Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NÔNG MỸ HOA

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ
DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NÔNG MỸ HOA

XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ
DƯỢC LIỆU SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2014.Y
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Tùng

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, th ời
điểm hoàn thành luận văn là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân
thành của mình với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian qua.
Đầu tiên tôi xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y
Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc
đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành
cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ tôi hoàn thành
chương trình học tập suốt 5 năm qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và tri ân tới GVHD, TS Nguyễn Hữu
Tùng, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2014.Y đặc biệt là
các bạn Hà, Nhung, Thảo, Vân đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời
gian qua. Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thành viên trong nhóm
nghiên cứu của tôi chị Đặng Thị Ngần, Nguyễn Thị Thu Thủy người đã nhiệt
tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng các giải pháp
khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ
hai loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất
hoang (Panax stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCNTB.07C/13-18, 2015- 2017 (Chương trình Tây Bắc) của PGS.TS Dương Thị
Ly Hương chủ nhiệm đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện nội dung nghiên cứu
này.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã nuôi dạy, khích lệ và sát
cánh, giúp tôi có thêm động lực cố gắng để có kết quả như ngày hôm nay.
Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn!


Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm

2019
Sinh viên

Nông M ỹ Hoa


DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

SVD

Sâm vũ diệp

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace
chromatography)

UV

Ultra violete

FLD

Đầu dò huỳnh quang

DAD

Detector mảng điốt (Detector Diod Array)

Rf

Hệ số di chuyển

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

R2

Hệ số tương quan tuyến tính

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

liqui
d


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp

Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của các mẫu Sâm vũ diệp
Bảng 3.2. Kết quả xác định tro toàn phần của các mẫu Sâm vũ diệp
Bảng 3.3. Kết quả xác định độ tro không tan trong acid của các mẫu
Sâm vũ diệp
Bảng 3.4. Chương trình dung môi
Bảng 3.5. Tính thích hợp của hệ thống.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính củ a stipuleanosid R2
Bảng 3.7. Khảo sát độ thu hồi
Bảng 3.8. Hàm lượng stipuleanosid R2 trong các mẫu Sâm vũ diệp


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp
Hình 1.2. 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp
Hình 2.1. Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái
tại Sa Pa, Lào Cai
Hình 3.1. Vi phẫu thân rễ Sâm vũ diệp
Hình 3.2. Bột thân rễ Sâm vũ diệp
Hình 3.3. Sắc ký đồ TLC định tính dược liệu Sâm vũ diệp
Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử.
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của stipuleanosid R2.
Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của stipuleanosid R2 (A) và dược liệu
Sâm vũ diệp (B)


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN..........................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP..................................................3
1.1.1. Tên khoa học................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật......................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái.....................................................4
1.1.4. Thành phần hóa học.....................................................................5
1.1.5. Tác dụng dược lý...........................................................................8
1.1.6. Công dụng......................................................................................8
1.2. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU..........................8
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......11
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.......................................................11
2.1.1. Nguyên liệu..................................................................................11
2.1.2. Dung môi, hóa chất.....................................................................12
2.1.3. Máy móc, thiết bị........................................................................ 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................13
2.2.1. Mô tả............................................................................................ 13
2.2.2. Vi phẫu.........................................................................................13
2.2.3. Soi bột.......................................................................................... 13


2.2.4. Độ ẩm........................................................................................... 13
2.2.5. Tro toàn phần.............................................................................. 13
2.2.6. Tro không tan trong acid............................................................14
2.2.7. Tạp chất....................................................................................... 14
2.2.8. Định tính......................................................................................15
2.2.9. Định lượng...................................................................................16
3.1. Mô tả............................................................................................... 20
3.2. Vi phẫu............................................................................................20
3.3. Soi bột............................................................................................. 21

3.4. Độ ẩm.............................................................................................. 21
3.5. Tro toàn phần................................................................................. 22
3.6. Tro không tan trong acid...............................................................22
3.7. Định tính.........................................................................................23
3.8.Định lượng....................................................................................... 24
3.9. Bàn luận..........................................................................................32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KH ẢO
PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC
PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU SÂM VŨ
DIỆP


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm là dược liệu quý có giá trị cao được sử dụng trong nhi ề u bài thuốc

học cổ truyền. Hiện nay, nhiều loài trong chi Sâm (Panax), đặ c biệt là các
loài nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer), sâm Việt Nam (Panax
vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen
ex C.Y. Wu et K.M. Feng; syn.: P. pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax
japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia
(AcanthoPanax senticosus (Rupr. et Maxim.) Harms; syn.: Eleutherococcus
senticosus Maxim.)..., là những cây thuốc quý, được ưa chuộng, rất nổi tiếng
và có giá trị cao. Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một cây thuốc
quý đang được sử dụng trong các bài thuốc truyền thống và có tiềm năng để
phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe như các loài khác cùng chi
[2,14].
y

Ngày nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có

nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng kèm theo đó là sự làm hàng giả, hàng
nhái, hàng kém chất lượng cũng tăng theo. Điều này gây ảnh hưởng xấu đến
sức khỏe con người và gây mất lòng tin của người sử dụng đối với thuốc và
các sảm phẩm từ dược li ệu. Để có thể sử dụng dược liệu làm nguyên liệu làm
thuốc thì đòi hỏi cần phả i xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng, đồng thời xây
dựng các phương pháp thử để đánh giá các tiêu chuẩn đó. Do đó, chúng tôi
thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu Sâm vũ diệp
(Panax bipinnatifidus Seem.)”. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ
“Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên
liệu và tạ o sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus
Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” của
Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
Mục tiêu đề tài: xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dược liệu Sâm vũ diệp.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài thực hiện với các nội dung sau:

1


Khảo sát đưa ra các tiêu chí của dược liệu SVD theo tiêu chuẩn chế
biến dược liệu thân rễ quy định trong DĐVN V.
2. Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở dược liệu SVD.
1.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP
1.1.1. Tên khoa học
SVD có tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem., h ọ Nhân sâm

(Araliaceae) [1,3].
SVD còn có tên gọi khác là Tam thất xẻ lá, Vũ diệp tam thất, Trúc tiết
nhân sâm, Ngật đáp thất [1,3].
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Là cây thảo sống nhiều năm, cao 0,3 – 0,5 m. Thân rễ mập, phân nhánh,
nằm ngang và thường nổi trên mặt đất; rễ củ dài, nhiều đốt và mang nhiều vết
sẹo do thân tàn lụi để lại, đầu rễ có hình con quay [1,15]. Thân mảnh, thường
đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọ c [1], đường kính thân từ 0,3 - 0,6
cm [3]. Lá kép chân vịt, mọc vòng ở ngọn, thường gồm 2 - 3 cái [3]. Lá kép
có 3 - 7 lá chét, thuôn dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn
thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông [1].

Hình 1.1. Hình ảnh Sâm vũ diệp [15]
3


Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 - 10 cm, mang từ 20 hoa; cuống hoa mảnh, dài 1 - 1,5 cm. Hoa màu trắng lục, 5 lá dài nh ỏ , 5
cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 - 3 ô, đầu vỏ nhụy chẻ đôi. Quả mọng, hình cầu hơi dẹt,
90

đường kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ, có chấm đen to ở đầu. Chứa 2 - 3
hạt, hình cầu, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt [1,3].
1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái
SVD đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác dưới tán rừng kín thường
xanh núi cao, ở độ cao từ 1600 – 2300 m [3]. SVD sinh trưởng và phát triển
mạnh trong mùa mưa ẩm. Hàng năm vào cuối tháng 2 đầu tháng 3, từ phần
đầu mầm thân rễ phân nhánh ngang nằm sát mặt đất sẽ mọc lên một hoặc vài
chồi thân (tùy thuộc vào số đầu mầm thân rễ phân nhánh). Chồi này sinh
trưởng nhanh trong vòng một tháng đã ra lá và gần đạt được chiều cao cực
đại. Đến tháng 4, mỗi thân mang lá có th ể cho ra một cụm hoa. Quả xanh

quan sát được vào cuối tháng 4 – 6, đến tháng 7 quả đã chín và rụng xuống
xung quanh gốc cây mẹ. Do quả chín đúng vào thời kì có lượng mưa lớn
tháng 7 – 8 nên hạt giống thường bị cuốn trôi, ảnh hưởng đến khả năng tái
sinh tự nhiên của SVD. Sau khi quả chín, từ tháng 9 đến tháng 10, toàn bộ
phần thân trên mặt đất tàn l ụi qua mùa đông để lộ ra những vết sẹo trên thân
rễ khá rõ – dấu hiệu giúp cho xác định tuổi của cây. Cũng vào lúc này chồi
mới bắt đầu hình thành ở phía đầu thân rễ. Phương thức sinh trưởng này làm
cho phần thân rễ ngày mộ t phát triển thêm về chiều dài [1].
Trong tự nhiên, SVD phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nê Pan ( vùng cận
Himalaya) và điểm phân bố cuối cùng của sâm vũ diệp về phía nam là Sa Pa
của Việt Nam, ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ( Sa Pa, Bát Xát, Than Uyên,
…). Do hậu quả của nạn phá rừng và khai thác bừa bãi, vùng phân bố SVD ở
nước ta đã bị thu hẹp dần, SVD đang phải đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng và
việc bảo vệ đang được ưu tiên ở Việt Nam [1,16].
Hiện nay, SVD đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa (Lào Cai) và Hà
Giang và cho những kết quả khả quan [15,16].

4


1.1.4. Thành phần hóa học
Nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2002, kết quả định
tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là
polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [7,12]. Saponin là thành
phần hoạt chất chính trong lá và thân SVD. Trong đó bao gồm saponin khung
oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung
dammaran với hàm lượng thấp hơn [21,25,26].
Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin
khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số
ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F, F

2

, F3, Rg2, Rb, Rd, Re, Rb3,

24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid, majorosid F1 và bipinnatifidusosid
F1, F2 [23,24].
Rễ SVD chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như
chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid R0, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2

Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm
10 saponin khung oleanan (hình 1.2) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu
hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C và
[1].

bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este, chikusetsusaponin
IVa, pseudoginsenosid RP1 methyl este, stipuleanosid R1, pseudoginsenosid
RT1 methyl este, momordin IIe và stipuleanosid R2 methyl este [22].
Năm 2018, nhóm nghiên cứu Việt Nam đã phân lập và xác định cấu
trúc hóa học của 2 saponin từ thân rễ SVD là stipuleanosid R 2, aralosid A
methyl ester [16].

5


Comp.
1:
2:
3:
4:

5:
6:
7:
8:
9:
10:
Me : methyl
Ara(f) :

-L-arabinofuranosyl

Ara(p) :

-L-arabinopuranosyl

Glc : -D-glucopyranosyl
Xyl : -D-xylopyranosyl
Hình 1.2. 10 hợp chất saponin tách từ rễ của cây Sâm vũ diệp
[22]

6


Bảng 1.1. Các hợp chất saponin đã phân lập từ Sâm vũ diệp
STT

Hợp chấ
1
2

24(S)-ps
Bifinosid

3

Bifinosid

4

Bifinosid

5

Bipinnat

6
7

Bipinnat
Chikuse

8

Ginseno

9

Ginseno

10

Ginseno

11

Ginseno

12
13

Ginseno
Ginseno

14

Ginseno

15

Ginseno

16

Ginseno

17
18

Majoros
Momord

19

Narcissi

20

Panasen

21

Pseudog

22

Stipulea

23

Stipulea

24
25

Stipulea
Aralosid


Hiện nay, đã có 25 hợp chất saponin được xác định từ thành phần cây
SVD.

1.1.5. Tác dụng dược lý
Tính vị, công năng: SVD có vị đắng, ngọt, tính hơi ấm, có tác dụng
dưỡng huyết, hoạt lạc, chỉ huyết, tán ứ [1].
SVD thường được dùng trong một số bài thuốc truyền thống ở nước ta
và Trung Quốc, nhưng chưa có nhiều tài liệu và công trình khoa học nghiên
cứu về tác dụng dược lý được công bố. Một số nghiên cứu về tác dụng dược
lý của SVD trên động vật thí nghiệm cho thấy SVD có tác dụng tăng cường
chức năng sinh lý, ảnh hưởng tốt đến hệ thần kinh trung ương, tăng sức dẻo
dai của cơ thể, tăng sức đề kháng, tác dụng tán huyết [1], chống stress, chống
trầm cảm, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễ n dịch, có hoạt tính ức chế sự phát
triển của các tế bào ung thư…[9-11,13,18-20].
1.1.6. Công dụng
Theo đông y, SVD có công dụng hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau,
thũng trướng tích tụ, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết,
chảy máu mũi, xuất huyết d ạ dày,[1,3]…, một vị thuốc quý có tác dụng
chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ [15], tốt cho phụ nữ sau
đẻ và người cao tuổi. SVD còn được dùng để ngâm rượu rồi chiết dưới dạng
tinh sâm hoặc nấu cao rồi pha với nước hoặc rượu để uống có tác dụng kích
thích sinh dục [1].
1.2. TỔNG QUAN VỀ TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU
Tiêu chuẩn cơ sở được xây dựng dựa trên các kết quả nghên cứu khoa
học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật, kinh nghiệm, nhu cầu và khả năng thực
tiễn.
Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu bao gồm việc mô tả,
định tính, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết được và định
lượng hoạt chất trong dược liệu [4]:
8


Mô tả: Bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi

vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu hoặc đặc điể m
thể chất của dược liệu.
•

Định tính: Là những phương pháp dùng đề nhận biết dược liệu, bao
gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp
lý hóa.
•

Nhận biết dược liệu dựa theo kinh nghiệm bằng phương pháp đơn
giản và truyền thống như sự chìm hay nổi trong nước, tiếng nổ, màu của ngọn
lửa hay khói và mùi khi đốt cháy dược liệu v.v...
-

-

Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học là việc quan sát đặc

điểm của các tế bào, các mô của lát cắt, của bột hay của bề mặt dược liệu dưới
kính hiển vi.
Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết
xuất, năng suất quay cực, v.v… của các dược liệu.
-

Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu
bằng các phản ứng hóa học. Phương pháp tiến hành được trình bày ở các
chuyên luận dược liệu cụ thể .
-

Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký

lớp mỏng, sắc ký khí, s ắ c ký lỏng hiệu năng cao,,,, để phát hiện một số thành
phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược
liệu chuẩn.
-

Định tính huỳnh quang là quan sát sự phát huỳnh quang của bề mặt
hay mặt c ắt dược liệu hay của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thường hay
sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử. Trừ khi có quy định riêng
trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm.
-

Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng
kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại
-

9


mỏng có kích thước hơi lớn hơn. Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng
kim loại và đậy kín bằng một phiến kính bên trên có đặt một miếng bông t ẩ
m nước lạnh. Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1
lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên
lỗ này. Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém.
Nhấc phiến kính ra và để nguội. Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể
chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến
hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa.
Thử tinh khiết: Là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, tùy từng
dược liệu mà có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:
•

-

Mất khối lượng do làm khô.

-

Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric.

Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị
biến màu, hư thối.
-

-

Tỉ lệ vụn nát của dược liệu.

-

Hàm lượng kim loạ i n ặng.

-

Dư lượng các chấ t bảo vệ thực vật.

Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược
liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác).
-

Định lượng: Là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có

trong dược li ệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học. Định lượng
bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực
bằng các phép thử sinh học.
•

10


CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Cây Sâm vũ diệp trồng ở huyện Sa Pa, Lào Cai 6 năm tuổi được thu
vào ngày 15/07/2016. Mẫu được giám định tên khoa học là Panax
bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm (Araliaceae) bởi ThS. Nguyễn Quỳnh
Nga, Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu. Mẫu tiêu bản (DL 150716) được lưu giữ Phòng tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện
Dược liệu.
Mô tả đối tượng nghiên cứu: Thân rễ sâm vũ diệp có nhiều đốt và
những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm. Thể
chất cứng chắc, giòn, dễ bẻ, mặt bẻ lởm ch ở m, màu vàng nâu nhạt. Mùi
thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt.
Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 50 0C
đến hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo,
thoáng mát để sử dụng trong nghiên cứu.

Hình 2.1. Mẫu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái
tại Sa Pa, Lào Cai

11

2.1.2. Dung môi, hóa chất
Hóa chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu và phân tích đều đạt tiêu
chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng.
-

Dung môi hóa chất: Methanol (CH3OH), ethanol (EtOH), ethyl acetat

(EtOAc), acetonitrile (CH3CN), acid acetic (CH3COOH), nước c ấ t hai lần,…
dùng cho phân tích.
-

Thuốc thử: Acid sulfuric (Meck), acid acetic (CH3COOH) (Meck).

-

Bản mỏng: Silica gel 60 RP-18 F254s (Meck).

-

Chất chuẩn stipuleanosid R2.

2.1.3. Máy móc, thiết bị
- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies,
Mỹ).
-

Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức).

-

Máy siêu âm Power sonic 405(Powersonic-Hàn Quốc).

-

Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUchi, Thụy Sĩ).

-

Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,2 μm.

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai
số 0,0001g, Precisa – Thụy Sĩ).
-

-

Cân xác định độ ẩm Precisa HA 60.

-

Hệ thống chiết hồi lưu dung tích bình cầu 1000ml.

-

Bình chạy sắc ký lớp mỏng.

-

Máy ly tâm HSCEN- 204- MRC.

-

Bếp điện, bếp đun cách thủy.
12


-

Kính hiển vi điện tử.

-

Máy ảnh.

-

Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong…

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu SVD dựa trên các tiêu chí chung được
quy định trong DĐVN V tại phụ lục 12.2 gồm: Mô tả, vi phẫu, soi bột, độ ẩm
dược liệu, tro toàn phần, tạp chất, định tính, định lượng,…
2.2.1. Mô tả
Kiểm tra về hình thái, màu sắc, mùi vị bằng cảm quan và kiểm tra kích
thước bằng cách đo.
2.2.2. Vi phẫu
Mẫu dược liệu SVD được tiến hành cắt vi phẫu, tẩy sáng trong dung
dịch Cloramin 5 – 10%, rồi nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm kép với đỏ
son phèn và xanh methylene. Lên tiêu bản, sử dụng kính hiển vi để soi các đặc

điểm vi phẫu của dược li ệu [4].
2.2.3. Soi bột
Dược liệu được làm khô rồi nghiển thành bột, lên tiêu bản bằng một
giọt dung dịch soi, quan sát các được điểm của bột bằng kính hiển vi [4].
2.2.4. Độ ẩm
Th ử theo DĐVN V, phụ lục 9.6: cân chính xác khoảng 3g dược liệu đã
cắt nhỏ, s ấy trong tủ sấy ở 105°C, áp suất thường trong 5 giờ.
2.2.5. Tro toàn phần
Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8.
Tỷ lệ % tro toàn phần của dược liệu được tính theo công thức:

13


100 ×
X%=

Trong đó:

×(100− )

× 100

m: Khối lượng tro (g)
M: Khối lượng mẫu thử (g)
B:

Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6. Tro không tan trong acid

Xác định theo DĐVN V, phụ lục 9.7:
Cho 25 ml dung dịch acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5
phút, lọc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa
bằng nước nóng rồi đem nung ở 500°C đến khối lượng không đổi (nung trong
4 giờ).
Tỉ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính tương tự như
tro toàn phần.
2.2.7. Tạp chất
Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.11: Cân khoảng 50g dược liệu dàn mỏng
trên tờ giấy, quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp.
Cân phần tạp chất và tính phần trăm:
X%=
×100
Trong đó:
a:

Khối lượng tạp chất tính bằng gam.

p:

Khối lượng mẫu thử tính bằng gam.

14


2.2.8. Định tính
Phương pháp sắc ký bản mỏng với điều kiện:
Pha động: Chọn một hệ dung môi đặc trưng cho nhóm saponin sau:
CH3OH-H2O (3:1, v/v) (Hệ I)
CH3CN-H2O (2:1, v/v) (Hệ II)

CH3OH-CH3CN-H2O (2:1:1, v/v/v) (Hệ III)
Pha tĩnh: Bản mỏng đế nhôm Silica gel 60 RP-18 F254S đã được hoạt
hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng.
Thuốc thử phát hiện: Acid sulfuric 10% trong ethanol.
Chuẩn bị mẫu:
Dung dịch thử: Lấy 1g bột mẫu thử, thêm 10ml methanol : nước
(4:1), siêu âm 15 phút, lọc, dịch lọc dùng chấm sắc ký.
+

Dung dịch đối chiếu 1: Lấy 1g mẫu bột SVD (mẫu chuẩn) thêm 10ml
methanol : nước (4:1), tiếp tụ c tiến hành giống dung dịch thử.
+

Dung dịch đối chiếu 2: Hòa tan một lượng stipuleanosid R2 chuẩn
trong methanol để được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml.
+

Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60 RP-18 F254S, đã hoạt hóa ở
105°C trong 60 phút, chấm riêng biệt mỗi 5 µl mỗi dung dịch thử và các dung
dịch đối chiế u, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi triển khai
hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi,
phun thuố c thử. Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút. Quan sát bản mỏng
dưới ánh sang tử ngoại UV 365 nm và ánh sáng thường.
Kết quả: Sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch đối chiếu được
chụp ảnh lưu giữ. Các giá trị hệ số di chuyển (Rf) của stipuleanosid R2 và các

15


vết chính được tính bằng tỷ số giữa đường đi của các vết đó trên đường đi của

pha động.
2.2.9. Định lượng
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, theo DĐVN V, ph ụ lục 5.3.
a)

Xây dựng phương pháp
Chuẩn bị dung dịch thử, dung dịch chuẩn:

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình
tam giác dung tích 100 ml, thêm chính xác 50 ml hỗn hợp methanol : nước tỷ
lệ 70 : 30, cân, siêu âm 30 phút, để nguội, bổ sung bằng hỗn hợp dung môi
trên lượng đã mất, lọc qua màng lọc kích cỡ 0,45 µm được dung dịch để tiêm
sắc ký.
Dung dịch mẫu chuẩn: Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn
stipuleanosid R2 trong methanol có các điểm nồng độ chính xác gồm: 18,75
µg/ml, 37,5 µg/ml, 75 µg/ml, 150 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml và 400 µg/ml.
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký:
Tham khảo một s ố tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm,
tiến hành khảo sát định lượng thành phần saponin trong thân rễ SVD như sau:
Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo.
Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành
phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau.
Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV,
FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi
cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp
nhất.

16