Tuyển Chọn Và Khảo Sát Điều Kiện Nuôi Cấy Vi Khuẩn Kỵ Khí Có Khả Năng Thủy Phân Rơm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT
ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI KHUẨN KỴ KHÍ CÓ
KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN
ThS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG

SINH VIÊN THỰC HIỆN
TÔ THỊ NGỌC ANH
MSSV:3064437
LỚP:CNSH TT K32

Cần Thơ, Tháng 11/2010


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS.Võ Văn Song Toàn

Tô Thị Ngọc Anh

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

ThS.Dương Thị Hương Giang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến:
Các thầy cô đã truyền dạy kiến thức cho em trong suốt 4 năm học vừa qua.
Ban giám đốc, và các thầy cô, anh chị phụ trách trong Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn
thành luận văn một cách tốt nhất.
Cô Dương Thị Hương Giang, thầy Võ Văn Song Toàn đã tận tình hướng dẫn,
truyền đạt tri thức bổ ích, tác phong làm việc khoa học, giúp đỡ em trong suốt thời
gian thực hiện luận văn.
Chị Nguyễn Thị Xuân Dung, anh Nguyễn Ngọc Thạnh luôn trao đổi, truyền đạt
kinh nghiệm tạo điều kiện cho em thực hiện các thí nghiệm.

Em xin chân thành cám ơn Cô cố vấn học tập, các bạn cùng lớp và các bạn
CNSH 33 phòng sinh hóa đã đồng hành và động viên em trong học tập.
Em xin kính chúc quý thầy cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khoẻ và
công tác tốt.

Cần Thơ, ngày....tháng....năm 2010

Tô Thị Ngọc Anh


i

TÓM LƯỢC
Mười bốn dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ bò có khả năng sinh
cellulase được nuôi cấy tách ròng trên môi trường agar chứa 0,5% cơ chất rơm.
Kiểm tra hoạt tính thủy phân của 14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ
bò trên môi trường agar chứa rơm 0,5% cho thấy dòng vi khuẩn 43 sinh trưởng
mạnh mẽ, có khả năng thủy phân rơm mạnh hơn 13 dòng còn lại. Dòng 43 là vi
khuẩn gram âm, có dạng cầu đôi, và có thể chuyển động được. Chúng có thể sinh
trưởng trong khoảng pH rộng từ 5,0 – 10,0, nhiệt độ từ 25-40 0C. Trong điều kiện
pH 6,0, nhiệt độ 300C, dòng 43 cho hoạt độ thủy phân cao nhất. Với thời gian ủ là 5
ngày, tương ứng với mật số vi khuẩn chủng đầu vào là 106, dòng 43 sinh trưởng
nhanh, hàm lượng protein sinh ra là 0,10 mg/ml, đường khử sinh ra đạt giá trị
0,046µg/ml.
Từ khóa: dạ cỏ bò, đường khử, kỵ khí, thủy phân, rơm.


ii

MỤC LỤC

Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ....................................................................................................
LỜI CẢM TẠ .............................................................................................................
TÓM LƯỢC ..............................................................................................................i
MỤC LỤC ................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH ...............................................................................................vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................................vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................3
2.1. TỔNG QUAN VỀ RƠM RẠ, CELLULOSE, .................................................3
2.1.1. Tổng quan về rơm ...............................................................................3
2.1.2. Cellulose...............................................................................................4
2.2. CELLULASE....................................................................................................6
2.2.1.

Tổng quan về Cellulase .......................................................................6

2.2.2.

Cơ chế hoạt động của Cellulase ..........................................................7

2.2.3.

Giá trị kinh tế của Cellulase................................................................8

2.2.4.

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................8

2.3.1.1.

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí ...................................8

2.3.1.2.

Phương pháp đo đường kính thủy phân..................................9

2.3.1.3.

Phương pháp pha loãng vi sinh vật..........................................9

2.3.1.4.

Phương pháp nhuộm gram vi khuẩn.....................................10

2.3.1.5.

Đếm mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống...........10

2.2.5.

Phương pháp sinh hóa......................................................................11
2.3.2.1. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976).....11

2.3.2.1.

Xác định hoạt tính Cellulase bằng phương pháp Nelson-

Somogyi (1942) ..........................................................................................11

2.3. TỔNG QUAN VỀ HỆ VI SINH VẬT KỴ KHÍ TRONG DẠ CỎ TRÂU BÒ ..
..........................................................................................................................11
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC .........................12
2.4.1. Trong nước .......................................................................................12


iii

2.4.2. Ngoài nước.........................................................................................12
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................13
3.1. Địa điểm, thời gian, hóa chất, phương tiện nghiên cứu ............................... 13
3.1.1.

Địa điểm ............................................................................................ 13

3.1.2.

Thời gian ..........................................................................................13

3.1.3.

Vật liệu thí nghiệm ...........................................................................13

3.1.3.1. Nguyên liệu .................................................................................13
3.1.3.2. Nguồn gốc vi khuẩn....................................................................13
3.1.4.

Hoá chất ............................................................................................ 13

3.1.5.

Thiết bị .............................................................................................. 13

3.1.6.

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật...................................13

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................14
3.2.1.

TN1: Khảo sát hàm lượng cellulose trong bột rơm .........................14

3.2.2.

TN2: Phân lập vi khuẩn kỵ khí trên môi trường cơ chất rơm ........15

3.2.3.

TN3: Tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm

cao

............................................................................................................15

3.2.4.

TN4: Khảo sát nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn

trên cơ chất rơm. ............................................................................................ 16
3.2.5.

TN5: Khảo sát thời gian tối ưu cho sự phát triển của các dòng vi

khuẩn thủy phân rơm.....................................................................................17
3.2.6.

TN6: Khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn chủng vào lên

quá trình phân hủy rơm .................................................................................18
3.3. Xử lý thống kê ................................................................................................ 19
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................20
4.1. TN1: Hàm lượng cellulose trong bột rơm......................................................20
4.2. TN 2: Kiểm tra độ ròng, nhuộm gram, mô tả đặc điểm của khuẩn lạc và vi
khuẩn.......................................................................................................................20
4.3. TN3: Tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm cao.. 23
4.4. TN4: Khảo sát pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của dòng 43 và 51 .25
4.5. TN5: Khảo sát thời gian tối ưu cho sự phát triển của dòng vi khuẩn 43 .....27
4.6. TN6: Ảnh hưởng mật số vi khuẩn chủng vào đến sự sinh trưởng của vi
khuẩn

............................................................................................................30


iv

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 33
5.1. Kết luận...........................................................................................................33
5.2. Đề nghị ............................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................34

v

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1:

Thành phần cellulose, hemicelluloses và ligin trong một số thực vật ..........5

Bảng 2:

Thành phần môi trường rơm .....................................................................14

Bảng 3:

Thành phần % cellulose trong các loại rơm khác nhau.............................. 20

Bảng 4:

Hình thái khuẩn lạc...................................................................................22

Bảng 5:

Hình thái vi khuẩn ....................................................................................22

Bảng 6:

Số liệu đường kính thủy phân của 14 dòng vi khuẩn kỵ khí ......................24

.

vi

DANH SÁCH HÌNH
Hình 1 (a): Đốt rơm trên đồng ruộng...........................................................................3
Hình 1 (b): Sử dụng rơm làm giá thể trồng nấm..........................................................3
Hình 2:

Phân tử cellulose và đơn phân của phân tử cellulose ..................................4

Hình 3:

Liên kết hydro nội và gian phân tử của cellulose.........................................5

Hình 4:

Cấu trúc enzyme cellulase ..........................................................................6

Hình 5:

Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase ......................................................7

Hình 6:

Bình hút ẩm chân không .............................................................................8

Hình 7:

Cách pha loãng mẫu .................................................................................10

Hình 8:

Các bước xác định hàm lượng cellulose trong bột rơm ............................. 14

Hình 9:

Quy trình tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí có khả năng thủy phân rơm cao
.................................................................................................................16

Hình 10: Quy trình khảo sát thời gian tối ưu cho sự phát triển của dòng vi khuẩn được
chọn..........................................................................................................17
Hình 11: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của mật số vi khuẩn lên hiệu suất thủy phân
rơm...........................................................................................................18
Hình 12: Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 30 (a), 33 (b), 38 (c), 39 (d) ..................21
Hình 13 : Hình thái vi khuẩn ....................................................................................21
Hình 14: Vòng tròn đường kính thủy phân của 2 dòng 51 và 43 sau 5 ngày ủ..........23
Hình 15: Vòng tròn thủy phân của dòng 43 tại pH 6,0; 7,0 ở 30 0C ..........................23
Hình 16: Vòng tròn thủy phân của dòng 43 tại tại nhiệt độ ủ 30 0C, và 35 0C ............26
Hình 17: Biểu đồ thể hiện sự tương tác giữa pH và nhiệt độ đến hoạt tính thủy phân
của dòng vi khuẩn 43 sau 5 ngày ủ............................................................................26
Hình 18: Mật số vi khuẩn theo thời gian..................................................................27
Hình 19: Biểu đồ thể hiện hàm lượng protein sinh ra theo thời gian ........................28
Hình 20: Biểu đồ thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian (µg/ml) .............29
Hình 21: Hoạt tính của CMCase theo thời gian .......................................................30
Hình 22: Ảnh hưởng của mật số chủng vào đến hàm lượng protein sinh ra..............30
Hình 23: Mẫu hàm lượng protein theo mật số vi khuẩn ...........................................31
Hình 24: Ảnh hưởng của mật số chủng vào đến hàm lượng đường khủ sinh ra........31


vii

CÁC TỪ VIẾT TẮT
CBH:

Cellobiohydrolase

Egl:

Endoglucanase

Bgl:

β-glucosidase

CMC:

Carboxymethyl-cellulose


viii

PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP VI SINH-SINH HÓA
I. CÁC PHƯƠNG PHÁP VI SINH
1.

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.

2.

Các bước chuẩn bị môi trường rơm 0,5% (Pha 1000ml dung dịch).

3.

Phương pháp pha loãng.

4.

Phương pháp đếm mật số vi khuẩn bằng cách đếm sống.

5.

Phương pháp nhuộm gram.

6.

Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulase bằng đường tròn thủy phân. Khảo

sát hiệu suất thuỷ phân CMC của các dòng vi khuẩn đã phân lập.
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA.
1.

Phương pháp Bradford (1976).

2.

Phương pháp Nelson (1942).

PHỤ LỤC 2: SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ

Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng trọng điểm sản xuất lương thực cả
nước, sản lượng lúa hằng năm toàn vùng chiếm hơn 53% tổng sản lượng lúa và đóng
góp 90% sản lượng gạo xuất khẩu cả nước. Ước tính hàng năm, đồng bằng sông Cửu
Long sản xuất khoảng 18-19 triệu tấn lúa, thì cũng có một lượng rơm rạ tương đương
được tạo ra. Sau khi thu hoạch, rơm rạ thường được dùng làm chất đốt trong gia đình,
thức ăn dự trữ cho trâu bò, giá thể để trồng nấm rơm, sản xuất giấy... nhưng phần lớn
được chất thành đống và đốt bỏ ngay trên đồng ruộng. Những nghiên cứu gần đây cho
thấy, đốt rơm rạ có thể làm mất đi gần như hoàn toàn lượng dinh dưỡng trong đất.
Lượng P mất đi khoảng 25%, K mất đi khoảng 20%, S mất từ 5-60%, làm ảnh hưởng
đến năng suất thu hoạch mùa vụ sau. Việc đốt rơm, rạ không những gây ô nhiễm môi
trường nghiêm trọng, mất an toàn giao thông, mà còn dẫn đến lãng phí nguồn nhiên
nguyên liệu. Khói rơm còn là khói độc, là nguyên nhân gây ra các bệnh về đường hô
hấp, mãn tính... Trong một nghiên cứu mới đây của Cục công nghệ bảo vệ môi trường
Mỹ cho thấy trong thành phần khói rơm có tồn tại hợp chất vòng thơm gây ung thư.
Việc xử lý rơm rạ sau thu hoạch đã trở thành một vấn đề cấp thiết, để bảo vệ môi
trường sống, sức khỏe, và tránh gây lãng phí nguồn nguyên liệu.
Cellulase là enzyme phân hủy cellulose và những dẫn xuất của cellulose, được
nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn so với nhiều loại enzyme khác như amylase và
protease.... Tuy nhiên, enzyme này đóng vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu khoa
học, cũng như trong đời sống xã hội. Cụ thể như: cellulase phá vỡ thành tế bào nên
thường được áp dụng vào việc nuôi cấy tế bào trần trong việc lai tạo giữa các tế bào
khác nhau. Cellulase còn được trộn vào trong thức ăn gia súc để tăng sự tiêu hóa, hấp

thụ thức ăn động vật đặc biệt là động vật nhai lại. Ngoài ra, cellulase có chức năng
quan trọng thủy phân phụ phẩm công nghiệp thành dịch rỉ đường, một thành phần
không thể thiếu trong lên men ethanol, sản xuất nhiên liệu sinh học.
Trong dạ cỏ trâu bò có một hệ vi sinh vật rất phong phú đa dạng có khả năng
thủy phân những thức ăn có thành phần chính là cellulose, trợ tiêu hóa. Bên cạnh đó,
vi sinh vật có thời gian sinh trưởng ngắn nhưng hiệu quả chuyển hóa các chất thành
những chất đơn giản cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn có thể
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

1

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

chuyển hóa một lượng thức ăn lớn gấp 30-40 lần so với trọng lượng cơ thể của chúng
và gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động và thực vật (Nguyễn Đức
Lượng, 1998). Đề tài "TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VI
KHUẨN KỴ KHÍ CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN RƠM" có ý nghĩa thiết thực trong
nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ bò xử lý rơm rạ sau khi thu
hoạch, và các nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase sau này.
1.2. Mục tiêu đề tài
1.

Tuyển chọn dòng vi khuẩn kỵ khí từ dạ cỏ trâu bò có khả năng thủy phân

2.

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng phát triển vi khuẩn được

rơm.

chọn trên cơ chất rơm.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

2

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ RƠM RẠ, CELLULOSE.
2.1.1.

Tổng quan về rơm

Rơm là phụ phẩm của cây lúa sau khi thu hoạch. Rơm rạ có thành phần chính là
celllulose, hemicellulose và lignin, chất hữu cơ kết dính (nhựa) và các chất vô cơ khác.
Trong đó cellulose chiếm khoảng 37,4%; hemicellulose (44,9%); lignin 4,9% và hàm
lượng tro (oxit silic) cao từ 9 đến 14%.
Trong nông nghiệp rơm rạ sau khi thu hoạch thường được dùng làm thức ăn dự
trữ cho trâu bò, giá thể trồng nấm, làm chất đốt cho gia đình, và đặc biệt là được đốt

thành tro bón cho đồng ruộng. Việc đốt rơm, rạ trực tiếp ngay trên đồng ruộng gây ra
bất lợi lớn cho trồng trọt sản xuất. Đồng ruộng bị khô, chai cứng, một lượng lớn nước
bị bốc hơi do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháy rơm, rạ. Quá trình đốt rơm, rạ
ngoài trời không kiểm soát được lượng dioxit cacbon CO2, phát thải vào khí quyển
cùng với cacbon monoxit CO; khí metan CH4; các oxit nitơ NOx; và một ít dioxit
sunfua SO2. Thành phần gây ô nhiễm không khí do đốt rơm rạ là các hydrocacbon
thơm đa vòng (viết tắt là PAH) ; dibenzo-p-dioxin clo hoá (PCDDs), và dibenzofuran
clo hoá (PCDFs), tiềm tàng nguy cơ gây ung thư, đe dọa đến sức khỏe con người.

(b)

(a)

Hình 1. (a) Đốt rơm trên đồng ruộng; (b) Sử dụng rơm làm giá thể trồng nấm
(*Nguồn: ngày 23/07/2010)

Hiện nay, rơm rạ được dùng làm cá thể nuôi vi khuẩn sản thu enzyme, sản xuất
phân bón vi sinh, nhiên liệu sinh học, sản xuất bột giấy, làm bê tông siêu nhẹ, đệm lót
vận chuyển hàng hóa dễ vỡ, vận chuyển hoa quả, v.v…
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

3

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

2.1.2.

Trường ĐHCT

Cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay
[C6H7O2(OH)3]n, cellulose là nguyên liệu hữu cơ phổ biến nhất trong thiên nhiên vì nó
là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật, gỗ, cỏ cây hoa lá… và chiếm 50%
tổng lượng hydrocacbon trên trái đất. Cellulose là polysacarit gồm những gốc ß-Dglucoside nối với nhau bằng liên kết 1,4- ß-D-glucoside, vì vậy cellulose không có
mạch nhánh.

Hình 2. Phân tử cellulose và đơn phân của phân tử cellulose
(*Nguồn:
/>Understanding_of_Polymer_Chemistry,_Thermochemistry_and_Kinetics, Ngày 23/07/2010)

Cellulose có mức độ polymer hóa rất cao tới 10000-14000 đơn vị glucose/ phân
tử, là thành phần chính trong tế bào thực vật dưới dạng vi sợi có đường kính khoảng 220 nm. Những vi sợi này tạo thành mạng lưới vững chắc của thành tế bào, mỗi đơn vị
là một disaccharide gọi là cellobiose. Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi
(microfibrin), các vi sợi thường tồn tại hai vùng:
+ Vùng kết tinh: cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững. Enzyme
cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này.
+ Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các
yếu tố bên ngoài. Enzyme cellulase rất dễ tác động làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của
chúng. Chiều dài phân tử cellulose trong vùng này thường lớn gấp hàng chục lần so
với vùng kết tinh.
Cấu trúc bậc hai và bậc ba rất phức tạp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro, lực
liên kết hydro nội và gian phân tử trùng hợp nhiều lần làm cho phân tử cellulose có độ
cứng và vững chắc. Vì vậy cellulose là một hợp chất khó phân giải. Cellulose không
tan trong nước. Khi đun nóng với acid sunfuric, cellulose bị thủy phân trở thành
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

4

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

cellubiose, rồi trở thành β-glucose.

Hình 3. Liên kết hydro nội và gian phân tử của cellulose
(*Nguồn: Ngày 23/07/2010)

Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay
kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc
một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc -metyl, -etyl, …
tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan trong nước ở các mức độ khác nhau.
Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần
là oxy-cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4), và muối của nó.
Dung dịch kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose có
phân tử nhỏ. Đặc biệt Cellulose dễ hòa tan trong dung dịch(Cu(NH3)4(OH)2, và hàng
loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm….)
Bảng 1. Thành phần cellulose, hemicelluloses và ligin trong một số thực vật
Thực vật

Cellulose (%)

Hemicellulose (%)

Ligin (%)

Cây gỗ cứng

40-45

24-40

18-25

Cây gỗ mềm

45-50

25-35

25-35

Cây một lá mầm

25-40

25-30

10-30

Tế bào nhu mô của lá

15-20

80-85

0

Sợi bông

8-95

5-20

0

(*Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

5

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

2.2. CELLULASE
2.2.1.

Tổng quan về Cellulase

Cellulase là enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân cellulose thành
glucose. Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase
như: nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh…khi được nuôi dưỡng trong môi trường có
cellulose.

Hình 4. Cấu trúc enzyme cellulase
(*Nguồn: Ngày 23/07/2010)

Enzyme cellulase là một hệ enzyme bao gồm 3 loại enzyme:
(1) Endo ß –glucanase (1,4-ß-D-glucan glucanohydrolase, EC 3.2.1.4), Cx: sự
phân cắt ngẫu nhiên chuỗi cellulose hình thành glucose và cello-oligo saccharides. Các
nhà khoa học chia chúng làm hai loại Egl I và Egl II.
o Egl I có 418 amino acid, trọng lượng phân tử 48,212 kDa.
o Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử là 42,2 kDa.
Endo ß –glucanase hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Các endoglucanase của các vi
sinh vật thường không khác biệt nhiều.
(2) Exo- ß –glucanase (1,4-ß - D-glucan cellobiohydrolase, EC 3.2.1.74),
Avicelase, C1: phân cắt những phân tử cellulose được tổng hợp từ endo ß –glucanase
thành những phân tử đường đôi cellobiose, thường bao gồm hai loại CBH I và CBH II.
o

CBH I: có chứa khoảng 496 amino acid trọng lượng phân tử khoảng 65

kDa, điểm đẳng điện là 4,4. CBH I tác động lên vùng vô định hình và vùng kết tinh
của cellulose, nhưng lại không tác động lên cellulose biến tính như carboxymethylcellulose

(CMC)

hay hydroxyethylcellulose,

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

6

cellohexaose

β-nitrophenyl,

β-

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

glucosidase hay β-glucan.
o

CBH II: có chứa khoảng 471 amino acid, trọng lượng phân tử là 53 kDa,

pI 5,0, có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và không hòa tan. Tuy nhiên, CBH
II cũng không có khả năng thủy phân CMC.
(3) ß-glucosidase, cellobiase: là nhóm enzyme khá phức tạp, thủy phân
cellobiose thành glucose. ß-glucosidase có khả năng hoạt động ở pH (4,4 – 4,8) rất
rộng từ trọng lượng phân tử từ 50-98 kDa, pI 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
Tên gọi khác là ß-glucosidase glucohydrolase, cellubiase.
2.2.2.

Cơ chế hoạt động của Cellulase

Vùng kết
tinh

Vùng vô định
hình

Vùng kết
tinh

Hình 5. Cơ chế hoạt động của7 enzyme cellulase

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

2.2.3.

Trường ĐHCT

Giá trị kinh tế của Cellulase

Tuy được nghiên cứu sau các enzyme như protease hoặc lipase nhưng cellulase
thu hút được sự chú ý của các nhà khoa học bởi vì sự đa dạng trong ứng dụng của nó
đối với đời sống. Một trong những ứng dụng chính của cellulase là dùng để sản xuất
nguyên liệu sinh học biến chế nguồn nguyên liệu có cellulose thành ethanol hoặc

diesel-sinh học (Gong et al., 1999; Homel, 1999), sử dụng trong chất tẩy để cải tiến độ
mềm và sáng của sợi vải trong công nghiệp tơ sợi (Cavaco-Pola, 1998). Bên cạnh đó,
cellulase còn được sử dụng để cải thiện chất lượng và khả năng tiêu hóa trong thức ăn
gia súc, trong quá trình chế biến nước trái cây và những thức uống có cồn…Việc sử
dụng trong ngành công nghiệp giấy là một ứng dụng nổi bật khác của cellulase.
2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.

Phương pháp vi sinh

2.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí
Nguyên tắc: Tạo môi trường kỵ khí, giúp cho các vi khuẩn kỵ khí phát
triển tốt.
Các bước tiến hành: nuôi cấy vi khuẩn trên hai môi trường rắn và lỏng.
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch
Vi khuẩn kỵ khí được cấy vào đĩa petri, sau đó dùng giấy parafin quấn chặt
đĩa nhằm hạn chế sự tiếp xúc với oxy, sự lan nhiễm từ không khí và môi trường xung
quanh. Chuyển các đĩa petri vào trong bình hút ẩm có để một ngọn đèn cầy. Quanh
miệng bình hút ẩm có thoa dầu vazơlin với mục đích giữ kín miệng bình, không cho
oxy đi vào. Trước khi đậy kín miệng bình, ta thắp ngọn đèn cầy cháy sáng, khi ngọn
đèn cầy tắt cũng có nghĩa là lượng oxy trong bình cũng không còn nữa.

không

Hình 6. Bình hút ẩm chân
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

8

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng
Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại.
Đun sôi môi trường một thời gian để loại hết O2. Để nguội 450C. Dùng ống hút cấy vi
sinh vật vào đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn
chế sự tiếp xúc với O2.
2.3.1.2. Phương pháp đo đường kính vòng tròn thủy phân
Mục đích: Đánh giá sơ bộ về khả năng phân hủy rơm của vi khuẩn để làm
cơ sở cho những thí nghiệm sau.
Nguyên tắc: Khi enzyme cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose trong môi
trường thạch, cơ chất bị phân giải làm cho độ đục môi trường giảm đi, môi trường trở
nên trong suốt. Độ trong suốt được tạo ra của môi trường tỉ lệ với độ hoạt động của
enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.3.1.3. Phương pháp pha loãng vi sinh vật
Nguyên tắc: Do dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng
độ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải được pha loãng. Phương
pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần
cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Các bước tiến hành
Dùng micropipet hút 1ml mẫu cho vào ống pha loãng chứa 9ml nước cất
theo sơ đồ sau, sau khi lắc kĩ sẽ được độ pha loãng 1/10 tức là 10-1, mẫu này được lắc
đều trên máy lắc và tiếp tục dùng ống hút khác hút 1ml dung dịch ở độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm thứ 2 ta có mẫu ở độ pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy ta có mẫu ở
các độ pha loãng 10 -3, 10-4, 10-5,…
Số lượng vi sinh vật trong mẫu càng lớn thì độ pha loãng càng cao. Khi pha

loãng mẫu chú ý dùng ống hút riêng cho mỗi độ pha loãng.
Mẫu được pha loãng thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100,…Mỗi
bậc pha loãng là 1/10 (Trần Linh Thước, 2002).

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

9

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

1 ml

ống
nuô
i
cấy
ban
đầu

9
ml
H2
O
cất

9 ml
H 2O
cất

9
ml
H2
O
cất

9
ml
H2
O
cất

Pha loãng

10-

10-

10-

10-

Độ pha

(101

(102)

(10

(104

Hình 7. Cách pha loãng mẫu
2.3.1.4. Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn
Mục đích: xác định vi khuẩn là gram âm hay gram dương.
Nguyên tắc:
Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm
tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.
 Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên
không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram
dương.
 Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên
mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung.
Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm.
2.3.1.5. Đếm mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống
Nguyên tắc:
Môi trường được pha loãng nhiều lần rồi chuyển đến dĩa Petri và trộn lẫn
với môi trường chứa agar khoảng 450C, để nguội, môi trường đặc lại, đem ủ trong tủ ủ
và đếm số khuẩn lạc (colony) rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốn đếm. Phương
pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi sinh vật sống mới phát triển thành
khuẩn lạc (Nguyễn Hữu Hiệp, 2007).

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

10

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

2.3.2.

Trường ĐHCT

Các phương pháp sinh hóa

2.3.2.1. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976)
Nguyên tắc: Phương pháp Bradford được sử dụng định lượng hàm lượng
protein trong nhiều phòng thí nghiệm vì ưu điểm đơn giản, hiệu quả và độ chính xác
cao hơn phương pháp Lowry.
Phương pháp Bradford định lượng hàm lượng protein trong dung dịch dựa
vào sự bắt màu của Coomassive Blue Brilliant G250 với protein. Thuốc thử ở trạng
thái tự do tồn tại 4 trạng thái ion hóa khác nhau. Trong đó, các cation thuốc thử màu
đỏ , màu xanh lá cây không kết hợp với protein xuất hiện nhiều trong môi trường
mang tính acid, có bước sóng hấp thụ cực đại 470 và 650nm. Ngược lại, các anion
thuốc thử màu xanh da trời có khả năng liên kết với protein, và được hấp thụ cực đại ở
bước sóng 595nm.
2.3.2.2.

Xác định hoạt tính Cellulase bằng phương pháp Nelson-

Somogyi (1942)
Nguyên tắc:
Đây là phương pháp xác định hoạt tính enzyme dựa vào lượng đường khử
sinh ra thông qua phản ứng với thuốc thử Nelson (Nelson, 1942). Đường khử là những

hợp chất có chứa nhóm chức aldehyde hoặc keto như glucose, galactose, lactose, và
maltose. Sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân cellulose là glucose khi cho tác
dụng với thuốc thử đồng ở điều kiện đun nóng sẽ khử đồng thành đồng oxid (Cu2O) có
màu vàng hoặc đỏ gạch. Khi được xử lý với thuốc thử Aseno Moblybdate sẽ làm dung
dịch chuyển sang màu xanh da trời và hấp thu ở bước sóng 520 nm do có sự khử
moblydic acid thành molydenum.
2.4. TỔNG QUAN VỀ HỆ VI SINH VẬT KỴ KHÍ TRONG DẠ CỎ TRÂU BÒ
Cellulose là một hợp chất khó phân hủy. Các loài động vật ăn cỏ và lá cây như
trâu bò tiêu hóa thức ăn nhờ vào một hệ vi sinh vật sống trong đường ruột có khả năng
sản sinh enzim cellulase, phân cắt cellulose thành các phân tử nhỏ hơn để hấp thu qua
đường ruột. Quá trình chuyển hóa cellulose có sự tham gia của nhiều vi sinh vật. Tuy
nhiên, các vi sinh vật kỵ khí chiếm số lượng chủ yếu, và có khả năng phân cắt mạnh
mẽ hơn các vi sinh vật hiếu khí.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

11

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

Hai loại vi sinh vật kỵ khí chiếm số lượng nhiều nhất trong dạ cỏ trâu bò là
Fibrobacter succinogenes và Ruminococcus albus. Cả hai loài này đều có khả năng tạo
enzyme cellulase, nhưng cơ chế hoạt động thì hoàn toàn khác nhau. Fibrobacter
succinogenes bám vào các sợi cellulose và trực tiếp phân hủy chúng. Ngược lại,
Ruminococcus albus tiết enzim cellulase vào trong dạ cỏ để phân hủy cellulose.
2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.4.1.

Trong nước

Nguyễn Ðức Lượng và Nguyễn Phượng Hải (1996) nghiên cứu tuyển chọn các
dòng vi sinh vật tổng hợp enzyme cellulase cao để xử lý chất thải hữu cơ chứa
cellulose.
TS. Lại Mai Hương (2008) sử dụng enzyme pectinase và cellulase thủy phân bã
đậu nành làm nguồn dinh dưỡng bổ sung vào thực phẩm.
Trần Thạnh Phong (2007) nuôi cấy nấm Trichoderma reesei để thu nhận enzyme
cellulase trên môi trường bán rắn với cơ chất rơm và cám mì tỉ lệ 7:3, độ ẩm 60%, thời
gian nuôi cấy 7 ngày cho hoạt tính enzyme CMCase (Carboxymethyl cellulase) là
280,64 IU/g và FPU (Filter Paper Unit) là 5 IU/g.
Đinh Thị Kim et al. (2008) thu nhận enzyme cellulase từ nấm Trichoderma trên
môi trường CMC.
2.4.2.

Ngoài nước

Popop (1875) là người đầu tiên xác nhận khả năng phân giải sợi cellulose của
một số vi sinh vật kỵ khí.
Tae-Il et al. (2000) phân lập vi khuẩn NLRI-X33 có khả năng sản sinh enzyme
cellulase từ phân bò. Vi khuẩn NLRI-X33 có đặc điểm hình thái và sinh hóa giống vi
khuẩn Bacillus licheniformis. Khi vi khuẩn được nuôi trong môi trường CMC 37 0C
trong vòng 24 giờ, hoạt tính của cellulase thu được là 1,65 U/ml.
Ramya (2007) khảo sát các điều kiện tối ưu nuôi vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ
cỏ trâu bò cũng như ứng dụng vào việc giải quyết môi trường do các phế phụ phẩm
nông nghiệp gây ra.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

12

Viện NC & PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1.

Địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh thực phẩm, phòng thí
nghiệm Công nghệ Enzyme, phòng thí nghiệm Vi sinh thực phẩm, phòng thí nghiệm
Sinh hóa của Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2.

Thời gian: đề tài được thực hiện từ 22/07/2010 đến 30/11/2010.

3.1.3.

Vật liệu thí nghiệm
3.1.3.1. Nguyên liệu
Mẫu rơm thu được tại thị trấn Cờ Đỏ, quận Ô Môn.
3.1.3.2. Nguồn gốc vi khuẩn
14 dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ trâu bò và được đánh số 30, 31,

32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 49, 50, 51, 52.
3.1.4.

Hoá chất

Agar, NaOH, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, HCl, ethanol, Bovine
serum albumin (BSA), carboxylmethyl cellulose (CMC), Comassie Brilliant Blue
G250, cồn tuyệt đối, dung dịch đệm Tris-HCl (Merk), thuốc thử Arsenomolybdate,
thuốc thử đồng, dung dịch Glucose, Congored và các hóa chất khác.
3.1.5.

Thiết bị

Máy đo pH, tủ lạnh, máy ly tâm (Rotor – Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbiinternational (Đức), tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), buồng cấy vi sinh vật, máy
khuấy từ (Hoa Kỳ), kính hiển vi Olympus, máy đo quang phổ, bình tam giác (250ml,
500ml,...), kim cấy, đèn cồn, đĩa petri, bình hút ẩm, và các thiết bị dụng cụ cần thiết
khác dùng trong thí nghiệm.
3.1.6.

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các dòng vi khuẩn kỵ khí phân lập từ dạ cỏ trâu bò được cấy trải phân lập lại và
tuyển chọn trên môi trường cơ chất rơm được chuẩn bị như trong Bảng 2.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

13

Viện NC & PT Công nghệ sinh học

Luận văn tốt nghiệp đại học Khóa 32 TT - 2010

Trường ĐHCT

Bảng 2. Thành phần môi trường thạch Delafield (2002) có cải tiến cho phù hợp
với điều kiện nuôi cấy.
Tên hoá chất

Khối lượng/thể tích

Đơn vị

Bột rơm
(NH4)2SO4
K2HPO4
MgSO4.7H2O
NaCl
Nước

5
1
1
0,5
0,001
1000

Gram
Gram

Gram
Gram
Gram
ml

(* Nguồn: Ryckeboer et al., 2002)

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát hàm lượng cellulose có trong bột rơm
Bột rơm (sấy ở 1050C trong 4 giờ)
- Cân chính xác 1 g vào cốc (m)
- Lắp cốc vào máy phân tích (FIWE)
Thêm vào 100 ml NaOH 0,5%
Đun nóng 30 phút (kể từ lúc sôi)
Lọc và rửa 3 lần với 30ml nước nóng

Rửa cặn với 100 ml NaOH 0,5%
Đun nóng 30 phút (kể từ lúc sôi)
Thêm 10 ml HCl 10%
Thêm từ từ 10 ml hypoclorite Natri
Rửa cặn với 100 ml NaOH
- Sấy mẫu và cốc ở 105 oC trong 4 giờ
- Cân trọng lượng mẫu thu được (a)
- Hàm lượng cellulose được tính
theo công thức
X 

a  100

m

Hình 8. Các bước xác định hàm lượng cellulose trong bột rơm
Chuyên ngành Công nghệ sinh học

14

Viện NC & PT Công nghệ sinh học