KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ GENE Ở SINH VẬT

Chương 6
KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÂN TÍCH HỆ
GENE Ở SINH VẬT

Tóm tắt: Sinh học phân tử là nòng cốt của công nghệ sinh học. Phân tích sinh
học phân tử được bắt đầu từ việc thu nhận dịch chiết ADN từ tế bào sống đủ
sạch để thực hiện các phân tích tiếp theo. Tuỳ theo vật liệu nghiên cứu mà có
phương pháp tách chiết ADN phù hợp. Dung dịch ADN sau khi kiểm tra hàm
lượng và độ sạch được sử dụng để phân tích theo những mục đích khác nhau
như Southem blot, Northem blot, xác định trình tự ADN, PCR, RFLP, AFLP,...
Nội dung của chương gồm 5 vấn đề cơ bản: (1). Phương pháp tách chiết ADN,
(2). Lai phân tử, (3). Xác điịh trình tự nucleotit, (4). Kĩ thuật RFLP, (5). Trình tự
nucteotit lặp lại.

Thành tựu của sinh học hiện đại và những hiểu biết về di truyền học phân
tử làm cơ sở cho việc nghiên cứu, xây dựng các kĩ thuật sinh học hiện đại.
Những kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong phân tích genome của sinh vật
đã được công bố trong các tạp chí khoa học và các sách chuyên khảo.


§1. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu
nhận một lượng axit nucleic, đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Điều quan tâm hàng đầu là các kĩ thuật tách chiết axit nucleic là thu nhận các
phân tử ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học hoặc
hoá học.
Có thể lấy ví dụ các bước tách ADN từ mầm hạt đậu dưới dây:

79

Hình 6.1. Sơ đồ quy trình tách chiết ADN từ mầm hạt đậu tương và đậu xanh

Từ ví dụ cụ thể ở trên ta thấy quy trình tách chiết ADN gồm ba bước cơ
bản sau:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryot). Thông thường
người ta nghiền tế bào, mô trong hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl) và proteinase
K. Hỗn hợp này phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng ADN ra môi
trường đồng thời phân huỷ các protein.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn, chủ yếu là protein
bằng li tâm.
Bước 3: Tủa axit nucleic trong ethanol hoặc trong isopropanol thu nhận
được axit nucleic dưới dạng cô đặc.
Sau khi thu nhận axit nucleic ở dạng sạch, người ta tiến hành phân tích
định tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như đo mật độ quang,
điện đi, siêu li tâm, sắc kí (hình 6.2 và 6.3).

80

Hình 6.2. Phổ hấp thụ ADN ở bước sóng 260 nm
Điện di ADN là kĩ thuật được sử dụng để kiểm tra chất lượng của chế
phẩm ADN tách từ tế bào sống. Đồng thời kết quả điện di còn cho phép dự đoán
được hàm lượng ADN trong dung dịch tách chiết. Phương pháp điện di dược sử
dụng kiểm tra sản phẩm PCR, giải trình tự ADN...

Hình 6.3. Cấu trúc của agarose (theo Nông Văn Hải, 2002)
Gel agarose được sử dụng để phân tích điện di ADN. Agarose ở dạng bột
dược pha với dung dịch TBE hoặc TAE và tuỳ theo mục đích phân tích ADN
mà pha gel với nồng độ thích hợp.
Kĩ thuật điện di ADN bao gồm các bước (hình 6.4):

81

Hình 6.4. Các bước tạo gel điện di agarose
(1, 2) Tạo khuôn ga agarose; (3) Đổ ga trên khuôn ga ;
(4) Tra dung dịch ADN ; (5) Chạy điện di.
Sản phẩm điện di ADN được nhuộm bởi EtBr và chụp ảnh dưới ánh sáng
đèn cực tím.
(1) Nhuộm gel bằng EtBr ; (2) Soi gel trên ánh sáng đèn cực tím để phát
hiện sự có mặt của ADN ; (3) Chụp ảnh để phân tích.


82
Hình 6.5. Hình ảnh điện di ADN tách từ mầm đậu tương
1. ADN chuẩn
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: ADN tách từ mầm đậu tương

Hình 6.6. Cấu trúc của EtBr (theo Nông Văn Hải, 2002)


§2. LAI PHÂN TỬ
Mục đích của kĩ thuật này là phát hiện trình tự nucleotit đặc thù, nghiên
cứu cấu trúc ADN hệ gene (gencomic ADN). Phân tử ADN bị phân cắt bởi
enzyme giới hạn thành những phân đoạn ADN riêng biệt. Bằng phương pháp
điện di các phân đoạn ADN này với những kích thước khác nhau được tách ra
(separate) trên gel thạch hoặc hoặc poliacrylamit và được chuyển sang màng lai
phân tử. Quá trình lai phân tử xảy ra giữa phân tử ADN và đoạn dò ADN có gắn
nhãn phóng xạ theo quy tắc liên kết bổ trợ. Các đoạn ADN đặc thù được phát
hiện theo phương pháp thẩm tách của Southern và phương pháp lai phân tử với
đoạn dò ADN có trình tự nucleotit tương đồng. Phương pháp tự ghi phóng xạ
(autoradiogrophy) có thể nhận biết vị trí đoạn dò ADN trên màng lai phân tử. Từ
khi E.M Southern thuộc Trường Đại học tổng hợp Edinburgh phát hiện ra kĩ
thuật này (1975) gọi là kĩ thuật phân tích màng thấm truyền Southern (Southern

blot analisis) gọi tắt là Southern, nó đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh
vực nghiên cứu sinh học phân tử và di truyền. Khi ứng dụng kĩ thuật Southern
đối với ARN thì gọi là Northern, còn với protein thì được gọi là Western. Hiện
nay đã có nhiều cải tiến về phương pháp, hình thành nhiều kĩ thuật phối hợp như
Southwestern.

83