Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR Để Xác Định Listeria Monocytogenes Trong Thực Phẩm Thủy Sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN

TRẦN VĂN TUẤN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH LISTERIA
MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM THỦY SẢN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

201


LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, Trước tiên tôi xin gởi lời cam ơn
đến Quí thầy cô thuộc Bộ Môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản, Khoa
Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ luôn quan tâm tận tình đến tôi trong quá
trình thực hiện đề tài. Ngoài ra tôi đã nhận được sự giúp đở rất lớn từ Thạc sĩ
Phạn Văn Hùng, Phó Giám Đốc Trung Tâm Nông lâm Thủy Sản vùng 6 và
các cán bộ khác ở phòng kiểm nghiệm vi sinh của Trung Tâm. Bên cạnh đó
còn có những người không thể nao không nhắc đến đó là gia đình và bạn bè
tôi đã chăm sóc và luôn ủng hộ cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin chân
thành tri ân đến tất cả mọi người!

i


TÓM LƯỢC

Việc phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản ngày
càng gia tăng trong thời gian gần đây. Đây là một loại vi khuẩn gây nhiều
bệnh nguy hiểm trên người. Hiện nay việc xác định loại vi khuẩn này trong
thủy sản chủ yếu là dùng Phương pháp ISO 11290-1:2004 nhưng thời gian cho
kết quả kéo dài từ bốn ngày cho trường hợp âm tính đến bảy ngày cho trường
hợp dương tính. Điều này thật sự đã gây nhiều trở ngại cho hoạt động sản xuất
mặt hàng thủy sản. Vì thế úng dụng các phương phân tích nhanh là rất cần
thiết, trong đó có Phương pháp PCR. Phương pháp này có thể cho kết quả
trong thời gian từ hai đến ba ngày. Để ứng dụng Phương pháp này vào thực
tiển thì cần phải kiểm tra độ đặc hiệu đối với L.monocytogenes, độ lập lại của
phương pháp và tính tương đồng của phương pháp so với Phương pháp ISO
11290-1:2004. Sau quá trình thí nghiệm từ tháng 1/2010 – 4/2010 ở Trung
Tâm Nông Lâm Thủy Sản Vùng 6, kết quả cho thấy Phương pháp PCR đặc
hiệu với L.monocytogenes, 100% số lần lập lại đều cho kết quả dương tính và
phương pháp phân tích nhanh L.monocytogens bằng PCR cho kết quả tương
đồng với phương pháp định tính L.monocytogenes theo ISO 11290-1:2004.
Qua đó cho thấy có thể ứng dụng Phương pháp PCR một bước trong xác định
nhanh L.monocytogenes vào thực tế kiểm nghiệm.
Từ khóa : PCR; Listeria monocytogenes

ii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

L.mono
L. innocua
L.ivanoii
R. equi
S. aureus

AOAC
FDA
ISO
PCR
HF
ALOA
SPW
TSYEA
TSYEB
TSA
BHI
TBE

Listeria monocytogenes
Listeria innocua
Listeria ivanoii
Rodococcus equi
Saphylococcus aureus
Association of Analytial Communities (Hiệp hội
các nhà phân tích)
Food and Drug Administration (Cục quản lý thực
phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)
International Standard Organization (Tổ chức tiêu
chuẩn Quốc Tế)
Polymerase Chain Reacion
Half Fraser Broth
Listeria selective Agar Base acc OTTAVIANI and
AGOSTI
Salty peptone water (Nước muối sinh lý)
Trytone soya broth Yeast extract Agar

Trytone soya broth Yeast extract
Tryptic Soy Agar
Brain Heart Infusion
Tris- Borate EDTA

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .......................................................................................................i
Tóm lược........................................................................................................ ii
Danh mục từ viết tắt ...................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................iv
Danh sách bảng ..............................................................................................vi
Danh sách hình..............................................................................................vii
Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................1
1.1 Giới thiệu ................................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài.......................................................................................... 2
1.3 Nội dụng nghiên cứu ................................................................................ 2
1.4 Thời gian thực hiện đề tài ......................................................................... 2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................3
2.1. Giới thiệu về Listeria monocytogenes ...................................................... 3
2.1.1. Phân loại hoc ................................................................................. 3
2.1.2. Hình thái học .................................................................................3
2.1.3 Đặc điếm sinh lý............................................................................. 4
2.1.4 Khả năng chịu đựng ........................................................................5
2.1.5 Phân bố nguồn lây nhiễm................................................................5
2.1.6 Đặc điểm gây bệnh ..........................................................................5
2.2. Các phương pháp .................................................................................... 7

2.2.1. Theo ISO 11290 -1:2004 ............................................................... 7
2.2.2. Theo phương pháp áp dụng kỷ thuật PCR.....................................11
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ..........15
3.1 Phương tiện thí nghiệm............................................................................15
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................15
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu.....................................................................15
3.1.3. Mẫu thủy sản ................................................................................15
3.1.4. Chủng vi sinh ...............................................................................15
3.1.5. Môi trường, hóa chất ...................................................................15
3.1.6 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................15
3.2 Qui trình định tính L.monocytogenes bằng kỷ thuật PCR ......................16
3.2.1 Thuyết minh qui trình ....................................................................16
3.3. Phương pháp thí nghiệm................................................................................18

3.3.1. Thí nghiệm 1: Xác định độ lập lại của phương pháp . ...................16
3.3.2. Thí nghiệm 2: Xác định độ nhạy ..................................................20
3.3.3. Thí nghiệm 3 : Xác định độ lặp lại................................................22
3.3.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra độ tương đồng của phương pháp...............23
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................26
4.1 Kết quả thí nghiệm 1 ........................................................................26
4.2 Kết quả thí nghiệm 2...........................................................................27
4.3 Kết quả thí nghiệm 3 ..........................................................................29
4.4 Kết quả thí nghiệm 4 .................................................................................30

iv


Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.........................................................34
PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................ 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 38

v


DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 2.1. Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria.....................4
Bảng 2.2. Một số thông số cơ bản của Listeria ................................................4
Bảng 3.1. Các giai doạn chính trong quá trình chạy PCR...............................17
Bảng 3.2. Danh mục các chủng vi sinh vật thử nghiệm..................................20
Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm 1 xác định độ đặc hiệu…….............................26
Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy.............................................28
Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm xác định độ lặp lại ……….. ............................30
Bảng 4.4. Kết quả thí nghiệm 4 xác định độ tương đồng………… ................31
Bảng 4.5. Bảng so sánh các ưu khuyết điểm của hai phương pháp…….........32

vi
Trang vi


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290 -1:
2004 ...............................................................................................................8
Hinh 2.2: Chu trình nhiệt trong máy luân nhiệt PCR ....................................12
Hình 3.1: Sơ đồ phân tích nhanh Listeria monocytogenes bằng kỷ thuật
PCR..............................................................................................................16
Hình 3.2: Sơ đồ thí nghiệm 1 xác định độ nhạy ............................................19
Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm 2 xác định độ lặp lại ..........................................21

Hình 3.4: Sơ đồ thí nghiệm 3 xác định độ tương đồng..................................24
Hình 4.1: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 1 .................................27
Hình 4.2: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 2 ................................29
Hình 4.3: Ảnh chụp kết quả chạy điện di thí nghiệm 3..................................30
Hình 4.4: Ảnh chụp mẫu nhiễm Listeria monocytogenes trên ALOA ...........32
Hình 4.5: Ảnh chụp kết quả phân tích mẫu nhiễm Listeria
monocytogenes trên PCR một bước..............................................................33

vii


Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Thủy sản là một trong những ngành đóng góp vào nguồn thu ngoại tệ nhiều
nhất nước ta, thế nhưng trong nhưng năm gần đây mặt hàng này đang gặp khó
khăn về thị trường xuất khẩu do vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm còn chưa
tốt, trong đó các trường hợp bị nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị phát
hiện ngày càng gia tăng, năm 2007 khi phân tích loại vi khuẩn này trên sản
phẩm cá tra đông lạnh thì có tới 21.5% cho kết quả dương tính, và tăng lên
30.36% vào năm 2008. với đặc tính gây ra nhiều bệnh nguy hiểm trên người
như gây nhiễm trùng máu, viêm màng não ở trẻ em, đối với phụ nữ mang thai
thì dễ bị sảy thai, để non và trẻ chết sau khi sinh…, Listeria monocytogenes đã
trở thành mối quan tâm lớn của khách hàng và các trung tâm kiểm tra chất
lượng trên thế giới.
Hiện nay có nhiều phương pháp được ứng dụng để xác định Listeria
monocytognens trong thực phẩm. Trong đó có các phương pháp truyền thống
như: ISO 11290- 1:2004, BAM-FDA, USDA, ALOA có thể định danh
Listeria.momocytogenes trong thực phẩm bao gồm nhiều bước phức tạp như
tăng sinh, phân lập trên môi trường chọn lọc và dùng các thử nghiệm hóa sinh
để dịnh danh. Các phương pháp truyền thống này cần nhiều thời gian thực

hiện từ ba đến bốn ngày cho các trường hợp âm tính và năm đến bảy ngày cho
trường hợp dương tính. Do hạn chế này mà dẫn đến nhiều khó khăn, bất tiện
trong hoạt động sản xuất kèm theo sản phẩm bị tổn thất và giảm chất lượng vì
phải lưu kho trong thời gian dài để đợi kết quả phân tích. Hiện nay đang phát
triển các phương pháp hiện đại như phương pháp miễn dịch ELISA, phương
pháp phân tích nhanh RAPID`Lmono, ...để phát hiện nhanh Listeria
monocytogenes.
Khi tìm ra được gen đặc hiệu cho Listeria monocytogenes thì việc ứng dụng
kỹ thuật PCR trong xác định Listeria monocytogenes đang có nhiều triển vọng
có thể rút ngắn được thời gian xét nghiệm xuống còn từ 2-3 ngày trong khi đó
có độ tin cậy cao và dễ thực hiện, từ đó mà khác phục được hạn chế lớn nhất
của phương pháp ISO 11290- 1:2004. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu
về “ ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes trong
thực phẩm thủy sản”.

1


1.2 Mục tiêu của đề tài
Kiểm tra khả năng ứng dụng kỹ thuật PCR một bước để phát hiện nhanh
Listeria monocytogenes trong sản phẩm thủy sản ở điều kiện phòng thí nghiệm
thông qua phân tích các chỉ tiêu:
Độ đặc hiệu
Độ nhạy
Độ lặp lại
Sự tương đồng của hai phương pháp PCR và ISO11290 – 1:2004
1.3 Nội dung nghiên cứu
Xác định độ đặc hiệu bằng cách cho chạy PCR trên mẫu có chứa DNA của vi
khuẩn Listeria monocytogenes và các mẫu có chứa DNA của các vi khuẩn
Listeria spp khác không phải Listeria monocytogenes. Dựa trên sử dụng các

chế phẩm chuyên dùng phân tích Listeria spp
Xác định độ nhạy của bước khuếch đại DNA trong kỹ thuật PCR một bước
bằng cách dựa vào độ đục chuẩn của McFarland để pha loảng chủng ra nhiều
nồng độ sau đó tiến hành chạy PCR. Nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được
vạch DNA trên ảnh gel doc là độ nhạy của phương pháp.
Xác định độ lặp lại của kỹ thuật thông qua việc tiến hành phân tích nhiều lần
lập lại các mẫu có chứa Listeria monocytogenes ở một nồng độ nhất định trong
điều kiện phòng thí nghiêm để đánh giá được mức độ ổn định của kỹ thuật.
Xác định độ tương đồng của phương pháp PCR và phương pháp ISO11290 –
1:2004 bằng cách tiến hành song song hai phương pháp để xác định Listeria
monocytogenes
1.4 Thời gian thực hiên
Từ tháng 1/2010 đến 5/2010

2


Chương 2: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về Listeria monocytogenes
2.1.1 Phân loại học
2.1.1.1 Phân loại theo kiểu hình
Có sáu loài thuộc loại Listeria spp: L. monocytogenes, L. seeligeri, L.
welshimeri, L. ivanovii L.innocua và L. grayi. Loại L. grayi có hai loài phụ là
L.grayigrayi và L. grayimurrayi.
2.1.1.2 Phân loại theo huyết thanh
Dựa trên các tương tác của kháng nguyên O (somatic) và kháng nguyên
(flagella) H với các kháng huyết thanh một hay nhiều hóa trị để tiến hành phân
ra các tiếp huyết thanh chính và phụ. Có tất cả là 15 chủng huyết thanh trong
đó có 12 chủng riêng và 3 chủng phức hợp, chủng I bao gồm serovars 1/2b,
3b, 4b, 4d và 4e, chủng II có chứa serovars 1 / 2a, 1/2c, 3a, 3c và chủng III

gồm serovars 4a, 4c và có thể là 7. Gần đây, chủng III tiếp tục được chia thành
ba nhóm con (IIIA, IIIB và IIIC), cụ thể là Listeria monocytogenes bao gồm
các tiếp huyết thanh 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, “7”.
L.ivanovii có kiểu huyết thanh 5. L.innnocua có 4ab, 6a, 6b, Una. L.welshimeri
có 6a, 6b còn loài L.seeligeri cho kết quả dương tính với tiếp 1/2b, 4c, 4d, 6b,
Un. khoảng 98% các trường hợp nhiểm bệnh listeriosis cho kết quả dương tính
với kiểu huyết thanh thuộc nhóm một (1/2a, 1/2b) và nhóm (4b)
(Microbiology, Dr Luudongyou, 8/2008).
2.1.2. Hình thái học
Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que, gram dương, di động nhờ tiêm
mao, không sinh bào tử và đôi khi chúng tạo thành hình chuỗi ngắn. Khi kiểm
tra kính phết, vi khuẩn này có dạng hình cầu, vì vậy thường lầm tưởng chúng
là vi khuẩn Streptococci. Đôi khi xuất hiện những tế bào dài hơn có thể trông
giống corynebacteria. Ở nhiệt độ phòng(không lớn 37 0C) vi khuẩn này có khả
năng tạo tiêm mao (flagella), di động theo thể thức lộn nhào và tạo hình tán dù
trong môi trường motility agar. Hoạt tính tiêu huyết(heamolysis) trên môi
trường thạch máu được dùng làm chỉ dấu để phân biệt Listeria monocytogenes
trong số các loài khác thuộc giống Listeria spp, nhưng đây không phải là tiêu
chí để xác định loài này.
Để phân biệt các loại thuộc Listeria spp cần thêm các đặc tính sinh hóa.

3


Bảng 2.1: Đặc điểm khác nhau của các loài thuộc giống Listeria spp
TÊN LOÀI
L. monocytogens
L. innocua
L. ivanovii
L. seeligeri

L. welshimeri
L. grayi loài phụ
grayi
L. grayi loài phụ
murrayi

Các phản ứng phân biệt Listeria spp.
Cata Gram Di
Henry Man
động
(a)

Rham

+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+

+
+

+
+
+
+

Xanh
Xanh
Xanh
Xanh
Xanh
Xanh

+

+
V
V
-

+
+
+
-

+

+

+

Xanh

+

V

-

Xyl

Tan
huyết

CAMP test
S.aureus

R.equi

+
+
(+)
-

+
(+)
-

+
-

-

-

-

V : phản ứng có thể xảy ra
(+): phản ứng yếu
+ : >90% phản ứng dương tính
-: phản ứng không xảy ra
(a) tham khảo theo USFDA/CFSAN BAM- chương 10.
Ghi chú: Cata: catalase, Henry: Henry illumination, Man: manitol, Rham: Rhamnose,
Xyl: Xylose.

2.1.3 Đặc điểm sinh lý
2.1.3.1 Thông số phát triển
Bảng 2.2: Một số thông số cơ bản của Listeria spp
Thế nước pH tối pH cực NaCl(%)
(aw) cực đại thiểu
đại
cực đại
0,92-0,95
4,6
9,6
8-12

T0C tối T0C cực Nhu cầu oxy
thiểu
đại
0-2

45
Kỵ khí tùy
nghi

2.1.3.2 Trong thực phẩm thủy sản.
Listeria monocytogenes có khả năng sống trong nhiều loại thực phẩm sống,
đông lạnh, xông khói, trong các sản phẩm chưa được tiệt trùng.. Vi khuẩn này
có khả năng tồn tại trong các sản phẩm thủy sản xông khói đóng gói chân
không được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 100C, trong nhiều trường hợp chúng
còn gia tăng số lượng tế bào. Ví dụ: trong tôm, thịt cua, surimi và cá được bảo
quản ở nhiệt độ 7 0C trong vòng 14 ngày, Listeria monocytogenes gia tăng đến
10.000 tế bào trên một gam sản phẩm. (Nguồn: Baron’s Medical
Microbiology, Miscellaneous Pathogenic Bacteria (H Hof)). Sự phát triển của
chúng phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và các loại thịt cũng
như sự hiện diện của quần thể vi sinh vật.

4


2.1.4 Khả năng chịu đựng
Listeria monocytogenes là vi khuẩn gây bệnh ưa lạnh và có khả năng phát
triển ở nhiệt độ 2 - 80C (nhiệt độ của tủ lạnh), pH tối thiểu là 4,6; chúng có khả
năng sống trong điều kiện kỵ khí, hiếu khí ngay cả môi trường hút chân không
hoặc có sự hiện diện của vi khuẩn lactic.
Loài vi khuẩn này cũng có khả năng sống từ 10 đến 30 ngày trong nguồn nước
công cộng ở nhiệt độ 28- 300C và từ 7 đến 110 ngày ở nhiệt độ 5 đến 100C. Ở
nước ao chúng có khả năng sống đến 8 tuần với nhiệt độ không khí từ -260C
đến 90C. Ở nước biển Listeria monocytogenes có thể sống đến 3 tuần hoặc lâu
hơn nữa. Việc tồn tại trong nước biển thì tùy thuộc vào nhiệt độ và chủng vi
khuẩn này.

Trong môi trường chế biến thực phẩm với độ ẩm là 75% và ở 150C, hỗn hợp
vi khuẩn Listeria monocytogenes và Flavobacteria spp.
Listeria monocytogenes là vi khuẩn điển hình không sinh bào tử có khả năng
kháng khá tốt các tác động trong bảo quản thực phẩm như đông lạnh, làm khô
và gia nhiệt.
2.1.5 Phân bố, nguồn lây nhiễm
Trước đây Listeria được cho là không liên quan đến bệnh ở người và động vật
khác nhưng sau này người ta bắt đầu phân lập được nhiều loài thuộc giống
Listeria bao gồm cả các loài gây bệnh như Listeria monocytogenes và L.
ivanovii từ nhiều nguồn khác nhau. Đến nay vi khuẩn này được công nhận là
phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Ít nhất có 42 loài động vật có vú hoang dã và
thuần dưỡng, 17 loài chim bao gồm thuần dưỡng và gà chọi là nơi ẩn náo của
Listeria. Có khoảng từ 5 – 10% trong số chúng ta có Listeria monocytogenes
hiện diện trong đường ruột nhưng không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào về
bệnh do listeria. Listeria cũng được phân lập từ giáp xác, cá, sò, ve ký sinh và
ruồi. Ngoài ra có thể phân lập vi khuẩn này từ đất, thức ăn, phân động vật và
các nguồn khác từ môi trường.
2.1.6 Đặc điểm gây bệnh
Trong 6 loài Listeria spp thì chỉ có L. ivanovii và L. monocytogenes là đối
tượng gây bệnh cho người và động vật khác. Tuy nhiên chỉ có loài L.
monocytogenes là đối tượng gây bệnh cho người. Bệnh do L. ivanovii và L.
seeligeri thì rất hiếm khi xảy ra ở người.

5


Thuật ngữ bệnh do listeria (listeriosis) bao gồm nhiều triệu chứng bệnh giống
nhau ở người và động vật. Listeria monocytogenes gây bệnh ở người và động
vật; L.ivanovii chỉ gây bênh ở động vật, chủ yếu ở cừu. Bệnh viêm màng não
là hình thức bệnh thường gặp nhất ở động vật nhai lại. Ở những động vật còn

nhỏ, thường xuất hiện nhiễm trùng nội tạng hoặc nhiễm trùng máu. Nhiễm
trùng cổ tử cung ở bào thai qua đường nhau thường làm cừu và gia súc đẻ non.
Theo Fs southwick và DL Purich thì cơ chế lây nhiễm của Listeria
monocytogenes vào tế bào chủ là dựa vào quá trình thực bào, do đặc điểm
sống của chúng là sống nội bào tức là đa số đời sống của tế bào Listeria
monocytogenes diễn ra trong tế bào chủ, vi khuẩn sẽ sản xuất ra chất
internalins (protein) trên bề mặt tế bào chất này sẽ tăng cường thúc đẩy cho
quá trình thực bào, sau khi tấn công vào tế bào chúng tiến hành phân chia và
phát triển liên tục trong tế bào chất (tăng gấp đôi trong một giờ) chúng tiến ra
ngoại vi màng tế bào chất và tiến hành tiết ra một số chất như là LLO, ACTA
phối hợp với internalins A và B hổ trợ cho việc thoát khỏi tế bào, khi đó hình
thành các FILOFODS có dạng thuôn và dài để cho các tế bào xung quanh thực
bào nhờ đó mà chúng tấn công tiếp vào các tế bào khác do cơ chế này mà
Listeriosis hầu hết chỉ xuất hiện ở những người có hệ thống miễn dịch kém
như phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh, người già và người bị HIV cụ thể:
Phụ nử mang thai: có nguy cơ nhiểm Listeriosis cao hơn người bình
thường 20 lần.
Trẻ sơ sinh, thai nhi có khả năng nhiểm cao nhưng thấp hơn người mẹ
Các bệnh nhân liên quan đến phổi và da.
Người bị AIDS có nguy cơ nhiễm cao hơn người thường là 300 lần
Người sử dụng thuốc cootizon (cortisone).
Hình thức bệnh nghiêm trọng thể hiện rõ ràng nhất là ở bệnh viêm màng não
và thường đi kèm theo nhiễm trùng máu. Tuy nhiên ở phụ nữ mang thai, mặc
dù triệu chứng thường xuất hiện là bệnh giống như cúm nhẹ không bị viêm
màng não, nhưng dễ có khả năng thai nhi bị bệnh và dẫn đến phải phá bỏ hoặc
sinh non.
Ở người bệnh do listeria spp biểu hiện rỏ ràng nhất là do L. monocytogenes
thường ít xảy ra, nhưng đã xuất hiện những đợt bùng phát thành dịch. Vào
năm 1981, xuất hiện đợt bùng phát liên quan đến 100 người ở Canada. Ba
phần tư những trường hợp bị nhiễm bệnh là phụ nữ mang thai, trong trường

hợp này có 9 thai nhi bị chết, 23 trẻ sơ sinh bị nhiễm trùng và 2 trẻ còn sống
khỏe mạnh. Trong số 77 người trưởng thành không mang bầu bị nhiễm khuẩn

6


đã biểu hiện bệnh do listeria một cách rõ ràng, tỷ lệ chết gần 30%. Nguồn
bùng phát là từ xà lách trộn được sản xuất tại một nhà máy tại địa phương.
Listeria monocytogenes gây ra một số triệu chứng lâm sàng như nhiễm huyết
trùng, nhiễm trùng trọng tâm của xương, khớp, mắt , tủy sống và túi mật, Đối
với triệu chứng viêm màng não (hay gọi là hội chứng meningoencephalitis) là
biểu hiện rỏ nhất cho việc nhiễm Listeria monocytogenes kèm theo đó là
những biểu hiện về run, co giật, cảm cúm...
2.2 Các phương pháp phân tích Listeria monocytogenes trong thực phẩm
2.2.1 Theo ISO 11290 -1:2004
Phương pháp này (tham chiếu theo ISO 11290-1:2004) được áp dụng để định
tính Listeria monocytogenes trong thực phẩm dành cho người và thức ăn gia
súc.
2.2.1.1 Nguyên lý
Phương pháp này thực hiện qua các giai đoạn:
Tăng sinh: giai đoạn này là cần thiết vì Listeria monocytogenes thường có
mặt trong mẫu với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương trong quá trình chế biến
cùng sự tồn tại một số lượng các loại vi sinh vật khác, do đó bước tăng sinh
đầu tiên rất quan trọng làm tăng sự phát triển của vi khuẩn.
Phân lập: Mục đích của giai đoạn này nhằm phân biệt vi khuẩn Listeria
monocytogenes và các vi khuẩn không phải là Listeria spp thông qua các đặc
điểm của khuẩn lạc. Do đó, môi trường phân lập có chứa các thành phần sao
cho Listeia spp có thể sinh trưởng tạo thành các khuẩn lạc rời rạc đồng thời ức
chế sinh trưởng của các vi khuẩn không phải là Listeria spp tồn tại được trong
giai đoạn tăng sinh. Phân lập trên hai môi trường chọn lọc là ALOA, Oxford

(hoặc Palcam).
Khẳng định: cấy chuyển khuẩn lạc Listeria monocytogenes nghi ngờ sang
thạch không chọn lọc để làm thuần vi khuẩn và thực hiện các thử nghiệm sinh
lý, sinh hóa để định danh. Khẳng định là Listeria spp bằng các thử nghiệm
Henry-illumination, catalase, nhuộm Gram, khả năng di động phương pháp
giọt treo. Sau khi các thử nghiệm trên đều nghiệm đúng Listeria spp, kế tiếp
khẳng định Listeria monocytogenes qua các thử nghiệm bổ sung sau: khả năng
tan huyết, khả năng biến dưỡng đường, thử nghiệm CAMP, di động trong ống
nghiệm tạo hình tán dù.

7


2.2.1.2 Sơ đồ quy trình phân tích theo ISO 11290-1:2004
A.Tăng sinh lần 1
25 g mẫu + 225ml Half Fraser

(II)

(I)

B.Tăng sinh lần 2
0,1ml dịch tăng sinh lần 1
+ 10ml Fraser

C. Cấy ria trên ALOA +
Palcam hoặc Oxford

C. Cấy ria trên ALOA +
Palcam hoặc Oxford

D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford
E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang
TSYEA, TSYEB

D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford
E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang
TSYEA, TSYEB

F. Khẳng định

G. Đọc kết quả

F. Khẳng định:
Henry illumination
Catalase
Gram
Tan huyết
Khả năng sử dụng đường
Xylose, Rhamnose
- Thử nghiệm CAMP
- Di động
-

G. Đọc kết quả

Hình 2.1 Sơ đồ phân tích Listeria monocytogenes theo ISO 11290-1:2004
Quy trình (I) và (II) thực hiện song song nhau. Nếu quy trình (I) cho kết quả
dương tính thì ngưng không tiếp tục thực hiện quy trình (II), nếu quy trình (I)
cho âm tính thì phải tiếp tục quy trình (II).

Thời gian cho kết quả của phương pháp từ 4- trên 7 ngày.

8


2.2.1.3 Thuyết minh quy trình phân tích
A. Tăng sinh lần 1: Cân 25gam mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào
225ml Half Fraser. Đồng nhất mẫu trong khoảng 30-60 giây tùy theo đặc điểm
của mẫu. Ủ dịch mẫu trong tủ ủ ở 30 ± 10C trong 24 ± 2giờ. Sau bước tăng sinh
lần 1 thực hiện hai quy trình (I), (II).
B. Tăng sinh lần 2: Chuyển 0.1ml từ dịch tăng sinh lần 1 sang ống nghiệm
chứa 10ml môi trường Fraser để tăng sinh lần 2. Ủ ống nghiệm trong tủ ủ ở
37 ± 10C trong 24 giờ.
C. Cấy ria trên ALOA, Oxford hoặc Palcam: Dùng que cấy kim loại hoặc
que cấy nhựa vô trùng cấy ria dịch mẫu tăng sinh lần 1 theo quy trình (I) và
dịch mẫu tăng sinh lần 2 theo quy trình (II) sang môi trường thạch ALOA và
Oxford hoặc Palcam sao cho khuẩn lạc mọc rời, ủ trong tủ ủ ở 37 ± 10C trong
24 giờ.
D. Đọc kết quả trên ALOA, Oxford hoặc Palcam. Thường sau 24 giờ ủ phải
kiểm tra. Nếu khuẩn lạc mọc yếu hoặc không có khuẩn lạc nào thì phải ủ tiếp
48 giờ. Sau khi ủ ghi nhận các khuẩn lạc điển hình trên các loại môi trường
thạch.
E. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy sang TSYEA, TSYEB: Chọn khuẩn lạc
nghi ngờ Listeria monocytogenes trên mỗi loại môi trường phân lập dùng que
cấy lấy ½ khuẩn lạc cấy ria trên môi trường TSYEA (ủ ở 37 ± 10C trong 1824 ± 2 giờ) và ½ khuẩn lạc còn lại cấy vào TSYEB (ủ ở 25 ± 10C trong 1824 ± 2 giờ).
F. Khẳng định
Thử nghiệm Henry-illumination
Kiểm tra khuẩn lạc Listeria spp bằng nguồn sáng trắng, kiểm tra khuẩn lạc
theo hướng vuông gốc với đĩa thạch hoặc trực tiếp bằng mắt thường hoặc qua
kính hiển vi phân tích (có gương riêng) hoặc kính hiển vi có độ phân giải thấp.

Nguồn sáng chiếu vào đĩa thạch với góc nghiêng 450, quan sát theo hướng
vuông góc với đĩa thạch.
Trên môi trường TSYEA khuẩn lạc Listeria spp. điển hình qua nguồn ánh
sáng trắng có màu xanh óng ánh (xanh xám đến xanh).
Thử nghiệm Catalase
Thực hiện: Lấy sinh khối ở tâm khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng
sau 18-24 giờ ủ. Chuyển sinh khối lên miếng lam. Nhỏ lên sinh khối một giọt

9


H2O2 3% (dùng ống nhỏ giọt hoặc pipette Pasteur). Quan sát nhanh sự hình
thành bọt khí và ghi nhận kết quả. Bỏ miếng lam vào dung dịch khử trùng.
Kết quả: Dương tính khi có hình thành bọt khí (O2). Âm tính khi không có
hình thành bọt khí.
Xác định loại Gram (thử nghiệm KOH)
Thử nghiệm KOH dùng để phân biệt vi khuẩn gram dương và gram âm: nhỏ
1-2 giọt KOH 3% lên lam kính, sau đó lấy khuẩn lạc đã được làm thuần từ
TSYEA trộn vào thuốc thử KOH trên lam. Sau khi trộn nếu gặp hiện tượng
đặc quánh kéo thành dây thì dùng khuyên cấy nhích lên là phản ứng dương
tính và ngược lại là phản ứng âm tính.
Vi khuẩn gram (-): thử nghiệm KOH dương tính
Vi khuẩn gram (+): thử nghiệm KOH âm tính
Listeria spp cho phản ứng gram (+)
Thử tính di động
Khả năng di động phương pháp giọt treo: Lấy một khuyên dịch từ TSYEB đặt
lên lamem và quan sát dưới kính hiển vi. Listeria spp là những tế bào hình
que, mảnh, ngắn và thể hiện những chuyển động xoay quanh trục thân thành
từng đợt (luân phiên nghĩ và động) rất đặc trưng.
Thử tính di động trong ống nghiệm: Lấy vi khuẩn đã được làm thuần từ

TSYEA đâm sâu vào thạch của ống nghiệm chứa môi trường Motility agar. Ủ
ở 250C ± 10C trong 48 giờ. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường cấy đâm
sâu. Thử nghiệm là dương tính khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy làm
môi trường có màu đỏ cam và tạo hình tán dù.
Thử nghiệm tan huyết
Dùng que cấy ria lấy sinh khối từ khuẩn lạc trên môi trường làm thuần
TSYEA cấy ria lên đĩa thạch Blood Agar. Ủ đĩa trong tủ ở 37 ± 10C trong
24 ± 2 giờ.
Kết quả: Listeria monocytogenes cho thấy vùng sáng, trong và hẹp (dung
huyết beta)
Thử nghiệm sử sụng đường
Dùng que cấy vòng, lấy sinh khối từ môi trường TSYEB cấy lần lược sang các
ống nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Xylose và sang các ống
nghiệm chứa khoảng 5ml dung dịch đường Rhamnose. Ủ các ống trong tủ ủ ở
37 ± 10C trong 24 – 48 giờ.

10


Kết quả: Dương tính khi dung dịch đường có màu vàng. Âm tính khi dung
dịch đường không đổi màu. Listeria monocytogenes Xylose (-), Rhamnose (+).
Thử nghiệm CAMP
Cấy ria 2 đường chủng vi khuẩn S.aureus và Rhodococcus equi theo các
đường thẳng đứng song song, cách nhau 4 cm trên mặt thạch máu cừu. Sau đó
cấy ria thẳng góc ở giữa các chủng nghi ngờ Listeria monocytogenes đã được
làm thuần từ TSYEA lên thạch máu, gần như không chạm vào 2 đường cấy
S.aureus và Rhodococcus equi khoảng 1-2mm. Cấy đồng thời các chủng
chứng L.monogenes, L.innocua, L.ivanovi để kiểm tra trên cùng một đĩa. Ủ ở
370C ± 1 0C trong 18- 24h.
Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết phát triển ngay

tại ranh giới giữa chủng cần thử với các chủng R.equi và S.aureus.
Phản ứng CAMP (+) với R.equi sẽ tạo vùng tan huyết rộng 5-10mm và có
hình dạng đầu mũi tên, phản ứng (-) vùng tan huyết yếu và nhỏ (khoảng
1mm). Phản ứng (+) với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng
2mm) có dạng hình tròn.
Listeria monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S.aureus và CAMP (-)
với R.equi.
G. Đọc kết quả: Phát hiện hay không phát hiện Listeria monocytogenes trong
25 gam mẫu.
2.2.2 Kỹ thuật PCR(Polymerase Chain Reaction)
2.2.2.1 Lịch sử của kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được phát minh bởi tiến sỉ sinh hóa người nhật Kary Mullis,
Ông đã được nhận giải Nobel hóa học vào tháng 10 năm 1993 vì thành công
trong việc nhân bản các đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR mà không cần sử dụng
các sinh vật sống như E.coli hay nấm men . Sau này qui trình được cải tiến
liên tục và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là sinh học và y học
như là ứng dụng cho mục đích phát hiện các bệnh di truyền, chuẩn đoán những
bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống…
2.2.2.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR để xác định Listeria monocytogenes.
PCR sẻ khuếch đại một đoạn DNA ngắn đặc hiệu cho Listeria monocytogenes
đã được xác định từ trước, từ một mẫu ban đầu lên hàng tỷ bản sao nhờ vào
các enzyme DNA – polymerase, sau đó các sản phẩm khuếch đại (amplicons)
được phát hiện và xác định trên máy điện di gel aragose.
11


Kỹ thuật PCR căn bản gồm có PCR một bước(Fist - PCR) và PCR tổ (Nested
PCR), Realtime PCR. Tuy theo điều kiện mục đích yêu cầu của người sử dụng
mà có cách lựa chon kỹ thuật PCR nào phù hợp
Kỹ thuật Fist PCR (PCR một bước) thì cần ít thời gian hơn để thực hiện và

ít nguy cơ bị nhiễm bẩn hơn, tuy nhiên có khuyết điểm là độ nhạy không cao
sử dụng cho các trường hợp mẫu nhiễm có nồng độ hiện diện của đối tượng
càn nghiên cứu cao
Kỹ thuật Nested PCR (PCR tổ) thì cần nhiều thời gian và nguy cơ bị nhiễm
bẩn cao hơn nhưng các thao tác có thể thực hiện dưới tia UV để tiệt trùng,
Ngoài ra kỹ thuật này có độ nhạy cao hơn kỹ thuật một bước đến 10 lần và có
thể phát hiện mẫu nhiễm có nồng độ loãng
Kỹ thuật Real time PCR: Kỹ thuật này phức tạp hơn nhiều so với hai kỹ
thuật trên nhưng kỹ thuật này có tính năng vượt trội là phương pháp vừa định
tính vừa định lượng.
2.2.2.3 Các giai đoạn chính trong quá trình chạy PCR
Khi đưa vào máy luân nhiệt thì sẽ xảy ra các quá trình sau đây

Hình 2.2 Chu trình nhiệt trong máy luân nhiệt
(Nguồn:Cao Xuân Hiếu, Trương Quốc Phong, chương 18, Cẩm nang sinh học
phân tủ, 2006)

12


(1) Giai đoạn biến tính
Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lên đến 940 C, ở nhiệt độ này sẽ làm cho
phân tử DNA biến tính tách ra làm đôi hoàn toàn, tất cả hoạt động của các
men đều dừng lại (Ví dụ hoạt động kéo dài ở chu kỳ trước). Mục đích của giai
đoạn này làm cho phân tử DNA tách ra làm đôi và được duỗi thẳng ra hoàn
toàn, từ đó dễ dàng cho việc bắt cặp và gắn các Nu vào mạch đơn đó theo
nguyên tắc bổ sung.
(2) Giai đoạn bắt cặp
Các Primer (Các đoạn mồi) là các đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn
trong ống mẫu sẽ bắt cặp vào các chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo

nguyên tắc bổ sung. Sự bắt cặp này sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo
nguyên tắc bổ sung với đoạn gen mà ta cần khuếch đại và đặc hiệu theo chiều
dài của đoạn gen khuếch đại.
(3) Giai đoạn kéo dài
Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với các mạch đơn DNA, nhờ tác dụng của
men Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn các Nu có sẵn trong ống
nghiệm vào các primer theo nguyên tắc bổ sung, từ đó làm cho đoạn mồi dài
ra và hình thành nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản
sao DNA mới đã được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai
phân tử DNA có cấu trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu. Thời gian của
bước này phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài mảnh DNA cần
khuếch đại
Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp và kéo dài thuộc một chu kỳ của khuếch đại
DNA.
2.2.2.4 Thành Phần cho phản ứng PCR

Enzyme:
Các đặc tính của enzyme DNA polymerase và định nghỉa về đơn vị của
mỗi loại là khác nhau tùy thuộc vào nhà sản xuất. Lượng enzyme cần thiết là
phụ thuộc vào lượng DNA template và kích thước phản ứng PCR. Thành phần
cuả enzyne nên hiệu chỉnh khi sản phẩm PCR lớn hơn 5kb, có khả năng hoạt
tính của enzyme bị giảm sút do thiếu sót ở khâu bảo quản đã tiến hành hiệu
chỉnh bằng nhiều cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc không có.
Không nên tăng enzyme quá 5µl trên 50 µl tổng thể tích phản ứng. Việc thay
đổi loại DNA polymerase có thể làm thay đổi hiệu suất của phản ứng.

13


Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´→5´

exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA
polymerase có hay không có hoạt tính này.
Dung dịch đệm ( Bufer )
Hiệu suất và tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào
hệ buffer sử dụng. Thông thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với
enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. Một số buffer chứa chất hoạt động bề
mặt có thể ảnh hưởng đến các phản ứng.
dNTPs
Đây là các nguyên liệu cung cấp cho việc tổng hợp nên các đoạn gen mới.
Gồm có bốn loại đó là A, G, T, C. Việc tăng hay giảm nồng độ của dNTPs
không làm thay đổi đáng kể hiệu suất của việc chạy PCR.
DNA gốc và Primer
DNA gốc: Là những đoạn DNA cần khuếch đại để xác định được sự hiện diện
của các đoạn DNA này. Nồng độ tối ưu DNA gốc đối với các mẫu DNA khác
trong hổn hợp tương đối đồng nhất (plasmid, lambda ): 1 pg - 10 ng / 50 µl
tổng thể tích phản ứng; đối với mẫu DNA genome thì từ 50 - 500 ng/50 µl
tổng thể tích.
Primer :Mảnh DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là
những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường là 18-25bp)
nucleotides. Primer phải phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết
thúc của DNA cần khuếch đại.
Primer gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà
DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới.
Chất khác
Với các DNA gốc lớn, giàu GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như
formamide, glycerol, và betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên, phải kiểm
tra
độ
tương
thích

đối
với
enzyme
DNA
polymerase.
Một số dung dịch đệm đã có chứa sẵn dung dịch đệm tải mẫu để có thể điện di
ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những dịch đệm này không
cao. Đối với các máy luân nhiệt(thermocycler) không có gia nhiệt trên nắp thì
nên bổ xung dầu khoáng(mineral oil) để tránh bay hơi mẫu.

14


Chương 3: PHƯƠNG TỊÊN NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG
PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Đối tương nghiên cứu: Listeria monocytogenes và các loài Liseria spp
khác trong sản phẩm thủy sản.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Nafiqad 6.
3.1.3 Mẫu thủy sản:
Mẫu thủy sản không nhiễm Listeria monocytogenes (mẫu trắng).
Mẫu thủy sản nhiễm Listeria monocytogenes.
3.1.4. Chủng Listeria spp: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria
innocua
3.1.5 Môi trường, hóa chất:
Môi trường tăng sinh Fraser broth, BHI
Nước muối sinh lý (SPW)
Đệm ly trích DNA (Lysis Buffer)
Môi trường PCA
Ethanol 95 – 100%

Hổn hợp phản ứng PCR có độ đặc 5 lần(5X MasterMix) bao gồm:
đệm, các dNTPs, enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và đệm tải mẫu .
Mồi cho phản ứng: Hly F1/R1(399bp) khuếch đại gen Listeriolysin
Enzyme Nuclease
Thang DNA
3.1.6 Thiết bị và vật dụng
Buồn nhiệt 960C
Tủ đông – 200C
Tủ ấm: 370C
Thiết bị đồng nhất mẫu
Máy ly tâm nhỏ
ống nghiệm 1,5 ml, pipets…
Máy luân nhiệt
Máy điện di gel agarose
Thiết bị chụp ảnh DNA (gel doc)
Và một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm khác.

15


3.2 Qui trình phân tích Listeria monocytogenes bằng kỹ thuật PCR một
bước (Fist PCR)
I. Tăng sinh trong môi trường lỏng BHI

II. Phân lập trên ALOA

III. Chon khuẩn lạc điển hình đem ly trích và tinh sạch DNA

IV. Chuẩn bị hổn hợp phản ứng và mồi

V. Khuếch đại DNA trong máy luân Nhiệt

VI. Chuẩn bị gel và tiến hành chạy điện di các sản phẩm PCR

VII. Đọc kết quả trên gel doc

Hình 3.1 Sơ đồ qui trình PCR một bước
3.2.1 Thuyết minh qui trình
I. Tăng sinh: Vì lượng Listeria spp trong thực phẩm không nhiều nên cần
tăng sinh để tăng độ nhạy phát hiện được Listeria spp. Tiến hành tăng sinh
trên môi trường lỏng BHI
II. Phân lập: Mục đích giai đoạn này là nhằm để phân lập được vi khuẩn
Listeria spp và các vi khuẩn không phải Listeria spp. Dựa trên các đặc điểm
và hình dạng của khuẩn lạc khi phát triên trên các môi trường phân lập. Ta
dùng các moi trường phân lập là ALOA, Oxford , Palcam .
III. Ly trích và tinh sạch DNA. Chon các khuẩn lạc điển hình ngi ngờ
Listeria spp đem đi thực hiện ly trích và tinh sạch DNA dùng. Công đoạn này
gồm các bước sau:
Bước 1: Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường ALOA cho vào ống
nghiệm chứa 1ml nước muối sinh lý(SPW).

16


Bước 2: Đem ống nghiệm trên đi ly tâm 13000 vòng/phút trong vòng 5
phút
Bước 3: Loại bỏ phần nước, cho vào 500 µ l đệm ly trích, đồng nhất
bằng máy trộn mẫu và đun trong buồn nhiệt 960C trong thời gian 10
phút. Sau đó đem đi ly tâm 12000 vòng/phút
Bước 4: Hút 200 µ l dung dich đồng nhất ở phía trên cho vào ống

nghiệm chứa 400 µ l cồn 950. Đem đi trộn đều bằng máy trộn mẫu
Bước 5 : Ly tâm hổn hợp 12000 vòng/phút.
Bước 6: Loại bỏ phần dịch phía trên và để khô.
Bước 7: Hút vào 40 µl Dd. H2O và trộn đều.
IV. Chuẩn bị hổn hợp phản ứng và mồi: Cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt:
8.0 µ l 5X Master mix, 4.0 µ l mồi Hly F2/R2, 18 µ l Dd. H2O. Sau đó đem đi
trộn đều.
V. Khuếch đại DNA : Thực hiện Khuếch đại DNA trong máy luân nhiệt qua
nhiều chu kỳ để tăng hiệu suất khuếch đại được các gen đặc hiệu do các gen
này trong môi trường thường bị che lấp bởi các mảng vun của các thành phần
hay các gen khác.. Khuếch đại DNA gồm các bước:
Bước 1: chuẩn bị hổn hợp cho phản ứng Fist PCR
Bước 2:Cho vào máy luân nhiệt để chạy các phản ứng PCR được lập
trình sẵn như bảng sau:
Bảng 3.1 Các giai đoạn trong quá trình chạy PCR
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1

1

94

3 phút

2

25

94

30 giây

55

30 giây

72

30 giây

3

1

72

5 phút

4

1

18

Chờ phân tích

17