XÁC ĐỊNH đột BIẾN TRÊN EXON 2, 3 của GEN SRD5A2 gây BỆNH THIẾU hụt ENZYM 5α REDUCTASE TUÝP 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
--------***--------

VŨ NGỌC MAI

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 2, 3 CỦA GEN SRD5A2
GÂY BỆNH THIẾU HỤT ENZYM 5α-REDUCTASE TUÝP 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 - 2019

HÀ NỘI-2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
--------***--------

VŨ NGỌC MAI
XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 2, 3 CỦA GEN SRD5A2
GÂY BỆNH THIẾU HỤT ENZYM 5α-REDUCTASE TUÝP 2
Ngành đào tạo

: Xét Nghiệm Y Học

Mã ngành

: 52720332

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 - 2019
Người hướng dẫn khoa học:
TS. Trần Thị Chi Mai
CN. Lê Hoàng Bích Nga

HÀ NỘI-2019


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học đại học, khóa luận tốt nghiệp chính là một dấu
ấn quan trọng trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Thời gian
tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp tại khoa Kỹ Thuật Y học- Trường Đại
học Y Hà Nội vừa qua đã giúp em học hỏi được nhiều điều, từ chuyên môn
kiến thức cũng như tác phong làm việc từ các Thầy cô, anh chị và bạn bè
trong khoa.
Trước tiên, em xin bày tỏ sự cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị Chi Mai,
Trưởng Khoa Kỹ Thuật Y học, Trưởng Bộ môn Hóa Sinh lâm sàng, Trường
Đại học Y Hà Nội, là người Thầy đã hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, luôn đưa ra
những góp ý quý báu, sửa chữa tỉ mĩ cũng như những lời khuyên hữu ích, tạo
điều kiện giúp em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Đại học,
Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành
khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc CN. Lê Hoàng Bích Nga, là người

trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, chia sẻ cho em những kỹ thuật và kinh nghiệm,
cùng các Thầy cô, anh chỉ trong khoa Kỹ Thuật Y học đã quan tâm, động viên
em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm,
động viên, chia sẻ những khó khăn với em trong suốt quá trình học tập.
Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2019
Sinh viên
VŨ NGỌC MAI


Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
------****-----LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Quản lý Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ
của thầy cô tại Khoa Kỹ thuật Y học- Trường Đại học Y Hà Nội, tất cả các số
liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ
công trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2019
Người viết khóa luận

Vũ Ngọc Mai


DANH MỤC VIẾT TẮT
DNA
Bp
DSDs
dNTP

ddNTP
EDTA
OD
PCR
DHT
SRD5A2

Deoxyribonucleic Acid
Base pair
Disorner of sex development
Deoxyribonucleotid triphosphat
Dideoxyribonucleotid triphosphat
Ethylen diamine tetraacetic acid
Optical Density (Độ hấp thụ quang)
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi
polymerase)
Dihydrotestosteron
Steroid 5-alpha-reductase 2

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN



7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn phát triển giới tính (DSDs) là một nhóm các rối loạn hiếm gặp

với sinh lý bệnh đa dạng, thường xuất hiện ở trẻ sơ sinh hoặc thanh thiếu niên,
được định nghĩa là các bệnh lý bẩm sinh liên quan đến sự phát triển cơ quan
sinh dục, giới tính không điển hình [1]. Tỷ lệ mắc bệnh DSDs chưa được
thống kê rõ ràng, trẻ sơ sinh có cơ quan sinh dục ngoài không điển hình là
tình trạng hiếm gặp, một báo cáo chỉ ra tỷ lệ này là 1: 4500 ca sinh [2].
Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reduacse tuýp 2 là một trong những bệnh điển
hình của nhóm bệnh 46, XY DSD, là bệnh rối loạn phát triển giới tính. Bệnh
nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 có kiểu hình bên ngoài gần như nữ,
khi sinh có bộ phận sinh dục không rõ ràng với một số triệu chứng như dương
vật nhỏ, tinh hoàn ẩn, lỗ đái thấp, bìu chẻ đôi, nữ hóa. Bệnh ảnh hưởng
nghiêm trọng đến cuộc sống của bệnh nhân và gia đình người bệnh, do bộ
phận sinh dục không rõ ràng nên không phân biệt giới tính là nam hay nữ, gặp
nhiều khó khăn trong việc chăm sóc và nuôi dưỡng. Do đó, phát hiện bệnh
sớm sẽ giúp đưa ra phương pháp điều trị và can thiệp tốt nhất.
Nguyên nhân gây bệnh là do thiếu hụt enzym 5α-reductase 2, là enzym
xúc tác phản ứng chuyển hormon sinh dục nam testosteron thành DHTdihydrotestosteron, phân tử có ái lực cao với thụ thể androgen. DHT đóng vai
trò quan trong trọng quá trình hình thành và phát triển bộ phận sinh dục ngoài
của nam giới trong quá trình phát triển thai nhi. Enzym 5α-reductase tuýp 2
được mã hóa bởi gen SRD5A2. Nghiên cứu cho thấy, các bất thường trên gen
SRD5A2 làm thay đổi, giảm nồng độ và hoạt tính của enzym 5α-reductase 2,
dẫn đến giảm hình thành DHT, gây nên sự xuất hiện của cơ quan sinh dục
không điển hình.


8

Chẩn đoán bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 ngoài các đặc
điểm về lâm sàng, có thể chẩn đoán dựa vào tỷ lệ Testosteron/ DHT trước và
sau làm test kích thích bằng hCG. Phương pháp thứ 2 để chẩn đoán phát hiện
bệnh là dựa trên kỹ thuật định lượng steroid niệu. Bên cạnh đó, để khẳng định

kết quả chẩn đoán, bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp 2 cần được tiến hành phân tích đột biến trên gen SRD5A2.
Ở Việt Nam, mặc dù bước đầu đã có nghiên cứu phát hiện bệnh tại
Bệnh viện Nhi Trung Ương, tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào xây dựng
quy trình và xác định đột biến gen SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp 2. Vì vậy, đề tài “Xác định đột biến trên exon 2, 3 của gen
SRD5A2 gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2” được thực hiện
với mục tiêu: “Phát hiện đột biến trên exon 2, 3 của gen SRD5A2 trên bệnh
nhân bị thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2”.


9

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2
1.1.1. Nhóm bệnh DSDs
DSDs có tên đầy đủ Disorder of sex development (DSDs), là nhóm bệnh
liên quan đến rối loạn phân biệt giới tính hay khác biệt giới, mô tả các tình
trạng bệnh lý bẩm sinh liên quan đến sự phát triển của cơ quan sinh dục hay
giới tính không điển hình [1].
Đặc điểm lâm sàng của những bệnh nhân mắc bệnh thuộc nhóm DSDs
rất khác nhau. Tuy nhiên, nhìn chung, trẻ nghi ngờ mắc bệnh DSDs thường có
một số đặc điểm lâm sàng như: trẻ sơ sinh có bộ phận sinh dục nữ với âm hộ
mở rộng hoặc bộ phận sinh dục là nam với tinh hoàn hai bên, kích thước
dương vật nhỏ, lỗ niệu đạo thấp, có sự bất đồng giữa bộ phận sinh dục ngoài
và bộ nhiễm sắc thể trước sinh. Ở tuổi dậy thì, bệnh nhân thường dậy thì
muộn hoặc không dậy thì, vô kinh nguyên phát hay có sự nữ hóa, phát triển
tuyến vú ở nam [2].
Một trong những bệnh DSDs phổ biến nhất là bệnh tăng sản tuyến
thượng thận bẩm sinh (CAH), đã được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam. Trong
đó, sự thiếu hụt enzym 21-hydroxylase chiếm hơn 90% các trường hợp bệnh

nhân mắc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh [3]. Bệnh di truyền lặn trên
nhiễm sắc thể số 6, do đột biến gen CYP21A2 gây ra, làm rối loạn quá trình
sinh tổng hợp hormon tuyến vỏ thượng thận, gây bệnh nam hóa ở trẻ gái, dậy
thì sớm ở trẻ trai.
Bên cạnh bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, bệnh thiếu hụt
enzym 5α-reductase tuýp 2 cũng là một trong những bệnh thường gặp của


10

nhóm bệnh DSDs. Bệnh di truyền lặn, do đột biến gen SRD5A2 trên nhiễm
sắc thể số 2 gây ra, làm giảm một phần hoặc hoàn toàn hoạt tính của enzym
5α-reductase 2, gây nên sự xuất hiện của cơ quan sinh dục không điển hình.
Năm 2006, một nhóm chuyên gia được tài trợ bởi Hiệp hội Nội tiết
Nhi khoa châu Âu (ESPE) và Hiệp hội Nội tiết Nhi Lawson Wilkins
(LWPES) đã đề xuất phân loại mới cho DSDs. Theo đó, những rối loạn này
được chia nhỏ thành:
•

46, XY DSD gồm những rối loạn liên quan đến tuyến sinh dục hoặc
phát triển tinh hoàn hay suy yếu tổng hợp và tác động androgen.

•

46, XX DSD gồm những rối loạn liên quan đến tuyến sinh dục hoặc
phát triển buồng trứng và dư thừa androgen.

•

DSD do bất thường nhiễm sắc thể giới tính [2].

Theo phân lại này, bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 thuộc

nhóm bệnh 46, XY DSD bao gồm những rối loạn của tuyến sinh dục hoặc
phát triển tinh hoàn hay suy yếu tổng hợp và tác động androgen.
1.1.2. Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2
Năm 1974, lần đầu tiên các đặc điểm lâm sàng và hóa sinh được mô tả
trong bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2, nghiên cứu thực hiện trên 24
đối tượng bị ảnh hưởng từ 13 gia đình lớn ở Dominican và trong hai anh em
đến từ Dallas. Sau đó, các trường hợp ở New Guinea và Thổ Nhĩ Kỳ cũng
được mô tả và nhiều trường hợp khác trên toàn thế giới [4].
Thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 là một trong hai nguyên nhân
thường gặp gây rối loạn phát triển giới tính ở nam giới, thuộc nhóm bệnh 46,
XY DSD cần được chẩn đoán sớm. Bệnh do sự thiếu hụt của enzym 5αreductase tuýp 2, là enzym tham gia vào quá trình chuyển hoá các hormon
sinh dục, cụ thể là testosteron. Sự thiếu hụt enzym gây ra sự xuất hiện những


11

cơ quan sinh dục không điển hình, hoặc nhận định nhầm giới tính, gây nên
các tổn thương về mặt tâm lý, sinh lý ở trẻ. Việc phát hiện và điều trị bệnh
sớm góp phần trả lại giới tính thật của trẻ, cũng như đưa ra các biện pháp điều
trị và can thiệp kịp thời.
1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2
Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 được mô tả trên những người
có bộ nhiễm sắc thể là nam giới 46, XY nhưng có kiểu hình gần như là nữ,
hoặc sinh ra với bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng với một dương vật
nhỏ, chiều dài dương vật bị giảm, bìu nứt đôi nghiêm trọng, nữ hóa. Do đó,
nhiều nam giới xác định nhầm giới tính và nuôi dưỡng như nữ giới.
Một số trường hợp khác, bệnh nhân không có lỗ âm đạo hoặc có túi âm
đạo mù mở vào niệu đạo, dị tật lỗ niệu đạo thấp có thể gần bìu hoặc thậm chí

là hẹp niệu đạo. Sự biệt hóa ống Wolff ở nam giới bị ảnh hưởng thường là túi
tinh, ống dẫn tinh, mào tinh và không có cấu trúc của Mullerian (giúp phát
triển các cơ quan sinh dục nữ như ống dẫn trứng, tử cung). Một số trường hợp
có thể không có một hoặc cả hai tinh hoàn, có trường hợp tinh hoàn thường
được tìm thấy trong ống bẹn, bìu hoặc đôi khi nằm trong bụng [5].
Ở tuổi dậy thì, tùy theo mức độ bệnh, các đối tượng có thể không dậy thì
hoặc dậy thì muộn, tuy nhiên vẫn có sự phát triển cơ bắp, giọng nói trầm hơn,
dương vật phát triển. Một số trường hợp tinh hoàn không dịch chuyển, một số
khác có tinh hoàn ở bẹn đã đi xuống bìu ở tuổi dậy thì, lông trên mặt và cơ thể
có thể giảm so với nam giới bình thường và không xảy ra chứng hói đầu ở
những bệnh nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 [6].
1.1.4. Cơ chế gây bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2


12

Bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 là bệnh rối loạn phát triển giới
tính do thiếu hụt enzym 5α-reductase 2, enzym này có chức năng chuyển hóa
testosteron thành DHT. Do đó, sự thiếu hụt enzym 5α-reductase 2 dẫn đến suy
giảm nồng độ DHT trong máu. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng: nồng độ DHT
thấp so với testosteron trong máu, nhưng trong các mô có mặt của enzym 5αreductase 2 thì DHT cao hơn testosteron [7].
Testosteron là hormone sinh dục nam đóng vai trò quan trọng trong sự
phát triển các mô sinh sản nam như tinh hoàn, tuyến tiền liệt, cũng như thúc
đẩy các đặc điểm sinh dục thứ cấp như tăng khối lượng cơ, xương và sự phát
triển của lông trên cơ thể. Trong tế bào, một phần testosteron sẽ khuếch tán
vào bên trong nhân để liên kết với thụ thể androgen, tạo thành phức hợp
testosteron-thụ thể androgen, một phần khác dưới tác dụng của enzym 5αreductase 2, testosteron sẽ chuyển thành DHT. Sau đó, DHT sẽ kết hợp với
thụ thể androgen tạo thành phức hợp DHT-thụ thể androgen. Hai phức hợp
này sẽ lần lượt tương tác với các vị trí đặc hiệu trên nhiễm sắc thể để điều hòa
quá trình phiên mã gen.

Mặc dù, chức năng của hai phức hợp này chưa được xác định rõ, nhưng
người ta cho rằng phức hợp testosteron-thụ thể androgen có vai trò trung gian
trong việc điều hòa hoạt động bài tiết LH của tuyến yên, kiểm soát sự sinh
tinh trong tinh hoàn và trong giai đoạn biệt hóa Wolffian hình thành mào tinh,
túi tinh, ống dẫn tinh, ống phóng tinh. Các phức hợp DHT-thụ thể androgen
chịu trách nhiệm cho sự phát triển của tuyến sinh dục ngoài, là hình thành
tuyến tiền liệt, dương vật, niệu đạo nam và hầu hết các đặc điểm sinh dục thứ
cấp như phát triển dương vật, bìu, lông mu, lông lách, lông mặt và tuyến tiền
liệt ở tuổi dậy thì [8]. Do đó, những người thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp
2 sẽ giảm sự hình thành DHT, dẫn đến sự phát triển không hoàn chỉnh của cơ
quan sinh dục ngoài và sự phát triển của nam giởi tuổi dậy thì.


13

Hình 1.1: Hoạt động của DHT trong tế bào
(Nguồn: )
1.1.5. Chẩn đoán bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2
Hiện nay, bệnh nhân được chẩn đoán bệnh dựa trên các đặc điểm lâm
sàng, xét nghiệm chẩn đoán hình ảnh hoặc các thông số xét nghiệm hóa sinh.
Sử dụng các công cụ chẩn đoán hình ảnh: Trong bệnh thiếu hụt enzym
5α-reductase tuýp 2, mặc dù bệnh nhân có bộ phận sinh dục bên ngoài là nữ
như có âm vật nhưng siêu âm sẽ không thấy sự xuất hiện của tử cung và
buồng trứng, do đó siêu âm được sử dụng để đánh giá hình ảnh của các bộ
phận sinh dục bên trong. Bên cạnh đó, siêu âm giúp đánh giá sự hiện diện của


14

các bộ phận sinh dục trong thời gian thai kỳ 16-18 tuần tuổi về vị trí, hình

dạng cũng như kích thước. Đối với trường hợp bệnh nặng, bệnh nhân có kiểu
hình bên ngoài gần như là nữ, đến tuổi dậy thì bệnh chỉ phát hiện ra khi không
có sự xuất hiện của kinh nguyệt hay tuyến vú không phát triển. Ngoài ra, một
số trường hợp không có sự xuất hiện của một hoặc cả hai tinh hoàn, có thể
dùng phương pháp nội soi ổ bụng để phát hiện ra tinh hoàn lạc chỗ.
Các chỉ số xét nghiệm hóa sinh gồm: nồng độ testosteron trong huyết
tương tăng cao, nồng độ DHT giảm nhẹ đến thấp, tỷ lệ testosteron/DHT tăng,
cortisol giảm, tăng nồng độ LH trong huyết tương và nồng độ FSH có thể
tăng [4]. Ngoài ra, enzym 5α-reductase tuýp 2 còn giúp chuyển hóa
tetrahydrocortisol (THF) thành 5α-THF, tetrahydrocorticosteron (THB) thành
5α-THB, etiocholanolon (Et) thành androsteron (An), do đó người ta có thể sử
dụng phương pháp định lượng steroid niệu bằng GC-MS (Gas
Chromatography Mass Spectometry) như một tiêu chuẩn quan trọng để chẩn
đoán thiếu hụt enzym tham gia tổng hợp hormon steroid, trong đó có thiếu hụt
enzym 5α-reductase tuýp 2. Kết quả định lượng steroid niệu trên những bệnh
nhân thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2: tỷ lệ 5α-THF/THF, 5α-THB/THB,
An/Et đều thấp, trong đó tỷ lệ 5α-THF/THF thường được sử dụng nhiều nhất,
tuy nhiên đối với trẻ dưới 3 tháng tuổi các sản phẩm chuyển hóa steroid rất
thấp nên không sử dụng phương pháp định lượng steroid niệu để chẩn đoán
thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2.
1.1.6. Điều trị bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2
Do sự thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 mà lượng DHT giảm dẫn
đến hình thành các bộ phận sinh dục không rõ ràng và không phát triển các
đặc điểm sinh dục nam thứ phát, vì vậy có thể điều trị bằng liệu pháp thay


15

thế hormon để tạo ra sự phát triển dương vật và các đặc điểm sinh dục nam
thứ cấp.

Sau khi được chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductae tuýp 2, ở trẻ sơ
sinh nên quyết định giới tính của trẻ để nuôi dạy tránh làm tổn thương tâm lý
xảy ra ở tuổi trưởng thành. Sự khiếm khuyết hay bất thường về bộ phận sinh
dục gây ra những mặc cảm cho bản thân người bệnh, do đó phẫu thuật chỉnh
sửa bộ phận sinh dục bên ngoài và điều chỉnh tinh hoàn trong trường hợp lạc
chỗ là cần thiết. Phẫu thuật bộ phận sinh dục thành công sẽ giúp đứa trẻ nam
dậy thì với sự phát triển tâm sinh lý nam bình thường, cơ quan sinh dục ngoài
sẽ phát triển ở tuổi dậy thì, tăng trưởng về chiều cao và khối lượng cơ bắp.
Các đối tượng mắc bệnh này, có thể xác định giới tính là nam giới và nên
được khuyến khích có vị trí là nam giới trong xã hội. Tuy nhiên, một số khác
lại không chấp nhận bệnh nên có thể thay đổi vai trò giới bằng việc phẫu thuật
chuyển giới để giải quyết các vấn đề áp lực xã hội, đảm bảo cuộc sống tốt
hơn.
Ở trẻ nhỏ, việc phẫu thuật còn nhiều khó khăn nên có thể bổ sung lượng
DHT thiếu hụt bằng cách sử dụng các dạng kem Dyhydrotestosteron, giúp cho
phát triển bộ phận sinh dục bình thường [5].
1.2. Tổng quan về gen SRD5A2
1.2.1. Cấu trúc gen
SRD5A2 có tên đầy đủ là steroid 5-alpha-reducetase 2, nằm trên nhánh
ngắn p của nhiễm sắc thể số 2 ở vị trí 23.1, từ cặp base 31,522,486 đến cặp
base 31,665,651. SRD5A2 còn có một số tên gọi khác như: 3-oxo-5 alphasteroid 4-dehydrogenase 2; 5 alpha-SR2; MGC138457, S5A2-HANAN; SR
type 2; steroid 5-alpha-reductase 2; steroid-5-alpha-reductase, alpha


16

polypeptide 2 (3-oxo-5 alpha-steroid delta 4-dehydrogenase alpha 2); type II
5-alpha reductase. Gen SRD5A2 gồm 5 exon và 4 intron, mã hóa cho protein
SRD5A2 gồm 254 acid amin với trọng lượng phân tử 28,4 kilodalton [4], [9].

Hình 1.2. Vị trí gen SRD5A2 trên nhiễm sắc thể số 2
(Nguồn: />
1.2.2. Chức năng của gen SRD5A2
Gen SRD5A2 mã hóa cho enzym steroid 5-alpha-reductase 2. Enzym
này xúc tác chuyển hormon testosteron thành DHT, trong đó DHT cần thiết
cho sự phát triển bình thường của bộ phận sinh dục ngoài và các đặc điểm
giới tính nam [9].
Enzym 5α-reductase giúp chuyển testosteron thành DHT, có 2 tuýp khác
nhau: 5α-reductase 1 được mã hóa bởi gen SRD5A1, xuất hiện phổ biến ở gan
và da; 5α-reductase 2 được mã hóa bởi gen SRD5A2 xuất hiện phổ biến ở
tuyến tiền liệt [10]. Enzym 5α-reductase tuýp 2 có ái lực cao với testosteron
gấp 10-15 lần so với loại 1 [11]. Enzym này xúc tác phản ứng khử liên kết đôi
của C4-C5 của vòng A nhân sterol giúp chuyển testosteron thành DHT.
1.2.3. Đột biến gen SRD5A2
Thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 là bệnh lý di truyền do đột biến
gen SRD5A2 gây ra, bất thường trên gen SRD5A2 làm giảm nồng độ và hoạt


17

tính của enzym 5α-reductase tuýp 2 dẫn đến giảm hình thành DHT từ
testosteron.
Một nghiên cứu (hồi cứu) trên 86 bệnh nhân thiếu hụt enzym 5αreduactase tuýp 2 từ năm 2007 đến 2017 tại Trung tâm Chuyển hóa Nội tiết
và Di truyền của Bệnh viện Đại học Bắc Kinh ở Trung Quốc đã xác định 19
đột biến trên gen SRD5A2 trong đó có 5 đột biến mới được phát hiện
p.A228F, p.E57D, p.V124D, p.A117D, p.E197K. Các đột biến chủ yếu nằm
trên exon 1 và exon 4. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, đột biến gen SRD5A2 có
ảnh hưởng đến bệnh thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2 [12].
Một nghiên cứu (hồi cứu) diễn ra tại bệnh viện Queen Elizabeth tại Hồng
Kông, trên 16 bệnh nhân được chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp

2, trong số đó 12 bệnh nhân có đột biến gen SRD5A2. Đột biến p. R227Q là
đột biến phổ biến nhất được phát hiện, nghiên cứu phát hiện một đột biến mới
là c.548 G>A ở trạng thái dị hợp tử [13].
Có thể thấy đột biến gen SRD5A2 có liên quan mật thiết đến những bệnh
nhân chẩn đoán thiếu hụt enzym 5α-reductase tuýp 2, do đó sử dụng các kĩ
thuật sinh học phân tử có thể xác định được nguyên nhân gây bệnh.
1.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng để phát hiện đột biến gen
SRD5A2
1.3.1. Kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử được
sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài đoạn DNA để tạo ra nhiều bản sao của
trình tự DNA nào đó. Phương pháp PCR được Karry Mulis phát minh vào
những năm 80 của thế kỉ XX đã tạo ra một cuộc cách mạng về sinh học phân
tử. Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc biến tính, hồi tính của DNA bởi nhiệt độ


18

và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của enzym DNA polymerase. Phản
ứng xảy ra cần sự có mặt của DNA khuôn, mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ
sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn, bốn loại nucleotid, enzym DNA
polymerase xúc tác cho quá trình tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn.
Phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:
•

Giai đoạn 1 (giai đoạn biến tính): là quá trình tách DNA mạch kép
thành 2 mạch đơn bằng cách làm đứt các liên kết hydro tạo mạch khuôn
cho quá trình tổng hợp. Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao từ

•

94-95°C.
Giai đoạn 2 (giai đoạn gắn mồi): ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp
xuống thường duy trì ở nhiệt độ 50-60°C cho phép các đoạn mồi gắn

•

vào mạch DNA khuôn.
Giai đoạn 3 (giai đoạn kéo dài chuỗi): nhiệt độ được tăng lên đến nhiệt
độ tối ưu của enzym Taq polymerase thường là 72°C, dưới tác dụng của
enzym này các mạch đơn được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung.

Hình 1. 1. Các giai đoạn của phản ứng PCR
(Nguồn: )
Thành phần của phản ứng PCR:


19

•

DNA khuôn: đoạn DNA khuôn tinh sạch, không bị đứt gãy, không bị
nhiễm các chất ức chế phản ứng hay các DNA ngoại lại là yếu tố quan

•

trọng giúp cho phản ứng PCR tạo ra được các sản phẩm chính xác.
Mồi: là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 20-30 nucleotid có
trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của hai đầu đoạn DNA

•

khuôn bao gồm một mồi xuôi và một mồi ngược.
Các nucleotid (dNTPs): là hỗn hợp của 4 loại dATP, dTTP, dCTP,

•

dGTC làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
Enzym DNA polymerase: enzym thường được sử dụng là enzym Taq
polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus

•

aquaticus sống ở nhiệt độ cao.
Dung dịch đệm: thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại
enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành phức
hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của DNA mạch kép
và tăng khả năng bắt cặp, khả năng gắn của các đoạn mồi vào mạch
khuôn [14].

1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp
xếp của 4 loại nucleotid A (Adenine), T (Thymine), G (Guanie), C (Cytosine).
Năm 1977, Frederick Sanger và các cộng sự đã phát triển phương pháp
giải trình tự gen bằng phương pháp enzym (phương pháp dideoxynucleotid)
với nguyên tắc cơ bản dựa trên hoạt động của enzym DNA polymerase nhưng
sử dụng dideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, có cấu trúc tương
tự như phân tử deoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường
deoxyribose không phải là hydroxyl (-OH) mà là (-H), để dừng việc tổng hợp
mạch bổ sung do không hình thành được liên kết phosphodieste. Các dNTP

20

tham gia vào phản ứng tại nhiều thời điểm khác nhau và tạo ra các sợi đơn
DNA có kích thước khác nhau [15].

Hình 1. 2. Cấu trúc ddNTP và dNTP
(Nguồn: )
Phương pháp giải trình tự gen được tiến hành trong 4 ống nghiệm, mỗi
ống nghiệm được cung cấp thêm DNA polymerase, 4 loại dNTP tự do (A,
T, G, C) và một trong bốn loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP). Nồng độ của mỗi ddNTP được điều chỉnh thận trọng, thường chỉ
dùng một lượng nhỏ, khoảng 1%. Trong quá trình tổng hợp chuỗi, một
dNTP gắn vào mạch khuôn bằng liên kết phosphodiester giữa 5’ phosphate
với 3’ hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi. Tuy nhiên, nếu một
ddNTP được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA
sẽ dừng lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid
tiếp theo, tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau hơn kém nhau 1
nucleotid [16]. Như vậy, trong mỗi ống phản ứng chứa các mạch đơn DNA
có chiều dài khác nhau và ở đầu 3’ của các đoạn DNA chứa một ddNTP
tương ứng đã cho vào ống đó. Sau một thời gian phản ứng, tiến hành điện
di trên gel để xác định trình tự DNA.


21

Hình 1. 3. Phương pháp giải trình tự gen của Sanger.
(Nguồn: )
Dựa trên nguyên lý của phương pháp giải trình tự gen bằng enzym,

F.Sanger và cộng sự đã phát triển phương pháp giải tình tự gen bằng máy
tự động. Với các thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang
khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP. Nhờ vậy, phản ứng giải trình tự thực
hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng, hệ thống
điện di thường là điện di mao quản. Mỗi khi có một vạch điện di đi qua,
phân tử ddNTP cuối cùng ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu
huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc và phân tích. Dựa vào
màu huỳnh quang mà máy nhận diện được nucleotid, từ đó biết được trình
tự của DNA đích [17].


22

Hình 1. 4. Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động
(Nguồn: )


23

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cỡ mẫu: lấy mẫu thuận tiện
Tiêu chuẩn lựa chọn:
-

Mẫu bệnh: nhóm gồm 3 bệnh nhân chẩn đoán thiếu hụt enzym 5αreductase tuýp 2 xác định với các đặc điểm lâm sàng và cận lâm
sàng (kết quả sàng lọc định lượng steroid niệu với tỷ lệ

-

•
•

5α-

THF/THF thấp).
Mẫu chứng: mẫu bỏ đi của trẻ bình thường, không mắc các bệnh rối

loạn phát triển giới tính.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu:
Khoa Kỹ thuật Y học-Trường Đại Học Y Hà Nội, số 1, Tôn Thất Tùng.
Khoa xét nghiệm Sinh hóa-Bệnh viện Nhi Trung Ương
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2018 đến tháng 5/2019
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp mô tả
cắt ngang.


24

2.4. Quy trình nghiên cứu
Lấy mẫu, thu thập thông tin về đặc điểm lâm sàng
và cận lân sàng
Tách chiết DNA
Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA
PCR và điện di sản phẩm

Giải trình tự gen và so sánh với trình tự gốc trên

Sơ Genbank
đồ nghiên cứu
2.5. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.5.1. Dụng cụ, trang thiết bị
- Tủ lạnh thường và tủ âm sâu
- Ống Eppendoft loại 0,5 ml; 1,0 ml và 1,5 ml
- Pipet định mức và đầu côn các loại 500µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl
- Máy ly tâm Hitachi Koki
- Máy vortex IKA Vortex 4 digital của hãng BCE Vietnam
- Máy lắc nhiệt Biometra TSC
- Máy ly tâm nhanh
- Máy ly tâm lạnh Uniequip UEC 14/B
- Máy điện di Clever Scientific
- Máy soi gel
- Máy PCR Bio-rad
- Máy đo mật độ quang
- Cân điện tử
- Cốc đong, bình thủy tinh
- Găng tay
- Khay đổ gel
2.5.2. Hóa chất
-

Hóa chất tách chiết DNA:


25

•
•

•
•

Hóa chất theo kit tách chiết QIAGEN: dung dịch buffer AL, dung dịch
buffer AE, dung dịch buffer AW1, AW2, Protein K
Ethanol 96-100%
Dung dịch PBS
Hóa chất PCR :
Nước PCR: nước cất được khử ion, không có chứa DNAase, RNAase,
enzym cắt giới hạn…nói cách khác không chứa bất kỳ thành phần nào

•
•
•
•
•
•
•

khác.
Mastermix 2X: chứa 4 lại dNTP tự do, enzym Taq polymerase, buffer,
MgCl2 của kit One Taq Hot Star 2X Master Mix with GC Buffer
Mồi xuôi và mồi ngược
Hóa chất điện di:
Dung dịch đệm TBE 10X (Tris Borate EDTA) gồm: Tris base, Boric
acid và EDTA, khi sử dụng pha thành dung dịch 1X
Bột agarose của hãng Thermo Scientific
Ethidium bromide 10 mg/ml
Dung dịch loading dye của hãng Bioline.
Dna HyperLadder 100bp của hãng Bioline.