.................................................. 14
2.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym ........................16
2.3.2 Enzyme bromelain (E.C.3.4.4.24) ...................................................17
2.3.2.1 Tính chất enzyme bromelain.............................................. 17

2.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain ................. 17
2.4 Nấm men.................................................................................................... 19
2.4.1 Cấu tạo và thành phần của nấm men ............................................... 19
2.4.2 Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men...................................... 19
2.4.3 Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang .................................. 19
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

iv


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.5 Các quá trình chính trong sản xuất rượu vang nếp .................................... 21
2.5.1 Quá trình hồ hóa tinh bột nếp ......................................................... 21
2.5.2 Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu vang nếp ....................... 22
2.5.3 Quá trình lên men trong sản xuất rượu vang nếp............................ 23
2.6 Các biến đổi và phản ứng sinh hóa trong sản xuất rượu vang nếp ............25
2.6.1 Cơ chế chuyển hóa đường thành rượu............................................ 25
2.6.2 Cơ chế chuyển hóa đường thành các sản phẩm phụ và sản
phẩm trung gian trong quá trình lên men ........................................26
2.6.2.1 Sự tạo thành methalnol.......................................................27
2.6.2.2 Sự tạo thành aldehyde.........................................................27
2.6.2.3 Sự tạo thành các rượu bậc cao ............................................27
2.6.2.4 Sự tạo thành các acid hữu cơ..............................................28
2.6.2.5 Sự tạo thành các ester .........................................................28
2.6.2.6 Sự tạo thành glycerin..........................................................28
2.6.2.7 Sự tạo thành acetone và diacetyl ........................................29
2.6.2.8. Sự tạo thành furfurol ..........................................................29

2.6.3 Phản ứng Maillard ...........................................................................29
2.6.3.1. Các điều kiện của phản ứng hóa nâu không enzyme .........29
2.6.3.2 Cơ chế phản ứng..................................................................30
2.7 Quy trình sản xuất rượu vang nếp có dùng chế phẩm enzyme................... 31
2.7.1 Sơ đồ quy trình.................................................................................31
2.7.2 Thuyết minh quy trình .................................................................... 31
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................33
3.1 Phương tiện nghiên cứu ..............................................................................33
3.1.1 Thời gian và địa điểm .......................................................................33
3.1.2 Nguyên liệu .......................................................................................33
3.1.3 Hóa chất ............................................................................................33
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ............................................................................33
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................35
3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của các loại
rượu trong giai đoạn lên men chính ..................................................35
3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của các loại
rượu trong giai đoạn lên men phụ. ....................................................37
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................40
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của các loại rượu trong
giai đoạn lên men chính ...............................................................................40
4.1.1 Kết quả sự thay đổi pH trong quá trình lên men chính của
các loại rượu ......................................................................................40
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

v


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

4.1.2 Kết quả sự thay đổi hàm lượng chất khô trong quá trình lên
men chính của các loại rượu..............................................................42
4.1.3 Kết quả sự thay đổi hàm lượng đường khử còn lại trong quá
trình lên men chính của các loại rượu ...............................................43
4.1.4 Kết quả sự thay đổi độ cồn trong quá trình lên men chính
của các loại rượu ...............................................................................45
4.1.5 Kết quả sự thay đổi hàm lượng acid tổng số trong quá trình
lên men chính của các loại rượu........................................................46
4.1.6 Kết quả sự thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men
chính của các loại rượu......................................................................47
4.1.7 Kết quả sự xuất hiện furfurol trong quá trình lên men chính
của các loại rượu ...............................................................................48
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát các chỉ tiêu chất lượng của các loại rượu trong
giai đoạn lên men phụ ..................................................................................49
4.2.1 Kết quả sự thay đổi pH trong quá trình lên men phụ của các
loại rượu ..........................................................................................49
4.2.2 Kết quả sự thay đổi hàm lượng chất khô trong quá trình lên
men phụ của các loại rượu ..............................................................49
4.2.3 Kết quả sự thay đổi hàm lượng đường khử còn lại trong quá
trình lên men phụ của các loại rượu................................................50
4.2.4 Kết quả sự thay đổi độ cồn trong quá trình lên men phụ của
các loại rượu....................................................................................50
4.2.5 Kết quả sự thay đổi hàm lượng acid tổng số trong quá trình
lên men phụ của các loại rượu ........................................................51
4.2.6 Kết quả sự thay đổi hàm lượng ester trong quá trình lên men
phụ của các loại rượu ......................................................................51
4.2.7 Kết quả sự xuất hiện furfurol trong quá trình lên men phụ
của các loại rượu .............................................................................52
4.2.8 Kết quả độ trong của các loại rượu trong quá trình lên men ..........52

4.2.9 Kết quả đánh giá cảm quan rượu thành phẩm ................................ 52
4.2.10 Kết quả phân tích vi sinh rượu thành phẩm ...................................53
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................56
5.1 Kết luận.........................................................................................................56
5.2 Đề nghị..........................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................58
PHỤ LỤC................................................................................................................ ix

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vi


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp...............................................................2
Bảng 2.2 Thành phần amino acid của papain .........................................................13
Bảng 2.3 Thành phần amino acid và những nhóm khác của bromelain từ thân
dứa, quả dứa xanh, quả dứa chín .............................................................17
Bảng 2.4 Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của
bromelain .................................................................................................18
Bảng 4.1 Số liệu thống kê pH của các loại rượu theo thời gian lên men chính......40
Bảng 4.2 Số liệu thống kê hàm lượng chất khô (oBx) của các loại rượu theo
thời gian lên men chính............................................................................42
Bảng 4.3 Số liệu thống kê hàm lượng đường khử còn lại (%) của các loại
rượu theo thời gian lên men chính ...........................................................43

Bảng 4.4 Số liệu thống kê độ cồn của các loại rượu theo thời gian lên men
chính.........................................................................................................45
Bảng 4.5 Số liệu thống kê hàm lượng acid tổng số của các loại rượu theo thời
gian lên men chính ...................................................................................46
Bảng 4.6 Số liệu thống kê hàm lượng ester sinh ra của các loại rượu theo thời
gian lên men chính ...................................................................................47
Bảng 4.7 Số liệu thống kê sự xuất hiện furfurol trong các loại rượu theo thời
gian lên men chính ...................................................................................48
Bảng 4.8 Số liệu thống kê pH của các loại rượu theo thời gian lên men phụ.........49
Bảng 4.9 Số liệu thống kê hàm lượng chất khô (oBx) của các loại rượu theo
thời gian lên men phụ ..............................................................................49
Bảng 4.10 Số liệu thống kê hàm lượng đường khử còn lại (%) của các loại
rượu theo thời gian lên men phụ ..............................................................50
Bảng 4.11 Số liệu thống kê độ cồn của các loại rượu theo thời gian lên men
phụ............................................................................................................50
Bảng 4.12 Số liệu thống kê hàm lượng acid tổng số của các loại rượu theo
thời gian lên men phụ ..............................................................................51
Bảng 4.13 Số liệu thống kê hàm lượng ester sinh ra của các loại rượu theo
thời gian lên men phụ ..............................................................................51
Bảng 4.14 Số liệu thống kê sự xuất hiện furfurol trong các loại rượu theo thời
gian lên men phụ......................................................................................52
Bảng 4.15 Số liệu thống kê Độ trong (%) của các loại rượu sau thời gian lên
men phụ 2 tháng.......................................................................................52
Bảng 4.16 Bảng điểm đánh giá cảm quan sản phẩm ..............................................52
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

vii


Luận văn tốt nghiệp khóa 32 – 2010

Trường Đại học Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase ..........................................3
Hình 2.2 cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột .............................................. 5
Hình 2.3 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột........................................... 6
Hình 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của amylase ......... 9
Hình 2.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase..... 9
Hình 2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của amylase ............................... 10
Hình 2.7 Quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào nấm men ........................ 19
Hình 2.8 Sơ đồ chuyển hóa đường thành rượu ................................................... 26
Hình 2.9 Quy trình tổng quát sản xuất rượu nếp.....................................................31
Hình 3.1 Máy nghiền...............................................................................................34
Hình 3.2 Máy đo pH................................................................................................34
Hình 3.3 WaterBath ................................................................................................34
Hình 3.4 Hệ thống sinh hàn.....................................................................................34
Hình 3.5 Cân điện tử ...............................................................................................34
Hình 3.6 Máy đo độ truyền quang ..........................................................................34
Hình 3.7 Hệ thống chưng cất ..................................................................................34
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH trong quá trình lên men chính của
các loại rượu...............................................................................................41
Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng chất khô trong quá trình lên
men chính của các loại rượu ......................................................................42
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường khử còn lại trong
quá trình lên men chính của các loại rượu .................................................44
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn biến đổi độ cồn theo thời gian lên men chính ứng
với từng loại rượu.......................................................................................45
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn biến đổi hàm lượng acid tổng số theo thời gian lên

men chính ứng với từng loại rượu..............................................................46
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn biến đổi hàm lượng ester theo thời gian lên men
chính ứng với từng loại rượu .....................................................................48
Hình 4.7 Sản phẩm rượu vang nếp..........................................................................55
Hình 5.1 Qui trình sản xuất ....................................................................................56

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

viii


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Nghề nấu rượu thủ công đã có từ xa xưa. Ngày nay, nghề nấu rượu đã rất phổ biến,
có loại chưng cất và có loại không qua chưng cất. Các loại rượu ra đời ngày càng
đa dạng hơn và càng được ưa thích hơn như rượu nho, rượu nếp than, rượu
gạo, rượu nếp trắng … Rượu nếp trắng là một thức uống có cồn, có hai dạng là
chưng cất cao độ và không qua chưng cất. Loại rượu nếp trắng không qua chưng cất
có chứa một số chất mà rượu qua chưng cất không thể có như: nhiều loại vitamin
(vitamin nhóm B như B1, B2, B12), các acid amin như lysin, acid glutamic… Vì vậy,
rượu vang nếp trắng là một thức uống bổ dưỡng, giúp tiêu hóa tốt nếu sử dụng hợp
lý. Sản phẩm còn có một màu sắc và hương thơm rất đặc trưng, hấp dẫn không có ở
các loại rượu qua chưng cất khác.
Hiện tại rượu nếp trắng được sản xuất hoàn toàn bằng phương pháp thủ công với
các thiết bị sản xuất thô sơ và trình độ công nghệ còn thấp. Chất lượng của sản
phẩm chưa ổn định, hao phí nguyên liệu nhiều và thời gian sản xuất kéo dài. Chính

vì vậy, việc phải đưa ra một qui trình sản xuất mới hiệu quả và rút ngắn được thời
gian sản xuất nhằm đa dạng hóa sản phẩm và góp phần nâng cao vị thế rượu nếp ở
nước ta.
Việc ứng dụng enzyme vào sản xuất ngày nay không còn là mới lạ ở các ngành
khác, do enzyme có tính đặc hiệu cao, mỗi enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất
nhất định, phản ứng do enzyme cũng dễ dàng điều chỉnh và đa số đều có nguồn gốc
tự nhiên, không độc. Dựa vào các đặc tính trên mà việc sử dụng các chế phẩm
enzyme thương mại amylase và protease vào qui trình sản xuất rượu vang nếp sẽ
nâng cao hiệu suất thu hồi dịch đường và rượu thành phẩm, đồng thời rút ngắn thời
gian sản xuất.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Khảo sát sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng trong giai đoạn lên men chính của
rượu sản xuất bằng chế phẩm enzyme và rượu sản xuất truyền thống.
- Khảo sát sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng trong giai đoạn bảo quản của rượu sản
xuất bằng chế phẩm enzyme và rượu sản xuất truyền thống.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

1


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về gạo nếp
2.1.1 Nguồn gốc
Gạo nếp là loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở vùng Nam Bộ. Hạt gạo này có màu

đục và có mùi thơm rất đặc trưng.
2.1.2 Thành phần hóa học
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của gạo nếp

Thành phần
Nước
Protein
Lipid
Glucid
Acid hữu cơ
Tro

Hàm lượng (%)
14
8,2
1,5
74,9
0,6
0,8
(Nguyễn Đức Lượng, 2003)

Cơ chất của enzyme amylase là tinh bột. Tinh bột là nhóm carbohydrate thực vật có
chủ yếu trong các loại ngũ cốc như gạo, nếp, ngô, trong các loại củ như khoai lang,
khoai mì, sắn,…Công thức tổng quát của tinh bột là (C6H12O6)n. Tinh bột được cấu
tạo từ hai phân tử amylose và amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là
chất dự trữ năng lượng quan trọng. Các loại tinh bột đều có chứa từ 20 ÷ 30%
amylose và 70 ÷ 80% amylopectin.
Amylose có trọng lượng phân tử từ 50.000 ÷ 160.000, được cấu tạo từ 200 ÷ 1000
phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside tạo thành mạch xoắn
dài không phân nhánh.

Amylopectin có trọng lượng phân tử khoảng 400.000, được cấu tạo từ 600 ÷ 6000
phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4 glycoside và α-1,6 glycoside tạo
thành mạch phân nhánh.
Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng sẽ bị hồ hóa khi đun nóng lên 60 ÷ 850C.
Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do liên kết glycoside bị
phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra ở hai mức độ: dịch hóa
và đường hóa. Kết quả của quá trình dịch hóa là tạo thành các sản phẩm trung gian
dextrin, sau đó dextrin tiếp tục bị phân cắt tạo thành sản phẩm cuối là maltose và
glucose.
Tốc độ thủy phân của tinh bột phụ thuộc rất nhiều vào loại enzyme thủy phân, thành
phần amylose và amylopectin trong tinh bột và mức độ hồ hóa của hồ tinh bột.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

2


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

Chính vì vậy để quá trình thủy phân đạt hiệu quả cần chọn loại enzyme amylase và
nhiệt độ hồ hóa phù hợp với loại nguyên liệu tinh bột.
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.2 Enzyme amylase
Enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Enzyme amylase thuộc nhóm
enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các
polysaccharide. Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin mạch dài
thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn.

Hiện nay, người ta biết có 6 loại amylase, trong đó -amylase, -amylase, amylase (hay glucoamylase) thủy phân các liên kết -1,4-glycoside của tinh bột,
glycogen và các polysaccharide đồng loại. các amylase còn lại: dextrin-6glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase
(hay dextrinase) thủy phân liên kết -1,6-glycoside. Sáu loại enzyme này được xếp
vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại vào).
 Endoamylase: gồm có -amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay dextrin 6-glucanhydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên
trong của chuỗi polysaccharide.
 Exoamylase: gồm có -amylase và -amylase. Đây là những enzyme
thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

Amylase
Exoamylase
-amylase

Endoamylase

-amylase

Enzyme khử nhánh

Khử trực tiếp
-dextrin 6-glucanhydrolase
(pullulanase)

-amylase

Khử gián tiếp
oligo-1,6-glucosidase
(transglucosylase)
và amylo-1,6-glucosidase

Hình 2.1 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

3


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của - amylase và glucoamylase
2.2.1.1 α-amylase (EC 3.2.1.1)
Đặc tính
-amylase có khả năng phân cắt các liên kết -1,4-glycoside của cơ chất một cách
ngẫu nhiên và là enzyme nội phân. -amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ
tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn.
-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại
-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. -amylase là một protein giàu
tyrosine, trytophan, acid glutamic và aspartic. -amylase có ít methionine và có
khoảng 7-10 gốc cycteine.
-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng.
Protein của các amylase có tính acid yếu. Điểm đẳng điển nằm trong vùng pH 4,25,7.
Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt
động của enzyme. Do đó, Ca2+ còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị
tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải
protein. Nếu phân tử -amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết
khả năng thủy phân cơ chất. -amylase bền nhiệt độ hơn các amylase khác. Đặc

tính này có thể liên quan đến khả năng hàm lượng Ca2+ trong phân tử. Tất cả các
amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+…
Độ bền của -amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên so với các loại
amylase khác thì độ bền nhiệt của -amylase cao hơn. Ở 0oC và pH 3,6 -amylase
của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính. -amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt
nhất ở nhiệt độ 58-60oC. Do đó trong sản xuất rượu, người ta thường dùng malt để
đường hóa cơ chất ở nhiệt độ 60-65oC.
Cơ chế tác dụng của -amylase
Sự thủy phân tinh bột của -amylase trải qua nhiều giai đoạn
- Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một
lượng lớn dextrin phân tử lượng thấp, sau đó các dextrin này bị thủy phân tiếp tục
để tạo ra maltose và glucose.
- Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (67 gốc glucose) dưới tác dụng của -amylase, sau đó các oligosaccharide này tiếp
tục bị phân cắt nên chuỗi bị ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose,
maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩn của quá trình amylose là 13% glucose
và 87% maltose.
Tác dụng của -amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được
tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

4


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

isomaltose (8%) do -amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch
nhánh của phân tử amylopectin.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của -amylase:

Giai đoạn dextrin hóa:

α-Amylase
Dextrin phân tử lương thấp

Tinh bột
Giai đoạn đường hóa:

α-Amylase
Dextrin
Amylose

Maltose

tetra và trimaltose

α-Amylase
lase

oligosaccharide

maltotriose

di- và monosaccharide
polyglucose

maltotetrose

Khả năng dextrin hóa của -amylase rất cao do đó người ta còn gọi -amylase là
amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.

Hình 2.2 cơ chế tác động của α-amylase lên tinh bột

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

5


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.1.2 -amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3)
Đặc tính
Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin,
dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia
của các loại amylase khác. Glucoamylase thủy giải các polysaccharide có phân tử
lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ. Các polysaccharide có nhánh như
amylopectin, glucogen, -dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh.
Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5-5,5 và nhiệt độ 50oC. nó
bền với acid hơn -amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được
bảo vệ bởi Ca2+.
Cơ chế tác dụng của glucoamylase
Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-glucoside. Khi thủy
phân liên kết -1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt
từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme
này có nhiều tên gọi khác nhau: -1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase;
glucoamylase; amyloglucosidase; taka-amylase B; -amylase; maltulase,…

glucoamylase là enzyme ngoại bào.
Ngoài các liên kết -1,4 và -1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy
phân các liên kết -1,2 và -1,3 glucoside.

Amylose

Amylopectin

Hình 2.3 Tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

6


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.2 Hoạt lực của enzyme amylase
Khi sử dụng bất kỳ một chế phẩm enzyme nào cũng cần biết rõ hoạt lực xúc tác của
nó. Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả
năng xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Các
chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa nhiều loại enzyme amylase.
Vì vậy, hoạt lực tổng hợp của chúng phản ánh tác dụng của tất cả các amylase có
trong chế phẩm. Do tính đa dạng của enzyme, đặc trưng của cơ chất sử dụng, nên
phương pháp xác định hoạt độ của enzyme cũng rất khác nhau. Để xác định hoạt độ
của các amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:
- Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên

hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch
giảm dần.
- Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod. Khi có
amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod.
- Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên
cơ chất. Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:
Hoạt độ của enzyme α-amylase dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có
trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau. Đo
cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod
bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme. Đơn vị hoạt độ của
α-amylase là lượng enzyme chuyển hóa được 1g tinh bột tan thành dextrin có phân
tử lượng khác nhau ở 300C trong một giờ.
Hoạt độ của glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến
glucose. Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành. Glucose trong
hỗn hợp các đường thường được xác định bằng các phương pháp đặc hiệu. Đơn vị
hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở
30oC và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp
Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải
phóng được 1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucose oxydase).
Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột
đến các đường khử. Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1
giờ ở 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1g tinh bột thành đường khử khi
mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

7


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase
2.2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme sử dụng
Khi có lượng cơ chất đầy đủ thì vận tốc phản ứng của enzyme tỷ lệ thuận với nồng
độ enzyme. Ta có thể biểu diễn sự liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ
enzyme bằng biểu thức:
v = k.[E]
Trong đó: v: vận tốc phản ứng.
k: hằng số tốc độp phản ứng.
[E]: nồng độ enzyme sử dụng.
Nồng độ của enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều. Tuy nhiên
khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng chậm lại.
2.2.3.2Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Sơ đồ phản ứng enzyme:
K1

E + S

K3

ES

P + E

K2

Trong đó:
+ K1: hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES.

+ K2: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo lại cơ chất và enzyme.
+ K3: hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P.
Michaelis và Menten đã chứng minh được rằng sự hình thành phức hợp ES là có
thật và tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự biến đổi phức hợp ES thành sản phẩm P
và enzyme tự do quyết định và đã chứng minh được:
V= Vmax

[S ]
Km  [S ]

Trong đó:
+ V: Vận tốc phản ứng enzyme.
+ Km: hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzyme.
+ Vmax: giá trị tốc độ cực đại (sử dụng nồng độ cơ chất rất lớn so với
nồng độ enzyme sao cho tất cả mọi enzyme có mặt đều chuyển thành ES
tức [ES]=[Et]).
Đường biểu diễn sẽ là một đường cong

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

8


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

Tốc độ
phản ứng
Vmax

1
Vmax
2
[S]=Km

0 Km

Nồng độ cơ chất

Hình 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của amylase

+ Nếu [S] << Km thì V= Vmax

[S ]
=> vận tốc phản ứng phụ thuộc
Km  [S ]

tuyến tính vào [S] => phản ứng bậc 1
+ Nếu [S] >> Km thì V= Vmax => Vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ
thuộc vào [S] => phản ứng bậc 0
+ Nếu [S] = Km thì V=

Vmax
=> vận tốc phản ứng bằng ½ giá trị cực đại
2

(Phan Thị Bích Trâm, 2008)

Thời gian thủy phân

Sự phụ thuộc tuyến tính của thời gian phản ứng vào nồng độ cơ chất theo chiều
hướng tăng nồng độ cơ chất sẽ kéo dài thời gian phản ứng thuỷ phân của amylase.

Nồng độ cơ chất (%)
Hình 2.5 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng của amylase

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

9


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

2.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến hoạt tính xúc tác enzyme. Vì
enzyme có bản chất là protein nên không bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao hơn
70oC, tại nhiệt độ này phân tử enzyme bị biến tính hoàn toàn dẫn đến làm mất hoạt
tính xúc tác của nó.
Trong khoảng nhiệt dộ mà enzyme có thể tồn tại, hệ số nhiệt độ Q10=(Kt + 10o)/Kt
của phản ứng enzyme từ 1,4 đến 2, có nghĩa khi nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ phản
ứng tăng từ 1,4 đến 2 lần.
Như vậy nhiệt độ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme ở 2 mặt:
+ Khi nhiệt độ tăng, một mặt tốc độ phản ứng tăng nhanh theo quy luật thông
thường. Khi tăng đến một mức nào đó sẽ làm tốc độ phản ứng giảm do sự biến tính
của enzyme.
Có thể biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của đa số enzyme bằng đồ
thị sau:

Hình 2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của amylase
(Phan Thị Bích Trâm, 2008)

Vận tốc phản ứng enzyme amylase tăng khi nhiệt độ tăng. Tuy nhiên do enzyme
amylase cũng có bản chất là protein nên nó kém bền đối với nhiệt độ. Đa số enzyme
bị mất hoạt tính ở nhiệt độ cao, enzyme amylase cũng không ngoại lệ. Nhiệt độ vô
hoạt tùy thuộc vào loại và nguồn gốc của enzyme.
Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích của
enzyme. Mỗi loại enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc nguồn gốc
của chúng. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu hoạt tính của enzyme bị giảm,
khi đó enzyme không còn khả năng phục hồi hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của enzyme
phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của có các chất, kim loại, pH và chất bảo vệ. Ta

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

10


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng
theo yêu cầu của chế biến.
2.2.3.4 Ảnh hưởng của pH
Enzyme rất nhạy với pH của môi trường, do đó pH có tác dụng rất quan trọng đối
với tốc độ phản ứng của enzyme. Mỗi enzyme đều có một trị số pH thích hợp cho
sự hoạt động của nó và tại đó tốc độ phản ứng xảy ra nhanh nhất. Ngoài trị số pH đó
thì tốc độ phản ứng của enzyme sẽ giảm dần.
Đối với một enzyme nhất định thì pH thích hợp của nó cũng không cố định mà có

thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ của phản ứng hoặc bản
chất dung dịch đệm.
Như vậy pH ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme là do chúng tác dụng vào
trạng thái ion hóa của phân tử enzyme và của cơ chất; vào độ bền vững của phân tử
enzyme do ảnh hưởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải
protein (coenzyme) của enzyme.
Ở pH cao quá hoặc thấp quá sẽ làm giảm nồng độ E- và S+, do đó sẽ làm giảm tốc
độ phản ứng. pH thích hợp của enzyme là giá trị pH mà ở đó E và S ở trạng thái ion
hóa tốt và nồng độ của E-, S+ ở trạng thái tích điện thích hợp cho phản ứng đạt tới
cực đại.
(Phan Thị Bích Trâm, 2008)
2.2.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành trạng
thái hoạt động, từ hoạt động yếu thành hoạt động mạnh. Các chất hoạt hóa thường
có bản chất hóa học khác nhau, chúng có thể là:
- Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển hóa
nhóm, chuyển gốc hóa học.
- Những chất có tác dụng phục hồi những nhóm chất hoạt động của trung tâm
hoạt động của enzyme.
- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử proenzyme làm
loại bỏ một vài đoạn peptid, tạo điều kiện cho nhóm chức xích lại gần nhau để hình
thành trung tâm hoạt động.
- Ngoài ra một số kim loại có bán kính 0,34 ÷ 1,65 A0 (Na+, K+, Ca2+, Mg2+) và
các anion Cl-, Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme. Trong quá trình hoạt hóa
các ion có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa các enzyme
với cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của
enzyme.
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

11

Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

Các chất hoạt hóa này chỉ có tác dụng tốt ở một nồng độ nhất định, vượt qua nồng
độ này chúng sẽ ức chế hoạt động của enzyme.
Anion Cl- có tác dụng hoạt hóa enzyme -amylase, còn các ion thuộc họ halogen F-,
Br-, I- cũng có tác dụng hoạt hóa enzyme này nhưng yếu hơn.
(Phan Thị Bích Trâm, 2008)
2.2.3.6 Ảnh hưởng của chất kìm hãm
Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng
của enzyme khi nó kết hợp vào phân tử enzyme, vì khi kết hợp với chất kìm hãm,
enzyme bị giảm ái lực đối với cơ chất hoặc làm mất khả năng tác dụng với cơ chất,
do đó nồng độ enzyme tham gia phản ứng bị giảm và sẽ kìm hãm tốc độ phản ứng.
Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là các ion kim loại, anion,
các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein.
Tùy theo cơ chế tác dụng của chất kìm hãm mà người ta chia thành 2 loại chính:
kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh.
- Chất kìm hãm cạnh tranh: là các chất thường có cấu tạo gần giống với cơ chất, do
đó có thể kết hợp với enzyme (thường là những enzyme không có tính đặc hiệu
tuyệt đối) ở ngay trung tâm hoạt động của nó và chiếm chỗ của cơ chất.
+ Tốc độ phản ứng trong trường hợp này phụ thuộc vào nồng độ cơ chất
vượt xa nồng độ chất kìm hãm thì có thể làm cho phản ứng ngược trở lại và khắc
phục được hiện tượng kìm hãm. Nếu tăng nồng độ chất kìm hãm lên thì có thể làm
cho enzyme bị ức chế hoàn toàn.
- Chất kìm hãm không cạnh tranh: là những chất có tác dụng kìm hãm hoạt động
của enzyme bằng cách kết hợp với các vị trí khác với vị trí gắn cơ chất của enzyme.
Hay nói cách khác là gắn vào một vị trí khác của trung tâm hoạt động của enzyme

và cơ chất, từ đó dẫn đến làm biến dạng phân tử enzyme, kết quả không tạo được
phức hợp ES, nếu có tạo được thì tốc độ vẫn không bình thường.
+ Quá trình kìm hãm không cạnh tranh có thể biểu diễn:
E+I
EI
ES + I
ESI
(các dạng không hoạt động)
+ Trong trường hợp này, tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ
chất mà thôi, do đó không thể khắc phục được sự kìm hãm bằng cách tăng nồng độ
cơ chất một cách đơn thuần.
+ Các hất kìm hãm không cạnh tranh có thể kìm hãm nhiều loại enzyme
khác nhau và chúng có cấu tạo không giống với cơ chất. Các chất kìm hãm thông
thường là muối của kim loại nặng như Ag+, Hg+,…
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

12


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

 Kìm hãm do thừa cơ chất: Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành
chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng:
E

+

S

ES

E

+

P

Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng đính vào một vị trí nào đó
trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức
hệ này coi như chất kìm hãm.
ES

+

S

ESS

Tất cả các enzyme amylase đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại như: Cu2+, Ag+.
(Phan Thị Bích Trâm, 2008)
2.3 Enzyme protease
2.3.1 Papain (E.C.3.4.4.10)
Tính chất vật lý:
Enzyme papain dạng bột màu vàng hay màu nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp
sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay
glycerine. Enzyme papain rất bền nhiệt.
Tính chất hóa học
Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1 % N và 1,2 % S. Papain là một

protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L. Smith, papain là một chuỗi
polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Bảng 2.2 Thành phần amino acid của papain

Amino acid
Alanin
Arginine
Aspartic acid
Half-cysteine
Glutamic acid
Glycine
Histidine
Isoleccine
Leccine

Số lượng
13
10
17
6
17
23
2
10
10

Amino acid
Lycine
Phenulalanine
Proline

Serine
Threonine
Tryptophan
Tyrosine
Valine
Methionine

Số lượng
9
4
9
11
7
5
17
15
0
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.3.1.1 Hoạt tính enzyme papain và cơ chế tác dụng
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, nó đóng vai trò
vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

13


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

R

R

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH)

Trường Đại học Cần Thơ

R
R
(-NH-CH-COOH)I + (NH2-CH-CO-)k

Trong đó: i + k = n
Các exopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành acid amin
R

R

R

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n +(HOH)

R

(H2N-CH-COOH)i’ +(H2N-CH-COOH)k’

Trong đó: n’ + k’ = n
So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng
thủy phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn

lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin.
Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng phân hủy hầu hết các
liên kết peptide trừ các liên kết với protein và với các glutamic acid có nhóm
carboxyl tự do.
Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn thùy thuộc vào trạng thái của cơ chất,
tức là cơ chất có bị biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả
năng thủy phân sâu hơn. Giống các protease serine khác như chymotrypsin hay
trypsin, papain có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân các dẫn xuất acyl.
RCOX + pap-SH

pap-S-C-R + HX (1)
O

pap-S-C-R + H2O

pap-SH + R-COOH (2)

O
2.3.1.2 Chất hoạt hóa và kìm hãm
Chất hoạt hóa
Papain cần nhóm sulfhyryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Chất hoạt hóa có ảnh
hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay papain nói riêng.
Do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cyteine 25 và nitrogen bậc 3 của
histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain là các chất có
tính khử như:cysteine, glutation, acid, hydrocyanic, hydrogensulfite,
sodiumthiosulfate, … trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất
này thì nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi làm tăng hoạt
tính papain. Sự hoạt hóa càng được tăng cường khi có sự hiện diện của các chất có
khả năng liên kết với kim loại như EDTA.

Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

14


Luận văn tốt nghiệp khóa 32-2010

Trường Đại học Cần Thơ

Để thu được hoạt tính cao nhất, thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA,
trong dó cysteine đóng vai trò hoạt chất hóa papain còn EDTA đóng vai trò liên kết
tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
Cơ chế của sự hoạt hóa là:
HCN, H2S…
Pa-S-S-Pa
(bất hoạt)

Pa-S- + -S-Pa
(hoạt động)

I2, O2,…
2+
2+

2 Pa-SH
(hoạt động)

{2 Pa-S-} Me2+
(bất hoạt)

Chất kìm hãm
Paapain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, ozon,
hydroperoxide, iodur acetate, iodur acetamide, thủy ngân chlobenzoate, cystine và
các hoạt chất disulfur khác. Đặc biệt papain rất dễ bị mất hoạt tính khi có mặt
hydrogen peroxide. Các chất này ức chế hoạt tính của papain bằng phản ứng với
nhóm – SH ở trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà phá vỡ cấu trúc tâm
hoạt động của nó.
Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, khí cysteine ở nồng độ thấp. Các ion
kim loại nặng như Cd+, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Fe2+, và các tác nhân gây ức chế
papain.
Papain tác dụng với chloromethyl cetone của phenylalanine và lysine thì mất hoàn
toàn hoạt tính. Trong trường hợp này chúng tác dụng lên nhóm sulfhydryl của
enzym thay vì lên nhóm imidazol của histidine như trường hợp của trypsin và
chymotrypsin. Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazine, hydroxylamine,…
cũng ức chế papain. Carborxyl – glutamic acid ức chế không cạnh tranh ở pH =3,9
– 4,5.
Nhiều chất ức chế papain chứa phenylalanine ở vị trí nhóm thế thứ hai kể từ đầu
mạch C là chất ức chế canh tranh mạnh của papain do chiếm một phần trung tâm
hoạt động.
Điều đáng chú ý là papain rất bền đối với các tác nhân biến tính như dung môi hữu
cơ hay được dùng trong hóa học protein (độ quay cực của papain hầu như không
biến đổi trong ethanol 70 % hay urea 6 – 8 M/l.
Các chế phẩm papain sau bảo quản vài tháng có độ hoạt động chỉ vào khoảng 30 %.
Ngay cả khi hoạt hóa, lượng sulfhydryl tự do vẫn nhỏ hơn 1 mol SH/1 mol papain
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng

15