(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang, Cao Bằng và lựa chọn vắc xin phòng bệnh
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.75 MB, 163 trang )
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------------
PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH
CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ
HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG
VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH
LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y
Thái Nguyên, năm 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------------------------
PHẠM THỊ PHƯƠNG LAN
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY BỆNH
CỦA VI KHUẨN Pasteurella multocida TRONG BỆNH TỤ
HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI HÀ GIANG, CAO BẰNG
VÀ LỰA CHỌN VẮC XIN PHÒNG BỆNH
Ngành: Ký sinh trùng và Vi sinh vật học thú y
Mã số: 9.64.01.04
LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đặng Xuân Bình
2. TS. Nguyễn Ngọc Nhiên
Thái Nguyên, năm 2017
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu,
kết quả trong luận án này là trung thực, không trùng lặp với những kết quả đã được
công bố và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài và hoàn thành luận
án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều đã được chỉ rõ
nguồn gốc.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2017
Tác giả
Phạm Thị Phương Lan
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ của nhiều
tổ chức, cá nhân, của các thầy, các cô, các bạn đồng nghiệp và gia đình.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo và các thầy, cô của Đại học Thái
Nguyên, phòng Đào tạo, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm đã trực
tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại
học Nông Lâm; Bộ môn vi trùng - Viện Thú y; Bộ môn vi trùng – Trung tâm chẩn
đoán Thú y Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ Chi cục Thú y
tỉnh Cao Bằng và Chi cục Thú y tỉnh Hà Giang đã hết sức tạo điều kiện, giúp đỡ tôi
trong quá trình thí nghiệm và thực hiện luận văn này.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học:
PGS.TS Đặng Xuân Bình trường Đại học Nông Lâm và TS. Nguyễn Ngọc Nhiên
Bộ môn Vi trùng – Viện Thú y đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các thày cô giáo, các anh, chị, em –
Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện thí nghiệm, đóng góp
những ý kiến quý báu, cùng những kinh nghiệm nghiên cứu để tôi hoàn thiện đề tài
nghiên cứu.
Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, hỗ
trợ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2017
Tác giả
Phạm Thị Phương Lan
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii
MỤC LỤC.......................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................................x
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4
1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida ................................................................... 4
1.1.1. Phân loại vi khuẩn ................................................................................. 4
1.1.3. Đặc tính sinh hóa ................................................................................... 7
1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida ..................................... 7
1.2. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây ra ..................................18
1.2.1. Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ..................................................18
1.2.2. Cơ chế sinh bệnh ..................................................................................18
1.2.3. Đặc điểm dịch tễ học ............................................................................19
1.2.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò............23
1.2.5. Chẩn đoán bệnh ....................................................................................25
1.2.6. Phòng và trị bệnh tụ huyết trùng ...........................................................32
1.3. Vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ..............................................................35
1.3.1. Trên thế giới .........................................................................................35
1.3.2. Ở Việt Nam ..........................................................................................38
1.4. Một số kết luận qua phân tích tổng quan .....................................................40
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 42
2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ...................................................................42
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................42
2.1.2. Nguyên vật liệu ....................................................................................42
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .........................................................44
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................44
2.2.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh
Hà Giang và Cao bằng....................................................................................44
2.2.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu
tố độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ......................45
iv
2.2.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc
xin P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho
trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng. ..........................................................45
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................46
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ........46
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu ...........................................................................49
2.3.3. Phương pháp phân lập vi khuẩn P. multocida .......................................49
2.3.4. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của P. multocida .......51
2.3.5. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn P. multocida phân lập
được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng bằng kỹ thuật PCR. .........51
2.3.6. Phương pháp xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được
từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng .......52
2.3.7. Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn P. multocida phân lập
được từ trâu, bò chết nghi mắc bệnh tụ huyết trùng đối với chuột nhắt trắng
(Carter và cs, 1995) [77]. ................................................................................53
2.3.8. Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của
các chủng P. multocida phân lập được (Nguyễn Thanh Hà, 1991) [10]. .........53
2.3.9. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin ..............54
2.3.10. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của
trâu, bò trước khi tiêm vắc xin và sau khi tiêm vắc xin bằng phản ứng
ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA (Indirect Haemaglunation Test). ...............55
2.3.11. Phương pháp xác định hiệu lực bảo hộ đối với trâu, bò trước và sau
khi tiêm phòng vắc xin bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng
(Bain và cs, 1982) [61]. ..................................................................................56
2.3.12. Phương pháp đánh giá tỷ lệ bảo hộ trung bình (Lê văn Tạo, Dương
thế Long, 1996) [42].......................................................................................58
2.3.13. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................58
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................................ 59
3.1. Nghiên cứu điều tra về dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà
Giang và Cao bằng từ năm 2011 - 2015 ............................................................59
3.1.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng tại tỉnh Hà
Giang và Cao Bằng ........................................................................................59
3.1.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài
trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng .......................................................61
v
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ trong năm
tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ....................................................................63
3.1.4. Mức độ dịch và hệ số năm dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ....................................................................66
3.1.5. Thời điểm phát dịch, mùa dịch đối với bệnh tụ huyết trùng trâu, bò
tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ....................................................................67
3.2. Nghiên cứu phân lập và xác định các đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố
độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ..............................70
3.2.1. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ
tại 2 tỉnh Hà Giang và Cao Bằng ....................................................................70
3.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh
tụ huyết trùng tại Hà Giang và Cao Bằng .......................................................72
3.2.3. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn
P. mutocida phân lập được .............................................................................73
3.2.4. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
bằng phản ứng PCR........................................................................................76
3.2.5. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ..78
3.2.6. Xác định LD50 của vi khuẩn P. multocida .............................................83
3.2.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn P. multocida
phân lập được với một số loại kháng sinh và hóa dược ...................................85
3.3. Xác định miễn dịch chủ động tự nhiên và đánh giá hiệu lực của vắc xin
P52 dạng keo phèn và nhũ dầu trong phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò
tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng. ..........................................................................88
3.3.1. Miễn dịch chủ động tự nhiên ở trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc
xin trong vùng thường xuyên xảy ra dịch tụ huyết trùng địa phương ..............88
3.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ
huyết trùng chủng P52 bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp. .......94
3.3.3. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò được tiêm
phòng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng. ........................108
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 127
vi
DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
AGPT
DNA
BHI
CFU
CSY
CBPT7
cs
DNT
ELISA
FAO
GMT
HE
HS
HGXB5
HSND
HSTD
IHA
LD50
MAT
NCCLS
: Agar Gel Precipitin Test (Phản ứng kết tủa trên thạch)
: Deoxyribonucleic acid
: Brain Heart Infusion (Môi trường thạch BHI)
: Colony forming units (Đơn vị khuẩn lạc)
: Casein-sucrose-yeast (Môi trường thạch CSY)
: Chủng P. multocida phân lập tại Cao Bằng
: Cộng sự
: Dermonecrotic toxin (Độc tố gây hoại tử)
: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Phương pháp ELISA)
: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương thực và Nông
nghiệp Liên Hiệp Quốc)
: Geometic Mean Titer (Hiệu giá trung bình)
: Hemtoxylin Eosin (Phương pháp nhuộm HE)
: Haemorrhagic septicaemia (Nhiễm trùng huyết, xuất huyết)
: Chủng P. multocida phân lập tại Hà Giang
: Hệ số năm dịch
: Hệ số tháng dịch
: Indirect Haemaglunation Tets (Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp)
: Lethal Dose 50 – Liều gây chết 50%
: Microscopic Agglutination Test (Xét nghiệm huyết thanh học MAT)
: National Committee for Clinical Laboratory Standards (Viện Tiêu
chuẩn Lâm sàng và Xét ngiệm)
OMP
: Outer membrane protein (Protenin màng ngoài)
PCR
: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng nhân gen)
PMPT
: Passive Mouse Protection Test (Phương pháp bảo hộ thụ động trên chuột)
P. multocida : Pasteurella multocida
REP-PCR
: Repetitive extragenic palindrome (Nhân các đoạn gen lặp lại bằng
kỹ thuật PCR)
RR
: Relative Risk (nguy cơ tương đối RR)
SDS
: Sodium dodicyl sulphate
TEM
: Transport enrichment medium (Môi trường vận chuyển)
TSI
: Triple Sugar Iron (Môi trường 3 đường)
THT
: Tụ huyết trùng
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự tương quan giữa các type của Roberts và Carter ...............................14
Bảng 1.2. Hệ thống phân loại serotype P. multocida ..............................................16
Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype B của vi khuẩn
P. multocida ..........................................................................................51
Bảng 2.2. Thành phần các chất trong phản ứng PCR .............................................52
Bảng 2.3. Đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng
sinh (NCCLS – 2014) [126] ..................................................................54
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò trước khi
tiêm phòng vắc xin ................................................................................57
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định hiệu lực bảo hộ của trâu, bò sau khi
tiêm phòng vắc xin ................................................................................58
Bảng 3.1. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ............................59
Bảng 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng xét riêng ở từng loài
trâu, bò ..................................................................................................61
Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc tụ huyết trùng và tử vong ở các mùa vụ ....................63
Bảng 3.4. Hệ số năm dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Hà Giang và Cao Bằng............66
Bảng 3.5. Hệ số tháng dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà Giang
và Cao Bằng ..........................................................................................68
Bảng 3.6. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ..........70
Bảng 3.7. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi
mắc bệnh tụ huyết trùng ........................................................................72
Bảng 3.8. Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi
khuẩn P. mutocida phân lập được .........................................................74
Bảng 3.9. Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn
P. multocida phân lập được ...................................................................75
Bảng 3.10. Xác định serotype các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập
được bằng phản ứng PCR ......................................................................77
Bảng 3.11. Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ......79
Bảng 3.12. Dung quang khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ......81
Bảng 3.13. LD50 của vi khuẩn P. multocida ..........................................................84
viii
Bảng 3.14. Kiểm tra khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của ................86
Bảng 3.15. Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng tụ huyết trùng trong huyết
thanh của trâu, bò chưa được tiêm phòng vắc xin ..................................88
Bảng 3.16. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của trâu, bò chưa tiêm vắc xin phòng bệnh tụ
huyết trùng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng .....................90
Bảng 3.17. Điều tra tình hình tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò tại
Hà Giang và Cao Bằng ..........................................................................92
Bảng 3.18. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời
điểm 1 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ......................95
Bảng 3.19. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời
điểm 3 tháng sau tiêm vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ......................99
Bảng 3.20. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò tại thời
điểm 6 tháng sau khi tiêm vắc xin tụ huyết trùng .................................101
Bảng 3.21. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh
trâu, bò đối với từng loại vắc xin tại các thời điểm 1, 3, và 6 tháng
sau tiêm phòng ....................................................................................103
Bảng 3.22. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh trâu, bò sau khi
tiêm vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu .....................................................106
Bảng 3.23. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh
trâu, bò đối với vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu tại thời điểm 9 và
12 tháng sau tiêm phòng .....................................................................107
Bảng 3.24. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm
1 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng...............109
Bảng 3.25. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm
3 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng...............111
Bảng 3.26. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng đối với trâu, bò sau tiêm
6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ..............113
Bảng 3.27. Kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ dầu đối với trâu, bò
sau tiêm 9 và 12 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột
nhắt trắng ............................................................................................115
Bảng 3.28. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ
dầu chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và 6
tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng .................117
ix
Bảng 3.29. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng nhũ
dầu chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 9 và 12
tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng .................118
Bảng 3.30. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin tụ huyết trùng keo
phèn chủng P52 đối với trâu, bò sau khi tiêm tại thời điểm 1, 3 và
6 tháng bằng phương pháp bảo hộ thụ động chuột nhắt trắng ..............120
x
DANH M1FỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn P.multocida (Viện Thú y Quốc gia) ............50
Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò
tại tỉnh Cao Bằng.....................................................................................62
Hình 3.2. Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng ở từng loài trâu, bò
tại tỉnh Hà Giang .....................................................................................62
Hình 3.3. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông –
Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Hà Giang ......................................................65
Hình 3.4. Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và tử vong do tụ huyết trùng vụ Đông –
Xuân và Hè – Thu tại tỉnh Cao Bằng ......................................................65
Hình 3.5. Diễn biến tình hình bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại 2 tỉnh Hà
Giang và Cao Bằng .................................................................................69
Hình 3.6. Thử phản ứng lên men đường ................................................................76
Hình 3.7. Phản ứng sinh Indol ...............................................................................76
Hình 3.8. Phản ứng PCR xác định serotype của các chủng vi khuẩn P.
multocida phân lập được .........................................................................78
Hình 3.9. Thử độc lực trên chuột ...........................................................................80
Hình 3.10. Dung quang khuẩn lạc chủng vi khuẩn P. multocida phân lập
được ........................................................................................................82
Hình 3.11. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn P. multocida
phân lập được ..........................................................................................87
Hình 3.12. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc
xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Cao Bằng .................102
Hình 3.13. Chỉ số miễn dịch của trâu, bò được tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc
xin keo phèn chủng P52 sau 1, 3, 6 tháng tại tỉnh Hà Giang .................102
Hình 3.14. Tỷ lệ trâu, bò được bảo hộ sau tiêm vắc xin nhũ dầu và vắc xin
keo phèn chủng P52 ..............................................................................121
1
MỞ ĐẦU
Ở Việt Nam ngành chăn nuôi trâu, bò luôn giữ vai trò quan trọng trong sản
xuất nông nghiệp. Ngoài cung cấp thịt, sữa là 2 loại sản phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao phục vụ cho nhu cầu đời sống của người tiêu dùng, còn cung cấp sức kéo, phân
bón cho trồng trọt. Bên cạnh đó, chăn nuôi trâu, bò cũng là nguồn cung cấp các sản
phẩm phụ như: da, lông, phủ tạng ... cho ngành nông nghiệp chế biến. Theo thông
báo của Cục thống kê (2015) [173] tính tới thời điểm 01/10/2015, đàn trâu cả nước
có 2,5 triệu con, tăng 0,1% so với cùng thời điểm năm trước; đàn bò có 5,4 triệu
con, tăng 2,5%, riêng đàn bò sữa đạt 275,3 nghìn con, tăng 21%. Song song với sự
phát triển của ngành chăn nuôi trâu, bò, công tác phòng chống dịch bệnh được đặc
biệt coi trọng, trước tiên phải nói đến bệnh tụ huyết trùng. Đây là một trong những
bệnh truyền nhiễm thường được đánh giá là nguy hiểm đối với trâu, bò hiện nay ở
Việt Nam và trên thế giới. Bệnh gây ốm và chết nhiều trâu, bò làm ảnh hưởng đến
sản xuất, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người chăn nuôi. Báo cáo tại Hội nghị
phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm, thủy sản năm 2014 [1] và hội nghị tổng kết
năm 2015 và triển khai nhiệm vụ năm 2016 [2] của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn cho biết, trong năm 2014 có 26 tỉnh thành có bệnh tụ huyết trùng với
7.682 trâu, bò mắc bệnh, năm 2015 cũng có 26 tỉnh thành báo cáo có bệnh với
7.278 trâu, bò mắc. Chính vì vậy bệnh này luôn được xác định là đối tượng nghiên
cứu của ngành Thú y trong những năm qua và những năm tiếp theo.
Một số tỉnh miền núi phía Bắc, trong đó có Hà Giang, Cao Bằng, có diện tích
tự nhiên rộng chủ yếu là rừng núi, đây là điều kiện thuận lợi để phát triển chăn nuôi
gia súc, đặc biệt là chăn nuôi trâu, bò. Hiện nay, tổng đàn trâu, bò tỉnh Hà Giang
trên 265.000 con và tỉnh Cao Bằng trên 228.000 con. Trâu, bò là nguồn sức kéo
quan trọng và nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi. Nhưng do có những
đặc thù riêng về địa lý, kinh tế xã hội và tập quán chăn nuôi, việc áp dụng kỹ thuật
và phòng chống dịch bệnh trong chăn nuôi còn hạn chế, đây chính là những nhân tố
tạo nên sự tồn tại và phát sinh nhiều ổ dịch tụ huyết trùng, gây thiệt hại trong chăn
nuôi. Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kết
quả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3]; năm 2008 tỉnh Hà Giang có
276 trâu, 157 bò chết vì bệnh tụ huyết trùng, tỉnh Cao Bằng năm 2008 có 455 trâu,
bò chết và năm 2009 có gần 400 trâu bò chết do bệnh tụ huyết trùng.
Để khống chế bệnh, cho đến nay đã có một số loại vắc xin tụ huyết trùng
trâu, bò được các cơ quan nghiên cứu, sản xuất, sử dụng để tiêm phòng cho đàn
2
gia súc, nhưng bệnh vẫn liên tục xảy ra ở nhiều địa phương, do đó mục tiêu
khống chế, thanh toán bệnh tụ huyết trùng ở từng tỉnh và trong cả nước vẫn còn
gặp nhiều khó khăn. Ở tỉnh Hà Giang và Cao Bằng hàng năm công tác tiêm phòng
được triển khai 2 lần/năm, nhưng do một số địa phương chưa quan tâm nhiều đến
công tác tiêm phòng, tuyên truyền vận động chưa tốt, một số người dân chưa thực
sự hưởng ứng việc tiêm phòng, số trâu, bò tiêm đủ 2 mũi không đạt nên tỷ lệ tiêm
phòng thấp, vì vậy dịch bệnh tụ huyết trùng vẫn thường xuyên xảy ra. Việc phân
lập xác định vi khuẩn Pasteurella để làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh, tìm ra
quy luật lưu hành, tính gây bệnh của vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng vắc xin
phù hợp trong từng vùng, hạn chế tiến tới thanh toán bệnh là cần thiết. Vì vậy
việc lựa chọn vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò phù hợp cho địa
phương có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả công tác kiểm soát, khống chế bệnh.
Mục tiêu của đề tài
Xác định đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng và tình trạng mang trùng vi
khuẩn Pasteurella multocida ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng.
Xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học và yếu tố độc lực của vi khuẩn
Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò trên thực địa.
Đánh giá mức độ tương đồng giữa kháng nguyên trong vắc xin phòng bệnh
tụ huyết trùng trâu, bò và kháng nguyên vi khuẩn Pasteurella multocida phân
lập được, từ đó đề xuất giải pháp, lựa chọn vắc xin phòng bệnh hiệu quả.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, serotype kháng nguyên, yếu tố
độc lực, và sự lưu hành của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết
trùng ở trâu, bò tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng.
Bổ sung tư liệu khoa học về hiệu lực bảo hộ của vắc xin khi thử thách với chủng
vi khuẩn Pasteurella multocida cường độc phân lập được; làm tiền đề cho việc
tuyển chọn chủng vi khuẩn Pasteurella multocida thích hợp, ổn định kháng nguyên
cho việc phát triển vắc xin nội địa để phòng bệnh tụ huyết trùng tại các tỉnh miền núi
phía Bắc Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P. multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở cho
việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại hai tỉnh Hà Giang, Cao Bằng.
Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau khi tiêm vắc xin tụ
3
huyết trùng tại thực địa là cơ sở thực tiễn để các nhà khoa học tiếp tục nghiên
cứu thay đổi công nghệ chế tạo vắc xin theo hướng tăng cường sự an toàn, đồng
thời kéo dài thời gian bảo hộ, hạn chế tỷ lệ mắc bệnh, góp phần nâng cao hơn
nữa hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu, bò.
Kết quả đề xuất lựa chọn vắc xin phòng bệnh thích hợp tại địa phương giúp
cho cơ quan thú y và người chăn nuôi tại Hà Giang, Cao Bằng nói riêng và các tỉnh
miền núi phía Bắc nói chung rà soát, điều chỉnh kế hoạch sử dụng vắc xin thích
hợp, đạt tỷ lệ miễn dịch bảo hộ cao ở trâu, bò sau khi tiêm phòng.
Những đóng góp mới của đề tài
Sử dụng chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ trâu bò mắc
bệnh tại thực địa để xác định độ dài đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắc xin
phòng bệnh đã cho thấy sự tương đồng kháng nguyên giữa chủng vi khuẩn sản xuất
vắc xin thương mại với chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng phân lập được.
Xác định được vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò đạt hiệu quả
cao, phù hợp với điều kiện các tỉnh miền núi phía Bắc.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Pasteurella multocida
1.1.1. Phân loại vi khuẩn
Theo phân loại của Bergey’s (1994) [63], vi khuẩn Pasteurella multocida
thuộc bộ (order) Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe)
Pasteurelliae, giống (genus) Pasteurella, loài (Species) Pasteurella multocida.
1.1.2. Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn Pasteurella multocida (P. multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực
khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể
đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không
có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực. Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí
nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận
lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn
cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999) [86].
P. multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen.
Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P. multocida có thể thấy khi nhuộm bằng
xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân
lập từ con vật mới chết. Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính
chất này (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [45]. Theo OIE (2012) [129] sử dụng kỹ
thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho
thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực.
Vi khuẩn P. multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường
nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể. Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho
thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau. Peter và cs
(1996) [133] sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc
tố và không sinh độc tố của P. multocida. Môi trường này gồm có 17 thành phần,
trong đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide,
pantothenate, thiamine. Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi
trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không
5
sinh độc tố như lúc đầu. Warner S. (1996) [165] đã chế tạo ra môi trường TEM
(Transport enrichment medium), môi trường vận chuyển giàu dinh dưỡng. Môi
trường có bổ sung thêm một số kháng sinh nhằm ngăn chặn sự tạp nhiễm của các
loại vi khuẩn như: Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus và các vi khuẩn gram âm
khác, cũng như các loại nấm. Đây là điều kiện nâng cao khả năng phân lập được P.
multocida từ gia súc mắc bệnh. Theo De Alwis (1999) [86], môi trường thích hợp nhất
cho sự sinh trưởng của P. multocida là môi trường dextrose-starch agar và caseinsucrose-yeast (CSY). Trong các phòng thí nghiệm trên thế giới hiện nay thường sử
dụng môi trường thạch máu (Blood agar) và CSY agar bổ sung 5% máu (bò, cừu) đã
loại bỏ sợi huyết để nuôi cấy và phân lập P. multocida. Vi khuẩn P. multocida phát
triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 37 °C trong môi trường bổ sung 5% máu cừu, môi
trường dextrose - starch, casein-sucrose-yeast (CSY), choco- late, Mueller-Hinton,
hoặc môi trường nuôi cấy có dung dịch não tim (BHI) (OIE, 2012) [129].
Vi khuẩn P. multocida phát triển trong môi trường thông thường có thêm tụy
đệm, CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI. Trong môi
trường nước thịt Hotinger hoặc Martin sau khi nuôi cấy 24h, P. multocida mọc tốt,
làm đục môi trường tạo mùi tanh của nước dãi khô. Mùi tanh đặc trưng rõ nhất ở
pha phát triển, để lâu mùi tanh giảm dần (Michael và cs, 2002) [112]. Theo Seleim
(2005) [150], để vi khuẩn P. multocida phát triển tốt trên môi trường nhân tạo cần
thêm một số chất như: cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ,
nicotinamide, pantothenate, thiamine và đường. Trong đó leucin tác dụng kích thích
tăng trưởng. Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, các gen liên quan tới quá trình
trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh (Shivachandra, 2006) [155]. Hussain và
cs (2012) [97] nghiên cứu sự phát triển của vi khuẩn P. multocida trên các nguồn
cacbon khác nhau, sử dụng đường glucose, maltose, galactose, sucrose như nguồn
carbon để tăng sinh khối tế bào vi khuẩn P. multocida tăng hiệu quả sản xuất vắc xin.
Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích
hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng
Đạt, 1994) [8]. Môi trường này được bổ sung thêm 0,8% sucrose và 2% tụy đệm đã
làm tăng hiệu suất phát triển của vi khuẩn trong quá trình lên men (Phạm Quang
Thái, 2004) [43]. Nguyễn Mạnh Thắng và cs (2008) [49] cũng kết luận rằng, môi
trường Hottinger thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn P. multocida trong hệ thống lên
men kín từng mẻ vắc xin.
6
P. multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc. Theo Namioka và Murata (1961)
[121], trên môi trường thạch huyết thanh P. multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và
vi khuẩn có độc lực mạnh.
+ Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): nhày, ướt, có kích thước lớn nhất, bề mặt
khuẩn lạc ẩm ướt, có dung quang yếu, vi khuẩn có độc lực trung bình.
+ Khuẩn lạc R (Rough): có rìa xù xì, thường không có dung quang, vi khuẩn có
độc lực yếu.
Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, nhỏ
long lanh như giọt sương, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi cấy lâu, khuẩn lạc có màu
trắng ngà dính vào môi trường.
Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển
mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch
thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng.
Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để
chẩn đoán.
Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn,
có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính
với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung
quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng. Khuẩn lạc dạng S có dung
quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M
không có đặc điểm nói trên. Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P. multocida có
liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất
định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966) [94].
Theo De Alwis (1999) [86], tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh
quang của khuẩn lạc khác nhau:
+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm
2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim
loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent).
+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu
vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent).
7
+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát
quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent). Khuẩn lạc nhỏ tròn trong.
Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của
vi khuẩn P. mutocida. Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P. multocida có
tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990) [156]. Rimler (1992) [141] cho
rằng, khuẩn lạc của vi khuẩn P. multocida tập trung ở hai dạng chính. Khuẩn lạc
dung quang sắc cầu vồng và khuẩn lạc dung quang màu xanh. Dung quang của
khuẩn lạc liên quan đến vỏ nhày của vi khuẩn. Vi khuẩn có dung quang sắc cầu
vồng đứng riêng hoặc từng đôi, có vỏ nhày và rất độc, thường gây bệnh thể cấp
tính. Vi khuẩn, có dạng khuẩn lạc dung quang màu xanh kém độc hơn, thường
gặp ở những đàn gia súc bị dịch địa phương.
1.1.3. Đặc tính sinh hóa
P. multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose,
galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose. Dương tính
với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase. Phản ứng urease âm tính, không mọc
trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010 [3]; Lê Văn Dương, 2012 [6]).
Mitra và cs (2013) [113] cho biết, vi khuẩn P. multocida dương tính với phản
ứng Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose,
galactose, fructose và mannitol.
Azmat và cs (2013) [59] nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn P.
multocida phân lập tại Pakistan cho thấy, vi khuẩn dương tính với oxydase,
catalase, sinh Indol. Phản ứng với TSI cũng dương tính, lên men đường xylose,
không lên men đường mantose, phản ứng nitrate dương tính, âm tính với phản ứng
urease và citrate, vi khuẩn không di động.
1.1.4. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P. multocida
1.1.4.1. Yếu tố độc lực
Kháng nguyên
Kháng nguyên P. multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng
nguyên cũng luôn thay đổi. Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân
bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vắc xin. Cho đến
8
nay, người ta đã xác định được kháng nguyên của P. multocida có 3 loại là:
Kháng nguyên vỏ K, kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP
(outer membrane protein).
- Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không
gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R. Kháng nguyên K bao bọc xung quanh
thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp
xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O. Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K
khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) [134] chúng gồm có 3 loại là α, β, γ.
Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide. Kháng nguyên
protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh. Kháng nguyên protein
đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố
miễn dịch quan trọng.
Vai trò của polysaccharit trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ kém.
Theo Bain và cs (1982) [61], những polysaccharide tinh khiết không tạo được sự bảo
hộ đối với chuột, thỏ và bò khi thử thách cường độc. Thành phần polysaccharide chính
trong kháng nguyên serotype A là axit hyaluronic (Rosner và cs, 1992) [143]. Ngược
lại với kháng nguyên serotype A, kháng nguyên polysaccharide serotype B bao gồm
arabinose, mannose, đường galactose với những mối liên kết chưa rõ ràng (Boyce và
cs, 2000) [67].
- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P. multocida có kháng nguyên thân là phức
hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch
phenol và siêu âm. Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch.
Namioka và Murata (1964) [122] là những người đầu tiên phát triển kỹ thuật
định type kháng nguyên thân. Sau khi bộc lộ kháng nguyên thân bằng xử lý tế bào
vi khuẩn với acide HCl và cho ngưng kết với kháng huyết thanh thỏ. Sử dụng kỹ
thuật này các tác giả đã xác định được 11 kháng nguyên thân. Price và Smith (1966)
[134] dùng phương pháp điện di miễn dịch trên máy lắc Mikle đã tách được 16
kháng nguyên O và kí hiệu từ 1 - 16. Sau khi nhuộm đỏ thiazine, xử lý nhiệt và
enzyme, tác giả xác định được 6 trong 16 kháng nguyên O là protein. Tiếp đến
Heddleston và cs (1972) [95], đã sử dụng phản ứng kết tủa trên thạch để định loại
kháng nguyên thân. Để thực hiện phản ứng này, tác giả đem tế bào vi khuẩn xử lý ở
nhiệt độ 100 °C/1 giờ, sau đó thu lấy huyễn dịch, kháng huyết thanh được chuẩn bị
qua gà, bằng phương pháp này đã phát hiện có 16 kháng nguyên thân.
9
Johnson và cs (1989) [102], phát hiện được một kháng nguyên O là protein với
hơn 40 chuỗi polypeptit trong một chủng P. multocida gây bệnh. Khi mở rộng
nghiên cứu 14 chủng gây bệnh trên các loài vật từ những vùng khác nhau, cũng cho
kết quả tương tự. Tuy nhiên qua phân tích, tác giả cho rằng không có một protein
nào đặc trưng cho những chủng P. multocida phân lập từ bệnh tụ huyết trùng, mà chỉ
có một chuỗi polypeptit chính (27kDa) được coi là chung cho những chủng phân lập.
Các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên
O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O. Những chủng vi
khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O.
Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng, kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng
trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng,
1994) [39].
- Protein màng ngoài (Outer membrane proteins – OPM): kháng nguyên
màng ngoài gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu
hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó). Một trong những
protein độc tính quan trọng của protein màng ngoài này là protein gắn huyết cầu
tố (hemoglobin-binding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên màng
hemoglobin. Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải
trình tự (Seleim, 2005) [150].
Ba loại protein màng ngoài đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi
được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III. Sự khác biệt này
được phân loại dựa trên cấu trúc chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (W) của kháng
nguyên này, khối lượng phân tử dao động trong khoảng giữa 28 kDa và 40kDa.
Protein H của P. multocida có các đặc điểm tương tự protein xuyên màng của vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, giống các peptidoglycane, kháng trypsine,
kháng dung dịch SDS (sodium dodicyl sulphate). Hơn nữa protein H phức hợp với
lipopolysaccharide khi gây đáp ứng miễn dịch. Mặc dầu không thể phát hiện ra mối
quan hệ giữa độc tính của các chủng với protein màng ngoài, song OMP type I có
độc tính cao với lợn và gây ra viêm teo mũi truyền nhiễm. ngược lại OMP type II và
III ít độc tính hơn. Protein OmpA và OmpH cho thấy sự không đồng nhất đáng kể,
ít nhất là giữa các chủng P. multocida ở gia cầm, một số các biến thể khác nhau có
liên quan tới các loại kháng nguyên cụ thể B, D, F (Davies và cs, 2003) [81]. Một
kháng nguyên bề mặt khác đã được xác định là một protein kết hợp 39-kDa (Cp39)
10
xuất hiện trong các chủng P. multocida ở gia cầm, chủng P-1059 (serotype A: 3) và
X-73 (serotype
A: 1) (Sthitmatee và cs, 2008) [157]. OmpH và Pasteurella
lipoprotein E (PlpE) là các kháng nguyên trên bề mặt có sức đề kháng cao có liên
quan đến P. multocida serotype A: 1, A: 3, và A: 4 thu thập từ những cá thể bò bị
xuất huyết nặng (Wu và cs, 2007 [171]; Okay và cs, 2012 [130]).
Kháng nguyên của P. multocida rất phức tạp, xét về quan hệ hoá học, các
kháng nguyên protein và lipopolysaccharid của P. multocida có vai trò chính trong
quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên là
polysaccharid đóng vai trò hỗ trợ.
Giáp mô của vi khuẩn P. multocida
Giáp mô là lớp vỏ nhày bao bọc ngoài tế bào, được sinh ra ở điều kiện nhất
định trong quá trình sinh trưởng. Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự
thực bào và các tác động có hại của môi trường. Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất
dinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời là yếu tố độc lực của vi khuẩn, vi khuẩn có giáp
mô thường có độc lực cao. Carter (1955) [70] cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 37 oC
trong môi trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn phát triển giáp mô đầy đủ,
sau đó mất dần đi. Điều này chứng tỏ giáp mô chỉ tồn tại ở những vi khuẩn mới
phân lập từ gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong thời gian ngắn. Vi khuẩn phân
lập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và có độc lực,
khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi
khuẩn sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực (Carter, 1967) [72]. Nhưng nếu cấy
những vi khuẩn đã mất giáp mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua
động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực.
Đặc tính kháng nguyên giáp mô của P. multocida xác định theo type huyết thanh A,
B, D, E và F (Wilson và cs, 1992) [168]. Giáp mô của chủng type A được cấu tạo bởi axit
hyaluronic và polysaccharide. Axit hyaluronic không bị thực bào phát hiện do nó không có
tính miễn dịch, nhưng khi tinh chế kháng nguyên K của P. multocida serotype A có một
protein (300kDa) có thể ức chế đại thực bào của bò (Seleim, 1993) [149].
Theo Seleim (2005) [150], khi tiến hành loại bỏ axit hyaluronic của giáp mô
thì không những vi khuẩn giảm khả năng bám dính với tế bào vật chủ mà còn dễ
dàng bị thực bào phát hiện. Tác giả cho rằng, giáp mô là thành phần rất quan trọng
trong việc xác định nhóm huyết thanh (serotype) của P. multocida.
11
Độc lực của vi khuẩn
Độc lực của P. multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế kỷ 20, Baldrey đã
nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có
độc tính của lipopolysaccharide. Các nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P.
multocida trên thế giới cho thấy độc lực của vi khuẩn này không ổn định, nó thay
đổi tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh, cấy chuyển nhiều lần
trong môi trường nhân tạo độc lực của nó cũng yếu đi.
Nghiên cứu của Ramdani và cs (1990) [137] cho thấy, một trong những chủng
P. multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404 thuộc
serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/chuột sau 18 giờ chuột
đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết.
Diallo và cs (1995) [87] nghiên cứu độc lực của 9 chủng P.multocida phân lập
được thuộc serotype A tại Australia, trong 9 chủng này có 3 chủng không chứa plasmid
nhưng rất độc với chuột, tiêm liều 100 CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trong
vòng từ 10-24 giờ, trong khi đó có 3 chủng phân lập có chứa 1 plasmid và 3 chủng
có chứa 2 plasmid lại không có khả năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn.
Chung và cs (2001) [79] cũng tiến hành đánh giá độc lực của vi khuẩn P. multocida
chủng X-73, PBA 930 và PBA 954 thuộc serotype A trên chuột và gà. Độc lực của
chủng X-73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia, đối với chuột thì độc lực của chủng
PBA 930 là thấp nhất.
Borrathybay và cs (2003) [66] đã nghiên cứu sự liên quan giữa vỏ và độc lực của
vi khuẩn P. multocida type A dưới kính hiển vi điện tử bằng kỹ thuật đánh dấu thấy: vi
khuẩn P. multocida chủng PM-18 và X-73, độ dày trung bình của vỏ lần lượt là 91,4 và
50,4nm, hai chủng này có độc lực cao. Hai chủng PM-1 và PM-3, độ dày trung bình
của vỏ chỉ là 21,0 và 29,8 nm nên có độc lực thấp hơn. Tuy nhiên cũng có ngoại lệ như
chủng P-1059, độ dày trung bình của vỏ lên tới 101,2 nm nhưng chỉ có độc lực trung
bình. Độ dày trung bình của vỏ vi khuẩn tùy thuộc vào số lượng protein kháng nguyên
39kDa, số lượng protein này càng nhiều thì vỏ vi khuẩn càng dày.
Khả năng xâm nhập và nhân lên trong cơ thể vật chủ được tăng cường bởi sự
hiện diện của kháng nguyên và polysaccharide đó là một trong những yếu tố độc lực
quan trọng nhất đối với loài này (Wilkie và cs, 2012) [169].
12
Hoàng Đăng Huyến (2004) [23] nghiên cứu độc lực của vi khuẩn bằng phương
pháp kiểm tra dung quang của khuẩn lạc và thử độc lực trên chuột, thấy 100% số
chủng thử nghiệm đều giết chết chuột trong vòng 5-10 giờ, kiểm tra dung quang
khuẩn lạc thấy có ánh xanh lơ, điều đó khẳng định độc lực của các chủng vi khuẩn
phân lập được là rất cao. Đặng Xuân Bình và cs (2010) [3] khi thử độc lực của các
chủng P. multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng
thấy các chủng đều có độc lực cao gây chết chuột từ 80 – 100% trong vòng 48 giờ
sau khi công cường độc. Cù Hữu Phú và cs (2014) [36] kiểm tra độc lực của 10
chủng P. multocida, thấy cả 10 chủng đều có độc lực mạnh, có khả năng gây chết
chuột trong vòng 16 – 32 giờ sau tiêm. Hoàng Văn Khoản và cs (2015) [24] kiểm
tra dung quang khuẩn lạc của giống vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin chủng
N41, thấy khuẩn lạc có dung quang đặc trưng, màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm phần
lớn diện tích bề mặt khuẩn lạc, phần diện tích khuẩn lạc còn lại có màu vàng da cam
chứng tỏ vi khuẩn có độc lực cao.
Độc lực của P. multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng
vi khuẩn và loài vật kí sinh. Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P. multocida các
tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do P. multocida gây ra người ta tìm
thấy dấu hiệu tác động của độc tố.
Độc tố của vi khuẩn P. multocida
Độc tố của P. multocida là chất phân bào mạnh, có khả năng hoạt hóa men
phospholipase C beta. Độc tố này cũng thúc đẩy hoạt động của RhoA và tác động tới
các protein nhóm G như: G alpha (q), G alpha (12/13) (Orth và cs, 2005) [131].
Theo Blocker và cs (2006) [64], độc tố P. multocida còn có khả năng tái tạo
polymeractin, làm thay đổi hình thái tế bào dendrite (Dendritic cells), làm cản trở sự
xâm nhập của tế bào này vào các hạch lympho trong quá trình đáp ứng miễn dịch đối
với bệnh tụ huyết trùng. Tuy nhiên độc tố của P. multocida không ảnh hưởng tới sự ẩm
bào của các đại thực bào (macropinocylosis).
Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một
số chủng P. multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của
những độc tố này tương đối giống nhau. Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có
13
độc tố bản chất là protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất
protein của serotype E.
- Nội độc tố (Lipopolysaccharide): Lipopolysaccharide là yếu tố độc lực chính
và nó còn đóng một vai trò chủ yếu trong việc gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò.
Nội độc tố được sinh ra bởi các chủng P. multocida, kể cả chủng có độc lực và
không có độc lực, Heddleston và cs (1972) [95] đã chứng minh nội độc tố được gắn
kết lỏng lẻo và có thể rửa trôi khỏi tế bào vi khuẩn P. multocida bằng dung dịch
nước muối có formalin và khi được làm lạnh. Nội độc tố của P. multocida có thể
chiết xuất được bằng acid trichloroacetic theo qui trình của Boivin. Khi tiến hành
nghiên cứu lipopolysaccharide của các chủng có nguồn gốc từ các ký chủ khác nhau
cho
thấy
chúng
khá
giống
với
nội
độc
tố
của
Enterobacteriacae.
Lipopolysaccharide là thành phần quan trọng giúp xác định kháng nguyên thân, khi
tiến hành điện di cho thấy lipopolysaccharide có khối lượng phân tử rất thấp. Bằng
phương pháp này cũng cho thấy lipopolysaccharide của P. multocida ngắn hơn của
các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và S. typhimurium (Horadagoda và cs,
2001) [96]. Lipopolysaccharide được xác định có khả năng kích thích giải phóng
TNF-a từ đại thực bào phế nang phổi bò và nhiều yếu tố gây hoại tử khác,
interleukine đã được giải phóng và cắt ngang bởi chất gây gián phân hoạt hóa của
nội độc tố, dẫn đến rối loạn hoạt động của tế bào (Lax và Thomas, 2002) [109]. Các
chủng P. multocida thuộc type D gây viêm teo mũi sau khi tiến hành điện di phát hiện
thấy có ít nhất 6 loại lipopolysaccharide đồng nhất với protein màng ngoài.
Vi khuẩn P. multocida được nuôi cấy trên môi trường thạch tới 72 giờ sẽ sinh
nhiều độc tố hơn. Nội độc tố của vi khuẩn P. multocida chỉ xuất hiện trong huyết thanh
của những con vật bị bệnh nặng từ 3 - 5 giờ trước khi chết với những triệu chứng như
giảm nhiệt độ, run rẩy… (Horadagoda và cs, 2001) [96].
- Ngoại độc tố (Exotoxin): Ngoại độc tố là sản phẩm của giáp mô P.
multocida, đặc biệt là của các chủng thuộc type D. Yếu tố này là nhân tố gây hoại tử
niêm mạc (dermonecrotic toxin - DNT). Gen toxA qui định tổng hợp dermonecrotic
toxin có chiều dài 4,381 bp, nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30 °C thì hoạt tính của gene toxA
