XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT

Chương 5: XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA PROTEIN VÀ
ĐẶC TÍNH Ở SINH VẬT

Tóm tắt: Protein lả sản phẩm biểu hiện gene, protein biểu hiện thành tính trạng
và đặc tính ở sinh vật. Trong tế bào có nhiều loại protein chức năng quan trọng
và những hiểu biết về đặc điểm của những protein này là cơ sở cho những ứng
dụng vào công tác chọn giống và bảo vệ sức khoẻ con người. Những loại protein
đề cập trong chương này là protein liên quan đến tính chống chịu của sinh vật
và protein ức chế hoạt động ribosome. Xác định mốt liên quan giữa protein và
tính trạng, đặc tính ở sinh vật lập thành các chỉ thị protein cho đặc tính và tính
trạng. Các chỉ thị protein có thể là chỉ thị hàm lượng protein, enzyme, phân tử
protein hay phổ isozyme và xác định các loại chỉ thị này được thực hiện theo
quy trình kĩ thuật nhất định. Hàm lượng protem, đường và hoạt độ enzyme liên
quan đến áp suất thẩm thấu trong tế bào và quan hệ với tính chống chịu của
sinh vật. Có nhiều đặc tính và tính trạng của sinh vật được quan tâm nghiên cứu
hiện nay là tính chống chịu của sinh vật và việc tìm ra các chỉ thị protein cho
đặc tính này có ý nghĩa cao trong chọn tạo giống.
Nội dung của chương gồm 6 vấn đề cơ bản: (1). Một số loại protein chức năng;
(2). Quy trình xác định chỉ thị protein; (3). Kĩ thuật phân tích protein; (4). Kĩ
thuật phân tích enzyme; (5). Kĩ thuật phân tích đường, (6). Nghiên cứu RIPs
bằng Westem blot.

§1. MỘT SỐ LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG
1.1. Protein liên quan đến tính chống chịu
Khả năng chống chịu của sinh vật nói chung và của thực vật nói riêng liên
quan đến cấu trúc và chức năng của các thành phần trong tế bào. Các vùng tế
bào và các quá trình xảy ra trong mỗi vùng liên quan đến khả năng chịu hạn,
nóng, mặn, phèn của thực vật (hình 5.1).

62

Hình 5.1. Chức năng của các vùng tế bào khi môi trường thiếu nước (theo
Bohnert,Jensen, 1996 và Đinh Thị Phòng, 2001)

Hình 5.2. Hoạt động của các gene liên quan đến sự mất nước và sự thay đổi áp
suất thẩm thấu (theo Bray, 1993 và Trần Thị Phương Liên, 1999).

1.1.1. Protein sốc nhiệt (HSP)
HSP có ở hầu hết các loài thực vật như: lúa mì, mạch, lúa gạo, ngô, đậu
hành, tỏi.... chúng chiếm khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực
vật này. HSP còn tìm thấy ở vi khuẩn và động vật bậc cao. HSP được tổng hợp
khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao.

63
HSP có thể chia làm 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác
nhau: MW 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong số đó có nhóm HSP70 và HSP60
có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (gọi là chaperonin). HSP8,5 hoa
(ubiquytin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhưng không phải là môi giới phân
tử. Ubiquytin có hoạt tính protease với chức năng phân giải các protein không
có hoạt tính enzyme, ngăn chặn hiện tượng gây độc tế bào của những protein
này. Ubiquytin có MW rất thấp, ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ nên ubiquytin có
vai trò tự sửa chữa của tế bào khi gặp yếu tố cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ.
1.1.2. Môi giới phân tử (MGPT)
Theo Ellis (1997) MGPT là một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau,
nhưng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho
protein trong tế bào. Chức năng của MGPT thể hiện ở những nội dung sau:
- Giữ ổn định chuỗi polipeptit khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không
gian đúng cho chúng.
- Tạo lại cấu trúc không gian của protein sau khi vận chuyển qua màng tế
bào.
- Lắp giáp các chuỗi polipeptit vào phức để tạo cấu trúc bậc 4.

- MGPT được tăng cường nhờ quá trình tổng hợp trong điều kiện cực
đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào.
Hoạt động của MGPT được thực hiện nhờ việc sử dụng năng lượng ATP.
MGPT được nghiên cứu đầu tiên ở thực vật và liên quan đến enzyme Ribulose
bisphotphat cacboxylase/oxygenelase (RUBISCO). RUBISCO xúc tác các phản
ứng tổng hợp chất hữu cơ nhờ sử dụng CO
2
tự do trong quang hợp. RUBISCO
có cấu trúc bậc 4 gồm từ 4- 8 tiểu đơn vị lớn (MW52) và 8 tiểu đơn vị nhỏ
(MW14 kDa). Một loại protein đặc hiệu gắn với những tiểu đơn vị chính tạo
phức RUBISCO-binding protein (RBP) và RBP là MGPT.
MGPT ở thực vật tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho những phân
tử protein mới được tổng hợp, chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc
hiệu của protein, ngăn chặn sự huỷ hoại protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu
sự phân giải protein bị biến tính.
MGPT có thể phân thành một số nhóm chủ yếu sau:
• HSP70 là nhóm MGPT có hoạt tính ATP-ase và có tính bảo thủ cao.
Trong điều kiện cực đoan HSP70 có thể ngăn chặn sự co cụm và kết tụ
protein.
• HSP60 (chaporonin) là loại protein cấu tạo từ các tiểu đơn vị có khối
lượng 60 kDa và cũng có hoạt tính ATP-ase. Chúng có cấu tạo 2 vòng,

64
mỗi vòng có từ 7-8 tiểu đơn vị. Ở tế bào Prokaryot, chaperonin giống với
protein tìm thấy ở ti thể, lục lạp và được gọi là GroEL, GroES. Trong tế
bào Eukaryot tìm thấy một loại chaperonin trong tế bào chất là CCT.
Nghiên cứu về CCT thực vật còn ít được đề cập. Tuy nhiên gần đây đã có
những công bố đầu tiến của Nông Văn Hải và cộng sự (1998), Trần Thị
Phương Liên và cộng sự (1999) về kết quả phân lập và tách được dòng
gene CCT từ cây đậu tương.

δ
1.1.3. HSP100, HSP90, SHSP

Các nhóm HSP100, HSP90, sHSP có tính bảo thủ cao và có hoạt tính
ATP-ase. Phần lớn các protein này được sinh ra khi.gặp nhiệt độ cao. Chức năng
của HSP100, HSP90, SHSP là ngăn chặn hiện tượng co cụm của protein và tái
hoạt hoá các phân tử protein đã biến tính.
1.1.4. LEA (Late embryogenesis abundant protein)
LEA là loại protein được tổng hợp với số lượng lớn trong giai đoạn cuối
của quá trình hình thành phôi. LEA có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu
khô hạn của hạt. Cấu trúc phân tử của LEA nổi bật là giàu axit amin ưa nước,
không chứa xystein, tryptophan, có vùng xoắn
α
và có khả năng chịu nhiệt.
Chúng thực hiện các chức năng cô lập ion, bảo vệ màng, huỷ protein biến tính
và điều chỉnh áp suất thẩm thấu.
LEA được chia làm 6 nhóm: nhóm 1-D19; nhóm 2-D11 (dehydrin); nhóm 3-D7;
nhóm 4- D113; nhóm 5-D29; nhóm 6-D95. Nhiều gene LEA đã được nghiên
cứu, phân lập và xác định chức năng. Khi gặp hiện tượng mất nước mARN của
nó được tổng hợp và dần trở thành một lượng lớn gồm nhiều loại mARN khác
nhau trong hạt chín, mARN bị phân giải hết khi hạt nảy mầm. Mức độ phiên mã
của gene LEA được điều khiển bởi ABA và độ mất nước của tế bào.
1.2. Protein bất hoạt ribosome (Ribosome inactivating proteins - RIPs)
Protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating proteins - RIPs) là
những độc tố (toxin) có hoạt tính rRNA N-glicosidase và các đặc tính sinh -
dược học rất đa dạng. Cơ chế tác động của RIPs là phân cắt cầu nối N-
glicosidic của adenine đặc hiệu trên vùng Sarcin/Ricin Loop (còn được gọi là
SRL hay R/S Domain) của rRNA (vị trí A4324 trên rRNA 28S ở gan chuột).
Kết quả là ribosome không gắn kết được với EF-2 và GTP, làm ức chế quá trình
sinh tổng hợp protein.

RIPs được phân loại theo cấu trúc phân tử của chúng theo hai hoặc ba tipe
khác nhau: (1) RIPs tipe I chỉ có một chuỗi polipeptit A (đôi khi ở dạng glicosyl
hoá) với hoạt tính RIPs N-glicosidase; (2) RIPs tipe II có hai chuỗi: polipeptit A
liên kết với chuỗi plipeptit B (là một phân tử có hoạt tính giống lectin) bằng một

65
hoặc hơn các cầu nối disulfide; (3) RIPs tipe III giống tipe I, bao gồm một chuỗi
polipeptit, nhưng lại chỉ có hoạt tính sau khi được phân cắt đoạn tín hiệu bằng
một loại protease đặc hiệu.
Số lượng RIPs tipe I (khối lượng phân tử khoảng 30kDa) nhiều hơn RIPs
tipe II và III. Tuy nhiên một số RIPs không thể phân loại theo các tipe kể trên.
RIPs được phát hiện ở hơn 50 loài thuộc 13 họ thực vật, bao gồm cả cây
một và hai lá mầm. RIPs không chỉ thấy ở họ Bầu bí (Cucurbitaceae) với rất
nhiều loài là các cây thuốc quý như Trichosanthes, Luffa, mà còn thấy ở rất
nhiều các họ thực vật khác như Cẩm chướng (Caryophylaceae), Thầu dầu
(Euphorbiaceae), Hoà thảo (Poaceae), Họ đậu (Fabaceae), họ Hoa phấn
(Nygtaginaceae)... RIPs không chỉ tìm thấy ở thực vật, mà còn thấy ở một số
loại vi khuẩn đường ruột. Sự có mặt của RIPs ở rất nhiều cơ thể sinh vật khác
nhau đã đưa đến một giả định về khả năng tồn tại của loại protein tương tự ở thế
giới động vật.


§2. QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ PROTEIN
Protein là sản phẩm của sự biểu hiện gene. Protein biểu hiện tính trạng
của cơ thể. Nghiên cứu xác định cơ sở protein của tính trạng hình thái, cấu tạo,
sinh lí, hoá sinh của cơ thể sinh vật được quan tâm một số khía cạnh cụ thể như
hàm lượng protein, các tiểu phần protein với kích thước phân tử khác nhau. Quy
trình xác định chỉ thị protein cho một tính trạng nào đó có thể được thực hiện
theo các bước sau:
Bước 1. Nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lí

Sàng lọc, phân lập các cá thể theo kết quả đánh giá dựa trên kiểu hình.
Những cá thể mang tính trạng quan tâm có thể được tạo ra do lai giống hoặc đột
biến thực nghiệm, sàng lọc trong quần thể tự nhiên và cũng có thể do xử lí, đánh
giá trong điều kiện nhân tạo. Hiện nay người ta quan tâm chủ yếu các tính trạng
chung chịu ở thực vật (khả năng chịu nhiệt: nóng, lạnh; mặn; hạn; phèn; khả
năng chịu sâu, kháng bệnh), các bệnh do viêm hoặc ung thư ở động vật.

Bước 2. Xác định chỉ thị protein
• Chỉ thị hàm lượng protein
- Chiết protein ở giai đoạn sinh trưởng, phát triển quan tâm của cá thể.
- Phân tích hàm lượng protein.
- Xác định mối liên quan đến tính trạng.

66
• Chỉ thị phân tử protein
- Chiết protein dùng cho điện di, tách chiết phân đoạn protein.
- Phân tích thành phần điện di.
- Phân tích đa hình protein.
- Giải trình tự axit amin của protein.
• Western blot
- Chiết protein dùng cho điện di.
- Tách protein bằng điện di trên gel poliacrylamide.
- Chuyển protein từ gel sang màng (PVDF) nhờ điện trường.
• Chỉ thị enzyme
- Chiết enzyme.
- Phân tích định lượng và định tính hoạt độ enzyme.
- Phân tích điện di entyme.


Hình 5.3. Sơ đồ phân tích xác định chỉ thị protein

§3. KĨ THUẬT PHÂN TÍCH PROTEIN
3.1. Tách chiết protein
Protein có tính tan trong nước và muối, do vậy người ta chiết protein bằng
một số loại dịch chiết có độ pH khác nhau kết hợp với phương pháp li tâm thu

67