Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym ache của sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem ) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên thực nghiệm

ĐẠI

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax

stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

LƯU THỊ HUYỀN TRANG

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA
VÀ ỨC CHẾ ENZYM AChE CỦA SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG (Panax
stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Dương Thị Ly Hương
2. PGS. TS. Bùi Thanh Tùng

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y
Dược, ĐHQGHN, Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điếu ki ện giúp
em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy
cô đã giảng dạy và giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5
năm qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Dương Thị Ly Hương
và PGS. TS. Bùi Thanh Tùng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo
điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến
các thầy cô bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã giúp đỡ em trong quá trình
hoàn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải
pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm
từ 2 loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã
số KHCN-TB.07C/13-18 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung
nghiên cứu này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người
thân đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi
những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của thầy cô

để khóa lu ận được thêm hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Lưu Thị Huyền Trang


Ký hiệu
ABTS
ACh
AChE
ATCI
DMSO
DPPH
DTNB
IC50

MeOH
ROS
RNS


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 2.1

Hình 2.2

Hình 2.3

Hình 2.4

Hình 3.1

Hình 3.2

Hình 3.3


DANH MỤC BẢNG
STT
Bảng 1.1
Bảng 3.1
Bảng 3.2

Bảng 3.3

Bảng 3.4

Bảng 3.5

Bảng 3.6

Bảng 3.7


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1. Tổng quan về chi Panax L.......................................................................3
1.1.1. Vị trí phân loại...................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L.......................................3
1.1.3. Phân bố.............................................................................................. 3
1.1.4. Thành phần hóa học chính của chi Panax L......................................4
1.1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L....................... 4
1.1.6. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam
thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)..............................................5
1.2. Tổng quan về gốc tự do........................................................................... 8
1.2.1. Khái niệm.......................................................................................... 8
1.2.2. Các ROS và RNS...............................................................................8
1.2.3. Stress oxy hóa....................................................................................9
1.2.4. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa..................10
1.3. Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan..................................11
1.3.1. Acetylcholin....................................................................................11
1.3.2.

Enzym Acetylcholinesterase...........................................................12

1.3.3. Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với
bệnh Alzheimer............................................................................................ 13
1.3.4. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro........................................14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........18
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 18
2.2. Dung môi, hóa chất................................................................................20

2.3. Máy móc, dụng cụ..................................................................................20
2.4. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 20
2.4.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp và Tam
thất hoang.....................................................................................................20
2.4.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ diệp và
Tam thất hoang.............................................................................................22
2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu............................................................... 24
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................. 26
3.1. Kết quả thực nghiệm..............................................................................26
3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của Sâm vũ diệp
và Tam thất hoang……………....................................................................26
3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang................................................................................ 29
3.2. Bàn luận.................................................................................................31
3.2.1. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang................................................................................ 31
3.2.2. Bàn luận kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của
Sâm vũ diệp và Tam th ất hoang..................................................................34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.......................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ
Gốc tự do là một thuật ngữ đã trở lên quen thuộc với giới y khoa và
ngày càng được quan tâm và nghiên cứu nhiều hơn. Bởi gốc tự do có nhiều
tác hại với sức khỏe của con người. Nó là nguồn gốc của sự lão hóa và hơn
bệnh tật nguy hiểm, bao gồm các bệnh về não, mắt, da, hệ miễn dịch, tim,
mạch máu, phổi, thận, đa cơ quan và khớp. Đồng thời, gốc tự do còn là
nguyên nhân gây ung thư [22]. Sau khi lấy đi điện tử, gốc tự do làm tổn
thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và các

acid béo, dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào. Số
lượng gốc tự do tích lũy theo tuổi và tác hại ngày càng nghiêm trọng [1].
100

Gốc tự do tác động tới tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thể, trong đó
có các tế bào thần kinh. Gốc tự do là nguyên nhân gây ra các bệnh thoái hóa
tế bào thần kinh và bệnh lý mạch máu não [1, 20]. Một trong những bệnh
thoái hóa tế bào thần kinh được quan tâm là bệnh Alzheimer.
Thống kê ở châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh
Alzheimer, con số này được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới
62,8 triệu người. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà
dạng bệnh điển hình là Alzheimer [3]. Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ làm giảm
khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy
nhận thức, hành động… ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng
cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và cộng đồng xã
hội. Các nhà khoa học đã đưa ra các nguyên nhân để giải thích cho bệnh
Alzheimer. Trong đó, giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền
đạt thần kinh bằng Acetylcholin (cholinergic) [21]. Bệnh Alzheimer là do
giảm t ổng hợp của Acetylcholine (ACh) (một chất dẫn truyền thần kinh).
Trong thực hành lâm sàng, các thuốc được dùng cho bệnh Alzheimer ức chế
enzym Acetylcholinesterase duy trì được nồng độ của ACh bằng cách giảm
tốc độ phân hủy ACh.
Chi Panax L. gồm nhiều loài cây thuốc quý như Nhâm sâm (Panax
ginseng), tam thất (Panax notoginseng) đã được sử dụng từ lâu đời. Các loài
thuộc chi Panax L. có thành phần hóa học chính là saponin. Đây là hợp chất

1


cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Trong đó, tác dụng bảo vệ tế bào thần

kinh của dịch chiết saponin từ các loài thuộc chi Panax ngày càng được quan
tâm nghiên cứu nhiều. Theo nghiên cứu của Cheng et al. (2005), các
ginsenosid Rg1, Rb1 giúp tăng độ bền các tế bào thần kinh [45]. Nghiên cứu
của Cheng et al. (2016) cho thấy Nhân sâm và Ginsenosid Rg1, Rg3 và Re
giảm Aβ trong não động vật [45]. Ngoài ra, trong nghiên cứu của Zhong, Z. et
al. (2005), Saponin trong Tam thất giúp tăng nồng độ và hoạt tính của Cholin
acetyltransferase, do đó giúp bảo vệ và cải thiện hệ thần kinh cholinergic [52].
Saponin cho tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh theo nhiều cơ chế khác nhau,
một trong số các cơ chế liên quan đến khả năng chống oxy hóa của hợp chất
saponin [45].
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhân
sâm (Araliaceae), phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc. Trong dân gian, 2 loài
được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm máu, giảm đau… Tuy nhiên,
các nghiên cứu về tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế. Qua các
nghiên cứu của Liang, Chun, et al. (2010) và Nguyễn Hữu Tùng, et al. (2011)
về thành phần hóa học của 2 loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang cho thấy
saponin khung drammaran và oleanan chiếm tỷ lệ cao trong rễ và lá. Với tỷ lệ
hàm lượng saponin cao trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang, liệu 2 loài này
có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh trong bệnh
Alzheimer không? Tôi đã thực hiện đề tài: “Bước đầu đánh giá tác dụng
chống oxy hóa và ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ diệp và
Tam thất hoang trên thực nghiệm” với mục tiêu:
1.

Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của Sâm vũ diệp và Tam thất
hoang trên in vitro.

2.

Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase của Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang trên in vitro.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Panax L.
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987), chi Panax L.
có vị trí phân loại như sau:
Giới Thực vật (Planta)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Hoa tán (Apiales )
Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae)
Chi Panax L.
Tuy nhiên, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về thực vật
của các loài thuộc chi Panax L..
1.1.2. Đặc điểm hình thái chung của chi Panax L.
Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Thân rễ ngắn hoặc thon dài,
phân nhánh. Các loài khác nhau của chi Panax L. có sự khác nhau về độ bền
của rễ (rễ các loài P. japonicus C. A. Mayer, P. vietnamensis Ha & Grushv., và
P. wangianus S. C. Sun dễ bị thủy phân hơn) và hình dạng của rễ. Lá kép chân
vịt, mọc vòng t ừ 3 – 5 lá, mép lá có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm
hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới. Hoa có 5 lá đài hàn liền
dưới, tràng 5, nhị 5. B ầu 2-3 có khi đến 5 ô. Quả mọng, hình cầu có khi hơi
dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [41].
1.1.3. Phân bố

ở

Trên thế giới, theo trang The plant list, đã có 261 loài đã được định
danh. Trong đó, có 13 tên khoa học đã được chấp thuận, 235 tên đồng nghĩa
và 13 tên loài chưa xác định chính xác thông tin. Có 2 loài phân bố ở Đông
Bắc M ỹ Seemann 1868; Burkill 1902; Graham 1966; Proctor and Bailey
1987). Các loài khác phân bố ở châu Á (Burkill 1902; Hara 1970; Wen and
Zimmer 1996). Ở châu Á, vùng Đông Nam Trung Quốc và phía Đông của dãy
Himalaya là nơi phân bố của nhiều loài khác nhau thuộc chi Panax L. (Burkill
1902; Hara 1970; Hu 1976; Wen and Zimmer 1996) [32].

3


1.1.4. Thành phần hóa học chính của chi Panax L.
Các hợp chất saponin hay còn được biết đến là các ginsenoside là thành
phần chính cho tác dụng sinh học trong các loài thuộc chi Panax L. Ngoài ra,
nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp như các acid hữu cơ, ester, các
polysaccarit, các amino acid, các sterol, flavonoid và các carben… cũng đã
được tìm thấy trong các loài thực vật thuộc chi Panax L.
1.1.4.1. Hợp chất saponin
Hợp chất saponin hay ginsenosid là oligosaccarit của triterpenoid
khung dammaran hoặc oleanan. Các nhà khoa học đã phân lập và xác định
cấu trúc của ít nhất 289 saponin khác nhau. D ựa vào cấu trúc của các
sapogenin, các ginsenosid đã biết có thể được phân loại thành 6 nhóm khác
nhau: saponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của
protopanaxatriol, saponin dẫn chất của octillol, saponin dẫn chất của acid
oleanolic, saponin có chuỗi bên C17 biến đổi và các saponin khác. Trong đó,
sponin dẫn chất của protopanaxadiol, saponin dẫn chất của protopanaxatriol,
saponin dẫn chất của octillol và saponin dẫn chất của acid oleanolic là phổ

biến nhất. [49]
1.1.4.2. Hợp chất polyacetylen
Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon.
1.1.5. Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Panax L
1.1.5.1. Nhâm sâm (Panax ginseng C.A. Mey)
Nhâm sâm là một trong những vị thuốc quý, được sử dụng với nhiều tác
dụng khác nhau, trong đó cho tác dụng chính là điều trị các bệnh tinh thần và
mệt mỏi. Ngoài ra, nhân sâm cũng đã được nghiên cứu và cho thấy có nhiều tác
dụ ng khác nhau. Thành phần chính saponin trong Nhâm sâm có tác dụng chống
oxy hóa, chống viêm, chống ung thư; giúp cải thiện chức năng của h ệ tim mạch,
hạ cholesterol và lipid máu; và chống kết tập tiểu cầu. [29] 1.1.5.2. Tam thất
(Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen) (Sanchi ginseng)

Tam thất cũng cho nhiều tác dụng sinh học khác nhau. Dịch chiết
saponin của Tam thất có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh trung ương và hệ tim
mạch. Thành phần saponin trong dược liệu cũng cho thấy tác dụng hạ đường

4


huyết, kích thích hệ miễn dịch, chống khối u, chống viêm, giảm đau, chống
oxy hóa, chống huyết khối, phòng ngừa xơ vữa động mạch, giúp hạ huyết áp
và tăng hoạt động của tinh trùng. [40]
1.1.5.3. Sâm Mỹ ( Panax quinquefolius)
Các nghiên cứu cho thấy Sâm Mỹ có tác dụng kích thích hệ miễn dịch,
nhờ sự kích thích sản sinh tế bào lympho B, tăng (interleukin) IL-2, IL-10,
interferon- γ và làm tăng tế bào diệt tự nhiên (NK). Sâm Mỹ cũng có tác dụng
chống oxy hóa và tác dụng tốt trên hệ tim mạch, giúp làm giảm nhồi máu cơ
tim và sự chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào cơ tim. Tương tự
như Nhâm sâm, Sâm Mỹ cũng có tác dụng chống huyết khối và chống kết tập

tiểu cầu. Ngoài ra, loài này cũng cho tác dụng hạ đường huyết [39].
1.1.6. Tổng quan về Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam
thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng)
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus Tsai & Feng) là 2 loài thuộc chi Panax L., họ Nhâm sâm
(Araliaceae). Đây là 2 loài cây được tìm thấy mọc tự nhiên ở vùng núi phía bắc
Việt Nam, hiện nay đang được quan tâm phát triển trồng. Các nghiên cứu nhiều
cả về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của 2 loài này còn hạn chế.

Hình 1.1. Sâm vũ diệp – Panax bipinnatifidus Seem.

5


Hình 1.2. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
Về thành phần hóa học:
Theo các kết quả nghiên cứu, các saponin là thành phần chính của 2
loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang.
a. Sâm vũ diệp
Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc đã công bố phân lập được 13
saponin khung dammaran từ lá Sâm vũ diệp ở Trung Quốc, trong đó bao gồm
một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re
và Rb3 [50]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc đã phân lập
và xác định được cấu trúc củ a 10 saponin khung oleanan trong rễ của Sâm vũ
diệp trong dịch chiết methanol. Trong đó, xuất hiện 3 hợp chất mới là các
bifinoside A—C và 7 h ợp chất đã biết bao gồm narcissiflorine methyl ester,
chikusetsusaponin IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl ester, stipuleanosid R1,
pseudoginsenosid RT1 methyl ester, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl
ester. [46]
Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu (Trần Thanh Hà, Đỗ Thị Hà,

Nguyễ n Minh Khởi) đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của Sâm vũ
diệp và đã phân lập được một hỗn hợp saponin bao gồm stigmasterol-3-O-βD-glucopyranosid và β-sitosterol-3-O-βD-glucopyranosid, glycosphingolipid:
1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl)
heptacosanamid, dichaccarid: saccharose từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ
của Sâm vũ diệp. Ngoài ra, trong Sâm vũ diệp cũng có các hợp chất

6


triterpenoide, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và
những nguyên tố vi lượng [5, 6]. Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen được
nhận diện trong Sâm vũ diệp và Tam thất hoang [6].
b. Tam thất hoang
Kết quả nghiên cứu cho thấy phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều
saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với
hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm
lượng thấp. [34]
Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung
oleanan, stipuleanoside R1 và R2 từ dịch chiết methanol của rễ cây này [48].
Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại
học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung
dammaran bao gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ
dich chiết ethanol của Tam thất hoang đượ c thu hái ở Trung Quốc [53]. Năm
2010, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định được 15 hợp
chất saponin khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A
methyl ester, 3 hợp chất polyme, một sesquitecpen và một acid béo. [34]
Ngoài ra, Tam thất hoang cũng chứa các thành phần như triterpenoid, tinh
dầu, đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, các nguyên tố vi
lƣợng, và polyuronic [5, 6].
Về tác dụng dược lý:

Trong dân gian, 2 loài được sử dụng với công dụng là thuốc bổ, cầm
máu, giảm đau… Các hợp chất có hoạt tính sinh học được xác định có trong
Sâm vũ diệ p có thể giải thích một phần cho các tác dụng chống oxy hóa,
chống ung thư, chống mệt mỏi, chống bệnh tiểu đường, cải thiện chức năng
sinh s ản… của cây theo y học cổ truyền đã sử dụng. [29, 39, 40]
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Liang, Chun, et al. tiến hành đánh giá khả năng
ức chế khối u của các hợp chất saponin phân lập từ Tam thất hoang. Kết quả cho thấy các
hợp chất trong dịch chiết cho tác dụng chống khối u trên các dòng tế bào ung thư của người
HL-60 (bệnh bạch cầu ác tính) và HCT-116 (ung thư ruột kết) với các giá trị IC50 là khác
nhau của từng hợp chất [34]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá khả

7


năng ức chế NF – κB của các triterpenoid khung oleanan cho thấy một số hợp
chất có tác dụng ức chế phụ thuộc liều đến khả năng phiên mã của TNF – α có
ảnh bởi NF – kB. [35]
1.2. Tổng quan về gốc tự do
1.2.1. Khái niệm
Gốc tự do là trạng thái cấu trúc của phân tử có một điện tử lẻ ở quỹ đạo
điện tử ngoài cùng [31], trong khi các phân tử của hệ sinh học đều có số điện
tử chẵn ở lớp ngoài cùng [4, 20]. Vì vậy gốc tự do có đặc điểm là rất kém ổn
định, chúng sẵn sàng phản ứng với phân tử hoặc nguyên tử lân cận, cho đi
hoặc nhận thêm một điện tử để hoàn chỉnh quỹ đạo điện tử ngoài cùng của
mình. [4]
1.2.2. Các ROS và RNS
Các gốc tự do hay nói chính xác là các chất hoạt động chứa oxy
(Reactive Oxygen Species - ROS ) và các chất hoạt động chứa nito (Reactive
Nitrogen Species - RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nito phân tử.
Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không

phải là gốc tự do (tiền thân của các gốc tự do). [18] (Bảng 1.6)
Bảng 1.1. Các ch ấ t hoạt động chứa oxy và nito chính [18]

8


ROS được coi là một trong những nguyên nhân chính gây tổn thương
mô. Tuy nhiên, sự cân bằng giữa sự sản sinh ROS và hoạt động của hệ thống
chống oxy hóa trong cơ thể sống giúp duy trì sự phá hủy của quá trình oxy
hóa ở mức độ thấp. Khi sự mất cân bằng xảy ra nghiêm trọng, sản sinh nhiều
ROS sẽ gây ra stress oxy hóa. ROS là nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch,
tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, ung thư và rối loạn thần kinh [47].
Tương tự như ROS, RNS có vai trò kép, vừa cho tác dụng có lợi vừa có
thể gây hại cho hệ thống sống. Nitric oxid là chất được biết sớm nhất với vai
trò là phân tử làm giãn nở mạch máu, kiểm soát lượng máu lưu thông đến các
bộ phận của cơ thể. Đồng thời, nó có thể là trung gian gây độc tế bào do phá
hủy các enzym chuyển hóa bằng phán ứng với superoxid, peroxynitrit. [18]
Các ROS và RNS đươc tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi
chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động xấu, tốt đến cơ thể. [1,18]

nồng độ thấp, các ROS và các RNS là các tím hiệu làm nhiệm vụ: [1]
• Điều hòa phân ly tế bào
Ở

• Kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho
các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm.
•
Ở

Điều hòa biểu hi ệ n các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa.

nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây

nên: [1]
•

Đột biến ở DNA

•

Biến tính protein

•

Oxy hóa lipid

1.2.3. Stress oxy hóa
1.2.3.1. Khái niệm
Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa sự sản xuất các gốc tự do và khả
năng của cơ thể sống trong việc khử các chất trung gian hoạt tính cao hay sửa
chữa các hư hại do những chất này gây ra. Sự nhiễu loạn của trạng thái oxy
hóa khử của các mô có thể gây ra các ảnh hưởng độc hại thông qua sự sản

9


sinh của các peroxid và gốc tự do làm hư hại tất cả các thành phần của tế bào,
trong đó bao gồm protein, chất béo và DNA [13].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của stress oxy hóa
Stress oxy hóa là nguyên nhân quan trọng trong các bệnh gây thoái
triển thần kinh, bao gồm bệnh xơ cứng teo cơ một bên (Amyotrophic Lateral

Sclerosis - ALS) hay bệnh Lou Gehrig, bệnh Parkinson và bệnh Alzheimer
Sự sản xuất ROS, RNS liên quan đến con đường bệnh sinh của các bệnh
này. Sự tích lũy quá trình stress oxy hóa cùng với sự rối loạn quá trình hô hấp
của ty thể và sự phá hủy ty thể liên quan đến bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson
và các bệnh lý thần kinh khác. [44]
[30].

Stress oxy hóa cũng được cho là có liên quan đến một số bệnh tim
mạch, do sự oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein LDL) dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu nội mô, giai
đoạn đầu tiên của bệnh huyết áp cao và nhiều bệnh tim mạch khác [1]. Đồng
thời, stress oxy hóa cũng là nguyên nhân gây đột quỵ, nhồi máu cơ tim, bệnh
tiểu đường.
Ngoài ra, stress oxy hóa cũng tham gia vào quá trình phát triển bệnh
ung thư liên quan đến tuổi. Các chất hoạt động ROS và RNS gây stress oxy
hóa có thể phá hủy trực tiếp DNA, gây ra đột biến và có thể gây ngăn chặn
quá trình phân ly tế bào; từ đó thúc đẩy quá trình phát triển, xâm lấn và di căn
của tế bào khối u [20]. Nhiễm Helicobacter pylori làm tăng sự sản xuất của
ROS và RNS trong dạ dày của người, là nguyên nhân của sự phát triển ung
thư dạ dày. [23]
1.2.4. Một số phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa
1.2.4.1. Phương pháp quét gốc tự do DPPH
Phân tử 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (α, α-diphenyl-β picrylhydrazyl;
DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa. Khi cho
các chất thử nghiệm vào dung dịch này, nếu chất có khả năng quét các gốc tự do sẽ
có khả năng làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt
tính chống oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch
thử nghiệm so với đối chứng, khi đo ở bước sóng 517 nm. [11, 42]

10

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. So với các phương
pháp khác, phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp nhanh, đơn
giản và ít tốn kém hơn.
1.2.4.2. Phương pháp đánh giá sự khử màu của 2,2'-azino-bis(3ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)
Phương pháp đánh giá sự khử màu của ABTS được sử dụng để đánh
giá cả chất oxy hóa thân nước và chất oxy hóa thân dầu.
Phương pháp sử dụng quang phổ diod-array để đo sự mất màu khi thêm
một chất chống oxy hóa gốc có màu xanh lam ABTS· + (2,2-azino-bis (3ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)). ABTS· + là một gốc tự do ổn định
không tìm thấy trong cơ thể của người. Chất chống oxy hóa sẽ làm chuyển
ABTS· + thành ABTS và do đó làm mất màu. [11]
1.2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính quét gốc tự do hydroxyl
Hydroxyl là một chất hoạt động chứa oxy phản ứng mạnh trong hệ
thống sống. Nó phản ứng với các acid béo không bão hòa trên màng
phospholipid và do đó gây tổn thương tế bào. Khả năng quét gốc tự do
hydroxyl được đo bằng phương pháp của Kunchandy và Rao (1990). Hỗn hợp
phản ứng gồm 100 µl 2-deoxy-Dribose (28 mM trong 20 mM đệm KH 2PO4KOH, pH 7.4), 500 µl dịch chiết 200 μl EDTA (1.04 mM) và 200 μM FeCl 3
(1:1 v/v), 100 μl H2O2 (1.0 mM) và 100 μL ascorbic acid (1.0 mM), sau đó ủ
trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm vào hỗn hợp 1 ml acid thiobarbituric và 1
ml acid trichloroacetic (2,8%) sau đó ủ ở 100ºC trong 20 phút. Đo độ hấp thụ
quang của hỗn hợp cuối ở 532 nm. [11]
1.3. Tổng quan về Acetylcholin và bệnh lý liên quan
1.3.1. Acetylcholin
Acetylcholin (ACh) là chất dẫn truyền thần kinh có ở tất cả các hạch
thần kinh tự chủ và các cơ quan nội tạng được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự
chủ, ở các khớp nối thần kinh cơ và có ở nhiều các synap ở hệ thần kinh trung
ương. ACh là chất dẫn truyền thần kinh ở sợi tiền hạch của các tế bào thần
kinh giao cảm và phó giao cảm, đồng thời chất dẫn truyền thần kinh ở

11

tuyến thượng thận và ở các cơ quan được kiểm soát bởi hệ thần kinh tự chủ.
Tại hệ thần kinh trung ương, ACh được tìm thấy chủ yếu ở các tế bào thần
kinh liên lạc.
ACh đươcc̣ tổng hơpc̣ từ Cholin và Acetylcoezym A thông qua enzym
Cholin acetyltransferase, rồi bi đọọ́ng gói vào các túi màng bi ṛàng buôcc̣. Sau sư c̣
xuất hiêṇ của môṭtinọ́ hiêụ thần kinh ởđầu tận cùng của môṭsơị truc,c̣ các túi
màng hơpc̣ nhất với màng tếbào se ̃giải phóng ra ACh vào khe synap. Đối với
các tiọ́n hiêụ thần kinh đểđươcc̣ dâñ truyền đi tiếp tucc̣ thìACh phải khuyếch tán
sang môṭtếbào thần kinh hoăcc̣ tếbào cơ bắp ởgần ngay đó, nơi nóse ̃ràng buôcc̣
vàkiọ́ch hoaṭmôṭprotein thu c̣thể. Sau khi ACh được giải phóng, nó sẽ gắn vào
các thụ thể của ACh (thụ thể Nicotinic vàMuscarinic). [15]
Trong hê c̣thống thần kinh trung ương, ACh đóng vai trò quan trongc̣
trong viêcc̣ dâñ truyền các xung đôngc̣ thần kinh, đảm bảo cho các hoaṭđôngc̣ cao
cấp của vỏnaõ như các quátriǹ h nhâ ṇ thức, quátriǹ h trinọ́ hớ, chúý… Khi mức
nồng độ ACh giảm xuống thấp, không đủ để gây khử cực, tín hiệu thần kinh
sẽ không được truyền đi. Viv
̀ âỵ ACh cóliên quan chăṭche ̃với bênḥ Alzheimer.
1.3.2. Enzym Acetylcholinesterase
Enzym Acetylcholinesterase (AChE) hay acetylhydrolase, là
cholinesterase chính trong cơ thể. Nó là enzym xúc tác cho sự phân hủy của
acetylcholin và của một vài ester cholin khác có chức năng là các chất dẫn
truyền thần kinh. AChE được tìm thấy chủ yếu ở các khớp nối thần kinh cơ và
các khớp nối thần kinh của hệ cholinergic. [15]
Quá trình thủy phân của ACh diễn ra ở đáy hẻm, mặc dù sự kết hợp ban
đầu của enzym AChE diễn ra ở rìa ngoài, ở vùng ngoại biên. Ở vị trí trên cùng
của hẻm, nơi mà quá trình thủy phân xảy ra, có 4 vị trí hoạt động chính của
enzym, bao gồm vị trí ester hóa, hố oxyanion, vị trí anion và túi acyl. Các vị
trí hoạt động được minh họa như trên hình 1.3 [24].

12


Hình 1.3. Các vị trí gắn của enzym AChE [24]
1.3.3. Bệnh Alzheimer và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với
bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer là bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển phổ biến. Bệnh
Alzheimer liên quan đến việc mất các tế bào thần kinh cholinergic ở não và sự
giảm nồng độ của ACh [1]. Bệnh này thường xuất hiện ở người trên 65 tuổi
[3], tuy nhiên dạng Alzheimer sớm dù không phổ biến nhưng có thể xảy ra
sớm hơn rất nhiều. Năm 2006 có 26,6 triệu người mắc bệnh Alzheimer trên
toàn thế giới. Dự đoán tỉ lệ mắc Alzheimer trên thế giới sẽ là 1 trên 85 vào
năm 2050. [3]
Các nhà khoa học đã đưa ra một số nguyên nhân để giải thích cơ chế
bệnh Alzheimer. Giả thuyết cổ điển nhất là giả thuyết về hệ thống truyền đạt
thần kinh bằng ACh (cholinergic). Trong đó, bệnh Alzheimer được cho là do
giảm tổng hợp ACh. Các chất ức chế Cholinesterase sẽ làm tăng chức năng
của hệ cholinergic bởi nó ức chế enzym phân hủy ACh, do đó làm tăng nồng
độ của ACh, kích thích các receptor nicotinic và muscarinic trong não.

13


Trong thực hành lâm sàng, các chất ức chế ChE vẫn là được sử dụng
chính để điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer [20]. Các thuốc được
dùng cho bệnh Alzheimer ức chế AChE, giúp duy trì được nồng độ ACh bằng
cách giảm tốc độ phân hủy ACh.
Các loại thuốc hiện đang được các cơ quan quản lý: Cục Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu

(EMA) chấp thuận để điều trị các biểu hiện về nhận thức của bệnh Alzheimer
và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân gồm: donepezil, rivastigmine
và galantamine là thuốc ức chế AChE thuận nghịch; memantine là một chất
đối kháng thụ thể NMDA. Tacrine là chất ức chế AChE đầu tiên được chấp
thuận cho điều trị AD năm 1993, nhưng việc sử dụng nó đã bị bỏ vì có nhiều
tác dụng phụ bao gồm gan nhiễm độc gan. [15]
1.3.4. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro
Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có 2
phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B.
1.3.4.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây
dựng và ứng dụng sớm nhất. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng
khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng. Trong đó, phương pháp đo
quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp
này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB).
❖ Phương pháp đo quang
Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym
cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm
1961 [19]. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc
tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử

14


DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất
này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412
nm. Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế enzym AChE in

vitro khác tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được
công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau
đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử
dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của
chúng vào hỗn hợp phản ứng
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương
pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi
bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ
chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym.
Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền
vàng [10].
Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng là có thể
gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên
bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE. Để khắc phục hạn chế này,
bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác
(bản đối chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản
thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp
dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới
phun dung dịch AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được
phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE
được phun sau. Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết
màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả
[9].
1.3.4.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử
dụng phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn

15

chế. Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là
muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).
❖ Phương pháp đo quang
Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công
bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962. Nguyên tắc của
phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải
phóng chất α-naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast
Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách
đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó không có
nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng
ức chế AChE in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di
Giovanni S. [17]. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả
này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn
gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt enzym và nồng độ dung dịch
cơ chất.
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương
pháp sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym
AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này,
sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng.
Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc
thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE
sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm [17].
Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử
Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng thuốc thử muối Fast
Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Để loại trừ các vết
dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được
triển khai. Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun
lên bản mỏng mà không có dung dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì

vết đó là vết dương tính giả.

16


Ngoài việc sử dụng 2 phương pháp trên, để nghiên cứu sàng lọc tác
dụng ức chế AChE in vitro trong nghiên cứu, tác giả Tang Z. M. và cộng sự đã
sử dụng phương pháp điện di mao quản. Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên
cứu sử dụng phương pháp này được công bố. Lý do là phương pháp này đòi
hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp.
Ngoài ra, những hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao
tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản
trong nghiên cứu sàng lọc.

17