Nghiên cứu định lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong chế phẩm thuốc xịt mũi nozeytin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HOÀNG YẾN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
AZELASTIN HYDROCLORID VÀ
BENZALKONIUM CLORID TRONG
CHẾ PHẨM THUỐC XỊT MŨI
NOZEYTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HOÀNG YẾN
MÃ SINH VIÊN: 1501566

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG
AZELASTIN HYDROCLORID VÀ
BENZALKONIUM CLORID TRONG
CHẾ PHẨM THUỐC XỊT MŨI
NOZEYTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Ngô Minh Thúy

Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI – 2020


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường
Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của ThS. Ngô Minh Thúy. Để hoàn thành
khóa luận này, bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia
đình và bạn bè. Hiện tại khóa luận đã được hoàn thành, tôi xin phép được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Ngô Minh Thúy, người thầy
đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình làm
thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Lê Đình Chi và ThS. Vũ Ngân
Bình đã luôn sẵn sàng cho tôi lời khuyên, hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện
đề tài.
Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên
ở Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện,
giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng xin kính chúc các thầy cô và các anh chị luôn mạnh khỏe, hạnh phúc
và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Hà Nội, ngày 20 tháng 6 năm 2020
Sinh viên
Nguyễn Hoàng Yến


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 2
1.1.1. Đặc điểm của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid ............................. 2
1.1.2. Một số phương pháp phân tích định lượng ......................................................... 4
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................... 8
1.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 8
1.2.2. Phân loại .............................................................................................................. 8
1.2.3. Sắc ký lỏng pha đảo ............................................................................................. 8
1.2.4. Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC ................................................................ 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................... 12
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................................... 12
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................. 12
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 12
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 13
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 13
2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện ........................................................................... 13
2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................................... 13
2.4.3. Khảo sát nồng độ định lượng ............................................................................ 14
2.4.4. Thẩm định quy trình ........................................................................................... 14
2.4.5. Áp dụng phương pháp ........................................................................................ 18
2.4.6. Xử lý kết quả ...................................................................................................... 18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................... 19
3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 19
3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử .............................................................................................. 19
3.1.2. Chuẩn bị mẫu placebo ....................................................................................... 19

3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ................................................................................. 19


3.1.4. Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn .................................................................... 20
3.2. Quy trình chuẩn bị dung môi pha động.................................................................... 22
3.3. Khảo sát phương pháp.............................................................................................. 22
3.3.1. Lựa chọn bước sóng........................................................................................... 22
3.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................................... 23
3.3.3. Khảo sát nồng độ định lượng ............................................................................ 26
3.4. Phương pháp phân tích đồng thời AZH và BAC ..................................................... 27
3.5. Thẩm định phương pháp .......................................................................................... 27
3.5.1. Độ thích hợp hệ thống (system suitability) ........................................................ 27
3.5.2. Độ chọn lọc (selectivity) .................................................................................... 28
3.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity) .................................................. 30
3.5.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................ 31
3.5.5. Độ chụm của phương pháp (precision) ............................................................. 32
3.5.6. Độ đúng (trueness)............................................................................................. 33
3.6. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thuốc xịt mũi trên thị trường............. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

AZH

Azelastine hydrochloride

Azelastin hydroclorid

BAC

Benzalkonium chloride

Benzalkonium clorid

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

Methanol

Reversed Phase High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography

pha đảo

RP-LC

Reversed Phase Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng pha đảo

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

RP-HPLC

TB

Gíá trị trung bình

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1

Một số phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC

5

Bảng 2.1

Các điều kiện pha động khảo sát

14

Bảng 3.1

Cách pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp

20

Bảng 3.2

Cách pha các mẫu thêm chuẩn AZH

21

Bảng 3.3

Cách pha các mẫu thêm chuẩn BAC

22

Bảng 3.4

Kết quả độ ổn định hệ thống

28

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát đường chuẩn

30

Bảng 3.6

Kết quả xác định LOD và LOQ

32

Bảng 3.7

Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày

32

Bảng 3.8

Kết quả độ đúng của AZH

33

Bảng 3.9

Kết quả độ đúng của BAC

33

Bảng 3.10

Kết quả định lượng azelastin hydroclorid trong chế phẩm

34

Bảng 3.11

Kết quả định lượng benzalkonium clorid trong chế phẩm

34


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1

Công thức cấu tạo của azelastin hydroclorid

2

Hình 1.2

Công thức cấu tạo của benzalkonium clorid

3

Hình 1.3

Thuốc xịt mũi Nozeytin

4

Hình 2.1

Cách xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

16

Hình 3.1

Phổ hấp thụ UV của AZH và BAC

23

Hình 3.2

Kết quả khảo sát thành phần pha động

24

Hình 3.3

Kết quả khảo sát pH đệm

25

Hình 3.4

Kết quả khảo sát tốc độ dòng tại bước sóng 210 nm

26

Hình 3.5

Sắc ký đồ kết quả độ chọn lọc

29

Hình 3.6

Hình 3.7

Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của azelastin hydroclorid
Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và
nồng độ của benzalkonium clorid

30

31

ĐẶT VẤN ĐỀ
Một thành phần quan trọng trong các chế phẩm thuốc đa liều là các chất bảo
quản kháng khuẩn. Các thành phần này có tác dụng làm giảm nguy cơ xâm nhập của
vi khuẩn sau khi đã dùng một phần chế phẩm. Theo những quy định quốc tế hiện hành,
tiêu chuẩn thành phẩm thuốc phải có quy định về giới hạn chất bảo quản khi có sử
dụng trong công thức bào chế, tên và hàm lượng các chất này phải ghi trên nhãn thuốc.
Tại thời điểm sản xuất, sản phẩm cần chứa một lượng chất bảo quản kháng khuẩn
được công bố (trong phạm vi ± 20% dao động cho phép trong sản xuất và kiểm
nghiệm) [2]. Một trong những chất bảo quản kháng khuẩn thường được sử dụng trong
các công thức thuốc nhỏ mũi là benzalkonium clorid. Ở Việt Nam, một phương pháp
định lượng benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi azelastin hydroclorid bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao đã được công bố [5]. Các chế phẩm của azelastin hydroclorid cũng
thường chứa thành phần chất bảo quản là benzalkonium clorid. Tính đến nay trên thế
giới đã có một số phương pháp được phát triển để định lượng hai chất này đồng thời
với nhau, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào được công bố tại Việt Nam.
Chính vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng Azelastin
hydroclorid và Benzalkonium clorid trong chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” trên đối tượng cụ thể là chế phẩm thuốc xịt
mũi Nozeytin với hai mục tiêu chính:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích azelastin hydroclorid và
benzalkonium clorid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
2. Ứng dụng phương pháp trên để định lượng azelastin hydroclorid và
benzalkonium clorid trong chế phẩm.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Đặc điểm của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid

Azelastin hydroclorid là dạng muối hydroclorid của azelastin, một hợp chất
phthalazinone thuộc nhóm thuốc kháng histamin thế hệ thứ hai, có đặc tính chống dị
ứng và giãn phế quản [12].

O

N

CH3

N
N

.HCl

Cl
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của azelastin hydroclorid
Công thức phân tử: C22H24ClN3O . HCl
Danh pháp: 1(2H)-Phthalazinone, 4-[(4-clorophenyl)methyl]-2-(hexahydro-1methyl-1H-azepin-4-yl),

monohydroclorid.

Tên

khác:

4-(p-Clorobenzyl)-2-

(hexahydro-1-methyl-1H -azepin-4-yl)-1(2H)-phthalazinone monohydroclorid.
Phân tử lượng: 418,36.

Tính chất vật lý: Bột trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể. Tan trong ethanol
và metylen clorid; ít tan trong nước [29].
Azelastin được bào chế dưới dạng thuốc xịt mũi, nhỏ mắt và dạng uống để điều
trị viêm mũi dị ứng, hen suyễn và viêm kết mạc dị ứng. Azelastin làm giảm chảy nước
mũi, hắt hơi và nghẹt mũi; có hiệu quả chống lại hen suyễn do tập thể dục và dị ứng ở
bệnh nhân hen suyễn ngoại sinh [12]. Thuốc nhỏ mắt azelastin được chỉ định để điều
trị tại chỗ viêm kết mạc dị ứng theo mùa và lâu năm [28]. Cơ chế tác dụng bao gồm ức
chế giải phóng histamin từ các tế bào mast và ức chế co thắt phế quản do histamin và
leukotrien [12].
Các thuốc xịt mũi chứa azelastin hydroclorid thường là chế phẩm đơn hoạt chất
hoặc kết hợp với một số corticosteroid (mometasone furoate, fluticasone propionate…)
2


Các chế phẩm thuốc đa liều thường phải đối mặt với nguy cơ nhiễm vi sinh vật
sau khi mở nắp. Vi sinh vật sẽ làm giảm độ ổn định, tác dụng của chế phẩm, thậm chí
gây bệnh cho người dùng. Các chất bảo quản kháng khuẩn được thêm vào nhằm ngăn
vi sinh vật xâm nhập trong quá trình bảo quản thuốc. Theo quy định, tên và hàm lượng
các chất bảo quản phải được ghi trong nhãn thuốc. Một trong số những chất bảo quản
kháng khuẩn thường được sử dụng trong công thức thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi chứa
azelastin là benzalkonium clorid.
Benzalkonium clorid là hỗn hợp của các alkylbenzyldimethyl amoni clorid có
công thức chung:
[C6H5CH2N(CH3)2CnH2n+1]Cl
trong đó gốc alkyl chủ yếu có n là 12, 14 hoặc 16. Các thành phần đồng đẳng n-C12H25
và n-C14H29 không được ít hơn 70,0% của tổng các alkylbenzyldimethyl amoni clorid
(n-C12H25 không ít hơn 40,0% và n-C14H29 không ít hơn 20,0%) [29].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của benzalkonium clorid
Danh

pháp:

Amoni,

alkyldimethyl(phenylmethyl)-,

clorid.

Tên

khác:

Alkylbenzyldimethylamoni clorid.
Tính chất vật lý: Dạng gel dày hoặc miếng gelatin trắng hoặc vàng trắng.
Thường có mùi thơm nhẹ. Dung dịch nước trong suốt không màu hoặc hơi vàng có vị
đắng, tạo bọt mạnh khi lắc và thường có tính kiềm nhẹ. Tan tốt trong nước và trong
ethanol. Dạng khan tan tự do trong benzen và ít tan trong ether [29].
Benzalkonium clorid thuộc nhóm chất bảo quản kháng khuẩn; tác nhân làm ướt
và/hoặc hòa tan; chất nhũ hóa. Benzalkonium clorid làm bất hoạt các enzym sinh năng
lượng, do vậy làm thay đổi bản chất các protein và làm phá vỡ màng tế bào vi sinh vật,
do đó có tác dụng khử khuẩn. Độ dài chuỗi alkyl khác nhau mang lại tính chất khác
nhau. Ví dụ, hoạt động kháng khuẩn lớn hơn đối với độ dài chuỗi ngắn hơn, tuy nhiên
độ nhạy cảm của da giảm khi chiều dài chuỗi tăng. Chiều dài chuỗi ngắn hơn thì khả
3


năng hòa tan và tạo bọt tăng. Benzalkonium clorid có hiệu quả ở mọi mức pH. Tuy
nhiên, hiệu quả sẽ tăng lên khi pH tăng, pH càng cao, nồng độ cần thiết để đạt được
hiệu quả kháng khuẩn càng thấp.

Benzalkonium clorid được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để
làm chất bảo quản chống vi sinh vật trong các loại dung dịch thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi
và xịt mũi, cũng như sử dụng làm chất sát khuẩn ngoài da. Ngoài benzalkonium clorid,
benzalkonium bromid và benzalkonium sacarinat cũng được sử dụng nhưng kém phổ
biến hơn.
Các dung dịch benzalkonium clorid nồng độ 0,01 đến 0,1% được sử dụng để
làm sạch da, niêm mạc và vết thương. Benzalkonium clorid được sử dụng làm chất bảo
quản trong các dung dịch nhỏ mắt ở nồng độ 0,01 đến 0,02%, và trong các dung dịch
nhỏ mũi và otic ở nồng độ 0,002 đến 0,02% [28]. Với mục đích an toàn cho người sử
dụng, hàm lưg benzalkonium clorid phải được kiểm soát chặt chẽ trong các chế phẩm
thuốc.
Ở Việt Nam, trên thị trường cũng có chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin với hàm
lượng azelastin hydroclorid 1 mg/mL và benzalkonium clorid 0,125 mg/mL. Thuốc
được sử dụng với chỉ định điều trị triệu chứng sổ mũi, hắt hơi, nghẹt mũi… của một số
bệnh như viêm mũi dị ứng, viêm mũi vận mạch, viêm xoang mũi…

Hình 1.3. Thuốc xịt mũi Nozeytin
1.1.2. Một số phương pháp phân tích định lượng
Trên thế giới, đã có khá nhiều phương pháp được phát triển để định lượng
azelastin hydrochlorid. Trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ đã có phương pháp
4


định lượng azelastin hydroclorid bằng chuẩn độ điện thế [11, 28]. Ngoài ra, một số
phương pháp bao gồm đo màu và đo quang [7, 16, 21], sắc ký lớp mỏng (TLC) [22,
25], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10, 24], phương pháp điện hóa [26] và phân
tích nhiệt [27] đã được phát triển để định lượng azelastin hydroclorid dạng đơn chất
hoặc dạng bào chế.
Với benzalkonium clorid, vì đây là một hỗn hợp các thành phần và được sử
dụng trong các công thức dược phẩm ở nồng độ thấp, nên khó có được các phép đo

đáng tin cậy. Hiện tại, trong Dược điển Mỹ và Dược điển Anh sử dụng phương pháp
định lượng benzalkonium clorid nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ và xác định
tỷ lệ các thành phần alkyl bằng kỹ thuật HPLC [11, 28]. Dược điển Việt Nam V cũng
định lượng benzalkonium clorid bằng phương pháp chuẩn độ [1]. Ngoài ra, nhiều
phương pháp đã được phát triển để định lượng benzalkonium clorid trong dạng bào
chế bao gồm đo quang [14], sắc ký lớp mỏng (TLC) [8] và điện di mao quản [30].
Phương pháp HPLC cũng được nghiên cứu rộng rãi trên pha tĩnh là cột C18 [20, 23]
hoặc cột CN [9, 13]. Tại Việt Nam, có hai nghiên cứu được đưa ra để định lượng
benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi azelastin hydroclorid [5] và xylomethazolin
hydroclorid [6] bằng HPLC với pha tĩnh là cột C18.
Các phương pháp điện di mao quản, điện hóa hay phân tích nhiệt mặc dù có độ
nhạy và độ chọn lọc cao, tuy nhiên quá trình xử lý mẫu phức tạp và cần trang thiết bị
đắt tiền, trong khi đó phương pháp HPLC là phương pháp ổn định, hiệu quả, sử dụng
thiết bị phổ biến hơn và hóa chất thông thường, dễ triển khai và phù hợp với điều kiện
của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
Bảng 1.1 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế
giới về phân tích azelastin hydroclorid (AZH) và benzalkonium clorid (BAC) sử dụng
phương pháp HPLC.
Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC
STT

1

Tên tác giả

B. Thangabalan
và cộng sự [10]

Đối tượng

Pha tĩnh
Cột Kromosil C18,

AZH

(150 x 4,6 mm; 5
µm)

Pha động
Dung dịch đệm kali
dihydrophosphat 50 mM,
pH 3,0 : ACN tỷ lệ 50:50
(v/v). Tốc độ dòng 1,0

5


mL/phút.

2

3

Poonam D.

Mometaso-

Dighe và cộng

ne Furoate,

sự [24]

AZH

Cột Zorbax SB CN

Dung dịch đệm phosphat

(150 x 4,6 mm; 5

pH khoảng 3,0 đến 3,1 :

μm) duy trì ở nhiệt

ACN tỷ lệ 55:45 (v/v).

độ 30oC.

Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.

Lê Đình Chi,

Cột sắc ký

Phạm Thị Hiền,

Phenomenex C18

Dương Minh

BAC

(250 x 4,6 mm; 5

Tân, Lê Quang

µm) được duy trì ở

Thảo [5]

40oC.

4

Hà, Lê Thị

Eclipse XDB-C18
BAC

Thiên Hương

(150 x 4,6 mm; 5
µm)

pH 2,2 chứa 0,3% (v/v)
triethylamin (60 : 40,
v/v). Tốc độ dòng 1,2

ACN : dung dịch đệm kali

dihydrophosphat 25 mM
pH 3,0 tỷ lệ 75:25. Tốc
độ dòng 2,0 mL/phút.

[6]

Cột Macherey-Nagel ACN : dung dịch đệm kali

Hashem
5

dihydrophosphat 10 mM

mL/phút.

Phan Thị Thùy
Chi, Phạm Thị

ACN : dung dịch đệm kali

AlAani và cộng BAC
sự [9]

Nucleodur 100-5

dihydrophosphat 50 mM

CN (250 x 4,6 mm;

(pH 5,5) tỷ lệ 70:30 (v/v).

5 μm)

Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.
ACN : dung dịch đệm
phosphat (5,0 mL acid
ortho phosphoric và 1,0

Pratik Kumar
6

Gupta, Vibha

BAC

Chaturvedi [23]

Cột C18, cosmosil

mL triethylamin pha

(250 x 4,6 mm; 5

loãng với nước tới 1000

µm)

mL, chỉnh tới pH 5,0
bằng NaOH 5 N) tỷ lệ
45:55 (v/v). Tốc độ dòng

1,5 mL/phút.

7

Rangan Mallik

BAC

Cột ACE Excel 2
6

Dung dịch đệm


và cộng sự [20]

C18-AR (50 x 2,1

ammonium phosphat (pH

mm; 2 μm)

3,3; 10 mM) : methanol/
acetonitril (85/15, v/v).
Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.

Fluticasone

8

K. Lakshmi

propionate,

Cột Waters

Narasimha Rao

phenylethy

Spherisorb CN (250

và cộng sự [15]

l alcohol.

x 4,6 mm; 5 μm)

AZH, BAC

Dung dịch đệm kali
dihydrophosphat 50 mM :
ACN tỷ lệ 55:45 (v/v).
Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.
Dung dịch đệm kali

M. E. M.
9

Hassouna và

cộng sự [18]

Cột Thermo CPS
AZH, BAC CN (150 x 4,6mm; 5
µm)

dihydrophosphat 50 mM
và 5,7 mM hexane
sulfonat pH 4,5 : ACN
(50:50). Tốc độ dòng 1,5
mL/phút.

Mặc dù có nhiều phương pháp phân tích từng chất riêng lẻ, tuy nhiên chưa có
nhiều nghiên cứu định lượng đồng thời cả 2 chất này. Hai phương pháp RP-HPLC đã
được phát triển để xác định đồng thời cả azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid
trong các công thức thuốc nhỏ mắt [18] và nhỏ mũi [15]. Cả hai phương pháp này đều
sử dụng cột sắc ký CN, tương đối chính xác và xử lý mẫu đơn giản. Tuy nhiên,
phương pháp [15] có thời gian phân tích khá dài (20 phút) và khoảng tuyến tính hẹp
(39,2 – 67,2 µg/mL với AZH và 2,8 – 4,8 µg/mL với BAC). Phương pháp [18] đã
khắc phục được thời gian phân tích (7,5 phút) và khoảng tuyến tính (6,25 – 50,0
µg/mL với AZH và 5,0 – 50,0 µg/mL với BAC).
Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào phân tích đồng thời azelastin hydroclorid
và benzalkonium clorid. Công thức thuốc xịt mũi được quan tâm có hoạt chất azelastin
hydroclorid với hàm lượng cao hơn nhiều lần so với benzalkonium clorid và đáp ứng
pic của benzalkonium clorid rất thấp, nên để định lượng benzalkonium clorid cần tiêm
mẫu ở nồng độ cao. Điều này không phù hợp với cột CN. Một số nghiên cứu định
lượng riêng từng chất cũng được thực hiện trên cột C18. So với cột CN, cột C18 có ưu
điểm là thông dụng và ổn định hơn, tuổi thọ cột cũng dài hơn. Vì vậy, trong nghiên
7

cứu này một phương pháp phân tích đồng thời hai chất trong chế phẩm thuốc xịt mũi
được phát triển trên cột C18.
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao [3, 4]
1.2.1. Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao.
Dưới áp suất cao, các thành phần phân tích đã được hòa tan trong dung môi sẽ
bị kéo đi theo sự di chuyển của pha động qua cột sắc ký với các tốc độ khác nhau và
được tách khỏi nhau theo thời gian phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất tan với pha
động và pha tĩnh. Chất nào có lực tương tác lớn hơn sẽ bị giữ lại lâu hơn trên cột và bị
rửa giải chậm hơn. Tín hiệu về từng chất được phát hiện bởi đầu dò đặt sau cột tách và
hiện diện dưới dạng các pic nhờ bộ phận xử lý và ghi kết quả.
1.2.2. Phân loại
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy
thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và các yêu cầu của công việc. Có thể
thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo các mức độ phổ biến trong thực tế:
-

Sắc ký phân bố (bao gồm cả sắc ký cặp ion) (Partition chromatography).

-

Sắc ký hấp phụ (Liquid – solid chromatography).

-

Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography).

-

Sắc ký loại cỡ (Size – exclusion chromatography).

-

Sắc ký ái lực (Affinity chromatography).

-

Sắc ký các đồng phân quang học.

Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất hiện nay. Sắc ký phân bố
được chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo. Theo một số tác giả, sắc
ký phân bố pha đảo chiếm đến 75% khối lượng sắc ký và được sử dụng rất nhiều trong
phân tích kiểm nghiệm thuốc. Đây cũng là phương pháp được hướng tới trong nghiên
cứu này.
1.2.3. Sắc ký lỏng pha đảo
Sắc ký lỏng pha đảo (Reversed-phase Chromatography) thuộc nhóm sắc ký
phân bố pha liên kết; sử dụng pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực hơn pha
tĩnh. Loại hình sắc ký này ngược với sắc ký pha thuận (Normal-phase
Chromatography) sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực.
8


Sắc ký pha đảo được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất hữu cơ có khối
lượng phân tử nhỏ (M < 2000), trung tính, phân cực. Về thứ tự rửa giải: trong sắc ký
pha đảo, các chất phân cực ra trước, các chất ít và không phân cực ra sau.
a. Pha tĩnh
RP-LC sử dụng pha tĩnh không phân cực (nonpolar phases), có liên kết hóa học
với bề mặt chất mang rắn. Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd

(silica). Nhóm -OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất
siloxan.
Chất nhồi cột pha liên kết thường là hạt hình cầu đường kính 3 – 10µm. Hạt
silica có diện tích riêng khá lớn (vài trăm m2/g) thường chỉ bền vững trong khoảng pH
2 – 8. Ngoài khoảng này liên kết siloxan bị thủy phân. Tuy nhiên, hiện tại các nhà sản
xuất cột sắc ký đang có ngày càng nhiều hướng tiếp cận mới cho phép các cột sắc ký
pha đảo nói riêng và sắc ký pha liên kết nói chung làm việc ổn định được ở khoảng pH
cao hơn so với cột pha liên kết kinh điển trên giá mang là hạt silica.
b. Pha động
Ba dung môi hữu cơ thường dùng là: acetonitril (ACN), methanol (MeOH) và
tetrahydrofuran (THF).
Pha động thường dùng hỗn hợp tỷ lệ 1:2 dung môi trên với nước hoặc dung
dịch đệm để nhằm đảm bảo tương tác với chất tan để tách pha đảo hỗn hợp nhiều nhất.
• Hỗn hợp thường dùng nhất là ACN với nước. ACN có độ nhớt thấp nên
có thể sắc ký ở áp suất thấp và thích hợp hơn với các chất không phân
cực. Mặt khác, có thể đo độ hấp thụ UV đến 190 nm.
• MeOH được lựa chọn thứ hai, vì độ nhớt cao hơn có thể làm giảm hiệu
lực cột, và giới hạn đo ở vùng UV là 205 nm.
• THF ít dùng hơn vì độ ổn định kém hơn (dễ bị oxy hóa), cân bằng với
pha tĩnh chậm hơn.
Để giảm hiện tượng kéo đuôi (tailing) tăng tính cân đối của pic, người ta
thường thêm vào pha động triethylamin 30 mM khi sắc ký các base amin. Nếu sắc ký
các hợp chất acid có thể giảm thiểu kéo đuôi bằng cách thêm amoni acetat 30 mM. Với
hỗn hợp chưa rõ thành phần, thường dùng muối triethylamoni acetat 30 mM, hoặc
dimethyloctylamin 10 mM. Đôi khi còn dùng dimethyloctylamoni acetat. Người ta cho
rằng các chất phụ gia kể trên sẽ đẩy nhanh cân bằng khi thay đổi dung môi.
9


1.2.4. Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC

Tất cả các kỹ thuật định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc nồng độ
của chất phân tích tỷ lệ thuận với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 kỹ thuật định lượng được sử dụng trong sắc ký:
-

Phương pháp chuẩn ngoại

-

Phương pháp chuẩn nội

-

Phương pháp thêm chuẩn

-

Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong đó phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp được sử dụng trong khóa
luận này. Phương pháp chuẩn ngoại được trình bày cụ thể như sau:
Kỹ thuật chuẩn ngoại: Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện mẫu chuẩn và
mẫu thử. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều
cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụng
phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm.
• Chuẩn hóa một điểm: Chuẩn bị mẫu thử có nồng độ xấp xỉ nồng độ mẫu chuẩn.
Nồng độ của mẫu thử được tính theo công thức:
𝐶𝑥 = 𝐶𝑠

𝑆𝑥

𝑆𝑠

Trong đó: Cx, Cs: nồng độ mẫu thử, mẫu chuẩn
Sx, Ss: diện tích pic mẫu thử, mẫu chuẩn
• Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ
tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích
(hoặc chiều cao) pic với nồng độ chất chuẩn. Sử dụng khoảng tuyến tính của
đường chuẩn để tính nồng độ của chất cần xác định. Xây dựng phương trình hồi
quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ chất
cần xác định:
Y = aCx + b
Trong đó: Cx: nồng độ của chất phân tích
Y: diện tích hoặc chiều cao pic
Chú ý: Độ lớn của diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử phải nằm trong
khoảng tuyến tính của đường chuẩn.

10


Phương pháp chuẩn ngoại tương đối đơn giản và nhanh chóng, tuy nhiên nhược
điểm là dễ mắc phải sai số do tiêm mẫu không lặp lại hoặc mất mẫu trong quá trình xử
lý mẫu. Phương pháp thường được sử dụng trong những trường hợp quy trình xử lý
mẫu đơn giản, và sử dụng khi định lượng đối với chế phẩm (do đã biết trước khoảng
nồng độ).

11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là thuốc xịt mũi Nozeytin. Thành phần của mỗi lọ thuốc
như sau:
+ Azelastine hydroclorid: 15 mg/15 mL
+ Benzalkonium clorid: 1,875 mg/15 mL
+ Tá dược khác: Acid citric khan, dinatri hydro phosphat dodecahydrat,
dinatri edetat, surcalose, hypromellose 2900, natri clorid, nước tinh
khiết.
2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.2.1. Hóa chất

- Chuẩn đối chiếu azelastin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương
(Độ tinh khiết 99,4%, số lô: AH 0020216).

- Chuẩn đối chiếu benzalkonium clorid: Dung dịch benzalkonium clorid chuẩn
50% trong nước (kl/tt), Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

- Thuốc xịt mũi Nozeytin: Nhà sản xuất Công ty Cổ phần Dược phẩm Gia
Nguyễn; số lô sản xuất: 004/19; số đăng ký: VD-23262-15; hạn dùng:
23/08/2021.

- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (Fisher – Hàn Quốc).
- Kali dihydro phosphat (Merck – Đức).
- Acid phosphoric (Merck – Đức).
- Nước cất hai lần.
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm Chemstation.
- Cột sắc ký: Cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) (Vertical).
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức).
- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan).

- Phễu lọc Bunchner, màng lọc cellulose 0,45 µm.
- Màng lọc mẫu cellulose 0,45 µm.
- Cân phân tích A&D Model GR-200 (Nhật).
- Máy đo pH Eutech pH 700 (Singapore).
12


- Micropipet 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL LABMATE pro.
- Bình định mức 10 mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL, 250 mL.
- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, vial.
2.3. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AZH và BAC trong chế phẩm thuốc xịt mũi
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ thích hợp hệ thống, độ chọn lọc,
đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ
chụm, độ đúng, theo hướng dẫn của ICH Q2B [19].

- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng AZH và BAC trong chế phẩm
thuốc xịt mũi Nozeytin trên thị trường.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ trên pic sắc ký của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng
từ 190 đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp với mỗi chất.
2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng trên hệ thống sắc ký HPLC
Agilent Technologies 1200 Series, với pha tĩnh là cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6
mm, 5µm) (Vertical). Khảo sát pha động về nồng độ đệm, tỷ lệ thành phần (v/v), pH
đệm và tốc độ dòng (f).

Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền, hình dáng pic
và thời gian lưu của chất phân tích để lựa chọn pha động.
Các điều kiện pha động khảo sát được trình bày ở bảng 2.1.

13


Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát
Pha động

Tỷ lệ (v/v)

Tốc độ
(mL/phút)

45 : 55

1,0

50 : 50

1,0

60 : 40

1,0

75 : 25

1,0

70 : 30

1,0

ACN : đệm phosphat 50 mM
ACN : đệm phosphat 10 mM
(khảo sát pH của dung dịch đệm)

1,0
ACN : đệm phosphat 10 mM pH 3,5

75 : 25

1,1
1,2

80 : 20

1,0

2.4.3. Khảo sát nồng độ định lượng
Khảo sát chuẩn hỗn hợp AZH và BAC ở 2 ngưỡng nồng độ cùng tỷ lệ AZH :
BAC = 8:1 (như tỷ lệ trong công thức chế phẩm) là AZH là 1000 µg/mL – BAC 125
µg/mL và AZH 400 µg/mL – BAC 50 µg/mL.
Đánh giá kết quả dựa trên diện tích pic và sự đáp ứng tuyến tính giữa diện tích
pic và nồng độ.
2.4.4. Thẩm định quy trình
Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định
lượng AZH và BAC theo hướng dẫn của ICH Q2B trên các tiêu chí sau: Độ thích hợp

hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn
định lượng, độ chụm và độ đúng.
a. Độ thích hợp hệ thống (system suitability)
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ
thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.
Tiến hành: Xác định tính thích hợp hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên
tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp chứa AZH và BAC (chuẩn bị ở phần sau). Ghi lại các giá
trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch
chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích.

14


𝑆𝐷 = √

2
∑𝑁
𝑖=1(𝑥𝑖 − 𝑥̅ )
𝑁−1

𝑅𝑆𝐷 (%) =
Trong đó:

𝑆𝐷
. 100
𝑥⃐

xi: Thời gian lưu/diện tích pic của lần thử nghiệm thứ i.
𝑥̅ : Thời gian lưu/diện tích pic trung bình của N lần thử nghiệm.
N: Số lần thử nghiệm.

Yêu cầu: RSD (%) của các đáp ứng thời gian lưu ≤ 1,0% và diện tích pic ≤
2,0%.
b. Độ chọn lọc (selectivity)
Tính chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất
cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác.
Tiến hành: Chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp AZH và BAC, dung dịch thử
và nền mẫu tự tạo, dung môi pha mẫu từ các thành phần của chế phẩm với chương
trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lưu.
Yêu cầu:
- Thời gian lưu pic AZH và BAC của dung dịch chuẩn đơn, dung dịch chuẩn
hỗn hợp, dung dịch thử phải tương đương nhau. Pic trong mẫu thử phải
tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu.
- Nền mẫu tự tạo và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng
thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic AZH và BAC trên sắc ký
đồ của các dung dịch chuẩn. Nếu có, đáp ứng của pic tạp phải ≤ 1,0% so
với đáp ứng pic của mẫu chuẩn.
- Hệ số tinh khiết pic AZH và BAC trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung
dịch thử xấp xỉ 1,0. Hệ số chồng phổ UV của pic AZH và BAC thu được
trong sắc ký đồ dung dịch thử và phổ UV của pic tương ứng trong sắc ký
đồ dung dịch chuẩn xấp xỉ 1,0.
c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity)
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ mà ở đó
có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Đường

15


chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ
các chất phân tích.

Tiến hành: Chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp, có nồng độ AZH và BAC lần
lượt bằng 50%, 75%, 100%, 125%, và 150% nồng độ định lượng và khảo sát sự phụ
thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ. Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ,
xây dựng phương trình hồi quy, xác định hệ số tương quan (r) và hệ số chắn tại nồng
độ 100% (Y%).
Hệ số chắn tại nồng độ 100%:
Y% =

𝐻ệ 𝑠ố 𝑐ℎắ𝑛 (𝑏)
𝐷𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑝𝑖𝑐 ở 𝑛ồ𝑛𝑔 độ 100%

x 100%

Yêu cầu: Hệ số tương quan: 0,995 ≤ r ≤ 1.
Hệ số chắn tại nồng độ 100%: - 2,0% ≤ Y% ≤ 2,0%
d. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) là nồng độ thấp nhất của chất
phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation - LOQ) là nồng độ tối thiểu của một
chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết
quả có độ chụm mong muốn.
Tiến hành: Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu
của chất phân tích, lặp lại 3-4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal
to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường
nền.

Hình 2.1. Cách xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
16

Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu
lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pic tại nửa
chiều cao.
𝑆 ⁄𝑁 =

2𝐻
ℎ

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tỷ lệ giữa cường độ tín hiệu và
cường độ nhiễu đường nền S/N = 3.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tỷ lệ giữa cường độ tín hiệu và
cường độ nhiễu đường nền S/N không dưới 10.
e. Độ chụm của phương pháp (precision)
Độ chụm thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần
tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định.
+ Độ lặp lại của phương pháp (repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ chụm của
một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời
gian ngắn. Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử.
+ Độ chụm trung gian (intermediate precision): Bố trí thí nghiệm tương tự
phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác và
phân tích trên cùng hệ thống sắc ký lỏng.
Tiến hành: Định lượng 6 lần riêng biệt trên một mẫu thử và tính toán độ lệch
chuẩn tương đối.
Yêu cầu:
+ Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn
tương đối RSD (%) của hàm lượng AZH và BAC không quá 2,0%.
+ Độ chụm trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một
ngày và 12 lần thử trong 2 ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn
tương đối RSD (%) của hàm lượng AZH và BAC không quá 2,0%.
f. Độ đúng (accuracy)

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị
trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng.
Việc xác định độ đúng có thể thực hiện thông qua xác định độ thu hồi (còn gọi là độ
tìm lại) của phương pháp. Độ thu hồi là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá
trị lý thuyết.
17