Xây dựng quy trình định lượng citral trong tinh dầu xả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò dãy diod

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC
======



======

NGUYỄN THỊ HUÊ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC
======



======

NGUYỄN THỊ HUÊ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CITRAL TRONG TINH DẦU SẢ CHANH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ DÃY DIOD
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH
DƯỢC HỌC KHOÁ: QHY.2014

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ
Nguyễn Thị Thanh Bình – Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y
- Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, là người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy trong bộ Bộ môn Hoá Dược và Kiểm nghiệm
thuốc, Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để tôi có
thể thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Chủ nhiệm, các Phòng ban Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Khoa đã
cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và
rèn luyện tại Khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn
bên cạnh, động viên tôi trong lúc khó khăn cũng như trong quá trình thực hiện
khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Huê

ACN

Acetonit

BP

Dược điể

DAD

Máy đo q

EP

Dược điể

GC

Sắc ký k

HPLC
ICH

Sắc ký lỏ

chromato

Hội nghị
phẩm sử

Harmoni
Pharmac
LOD

Giới hạn

LOQ

Giới hạn

MS

Phương p

NIR

Quang p

RSD

Độ lệch c

USP

Dược điể


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU..........................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN..........................................................................2
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh.............................................................. 2
1.2. Giới thiệu chung về citral...........................................................................4
1.2.1. Nguồn gốc...............................................................................................4
1.2.2. Cấu trúc và tính chất............................................................................... 5
1.2.3. Công dụng...............................................................................................5
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral.........................................................6
1.3. Thẩm định quy trình phân tích...................................................................9
1.3.1. Tính đặc hiệu...........................................................................................9
1.3.2. Miền giá trị............................................................................................10
1.3.3. Tính tuyến tính......................................................................................10
1.3.4. Giới hạn phát hiện.................................................................................11
1.3.5. Giới hạn định lượng.............................................................................. 11
1.3.6. Độ đúng.................................................................................................12
1.3.7. Độ chính xác......................................................................................... 13
CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................14
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị..................................................................14
2.1.1. Dung môi, hoá chất............................................................................... 14
2.1.2. Trang thiết bị.........................................................................................14
2.2. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................14
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký.................................................................. 14
2.2.2. Thẩm định tính đặc hiệu........................................................................15
2.2.3. Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị..............................15


2.2.4. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.............................15
2.2.5. Thẩm định độ đúng............................................................................... 15
2.2.6. Thẩm định độ chính xác........................................................................15

2.2.7. Định lượng citral trong tinh dầu sả chanh.............................................16
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN................................................. 17
3.1. Xác định điều kiện phân tích....................................................................17
3.1.1. Khảo sát các hệ dung môi..................................................................... 17
3.1.2. Xác định bước sóng hấp thụ..................................................................19
3.1.3. Điều kiện sắc ký....................................................................................20
3.2 . Tính đặc hiệu...........................................................................................21
3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị.................................................................23
3.3.1. Đối với đồng phân neral........................................................................23
3.3.2. Đối với đồng phân geranial...................................................................24
3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.............................................. 26
3.5. Độ đúng....................................................................................................26
3.5.1. Đối với đồng phân neral........................................................................26
7.5.2. Đối với đồng phân geranial...................................................................27
3.6. Độ lặp lại..................................................................................................27
3.6.1. Đối với đồng phân neral........................................................................28
3.6.2. Đối với đồng phân geranial...................................................................29
3.7. Độ chính xác trung gian...........................................................................29
3.7.1. Đối với đồng phân neral........................................................................30
3.7.2. Đối với đồng phân geranial...................................................................31
3.8. Định lượng citral trong một số mẫu tinh dầu sả chanh............................31
3.8.1. Sản phẩm A...........................................................................................31
3.8.2. Sản phẩm B...........................................................................................32


3.8.3. Sản phẩm C...........................................................................................33
3.8. Bàn luận................................................................................................... 35
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................38
4.1. Kết luận....................................................................................................38
4.2. Kiến nghị..................................................................................................39

TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Công thức c

Hình 3.1. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước
sóng 233 nm, hệ dung môi ACN : H2O = 70 : 30 (v/v/v)
Hình 3.2. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước
sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 :
10 : 43 (v/v/v)
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV-VIS của Neral (A) và Geranial (B)
Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml trong điều
kiện sắc ký được lựa chọn
Hình 3.5. Phổ hấp thụ cực đại UV-VIS của geraniol
Hình 3.6. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol
tại bước sóng phát hiện 200 nm
Hình 3.7. Sắc ký đồ của dung dịch chứa 20 µg/ml citral và 5 µg/ml geraniol
tại bước sóng phát hiện 242 nm
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện
tích pic của đồng phân neral
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự tương quang giữa nồng độ dung dịch và diện
tích pic của đồng phân geranial
Hình 3.10. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân
neral
Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch mẫu A nồng độ 100 µg/ml
Hình 3.12. Sắc ký đồ dung dịch mẫu B nồng độ 100 µg/ml
Hình 3.13. Sắc ký đồ dung dịch mẫu C nồng độ 50 µg/ml

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Tên gọi cây sả

Bảng 1.2.

Hàm lượng ci

Bảng 3.1. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước
sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : H 2O = 70 : 30 (v/v) 18

Bảng 3.2. Thông số pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml tại bước
sóng phát hiện 233 nm với hệ dung môi ACN : MeOH : H2O = 47 :
10 : 43 (v/v/v)
Bảng 3.3. Thông số các pic của dung dịch citral chuẩn nồng độ 25 µg/ml
trong điều kiện sắc ký được lựa chọn
Bảng 3.4. Thông số các pic của dung dịch citral 20
geraniol 5 µg/ml tại bước sóng phát hiện
Bảng 3.5. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch
và diện tích pic của đồng phân neral
Bảng 3.6. Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch
và diện tích pic của đồng phân geranial
Bảng 3.7. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân neral
Bảng 3.8. Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi của đồng phân geranial
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với đồng phân
geranial
Bảng 3.10. Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với

đồng phân neral
Bảng 3.11. So sánh một số phương pháp định lượng citral
Bảng 4.1. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với neral
Bảng 4.2. Các yêu cầu đảm bảo quy trình định lượng đối với geranial



MỞ ĐẦU
Sả chanh (Cymbopogon citratus) còn được gọi là cỏ sả, lá sả, hương
mao, thuộc họ Lúa có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới. Cây cao khoảng 1,5 m
sống lâu năm mọc thành bụi, phân nhánh nhiều. Sả không những được sử
dụng làm gia vị trong chế biến các món ăn mà còn được sử dụng ở nhiều nước
trên thế giới [16]. Tại Việt Nam, cây sả chanh dễ trồng, thích hợp với nhiều
loại đất ở các vùng trung du, miền núi và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Tinh dầu sả chanh được các nhà khoa học quan tâm bởi khả năng ức
chế hoạt động sống của một số nhóm vi sinh vật gây bệnh và hoạt tính dược lý
của nó. Priyanka Singh và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu sả
chanh đến sự phát triển và khả năng sản sinh độc tố của Aspergillus flavus.
Kết quả cho thấy tinh dầu sả chanh ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm
mốc A. flavus [38] và ức chế sự hình thành của các biofilm gây nên bởi
Candida albicans, Listeria monocytogenes (biofilm là nguyên nhân chính gây
nhiễm khuẩn trong công nghiệp sản xuất thực phẩm bởi chúng rất khó bị loại
trừ trong quá trình vệ sinh hệ thống trang thiết bị) [21,27]. Một số công trình
nghiên cứu về thành phần tinh dầu sả chanh (Cymbopogon citratus) cho thấy
thành phần chính của tinh dầu sả chanh là citral, bao gồm hai đồng phân
geranial (citral-A) và neral (citral-B) [6].
Tại Việt Nam, tinh dầu sả chanh khá phổ biến trên thị trường nhưng
chất lượng chưa được kiểm soát chặt chẽ. Nhằm kiểm soát chất lượng của tinh
dầu sả chanh, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình định lượng citral trong
tinh dầu sả chanh bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò

dãy diod theo hướng dẫn của Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng
ký dược phẩm sử dụng cho con người (International conference on
Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals
for Human use) và ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng citral trong
một số sản phẩm thương mại.

1


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây sả chanh
Cây sả chanh tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Poaceae,
là một loại thảo dược ở vùng nhiệt đới và có nguồn gốc từ Ấn Độ và Sri
Lanka [32]. Loài cây này được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới với nhiều
tên gọi khác nhau (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Tên gọi cây sả chanh tại một số nước [45]


Cây được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và thích hợp
với khí hậu ẩm ướt trong điều kiện đầy đủ ánh nắng mặt trời. Trong điều kiện
được hỗ trợ, cây sẽ chịu đựng được các loại khí hậu khác. Tuy nhiên, ở khu
vực ôn đới, cây không sống được vào mùa đông vì rễ bị đóng băng [49]. Loại
cây nhiệt đới này phát triển nhanh thành cụm dày đặc, có thể đạt chiều cao
180 cm và chiều rộng khoảng 120 cm. Lá rộng khoảng 3 cm, dài khoảng 90
cm, đầu lá nhọn rủ xuống và có màu xanh hơi sáng [50]. Cây sả chanh có lẽ
được biết đến nhiều nhất vì sự xuất hiện trong ẩm thực Thái Lan và Việt Nam.
Sả chanh cũng được sử dụng trong các loại trà thảo dược và đồ uống không
cồn khác, trong các món nướng và trong bánh kẹo. Sả chanh từ lâu đã được sử
dụng trong y học cổ truyền Ấn Độ như một loại thuốc để hạ sốt, làm giảm
hơi trong đường tiêu hóa, chống nhiễm trùng và chống côn trùng rất hiệu

quả [39]. Tinh dầu chiết xuất từ sả chanh được sử dụng rộng rãi như một
hương thơm trong nước hoa và mỹ phẩm vì có đặc tính khử mùi tốt. Trong
liệu pháp mùi hương, tinh dầu sả chanh được sử dụng như một chất chống
trầm cảm, làm dịu cơn đau nhức và giảm căng thẳng [39].
ợ


3


Tinh dầu sả chanh có thành phần chính là citral. Chất lượng của tinh
dầu sả chanh được xác định bởi hàm lượng citral, mùi thơm của tinh dầu sả
chanh do thành phần aldehyd quyết định [34]. Trong tinh dầu sả chanh, đồng
phân trans geranial (40 đến 62%) chiếm ưu thế so với đồng phân cis neral (25
đến 38%) [37].
1.2. Giới thiệu chung về citral
1.2.1. Nguồn gốc
Citral là thành phần chính của một số loại tinh dầu (bảng 1.2) [15,25,30].
Bảng 1.2. Hàm lượng citral trong một số loại tinh dầu

Citral là một aldehyd có công thức C 10H16O được phân lập lần đầu tiên
bởi Bertram [8] từ tinh dầu Backhousia citriodora. Năm 1890, Dodge phân
lập được citral từ tinh dầu sả chanh [12]. Sau đó, Tiemann và các cộng sự [23]
phân lập được đồng thời hai đồng phân geranial (citral A) và neral (citral B)
4


của citral. Citral A dễ dàng tách khỏi citral B bằng phương pháp bisulphate
natri được đề xuất bởi Tiemann [44].
1.2.2. Cấu trúc và tính chất

Citral có danh pháp quốc tế là 3,7-dimethyl-2,6-octadienal, khối lượng
mol phân tử là 152,237 g/mol. Citral có số CAS là 5392-40-5, mã Pubchem là
638011 [51].
Citral là một chất lỏng màu vàng nhạt, có mùi chanh mạnh. Citral hòa
tan trong nước rất kém (độ hòa tan trong nước là 0,059 g/100ml ở 25 0C); hòa
tan được trong rượu (độ hòa tan trong rượu là 1 ml trong 7ml cồn 70%); đồng
tan trong benzen benzoat, diethyl phthalate, glycerin, propylene glycol, dầu
khoáng, dầu cố định và cồn 95%. Citral có khối lượng riêng 0.9 g/cm³ và
nhiệt độ sôi ở 229 °C (502 K; 444 °F) [51].
Citral là hỗn hợp của hai đồng phần hình học monoterpene aldehyd có
cùng công thức phân tử là C 10H16O. Hai đồng phân này có tên gọi lần lượt là
neral (Cis hay Z) và geranial (Trans hay E) cùng thể hiện tính chất vật lí gần
giống nhau.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Neral (A) và Geranial (B)
1.2.3. Công dụng
Geranial có mùi chanh mạnh. Mùi chanh của neral ít nồng hơn, nhưng
ngọt hơn. Do đó Citral là một hợp chất hương thơm được sử dụng trong nước
hoa để tạo mùi hương của họ cam quýt. Citral cũng được sử dụng như một
hương liệu và làm tăng thêm mùi hương của tinh dầu sả chanh.
Citral cho thấy hoạt động kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn
Gram dương và Gram âm cũng như nấm do tinh dầu có tính chất kỵ nước, có
thể tấn công và phá vỡ màng tế bào, gây ảnh hưởng đến hệ thống enzym dẫn
đến ức chế hô hấp và gây chết tế bào. Do đó, citral được sử dụng như một
5


chất bảo quản trong các ngành công nghiệp thực phẩm, xà phòng và mỹ phẩm
[30].
Mặc dù citral trong tinh dầu sả chanh có khả năng xua đuổi côn trùng,

tuy nhiên tinh dầu sả chanh lại có tác dụng hấp dẫn và được sử dụng như "mồi
nhử" để thu hút ong mật. Vì một trong những chất pheromone từ ong chúa tiết
ra giống như mùi của tinh dầu sả chanh. Do đó trong kỹ thuật nuôi ong mật
người ta dùng tinh dầu sả chanh như chất gọi đàn khi đàn ong mới được
chuyển vùng [24,33].
Citral còn được dùng để tổng hợp vitamin A, ionone và methylionone.
Citral đã được thử nghiệm lâm sàng rộng rãi, không gây biến đổi gen
hay gây ung thư [40].
1.2.4. Các phương pháp định lượng citral
Phương pháp chuẩn độ (theo dược điển Anh)
Tiến hành lấy 25 mẫu tinh dầu sả chanh nguyên chất và trộn mỗi mẫu
với ethanol tuyệt đối. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trên dung dịch
hydroxylamine hydrochloride và dung dịch xanh promophenol. Thêm axit
clohydric, hiệu chỉnh lượng axit clohydric theo phản ứng của hydroxylamine
với citral. Axit clohydric đã phản ứng được chuẩn độ từ từ với dung dịch kali
hydroxit etanolic chuẩn cho đến khi màu 19 chuyển từ màu vàng sang màu
xanh ô liu. Hàm lượng citral được tìm thấy trong mẫu tinh dầu sả chanh là
69,89-76,95%.
Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại
Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được Wilson và các cộng sự
xây dựng để xác định hàm lượng citral trong tinh dầu sả chanh vào năm 2002
Phương pháp quang phổ cận hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ bức xạ
điện tử ở các bước sóng trong phạm vi 750 – 2500 nm: Khi có một chùm ánh
sáng tới chiếu qua các mẫu, vùng ánh sáng cận hồng ngoại (bước sóng 750 –
2500 nm) được các liên kết C-H, N-H, O-H có trong các chất hữu cơ hấp phụ.
Ghi nhận phổ ánh sáng phản xạ từ các mẫu sẽ thu được các thông tin về thành
phần hóa học của mẫu đó. Phổ thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm
[17].

6

máy tính. Áp dụng mô hình thống kê nhiều biến sẽ mô tả được mối quan hệ
giữa phổ hấp phụ và thành phần hóa học; mối quan hệ này là cơ sở để xác
định thành phần hóa học tại các máy phân tích (máy NIR) [46].
Các tác giả tiến hành lấy 26 mẫu tinh dầu sả chanh và quét phổ trong
khoảng 1100-2500 nm trên máy Foss NIR- System 6500 Rapid Content
Sample. Mỗi mẫu thu lấy 3 phổ (mỗi phổ là trung bình của 32 lần quét).
Quang phổ sau đó được tính trung bình bằng phần mềm NSAS phiên bản 3.52.
Kết quả thu được hàm lượng citral trung bình trong mẫu tinh dầu sả chanh là
75,77% (w/w) có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của độ chính xác trung gian
là 1,00% và RSD của độ đúng là 0,23% [46].
Tham chiếu với phương pháp định lượng citral trong tinh dầu sả chanh
quy định trong Dược điển Anh, phương pháp NIR có độ chính xác tương
đương. Tuy nhiên, phương pháp NIR có ưu điểm hơn so với phương pháp của
Dược điển Anh là thực hiện đơn giản hơn, không cần xử lý mẫu và thời gian
định lượng nhanh hơn [46].
Phương pháp sắc ký khí
Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định
lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong mẫu tinh dầu sả
chanh. Phân tích được thực hiện trên máy Agilent technologies 5975 Inert
Mass Selective Detector GC–MS. Sử dụng cột sắc ký HP-5MS với chiều dài
30 mm, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25 µm. Heli
được sử dụng làm khí mang với tốc độ dòng 1ml/phút. Nhiệt độ buồng bơm
mẫu 250oC. Nhiệt độ bộ phận phát hiện 260oC. Chương trình nhiệt độ buồng
điều nhiệt: duy trình nhiệt độ 75 oC trong 2 phút, tăng 4oC/phút cho đến
250oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút. Kết quả thu được hàm lượng citral
trong mẫu tinh dầu sả chanh là 72,57%.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự

phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích
7


sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân
tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các chất không bền với
nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký [3,11,22,29].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận
Phương pháp được Rauber và các cộng sự [50] xây dựng để xác định
hàm lượng citral có trong tinh dầu sả chanh. Phân tích sử dụng pha động là nhexane : ethanol (85:15, v/v) với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, ghép với đầu dò
UV được cài đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Phương pháp sử
dụng cột pha thuận CN. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thời gian lưu của citral
là 13,8 phút. Trong khoảng nồng độ tiến hành có sự tương quan chặt chẽ với
độ lệch chuẩn se slopes là 1,78 và hệ số xác định R 2 = 0,9991. Phương pháp
đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục
hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤ 1,37%.
Ứng dụng phương pháp trên, xác định được hàm lượng citral trong mẫu
tinh dầu sả chanh là 75,20%.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
Phương pháp được Gaonkar và các cộng sự [49] xây dựng để định
lượng đồng thời 2 đồng phân hình học của citral có trong một số mẫu tinh dầu.
Phân tích sử dụng cột silicagel pha đảo Enable C - 18G (250 × 4,6 mm, 5 µ),
pha động là acetonitril : nước (70: 30, v/v) với tốc độ dòng 1 ml/phút; ghép
với đầu dò DAD được đặt ở bước sóng 233nm để phát hiện citral. Nhiệt độ cột
22oC, đầu dò có nhiệt độ 40oC và độ rộng khe 1,2 nm. Kết quả thực nghiệm
cho thấy, thời gian lưu của neral và geranial tương ứng là 7,246 phút và 7,680
phút. Trong khoảng nồng độ citral từ 3 – 100 µg/ml, có sự tương quan tuyến
tính chặt chẽ giữa diện tích pic y (mAU.min) và nồng độ dung dịch x (µg/ml)

theo phương trình đối với đồng phân neral là y = 230540x – 100165 (hệ số xác
định R2 = 0,9996), phương trình đối với đồng phân geranial là y = 260014x +
23521 (hệ số xác định R2 = 0,9964). Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ) đối với đồng phân neral lần lượt là 0,062 µg/ml và 0,205
µg/ml, đối với đồng phân geranial lần lượt là 0,059 µg/ml và 0,198 µg/ml.
Phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu với citral, có độ
8


đúng và độ chính xác tốt với tỷ lệ phục hồi ≤ 100 ± 2%, RSD của độ lặp lại ≤
1,74%, RSD của độ chính xác trung gian ≤ 1,93%.
Ứng dụng phương pháp để định lượng citral có trong tinh dầu của cây
sả chanh, tinh dầu lá chanh ta và tinh dầu vỏ quả chanh tây. Kết quả xác định
được hàm lượng citral trong mẫu tinh dầu sả chanh là 74,98%, trong mẫu tinh
dầu lá chanh ta là 2.09% và trong mẫu tinh dầu từ vỏ quả chanh tây là 0,3%.
1.3. Thẩm định quy trình phân tích
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương
pháp”(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH
(International conference on Harmonisation of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human use) ban hành vào tháng 11 năm
2005 [43], các yếu tố của một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định
gồm: độ đúng, độ chính xác, tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị.
LOD và LOQ là các thông số không bắt buộc phải có trong quy trình thẩm
định.
1.3.1. Tính đặc hiệu
Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu:
Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có
nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
-

ý

Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong
khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [1,2,14,43].
-

Phương pháp xác định
Trong phương pháp HPLC với đầu dò DAD hoặc khối phổ, việc sử
dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với các
hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh sắc ký không phải là pic của hai
thành phần trở lên.
Khi chế phẩm chưa xác định có sản phẩm phân huỷ hay không thì tự
tạo ra mẫu có sản phẩm phân huỷ và so sánh với một mẫu không có sản phẩm
phân huỷ.

9


1.3.2. Miền giá trị
Khái niệm
Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và
nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ
nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính
chất tuyến tính của phương pháp [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
-

Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất

định.

Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ
tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không.
-

Yêu cầu
Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của
miền giá trị là phải đạt 80% - 120% nồng độ của mẫu thử [1,2,14,43].
1.3.3. Tính tuyến tính
Khái niệm
Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của
đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).
Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với
hệ số tương quan tuyến tính R2 [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
-

Khảo sát ở ít nhất 5 [43] hoặc 6 [14] mức nồng độ khác nhau.

Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của
phương pháp.
Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.
-

Đánh giá tính tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp:
trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra
tính thích hợp của phương trình.
10
-

Yêu cầu
Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1 [1, 2].
1.3.4. Giới hạn phát hiện
Khái niệm
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của
chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác
định chính xác hàm lượng [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định
bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ
nhỏ nhất nào đó còn có thể phát hiện bằng quy trình phân tích đang thực hiện.
-

Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: Áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng
độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 - 3.
Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
-

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng
SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
dựa vào đường chuẩn định lượng.
1.3.5. Giới hạn định lượng
Khái niệm
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp
nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ
chính xác phù hợp [1,2,14,43].

11


Phương pháp xác định
Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ
chính xác: giới hạn phát hiện được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm
lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng
quy trình phân tích đang thẩm định vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác
chấp nhận.
-

Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương
pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu
thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng
độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10.
- Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc:
-

Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn
độ SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng.
SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc
dựa vào đường cong chuẩn độ.
1.3.6. Độ đúng
Khái niệm
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị
tìm thấy so với giá trị thực, khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng với một
mẫu thử dã được làm đồng nhất trong cùng một điều kiện xác định
[1,2,10,42].
Phương pháp xác định

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần
mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3
lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau).
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo
công thức sau:
12


Tỉ lệ phục hồi = µ × 100%
Trong đó:

là giá trị mẫu đo được
µ là giá trị mẫu theo lý thuyết.

Yêu cầu
Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý
mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi
thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [1,2]. Tỷ lệ phục hồi càng gần
giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao.
1.3.7. Độ chính xác
Khái niệm
Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử
riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất
cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [1,2,14,43].
Phương pháp xác định
Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá
trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định
lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%.
Độ chính xác trung gian: tuỳ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. Phân
tích nhiều lần, nhiều mẫu với các yếu tố như thời gian, địa điểm, hệ thống

máy thay đổi.
Yêu cầu
Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu
phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên
dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở
giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD
càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [1,2].

13


CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị
2.1.1. Dung môi, hoá chất
Chất chuẩn citral tinh khiết 96% có tỷ lệ neral : geranial là 50:50, chất
chuẩn geraniol tinh khiết 98%, methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) đạt tiêu
chuẩn HPLC, kali hydroxit (KOH) được mua từ nhà sản xuất Merck KGaA,
Đức. Nước được tinh chế bằng thiết bị Thermo Scientific GenPure UV-TOC
đạt điện trở suất 18,2 M Ω.m. Các mẫu tinh dầu: Caroline (mẫu A), Julyhouse
(mẫu B), Ngọc Tuyết (mẫu C) mua từ trang thương mại điện tử Tiki.vn.
2.1.2. Trang thiết bị
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Model Ultimate 3000 –
Dionex, Thermo Scientific Hoa Kỳ ghép thiết bị phát hiện đa sóng DAD 3000 Dionex. Cột silica gel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250mm, 5µm).
Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang
bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478.
Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC - 150H, MRC Ltd, Isareal. Cân
phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản. Pipetman Finnpipette F3, Thermo
Scientific, Hoa Kỳ,…
2.2. Phương pháp nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu, mỗi mẫu được phân tích 3 lần, lấy giá trị
trung bình . Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Exel.
2.2.1. Tối ưu hoá điều kiện sắc ký
Tiến hành sắc ký dung dịch citral chuẩn, sử dụng cột silica gel pha đảo
C18 (5 µm, 120 Å, 4,6×250 nm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10
µl, thời gian sắc ký 25 phút. Quét phổ hấp thụ trong khoảng 190-300 nm để
tìm bước sóng hấp thụ cực đại. Khảo sát các pha động khác nhau, xác định
14