Sane xuất Enzim từ thực vật

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 40
Chng 4: SN XUT ENZIM T THC VT
Enzim t thc vt cng chim mt t l thích áng trong công ngh sn xut và s
ng enzim nói chung. Mt s loi enzim ã c s dng nhiu trong y hc, thc phm
và công nghip. c bit trong nghiên cu khoa hc ngi ta rt chú trng chit tách và
xác nh c ch tác dng ca các enzim trong các mô thc vt nh nhóm enzim
glycoxydaza, nhóm enzim oxy hoá kh polyphenoloxydaza (EPPO) ã mang li nhng
giá tr lý thuyt và thc tin rt cao trong thi gian gn ây.
4.1. n xut ureaza tu ra:
Chi hu Canavalia  châu phi,  Vit Nam có loài Canavalia ensifomis - c gi
là cây u ra, u tc; ht dùng cha bnh lui hàn, nc ct, yu thn. Trong ht u ra,
hàm lng ureaza có tht n 20% cht khô do ó ay là ngun nguyên liu quan
trng  thu nhn ureaza.
- V mt ng dng: ureaza c s dng trong y t xác nh hàm lng urê trong
huyt, bàng quan, có trong thành phn ca thuc chng thn nhân to. Trong ch bin
t s loi cá có mùi khai (i, nhám, mp) thì dùng ureaza  kh mùi khai rt hiu
qu.Ureaza có th xúc tác thu phân urê c trong và ngoài t bào (có th).
+ Chit xut ly enzim:
Nghin k bt u trong dung dch HCl 0,4% có thêm EDTA (trilon B, complexon III)
5.10
-3
M và L.cystein 5.10
-3
M. Sau ó ly tâm tách bã ly dch chit.
+ X lý nhit: Nâng nhit nhanh n 60
0
C, gi trong 30 phút em ly tâm tách b cn
t ta.
+ Siêu lc: dch ly tâm c lc qua màng siêu lc  loi b peptit và polypeptit có
trng lng phân t bé (M>500)

+ Kt ta bng axeton:
ch lc c x lý bng axeton lnh (t l 1:1), ly tâm tách kt ta. Phn kt ta em
hoà tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 cha EDTA và L.cystein 5.10
-3
M.
+Sc ký trao i ion
ch enzim c chy sc ký trao i ion trên ct cha DEAE – xenluloza vi gradien
ng  NaCl t 0 – 1M. Phân n cha enzim c sy thng hoa (ông khô) vi cht
sacaroza làm cht n nh vi t l 2,5mg/1mg enzim.
Ch phm thu c có hot tính tng 25 ln so vi ban u và hiu sut thu hi 43%.
Xem bng 8 ca giáo trình (trang 186). Mt s thông s ca quá trình thu nhn ureza
u ra.
4.2. Thu nhn bromelain t da:
- Gii thiu qu da: tên latinh: Bromelia ananas-L: thuc chi da n qu. Ngoài ra
còn có chi da di ( ly si ).
(NH
2
)
2
CO + H
2
O ureaza 2NH
3
+ CO
2
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 41
Bromelain có nhiu trong ph liu da nh v, lõi, chi, li u.
Gii thiu c m ch phm Bromelain (Xem quá trình trang 187-189).
Nguyên tc chung  thu nhn Bromelain.

Ghi chú: kt ta bng (NH
4
)
2
SO
2
lnh hay axeton lnh t l 1:1.
- Thu nhn Bromelain bng phng pháp nhanh s dng CMC.
Thu nhn Bromelain bng phng pháp mô t nh trên òi hi thi gian lâu, khó
c, lng dch ln, khó bo qun. Hin nay mt s nhà nghiên cu ã dùng phng pháp
nhanh tách Bromelain bng CMC. Cho phép thu c Bromelain bt trng có hot tính
cao, thi gian nhanh, n gin nh sau:
+ Công ngh ch to CMC (xem giáo trình trang 191).
Chú ý : có th thay vi màn (hay gt) bng bông nón ( Xenluloxa ~ 100%).
+ Tách chit Bromelain t dch chit da bng CMC.
CMC c tm t bng dung dch m photphat 0,05 M, pH= 6,1. Cho dch chi da
( chi da  nghin  ép lc c dch) vào, thnh thong khuy trn. Emzim
Bromelain s hp th lên b mt ca CMC. Sau 2 gi ly ra vt nc loi b cn bn
bám vào CMC, ra trôi các prôtêin không phi enzim bng m photphat  pH=6,5. Sau
ó cho phn hp th ln 1. Dung dch phn hp th là m photphat pH=7,1, NaCl 0,5 N
khuy trn. Sau 2 gi ly ra vt c dung dch m dc cha bromelain. Tip tc phn
p th nh ln th hai ri gp chung dch chit ca c hai ln kt ta enzim bng axeton
hay còn lnh.
i phng pháp này hiu xut thu hi t 0,1% so vi chi da ti, ch phm có
hot tính 24 n v (mg ch phm enzim. So vi phng pháp kt ta t ban u bng
(NH
4
)
2
SO

4
thì  sch cao hn hai ln, thi gian nhanh hn, tin hành thun li hn.
- Mt sng dng ca ch phm bromelain:
+ Thu phân gan bò:
Gan bò c x lý bng ch phm bromelain trong10 gi 1-55
0
C, sau ó vô
hot enzim  100
0
C trong 3-4 phút. Dch oc lc và ông khô thành dng bt là ch
phm hn hp axit amin y t (sn xut các dch truyn m y t). Thành phn axit amin
a ch phm thu phân gan bò bi bromelain c trình bày  bng 12 (trang 193 ca
giáo trình).
+S dng bromelain làm ông sa:
 làm ông sa trong phng pháp truyn thng (trong CN-SX photphat) ngi ta s
ng renin thu c t ngn th 4 ca d dày bê. Hin nay, lng renin cha áp xng
 nhu cu ca công ngh. Trong nhng nm gn ây xu hng s dng proteaza thc
t  thay th mt phn renin trong ch bin phomat ang c phát trin. Trong ó
Ph liu da làm dp chit lc ly tâm kt ta ly
tâm lc ch phm k thut Sc ký trao i ion sy thng
hoa sn phm tinh khit .
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 42
áng k nht là 2 loi ch phm: ficin t cây c ficus và bromelain t da. Kt qung
ng xem bng 13 (trang 194 ca giáo trình)
+ S dng bromelain  thu nhn các cht c ch proteaza.
Trong mt s loi c quan ng vt, thc vt tn ti các cht c ch enzim, trong
ó có cht c ch proteaza, chúng có bn cht protein nh enzim. n hình nh trong
các ht hu: u tng, u xanh, u ván, ht mít, ni tng ca mc nang, a, trong
a (tn ti song song vi bromelain). Các cht c ch thng tác ng mnh lên mt s

enzim, trong ó có c enzim trong ng tiêu hoá (ca ngi và ng vt) nh: ficin,
bromelain, tripxin.  thu hi c các cht c ch này, ngi ta dùng phng pháp hin
i, hin nay là dùng enzim cnh. Bromelain sau khi thu nhn bng CMC nh trên
c cnh trong gel sepharoza ri nhi vào to ra ct phn ng. Dch nghin, lc ph
liu da c cho chy qua ct này: u tiên  pH photphat 4,6, sau ó pH = 7,6 – 7,8,
tip ó xy ra quá trình liên kt gia bromelain vi các cht c ch. Thu hi cht c ch
ng NaOH 0,01N + NaCl 0,1N vi pH = 11,5 – 12; có tinh sch, hot tính cao (xem
ng 14 trang 195 ca giáo trình). Ngoài ra bromelain có s dng trong quá trình làm
m tht, sn xut nc mm ngn ngày, bt cá.
- Thu nhn papain t nha u :
Cây u  (carica papaya.L), qu dùng làm thc phm. nha qu u  làm thuc
giun, chai chân, mn cm, sng khp, eczema. R làm thuc cm máu, si thn. Hoa
cha ho, viêm cung phi, lá cha ung th phi. Papain có M = 20.700, t
op
= 80
0
C, pH
op
= 5 – 5,5. Bc ch và mt hot tính bi H
2
O
2
, Iodoaxetat, I
2
, fericianua. c hot hóa
i -CN, cystein, H
2
S và glutation.
+ Thu nhn papain thô:
Dùng các loi quu  còn non, u  già (cha chín), dùng khn lau sch v, ly

dao co sch nhng ng không quá sâu, hng nha (catex) vào cc ri làm khô bng
các phng pháp khác nhau, ta thu c ch phm papain thô có hot tính nh bng 15
(trang 196 ca giáo trình).
t qu cho thy hot tính papain sau khi chit tách cao hn khi ã  3 tháng.
Phng pháp phi nng cho kt qu hot  enzim thp nht, sy chân không dung môi
(axeton hay ru etylic lnh) cho hot tính cao nht. Ch phm cn bo qun lnh 6 –
10
0
C mi duy trì hot tính.
+ Thu nhn papain thng phm:
Ngâm papain thô hoà tan nha ti (catex) trong nc ct có b sung glyxerin  tng
 hoà tan, lc qua vi màn. Kt ta bng axeton lnh vi t l 2:1 so vi th tích dch
c. Ly tâm lnh ly kt ta, sy 45 – 50
0
C (sy chân không hay phi khô), em nghin
thành bt.
 nc ta hin nay vin công ngh sinh hc ã sn xut thành công ch phm papain
thng mi dng ông khô. Bng 16 so sánh hot tính (trang197) ca papain thng mi
quc t vi papain ti và ông khô Vit Nam. Kt qu n di ó (trên gel
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 43
polyacrilamit), th hin trên hình 56 (trang 198). Hot tính thành phn các enzim trong
ch phm papain c trình bày  bng 17 (trang 199).
+ ng dng ca papain: làm ông sa, thu phân protein nh sn xut bt cá thc
phm, sn xut nc mm ngn ngày, làm mm tht.
- Gii thiu kt qu nghiên cu ch phm EPPO (bt axeton) trong lá chè và ht ca cao
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 44
Chng 5: ENZIM CNH
5.1. Gii thiu chung:

Enzim cnh (hay enzim không tan) là enzim có s tham gia hot ng trong mt
không gian b gii hn. S gii hn hot ng vn linh hot ca enzim bng cách gn nó
vào mt pha cách ly tách ri khi pha lng t do và ó nó vn có kh nng tip xúc
c vi các phn t c cht, effector hay inhibitor (cht c ch ). Pha gn enzim thng
không tan trong nc nhng cng có th là các polyme a nc.
Enzim không tan c nghiên cu và ng dng t nhng nm 1950.  ch to enzim
nh có th dùng các phng pháp hp ph, liên kt hoá tr gn kt enzim. Cht
dùng  gn kt enzim gi là cht mang (enzim), hin nay ngi ta thng dùng
xenluloza, tinh bt, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bt thu tinh,
nilon…..Ch phm enzim không tan có th dng bt, ht, phin, màng mng.
Trong mt s trng hp không cn thit phi gn enzim vào cht mang mà có th gi
nó  bên trong mng li polyme bao quanh ly phn t enzim. Mng li ó có mt nh
không cho phép enzim thoát ra khi mng nhng vn  ln  c cht và sn phm to
ra qua li d dàng.
Theo thng kê, u nm 1995 ngi ta ã ch to c trên 100 ch phm enzim c
nh .
i ích ca vic s dng enzim cnh:
- Gim giá thành do enzim c s dng lp li nhiu ln vi cùng mt kiu phn ng
xúc tác, ch phm bn hn trong các u kin pH, nhit , áp xut thm thu ti u, tc
 phn ng ln, d t chc sn xut  mc  tng hoá cao.
- Ch to enzim tng i d, u t xây dng và sn xut tng i ít, sn phm phn
ng không ln ln vi enzim (ch mt s ít b ra trôi theo dòng chy ca tác nhân), có
th d dàng t chc sn xut các sn phm lên men bng enzim ngoi bào nh: ru
etylic, axit hu c, axit amin, vitamin.
5.2. t s phng pháp ch yu ch to enzim cnh :
5.2.1. Microencapsulation ( gói enzim trong bao cc nh )
c nghiên cu bi Chang et al(1967-1968)
Cái màng polymer thm thu dày 200A
0
(xenluloza, polysacarit, phi tinh bt ) to

thành ht ng vng 10-12M cha các phn t enzim bên trong. Lp màng này cho phép
 cht và sn phm phn ng enzim c qua li t do nhng các phn t enzim không
th qua li c vì các phn t quá ln. Nh vy nu c cht có phân t lng quá ln
nh: poly saccarit, protein cng không th qua li màng c do ó không th thc hin
phn ng enzim c.
5.2.2. Liên kt enzim vào cht mang không tan (silman và katchalski-1966)
Các cht mang nay thng là: CMC, silicagen. Lúc ó enzim c gn vào cht mang
o mt s v trí xa vi trung tâm hot ng ca nó. Nh vy c tính ca enzim phn nào
 thay i không còn nh khi nó  trng thái hoà tan t do trong h nh:  pH
op
, t
op
...
n n s thay i các tr s K
m
, V
m
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 45
5.2.3. nh v enzim trong pha lng ca h thng 2 pha (Reese and
Mandels.1958)
Enzim c hoà tan trong pha lng và c gi li trên ct ca cht rn không tan nh
xenluloza. C cht nm trong pha lng khác (pha dung môi) khuch tán vào pha lng
cha enzim và xy ra phn ng vi enzim. Các sn phm phn ng khuch tán ngc li
i ra ngoài ct. H thng này gn ging vi phng pháp microen capsule mà pha dung
môi óng vai trò nh mt màng bán thm.
5.2.4. Gi enzim bng màng siêu lc:
Enzim c hoà tan t do trong dung dch và tin hành phn ng enzim ngay trong
dung dch này. Sn phm phn ng c tách ra nh màng siêu lc chn lc còn c cht
và enzim c gi li  phía bên kia ca màng.

(Xem hình v trang 204 và gii thích trang 205 ca giáo trình)
5.3. t s liên kt trong vic cnh enzim.
5.3.1. Liên kt hoá tr: (cng hoá tr)
Cht mang trong phng pháp này là các polyme t nhiên và các sn xut ca chúng
nh: xenluloza, agaroza, alginic acid, chitin, collagen, keratin, các polyme tng hp: axit
acrylic, polyme tan, N – Vinylpyrolidon...
n cht ca phng pháp cnh enzim bng kiên kt cng hoá tr là enzim c ni
i cht mang thông qua “cu ni có cc” nào ó. Cu ni này có kích thc va phi,
t u gn vi cht mang polyme, u kia gn vi enzim.
Ví d: cyanuric chloride (tricloro triazin) có 3 nhóm có kh nng to liên
t áp ng c yêu cu trên, trong ó có mt nhóm s liên kt mnh vi polyme, nhóm
th 2 vi enzim, nhóm th 3 có th liên kt vi c 2 u thc bit ca cht này là  ch
din tích ca nó quyt nh các tính cht ion ca phc enzim – xenluloza. Phc này có
th trung tính, âm (anion), dng (cation) ph thuc vào bn cht ca cht gn vi
th 3
Trong khi ó mt s các phng pháp cnh enzim khác ch do phc mono – ion
(cation hoc anion).
- Glutaraldehyt cng hay c s dng làm cu ni  gn enzim vì nó cha 2 nhóm –
CHO  hai u,  pH trung tính s kiên kt c vi các nhóm amin – NH
2
t do.
Nh vy mt u s gn vào cht mang, còn u kia gn vào enzim.
5.3.2. p ph vt lý:
Cht hp ph và enzim c trn ln vi nhau trong mt khong thi gian nht nh
 s hp ph xy ra nh tng tác b mt nh: liên kt ion, liên kt a béo (k nc),
liên kt hidro, lc Vandewaals. Nhc m ca phng pháp này chính là quá trình hp
ph enzim có th xy ra do s thay i pH, nhit , thành phn ion.
- Các cht mang hu c dùng cho hp ph vt lý: dn xut polyme t nhiên, DEAE
– xenluloza, DEAF – sephadex. ây là các amonit (mang n (-))
- Cht st ký xotein - k nc nh: agaroza ci bin có gn các nhóm mang n 

u chui cacbon hydrat ca nó (hai loi lc hp ph là lc tnh n và lc k nc gn