(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

NGUYỄN MẬU HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG
CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1




BỘThạc

GIÁO
Luận văn
sỹ DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC
VÀ Mậu Hưng
Nguyễn
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG
CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

Chuyên ngành:
Mã số:

Sinh học thực nghiệm
60420114

Học viện:
Hƣớng dẫn khoa học:

Nguyễn Mậu Hƣng
TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016
LỜI CAM ĐOAN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá
trình nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS .
Phạm Bích Ngọc cùng v ới cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công
nghệ Sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này
là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người
khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam
đoan của mình trước hội đồng khoa học.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hƣng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,
giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:
TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật Viện Công nghệ Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức,
những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo
sát thí nghiệm của tôi để có những lời khuyên bổ ích và kịp thời.
ThS. Lê Thu Ngọc, CN. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Phạm Thanh Tùng đã
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý
báu trong thời gian học tập vừa qua.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè
đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn
này.
Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hưng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

4




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... 11
1.

Đặt vấn đề ....................................................................................................................................... 11

2.

Mục đích nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

3.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

4.

Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................................. 13

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................... 14
1.1.

Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột ............................................................................. 14

1.1.1. Giới thiệu về tinh bột ....................................................................................................................... 14
1.1.2. Cấu trúc của tinh bột........................................................................................................................ 15
1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT ........................................................................................................ 16
1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT ............................................................................................................... 17
1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp ........................................................................................................... 17
1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ........................................................................ 18
1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình trao đổi tinh bột. ..................... 21
1.2.

Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam .................................................... 22

1.3.

Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp ............................................ 26

1.4

Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật ................. 28

1.5

Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật ............................................................... 29

1.6

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ................................................................................................................... 30

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 32
2.1.

Vật liệu , hóa chất và thiết bị ........................................................................................................... 32

2.1.1 Thực vật .......................................................................................................................................... 32
2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ..................................................................................... 32
2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................................................... 33
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................................................ 33
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 34

2.2.

Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV ............................................. 34

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 ........................................................................ 34
2.2.2. Phản ứng RT-PCR ........................................................................................................................... 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

5




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO ................................................................... 36
2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc ......................................................... 37
2.2.5. Tách chiết plasmid ........................................................................................................................... 38
2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank. ....... 39
2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. .................... 39
2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ...... 42
2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc ............................................... 43
2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu .............................................................................................................. 43
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 44
3.1.

Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn .................................. 44

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140. ....................................................................... 44
3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA............................................. 44
3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn .................................................................... 45
3.2.

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes tƣơng ứng ................................................................................................................................. 46
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway ............................. 46
3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế ......................... 47
3.3.

Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV ............................................................... 48

3.5.

Phân tích các dòng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR ..................................... 50

3.6.

Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR ............................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................................... 55
KẾT LUẬN: ................................................................................................................................................ 55
ĐỀ NGHỊ:.................................................................................................................................................... 55
Tài Liệu Tham Khảo .................................................................................................................................. 56
Phụ Lục: ........................................................................................................................................................ 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

6




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose .................................. 15
Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan ................ 19
Hình 3. Cây Sắn .............................................................................................. 23
Hình 4. Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not

defined.
Hình 5. Tỷ lệ sản lƣợng sắn các nƣớc trên thế giới, 2012Error!

Bookmark

not defined.
Hìnhaltime PCR hay qRT-PCR) sẽ đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ
biểu hiện của các gen quan tâm tại các mô cơ quan khác nhau hay ở những giai đoạn
phát triển. Đây là phƣơng pháp nhanh, nhạy, hiệu quả để xác định sự biểu hiện của các
gen trong quá trình phát triển đặc thù của thực vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

31




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Vật liệu , hóa chất và thiết bị

2.1.1 Thực vật
Giống sắn KM140 đƣợc thu thập tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm

-

nông nghiệp Hƣng Lộc, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam
Mẫu cây khoai lang KB1 nuôi cấy trong điều kiện in vitro do Phòng Công

-

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng
-

Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599, Escherichia coli

DH5(α) do Phòng công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học cung
cấp.
-

Vector tách dòng pBT để tách dòng đoạn gen SSIV mã hóa cho enzym

stacrch synthase IV đƣợc phân lập từ giống sắn KM140, Vector chuyển gen
pK7GWIWG2 (II) (Ghent Uni. Belgium); vector nhân dòng pENTR TM/DTOPO®.
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi sử dụng
Mục đích

Nhân đoạn gen

Tên

Trình tự mồi

mồi
SSIV_F

CACCATGGCGTCGAAGCTATCGA

EcoRI

CGTGGTTTCTG

SSIV_R

TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCT TG

SSIV

Chiều dài
gen

3,5 kb

SSIVCCTCTCCTGAACAACCTCCA

Kiểm tra vector

Frag_F

pK7WG2D/SSIV

SSIV-

1kb
Frag_R

GCAAACTTCCCACCTTTTCC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

32




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

2.1.3 Hóa chất
Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch 1 (25 nM Tris HCl, pH 8,0; 10
mM EDTA, pH 8,0; 50 mM Glucose); Dung dịch 2 (0,2 M NaOH; 1% SDS);
Dung dịch 3 (3M CH3COOK; 11,5% CH3COOH); Isopropanol, Ehtanol 70%;
dung dịch Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1).
Dung dịch TAE 1X (40 mM Tris, 20mM acetic acid và 1 mM EDTA);
Agarose 0,8%; Ethidium bromide 0,5 µg/ml, thang ADN 1kb (Thermo); kit tinh
sạch ADN Gene JET gel extraction (Thermo)
Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN
(Đức); Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen, Cat No: 911791
– 020).
Các hóa chất đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng BAP,
kinetin, IBA, NAA, Yeast extract, Bacto pepton, Trypton, NaCl, Agarose,
Sucrose, Tris HCL, EDTA, MgSO4, Glycerol, Glycine betaine, Proline,

Kanamycin, Rifamycin, Cefotaxime, X-gluc và các loại hóa chất thông dụng
khác đƣợc cung cấp bởi các hãng nhƣ Sigma (Mỹ), Merck (Đức) và Wako (Nhật
Bản).
2.1.4. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen: box
cấy vô trùng, bình nuôi cây, dàn nuôi cấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo
pH, máy đo OD. Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử: pipetman, máy soi
gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li
tâm (Eppendorf), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR
System 9700 (Appied Biosystem), bể ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện,
máy voltex v.v cùng các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực
vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

33




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.

Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140
Quy trình tách chiết RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit
PureLink Plant RNA Reagent, Invitrogen. Đầu tiên nghiền 0,1 g mẫu trong nitro
lỏng. Sau đó bổ sung 0,5 ml PureLink®Plant RNA Reagent lạnh, đảo đều. Ủ 5
phút ở nhiệt độ phòng. Rồi ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở nhiệt độ phòng.
Chuyển phần dịch nổi qua ống ly tâm mới. Bổ sung 0,1 mL NaCl 5 M, trộn đều.
Bổ sung thêm 0,3 mL Chloroform, trộn đều. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút
ở 4°C, chuyển pha trên qua ống ly tâm mới. Thêm 1 lần thể tích isopropanol,
trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 10 phút
ở 4°C, bỏ phần dịch. Tiếp tục bổ sung 1 ml cồn 75%, trộn đều. Ly tâm 12000
vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch, dùng pipet cẩn thận hút hết dịch
vẫn còn trong ống ly tâm. Bổ sung 30 μL nƣớc khử RNase, trộn đều, mẫu đƣợc
bảo quản ở -80°C.
2.2.2. Phản ứng RT-PCR
-

-

Sử dụng 500 ng RNA tổng số để tổng hợp cDNA
Thành phần

Thể tích

RNA tổng số

500 ng

Mồi ngẫu nhiên (Hexam)

1µL

Nƣớc khử ion

Dẫn đến 12µl

Trộn nhẹ, ủ 65°C trong 5 phút. Cắm ngay vào đá, sau đó bổ sung các

thành phần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

34




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Thành phần

Thể tích

5X Reaction buffer

4

dNTP mix (10mM)

2

Ribolock Rnase Inhibitor (20u/µl)

1

M-MuLV Reverse Transcriptase 1
(20u/µl)
Tổng thể tích
-

20µl

Trộn nhẹ và cho vào máy spin sau đó chạy chƣơng trình tổng hợp cDNA

25°C/5 phút; 42°C/ 60 phút. Kết thúc phản ứng ở 70°C/5 phút. Bảo quản cDNA
ở -20°C hoặc -70°C. Thực hiện phản ứng PCR
Thành phần

Thể tích (µl)

Pfu Buffer with MgSO4 10X 2,5
Pfu DNA polymerase

0,5

dNTPs

2,5

SSIV_F

0,5

SSIV_R

0,5

Khuôn

0,5

Nƣớc

17

Tổng

25

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

35

Luận văn Thạc sỹ
Bƣớc Phản ứng

Nguyễn Mậu Hưng
Nhiệt độ (°C) Thời gian
3 phút

1

Biến tính

95

2

Biến tính

95oC

Gắn mồi

o

3
4
5
6

Kéo dài chuỗi
Hoàn tất kéo dài

Kết thúc phản ứng

Chu kỳ
1

45
giây

52 C

30

30 giây

o

72 C

4 phút

o

72 C

1

10 phút

o

4C



Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng GeneJET PCR Purification Kit của
hãng Thermo Scientific nhƣ sau: Thêm vào 25 µl Binding buffer, trộn đều. Cho
toàn bộ dịch lên cột ly tâm. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua
cột. Thêm vào cột 500 Wash buffer. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ
dịch qua cột. Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột ly tâm sang
ống 1,5 ml. Thêm vào cột ly tâm 30 µl nƣớc khử ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ
phòng trong 2 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu lấy dịch.
2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO
Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector pENTR theo pENTR™/D-TOPO®
Cloning Kit.
Thành phần

Thể tích (µl)

Sản phẩm PCR sạch (200ng)

4

Salt solution

1

TOPO® vector

1

Tổng thể tích

6

Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ 5’ ở nhiệt độ phòng (22-23oC). Đặt phản ứng
trên đá và thực hiện quá trình biến nạp vào tế bào E.coli One Shot Competent.
Bổ sung 2 µl phản ứng TOPO Cloning vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Ủ trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

36




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

đá 10 phút. Sốc nhiệt tế bào 30s,ở 42oC rồi chuyển ngay ống vào đá. Bổ sung
250 µl môi trƣờng S.O.C ở nhiệt độ phòng. Nuôi lắc 200v/p, 37oC, 1h. Cấy trải
50-200 µl dịch biến nạp lên đĩa môi trƣờng LB đặc chứa 100 µg/ml Kanamycin
và ủ qua đêm ở 37oC.
2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc
Sau khi nuôi khuẩn đã biến nạp trên môi trƣờng chọn lọc, tiến hành chọn
ra các khuẩn lạc trắng để chạy PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu trên
vector để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen mong muốn. Thành phần
phản ứng PCR từ khuẩn lạc và chu kì nhiệt nhƣ sau:
Thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

Nƣớc khử ion vô trùng

8

2

Maste mix

10

3

Khuẩn lạc

4

M13F

1

5

M13R

1

Tổng

20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

37




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR từ khuẩn lạc
Bƣớc Phản ứng

Nhiệt độ ( °C) Thời gian

Chu
kỳ

1

Biến tính

94

5 phút

2

Biến tính

94oC

50giây

3

Gắn mồi

52oC

30giây

4

Kéo dài chuỗi

72oC

2 phút

5

Hoàn tất kéo dài

72oC

10 phút

6

Kết thúc phản ứng

4oC



1

30

1

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trên gel agarose 0,8% để chọn
ra các khuẩn lạc mang gen có kích thƣớc nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi
những khuẩn lạc dƣơng tính vào 3ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp
để tách plasmid.
2.2.5. Tách chiết plasmid
Các dòng khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi trong 3 ml LB lỏng có bổ sung
kháng sinh thích hợp để tiến hành tách plasmid. Đây là phƣơng pháp tách
plasmid lƣợng bé từ 1-1,5 ml dịch khuẩn E. coli, có số bản copy plasmid cao.
Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào eppendorf, ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1
phút, loại dịch trên. Bổ sung 200 µl dung dịch I dùng máy Voltex hòa tan tế bào.
Từ bƣớc này các thao tác phải đƣợc thực hiện trong đá. Bổ sung 400 µl dung

dịch II đảo nhẹ nhàng. Dung dịch II có tác dụng phá vỡ thành tế bào. Bổ sung
300 µl dung dịch III để kết tủa protein, đảo đều. Bổ sung 900 µl Chloroform :
isoamin (24:1), lắc đều. Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Dƣới tác dụng
của lực ly tâm, mẫu chia thành ba pha: pha trên chứa DNA plasmid, pha giữa là
protein tủa và pha dƣới cùng là tạp chất. Dùng pipet hút nhẹ nhàng pha trên
cùng chứa DNA plasmid sang ống eppendorf mới. Bổ sung thể tích tƣơng đƣơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

38




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

isopropanol để tủa plasmid, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm thu DNA
plasmid ở 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Bỏ dịch thu cặn. Thêm 500 µl
Ethanol 70%, đảo đều. Ly tâm 7000 vòng/ phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn
Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút. Hòa tan DNA thu đƣợc trong 30 µl
H2O deion. Điện di kiểm ta plasmid trên gel agarose 0,8%.
2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự
tƣơng ứng trên GenBank.
Xác định trình tự nucleotide: Các mẫu plasmid tái tổ đƣợc xác định trình tự trên
máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer.
Phân tích trình tự: Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit, BLAST để so
sánh các trình tự gen.
2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ
thuật Gateway.

Phản ứng LR: Khi đoạn gen cần quan tâm đã đƣa vào entry vector
pENTRTM/D-TOPO là vector mang gen kháng Kanamycin, ở bên sƣờn đoạn gen
quan tâm có hai điểm tái tổ hợp (attL1 và attL2). Tiến hành phản ứng tái tổ hợp
LR để chuyển đoạn gen quan tâm vào destination vector pK7GWG2D. Vector
này chứa tất cả trình tự cần biểu hiện nhƣ các điểm tái tổ hợp (attR1 và attR2) ở
giữa hai điểm có đoạn gen chọn lọc âm tính ccdB, các gen chọn lọc
(Spectinomicin hay Streptomycin, Kanamycin). Hai sự tái tổ hợp: một là giữa
attL1 và attR1, hai là attL2 và attR2 tạo ra dòng biểu hiện.
attL1-gene-attL2 x attR1-ccdB-attR2
(entry clone)

attB1-gene-attB2 x attP1-ccdB-attP2

(destination vector)

(expression clone)

Phản ứng đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của bộ kit Gateway® LR
ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện
phòng thí nghiệm. Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ
phòng và trộn nhẹ:
Thành phần phản ứng LR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

39




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

STT Thành phần

Thể tích (µl)

1

Plasmid pENTR/CPi (50 – 150 ng)

1

2

Vector pK7GWIWG2(II) (150 ng/l)

0,5

3

Nƣớc khử ion, khử trùng

2,5

Tổng

4

Làm tan hỗn hợp enzym LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Vortex 2

lần, mỗi lần khoảng 2 giây. Bổ sung vào ống ly tâm 2 µl enzym LR ClonaseTM
để phản ứng và trộn bằng cách vortex nhẹ nhàng 2 lần. Ly tâm nhẹ nhàng. Ủ
phản ứng ở 25oC trong 90 phút (thay vì 1 giờ nhƣ trong kit). Bổ sung 1 µl dung
dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Vortex nhẹ nhàng. Ủ 37oC trong 10
phút. Hỗn hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli Top10. Chúng tôi thực
hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R
khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV

Hình 4. Vector pK7GWG2D

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

40




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Theo tính toán lý thuyết sản phẩm thu đƣợc sau khi xử lý với enzyme EcoRI sẽ
cho ba phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ trình bày trong bảng sau.
Bảng 2. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp
pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI
Mẫu

pK7GWG2D/SSIV

Phân đoạn 1

10661 bp

Phân đoạn 2

2201 bp

Phân đoạn 3

1486 bp

Thành phần phản ứng cắt bằng EcoRI nhƣ sau:
STT Thành phần

Thể tích (l)

1

Nƣớc cất khử ion, khử trùng 5

2

Dung dịch đệm (10X)

1

3

EcoRI

1

4

DNA plasmid

3(l)

Tổng

10

Tách Plasmid và biến nạp pK7GWG2D/SSIV đã có kết quả chọn dòng dƣơng
tính ở trên vào tế bào Agrobacterium rhizogenes K599
Trƣớc khi biến nạp vector tái tổ hợp pK7GWG2D/SSIV vào tế bào
A.rhizogenes K599 bằng phƣơng pháp xung điện, tế bào này đƣợc làm cho khả
biến theo Sambrook và cộng sự (1998). Quy trình biến nạp đƣợc tiến hành nhƣ
sau: Tế bào khả biến đặt trong đá 10-15 phút. Bổ sung 1 µl plasmid tái tổ hợp
pK7GWG2D/SSIV vào tế bào khả biến và trộn nhẹ. Rửa Cuvette bằng cồn 100o,
rửa lại bằng nƣớc khử ion, khử trùng rồi thấm khô. Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A.
rhizogenes + pK7GWG2D/SSIV vào Cuvette. Xung điện: 2,5 kv, 25µF và điện trở
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

41




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

400. Đặt ngay vào đá. Sau 5-10 phút bổ sung 300 µl LB và trộn nhẹ. Chuyển
sang ống eppendorf 2 ml. Ủ ở 28oC trong 1 giờ trên máy lắc. Chuyển dịch vào
đĩa chọn lọc chứa kháng sinh Streptomycin 100 mg/l và spectinomycine 1000
mg/l. Ủ ở 28oC từ 24 - 48 giờ.
Chọn dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes mang vector chuyển gen:
Sự có mặt của vector chuyển gen đƣợc kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi
đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của
gen SSIV
2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes
Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây khoai lang thông qua vi khuẩn A.
rhizogens K599 bao gồm các bƣớc chính sau: Chủng khuần A.rhizogenes
K599/SSIV gốc đƣợc cấy ria trên môi trƣờng YMB đặc bổ sung 100 mg/l
spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine, nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ.
Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng bổ sung kháng
sinh chọn lọc (100 mg/l spectinomycine và 100 mg/l Streptomycine) nuôi lắc
200 vòng/phút qua đêm . Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi
cho vào 45 ml YMB lỏng (không chứa kháng sinh chọn lọc), nuôi lắc 200
vòng/phút, 28o C trong 4 -6 giờ. Các môi trƣờng nuôi khuẩn đều không bổ sung
kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh. Dịch khuẩn
đƣợc đem ly tâm 6500 vòng/phút ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trƣờng nuôi
cấy. Cặn khuẩn đƣợc hòa tan trong môi trƣờng MS lỏng tạo dịch huyền phù vi
khuẩn. Các mẫu lá khoai lang đƣợc cắt tạo tổn thƣơng sau đó đƣợc lây nhiễm
bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn . Sau khi lây nhiễm, mẫu biến
nạp đƣợc thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi đƣợc đặt vào môi trƣờng đồng
nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l . Sau thời gian đồng nuôi cấy,
chuyển mẫu lên môi trƣờng diệt khuẩn: MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l +
cefotaxime 500 mg/l. Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đầu cảm ứng tạo rễ và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

42




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

đƣợc cắt ra chuyển lên môi trƣờng MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l +
cefotaxime 500 mg/l.
2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc
Sàng lọc cây chuyển gen bằng cách chọn lọc: Do không phải toàn bộ các
tế bào và các mẫu chuyển gen đều mang gen chuyển nên nhất thiết phải tiến
hành sàng loc các tế bào chuyển gen Dna vào các gen chọn lọc đƣợc thiết kế
trong vector chuyển gen mà ngƣời ta sử dụng các kháng sinh phù hợp để thu
đƣợc các tế bào, mẫu mang gen chuyển. Gen chọn lọc điển hình là các gen mã
hóa cho các loai enzyme có khá năng

khử độc đối vói kháng sinh nhƣ

kanamycin (nptII), hygromycine (hyg), gentamycine (gent),… hoặc chất diệt cỏ
glyphosate hay basta (bar),… Chỉ những tế bào mang gen biến nạp có thể sống
sót trên môi trƣòng chứa chất kháng sinh hoặc chất diệt cỏ. Các loai vector này
dã đƣợc ứng dụng và mang lai thành công trong việc chọn lọc nhiều đối tƣợng
cây chuyển gen nhƣ cây đu đủ, cây hồng, cây lúa, cây bông vái, cây thuốc lá, …
2.2.10.

Phƣơng pháp xử lí số liệu

Thiết kế mồi và dữ liệu trình tự DNA đƣợc xử lý bằng phần mềm
Lasergene version 7 cúa DNASTAR Inc., USA; BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990); BioEdit version 7 (Tom Hall,
Department of Microbiology , North Carolina State University, NC) và
Primer3 Input Version 4 ( />
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

43




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase

ở sắn
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140.
RNA tổng số đƣợc tách chiết từ củ của giống sắn KM140 bằng hóa chất
chuyên dụng cho việc tách chiết RNA thực vật (PureLink Plant RNA Reagent)
của Invitrogen. Các bƣớc thực hiện đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản
xuất. DNA genome tạp nhiễm sau đó đƣợc loại bỏ bằng cách xử lý mẫu với
DNase I và RNA tổng số đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp tủa sử dụng Lithium

chloride (LiCl). Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose cho thấy
RNA tổng số thu đƣợc có tính toàn vẹn, không bị đứt gẫy, đảm bảo hàm lƣợng
và độ tinh sạch cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 5. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140
3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA
Do kích thƣớc DNA của gen SSIV rất lớn (hơn 8 kb) nên chúng tôi sử
dụng

trình

tự

CDS

của gen

SSIV

sắn

trên

phytozome

với

mã

cassava4.1_000719m để thiết kế cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen SSIV từ

cDNA

củ

sắn

là

SSIV_F

CACCATGGCGTCGAAGCTATCGACGTGGTTTCTG-3’)

(5’và SSIV_R

(5’- TTAGACCTACTTGCTGCCGCTCTTG-3’). Trên mồi xuôi có chứa trình
tự CACC ở đầu 5’ giúp quá trình nối ghép gen đích vào vector pENTR đƣợc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

44




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

đơn giản hóa nhờ phản ứng TOPO cloning - một phƣơng pháp tạo dòng của
Invitrogen.
Để tăng hiệu suất cũng nhƣ độ đặc hiệu của phản ứng PCR khuếch đại

gen SSIV từ cDNA sắn, chúng tôi tiến hành tổng hợp cDNA từ RNA tổng số
tách chiết từ củ sắn sử dụng mồi đặc hiệu. Theo đó, cDNA đƣợc tổng hợp theo
kít ―RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit‖ (Thermo
Scientific).
3.1.3. Phân lập, tách dòng, giải trình tự gen SSIV của sắn
Chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế để khuếch đại gen SSIV từ
cDNA sắn đã tổng hợp bằng phản ứng PCR dƣới sự xúc tác của enzyme Pfu
DNA polymerase. Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% cho thấy
chúng tôi đã khuếch đại thành công 1 đoạn DNA có kích thƣớc gần 3,5 kb tƣơng
đƣơng với kích thƣớc đoạn CDS của gen SSIV theo lý thuyết.

Hình 6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA
sắn
Đoạn DNA này sau đó đƣợc tinh sạch và gắn vào vector pENTRTM/DTOPO trong dung dịch muối đệm tạo thành vector pENTR/SSIV. Sản phẩm của
phản ứng TOPO cloning đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
One Shot TOP10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt. Sàng lọc các dòng khuẩn lạc trên
đĩa biến nạp bằng phƣơng pháp colony-PCR sử dụng cặp mồi M13F/R, chúng
tôi đã chọn đƣợc 3 dòng khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính với kích thƣớc băng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

45




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

DNA đúng nhƣ tính toán là > 3,5 kb. 3 dòng này sau đó đƣợc nuôi lƣợng lớn để

tách chiết plasmid phục vụ cho việc giải trình tự gen.

Hình 7. Colony-PCR chọn lọc các dòng khuẩn mang vector pENTR/SSIV
Kết quả giải trình tự cho thấy gen SSIV của giống sắn KM140 đã phân lập
có kích thƣớc 3189 bp mã hóa cho 1063 axit amin, có độ tƣơng đồng 99% so với
trình tự gen SSIV trên phytozome với mã cassava4.1_000719m, chứng tỏ chúng
tôi đã phân lập thành công gen SSIV từ giống sắn KM140. Trình tự gen SSIV
phân lập đƣợc từ giống sắn KM140 đang đƣợc đăng kí trên ngân hàng GenBank
với mã số dự kiến là KT033500.
3.2.

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes tƣơng ứng
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật
Gateway
Kỹ thuật Gateway là một phƣơng pháp nhân dòng phổ biến và tiện ích
dựa trên cơ sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các điểm chuyên biệt ở
DNA của phage và vi khuẩn đƣợc gọi là các điểm gắn (attachment sites). Với kỹ
thuật này, một hoặc nhiều gen đích có thể di chuyển từ entry clone vào bất kì
vector đích biểu hiện nào theo đúng chiều và khung đọc chỉ trong một bƣớc thao
tác mà không phải sử dụng bất kỳ enzyme cắt giới hạn nào. pK7WG2D là một
vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm 1 vùng chứa cassette attR1ccdB-attR2. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid có chứa 1 vị trí
tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

46

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Thành phần và các bƣớc thực hiện phản ứng LR đƣợc thực hiện theo
hƣớng dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix của Invitrogen với
vector đích là pK7WG2D và entry clone chính là vector pENTR/SSIV đã thiết kế
thành công. Sản phẩm của phản ứng đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E.
coli One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi trƣờng có bổ sung Spectinomycin 100
µg/ml. Để sàng lọc các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV
mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu
SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV.
Các dòng khuẩn lạc cho kết quả PCR dƣơng tính sẽ đƣợc chọn để nuôi cấy và tiến
hành tách chiết plasmid, sau đó cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.

Hình 8. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra
sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI.
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt cho thấy chúng tôi đã chọn đƣợc các
dòng plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV cho các băng DNA đúng kích thƣớc theo
tính toán lý thuyết là: 10661 bp, 2201 bp và 1486 bp, chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế
thành công vector pK7WG2D/SSIV.
3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen
đã thiết kế
Vector chuyển gen pK7WG2D/SSIV đã thiết kế đƣợc sử dụng để biến nạp
vào tế bào khả biến chủng A. rhizogenes K599. Sản phẩm của quá trình biến nạp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

47

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

đƣợc nuôi trên môi trƣờng YMB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l
Spectinomycin, ủ ở 28oC. Sau 2 ngày thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc trên đĩa
thạch. Sau khi sàng lọc bằng phƣơng pháp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu
SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R, các dòng Agrobacterium mang cấu trúc chuyển
gen sau đó sẽ đƣợc nuôi lỏng trong 3 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc,
lắc ở 28oC qua đêm,
giữ
Glycerol
trong
ĐCsauMđó đƣợc
1
2 trong
3
4
5 20%
6 và7bảo quản
8
tủ -84oC.

960 bp

Hình 9. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc
Kế t quả điê ̣n di s ản phẩm PCR cho thấ y m ột số dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, 4,

8 mang xuất hiện băng PCR kích thƣớc khoảng 960 bp, đúng với kích thƣớc lý
thuyế t của đo ạn gen PCR bằng mồi SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R. Kế t quả
trên, chƣ́ng tỏ các dòng vi khu ẩn đã mang gen cầ n chuyể n . Chúng tôi chọn cá c
khuẩ n la ̣c có k ết quả PCR dƣơng tính nuôi trong môi trƣờng LB lỏng và nuôi
tạo dịch huyền phù tế bào vi khuẩn để chuyển gen t

ạo rễ tơ cây khoai lang

mang gen SSIV.
3.3.

Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV
Thí nghiệm này chúng tôi chọn hệ thống nuôi cấy rễ tơ với mục đích đánh

giá khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột của gen SSIV trên mô hình cây
khoai lang KB1. Đối với mỗi cấu trúc gen SSIV, chúng tôi sử dụng 216 mảnh lá
và đoạn thân khoai lang. Sau khi lây nhiễm và đồng nuôi cấy với vi khuẩn
Agrobacterium, các mảnh khoai lang đƣợc đặt trên môi trƣờng chọn lọc có bổ
sung kanamycin ở nồng độ cao (30 - 50 mg/L). Do trong quá trình xâm nhiễm,
ngoài các cấu trúc gen SSIV, gen SSIV trên vector chuyển gen mã hóa cho
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

48




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

enzyme phân hủy kanamycin cũng đƣơc tích hợp vào genome thực vật chủ nên
chỉ những mô lá, thân đƣợc chuyển gen mới có thể sống sót trên môi trƣờng
kháng sinh kanamycine và cảm ứng tạo rễ ( Hình 10).

Hình 10. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi
trƣờng đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes

Hình 11. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra
rễ trên môi trƣờng chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày
Qua theo dõi, các mô đƣợc lây nhiễm với A.rhizogenes mang cấu trúc
SSIV có khả năng biệt hóa tạo rễ tơ trên môi trƣờng MS bổ sung 30 mg/L
kanamycine.
Quá trình phát sinh kiểu hình rễ tơ diễn ra sau từ 20 đến 30 ngày sau lây
nhiễm Agrobacterium. Các mảnh lá và thân chuyển gen có xu hƣớng hình thành
rễ ở các cạnh đã cắt bỏ gân giữa gây tổn thƣơng. Các dòng rễ chuyển gen SSIV
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

49