Nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE
CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC
Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

NGHIÊN CỨU THAY ĐỔI LYSYL OXIDASE
CỦA TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU VÕNG MẠC
Ở MÔI TRƢỜNG NỒNG ĐỘ GLUCOSE CAO
Chuyên ngành : Nhãn khoa
Mã số

: 9720157

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Huy Thịnh
2. TS. Nguyễn Xuân Tịnh

HÀ NỘI – 2020


LỜI CẢM ƠN
Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời
cảm ơn chân thành nhất tới:
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Mắt Trường
Đại học Y Hà Nội, Trường Y Đại học Boston, Ban Giám đốc Bệnh viện
Mắt Trung Ương đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt quá trình tôi học tập và tiến hành nghiên cứu để tôi có thể
hoàn thành luận án này.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.
Trần Huy Thịnh và TS. Nguyễn Xuân Tịnh – những người thầy đã tận tình
hướng dẫn, dìu dắt tôi trong quá trình học tập, công tác chuyên môn nghề
nghiệp và chỉ bảo giúp tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá
trình thực hiện nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Sayon Roy - Trường
Y Đại học Boston và PGS.TS. Phạm Trọng Văn - Trưởng Bộ môn Mắt đã
cho tôi nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thiện nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng, cùng hai nhà
khoa học phản biện độc lập. Các thầy cô đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi
trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị em Phòng nghiên cứu biến

chứng mạch máu nhỏ do đái tháo đường - Trường Y Đại học Boston và Bộ
môn Mắt - Trường Đại học Y Hà Nội cùng các anh chị đi trước, bạn bè đồng
nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và công tác.
Sau nữa, tôi xin dành tình yêu thương và lòng biết ơn đến những người
thân trong gia đình, bạn bè đã chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi thực
hiện và hoàn thành luận án.
Hà Nôi, ngày 2 tháng 10 năm 2020
Tác giả luận án

Nguyễn Ngân Hà


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Ngân Hà, nghiên cứu sinh khóa 36, chuyên ngành Nhãn
khoa, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS. Trần Huy Thịnh và TS Nguyễn Xuân Tịnh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là chính xác, trung thực
và khách quan, đã được cơ sở nơi nghiên cứu xác nhận.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam kết này.
Hà Nội, ngày 02 tháng 10 năm 2020
Người thực hiện

Nguyễn Ngân Hà


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
APS

: Ammonium Persulfate

BAPN

: β-Amin-opropionitrile

BSA

: Bovine serum albumin

Coll IV

: Collagen IV

Cx

: Connexin

DAPI

: 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMEM

: Dulbecco Medified Eagle Medium

FBS

: Fetal Bovine Serum

FITC

: Fluorescein isothiocyanate

FN

: Fibronectin

HIFs

: Các yếu tố gây thiếu oxy

HSPGs

: Heparan sulfate proteoglycan

LOX

: Lysyl oxidase

LOXsiRNA

: LOX small interfering RNA

NH4OH

: Amonium Hydroxide

PBS

: Photphaste-buffered saline

PDR

: Bệnh võng mạc đái tháo đường tăng sinh

PVR

: Bệnh dịch kính võng mạc tăng sinh

RRD

: Bong võng mạc nguyên phát

TGF- β

: Yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β

TTBS

: Tween Tris-buffered saline

VEGF

: Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

WB

: Western blot

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc ......................................... 3
1.1.1. Lớp nội mô ..................................................................................... 3
1.1.2. Màng đáy ........................................................................................ 4
1.1.3. Tế bào quanh mạch ........................................................................ 9
1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường ............. 9
1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thương mao mạch võng mạc do tình
trạng đường huyết cao. ........................................................................... 11
1.2.1. Dày màng đáy mao mạch võng mạc ............................................ 11
1.2.2. Rối loạn kết nối tế bào-tế bào ...................................................... 14
1.2.3. Thay đổi cấu trúc ti thể................................................................. 18
1.3. Lysyl oxidase ...................................................................................... 20
1.3.1. Đặc điểm lysyl oxidase ................................................................ 20
1.3.2. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện
LOX .............................................................................................. 23
1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới ............................. 26
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 30
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 30
2.2. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 30
2.3. Phương pháp nghiên cứu..................................................................... 30
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm ............................. 30
2.3.2. Mẫu............................................................................................... 30
2.3.3. Phương tiện nghiên cứu ............................................................... 31
2.3.4. Cách thức tiến hành ...................................................................... 32
2.3.5. Các chỉ số nghiên cứu .................................................................. 50
2.4. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu .................................... 52

2.5. Đạo đức nghiên cứu ............................................................................ 52


Chƣơng 3: KẾT QUẢ ................................................................................. 53
3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .................................................................. 53
3.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu
võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao ........................ 54
3.2.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu
hiện của LOX ................................................................................ 54
3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX . 62
3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt
động của tế bào ............................................................................. 66
3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào
tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ
glucose cao ............................................................................................. 70
3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 70
3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào .... 72
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 80
4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX.............................................. 80
4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX ........................................... 80
4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu
hiện của LOX ................................................................................ 84
4.2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào . 94
KẾT LUẬN ................................................................................................ 100
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ................................................... 102
DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể người .. 5
Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau ............. 5


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX
trong protein toàn phần ....................................................... 55

Biểu đồ 3.2.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hàm
lượng LOX tại chất nền ngoại bào. .................................... 56

Biểu đồ 3.3.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX
trong tế bào. ........................................................................ 57

Biểu đồ 3.4.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ
LOX trong protein toàn phần. ............................................ 60

Biểu đồ 3.5.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới mật độ

LOX trong protein chất nền ngoại bào. .............................. 61

Biểu đồ 3.6.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới hoạt động
của LOX.............................................................................. 62

Biểu đồ 3.7.

Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA. 63

Biểu đồ 3.8.

Sự thay đổi mật độ LOX trong protein toàn phần. ............. 64

Biểu đồ 3.9.

Tác động ức chế hoạt động LOX của BAPN. .................... 65

Biểu đồ 3.10.

Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ
thẩm thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc. ........... 66

Biểu đồ 3.11.

Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện
tượng chết tế bào theo chương trình biểu thị qua số lượng tế
bào chết/1000 tế bào. .......................................................... 69

Biểu đồ 3.12.

Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám
dính của LOX với Coll IV và FN trong protein toàn phần. 71

Biểu đồ 3.13. Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mức độ bám
dính của LOX với Coll IV và FN trong protein chất nền
ngoại bào............................................................................. 72


Biểu đồ 3.14.

Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX
liên kết với Coll IV trong protein toàn phần. ..................... 73

Biểu đồ 3.15.

Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX
liên kết với FN trong protein toàn phần. ............................ 75

Biểu đồ 3.16.

Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX
liên kết với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ....... 76

Biểu đồ 3.17.

Tác động của môi trường nồng độ glucose tới mật độ LOX
liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. .............. 79

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1.

Cấu trúc mao mạch võng mạc .................................................... 3

Hình 1.2.

Cấu trúc màng đáy mao mạch .................................................... 6

Hình 1.3.

Hiện tượng rò mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường ở
chuột ......................................................................................... 10

Hình 1.4.

Hiện tượng mao mạch không có tế bào ở võng mạc chuột đái
tháo đường ................................................................................ 10

Hình 1.5.

Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường ............................. 13

Hình 1.6.

Cấu trúc và vị trí của connexon ................................................ 14

Hình 1.7.

Sự ghép cặp của các connexon hình thành mối liên kết khe .... 15

Hình 1.8.

Sơ đồ cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do dày màng
đáy mao mạch và rối loạn kết nối tế bào-tế bào ....................... 18

Hình 1.9.

Cơ chế bệnh sinh bệnh võng mạc đái tháo đường do thay đổi
cấu trúc ti thể............................................................................. 19

Hình 1.10. Quá trình hình thành LOX trưởng thành .................................. 21
Hình 1.11. Điều hoà quá trình hình thành và hoạt động của LOX ............. 21
Hình 2.1.

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào ................................... 33

Hình 2.2.

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong tủ hút .............................. 33

Hình 2.3.

Các tế bào nuôi cấy trong các đĩa môi trường. ......................... 35

Hình 2.4.

Các tế bào được nuôi cấy trên các lam kính đặt trong các đĩa tế bào.. 40

Hình 2.5.

Chuẩn bị kháng thể sơ cấp ........................................................ 41

Hình 2.6.

Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang ngày thứ nhất .......... 42

Hình 2.7.

Phân tích hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua phần
mềm Image J ............................................................................. 43

Hình 3.1.

Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein toàn phần .. 54


Hình 3.2.

Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong protein chất nền
ngoại bào ................................................................................... 55

Hình 3.3.

Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX trong tế bào. ............. 56

Hình 3.4.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới LOX bên
ngoài tế bào. .............................................................................. 58

Hình 3.5.

Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein
toàn phần .................................................................................. 59

Hình 3.6.

Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein
chất nền ngoại bào. ................................................................... 61

Hình 3.7.

Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX ở các nhóm tế bào. ... 63

Hình 3.8.

Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang LOX trong protein
chất nền ngoại bào. ................................................................... 64

Hình 3.9.

Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT67

Hình 3.10. Hình ảnh nhuộm huỳnh quang thể hiện hiện tượng chết tế bào
theo chương trình ở các nhóm tế bào........................................ 68
Hình 3.11. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và
hàm lượng LOX liên kết với FN trong protein toàn phần. ....... 70

Hình 3.12. Hình ảnh WB thể hiện hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và hàm
lượng LOX liên kết với FN trong protein chất nền ngoại bào. ...... 71
Hình 3.13. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử
thể hiện liên kết của LOX với Coll IV trong protein toàn phần. ... 73
Hình 3.14. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi đồng tiêu
thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần. 74
Hình 3.15. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử
thể hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần.75
Hình 3.16. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang thể hiện liên kết của
LOX với Coll IV trong protein chất nền ngoại bào. ................. 77


Hình 3.17. Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang qua sinh hiển vi điện tử thể
hiện mật độ liên kết của LOX với FN trong protein toàn phần....... 78
Hình 4.1.

Giảm LOX giúp ngăn ngừa rò mạch máu võng mạc trong bệnh
đái tháo đường .......................................................................... 85

Hình 4.2.

Giảm lượng LOX giúp ngăn ngừa chết tế bào theo chương trình
ở các tế bào mạch máu trong mạng mao mạch võng mạc. ....... 90

Hình 4.3.

Tác động của đái tháo đường và giảm nồng độ LOX tới sự
phát triển của mạch máu không có tế bào và chết tế bào ngoại
mạch ở võng mạc chuột ........................................................... 93

Hình 4.4.

Hình ảnh cắt ngang mao mạch võng mạc chuột qua sinh hiển vi
điện tử ....................................................................................... 95

Hình 4.5.

Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới sự kết dính
của LOX với chất nền ngoại vào và LOX quay trở lại tế bào
biến thiên theo thời gian ........................................................... 98


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị
lực trong dân số trong độ tuổi lao động [1-2]. Các giai đoạn đầu của bệnh
võng mạc đái tháo đường được đặc trưng bởi sự hiện diện của mao mạch
không có tế bào và sự chết tế bào ngoại mạch, tiếp đó là sự chết tế bào mạch
máu võng mạc theo chương trình [3-4]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng
đáy mao mạch dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường
[5-6] và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu [7-8]. Ngoài ra, màng
đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng
tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc [4], một dấu hiệu lâm
sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường. Cơ chế bệnh sinh của bệnh lý vi
mạch do đái tháo đường bị ảnh hưởng bởi những thay đổi về chất lượng và số
lượng của màng đáy mao mạch. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức
năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá rõ [9],
nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi
này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng của bệnh võng mạc đái tháo đường

vẫn chưa rõ ràng.
Lysyl oxidase (LOX) là một enzyme ngoại bào đã được chứng minh là
rất cần thiết cho sự hình thành và chức năng của màng đáy [10]. Ức chế
enzyme này có thể gây ra bệnh loãng xương [11], nhưng đồng thời, các loại tế
bào khối u gây tăng lượng enzyme này có thể thúc đẩy sự di căn của khối u
hiện có, khiến nó trở nên ác tính [12-13]. LOX được tổng hợp và tiết ra dưới
dạng tiền enzyme glycosyl hóa (proLOX, 50 kDa), tiếp tục trải qua quá trình
phân giải protein ngoại bào thành dạng trưởng thành (LOX 32 kDa) [14].
LOX trưởng thành một phần quay trở lại tế bào, một phần bám vào chất nền
ngoại bào thực hiện chức năng sinh học. Enzym LOX xúc tác quá trình khử


2

oxy hóa lượng peptidyllysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất
collagen và lượng lysine dư thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các
phản ứng tự ngưng tụ dẫn đến hình thành chất nền ngoại bào [14-15]. Vì vậy,
LOX đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn
vẹn của màng đáy.
LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ,
tim, phổi, gan, sụn, xương, thận, vú, võng mạc và não [16-18]. Có khá nhiều
nghiên cứu về LOX tại tim, xương, vú, phổi,... đem lại những hiểu biết sâu
hơn về cơ chế sinh bệnh và mở ra các hướng nghiên cứu biện pháp can thiệp
hiệu quả. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng
trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa
tổn thương võng mạc do đái tháo đường [19]. Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng
cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân
tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh
võng mạc đái tháo đường [12]. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh
nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ

LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Tuy nhiên, cơ chế
gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào
còn chưa rõ ràng.
Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Nghiên cứu thay đổi Lysyl
oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ
glucose cao" với 2 mục tiêu:
1.

Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu
võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.

2.

Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền
ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường
nồng độ glucose cao.


3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc
Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có lớp nội mô,
màng đáy và tế bào quanh mạch.
1.1.1. Lớp nội mô
Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao
mạch. Phần bào tương chứa nhân lồi vào lòng mạch, phần bào tương ở ngoại
vi tế bào toả thành lá mỏng. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên
kết khe. Dưới sinh hiển vi điện tử có thể thấy ở lá bào tương tế bào nội mô có

những cửa sổ (lỗ nội mô), màng bào tương ở cả hai mặt tế bào có những vết
lõm siêu vi, trong bào tương có những không bào vi ẩm. Những bào quan như
lưới nội bào, ti thể, ribosom nằm rải rác nhưng tập trung nhiều quanh nhân, bộ
Golgi nhỏ, thường nằm sát nhân [6-21-23].
A

B

Hình 1.1. Cấu trúc mao mạch võng mạc [24]
A. Thiết đồ dọc. B. Thiết đồ cắt ngang


4

1.1.2. Màng đáy
1.1.2.1. Cấu trúc
Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào
nội mô và tế bào ngoại mạch của mạch máu [25]. Màng đáy mạch máu
chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để
hình thành giá đỡ cho tế bào [25]. Màng đáy là nơi thực hiện nhiều chức
năng quan trọng của tế bào do đó nó rất quan trọng với sự sống còn của tế
bào và cân bằng nội môi võng mạc. Màng đáy mạch máu cung cấp môi
trường vi mô, tại đó tín hiệu hai chiều thông qua các integrin điều chỉnh sự
gắn kết và chức năng của tế bào. Chức năng chính của màng đáy là tạo bộ
khung gắn kết tế bào [26], tạo điều kiện cho kết nối tế bào-tế bào [27], và
điều khiển việc chữa lành vết thương [28]. Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp
tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV
(Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được
sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn
của màng đáy. Ở võng mạc, chất nền ngoại bào được sản xuất chủ yếu bởi

các tế bào nội mô mạch máu và tế bào ngoại mạch [6-21-22]. Các loại tế
bào khác cũng sản xuất một lượng nhỏ chất nền ngoại bào là tế bào Muller
[29], tế bào hình sao [30], tế bào hạch [31] và các tế bào biểu mô võng mạc
[32]. Bằng phương pháp đo lường siêu cấu trúc sử dụng sinh hiển vi điện
tử cho thấy có sự khác nhau về độ dày màng đáy mạch máu giữa các mô
(bảng 1) và giữa các lớp động vật (bảng 2). Màng đáy bao gồm 2 vùng
riêng biệt là lá sáng (lamina lucida) và lá đặc (lamina densa), nơi tiếp giáp
phía trước với màng tế bào, phía sau liên tục với mô liên kết của chất nền
ngoại bào [33].


5

Bảng 1.1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể
ngƣời [6]
Độ dày (nm)

Tài liệu tham khảo

Võng mạc

250-480

[34]

Tiểu cầu thận

330±50

[35-36]

Cơ xương

220

[37]

Cơ tim

77±4

[38]

108-246

[39]

Loại mô

Cơ tứ đầu đùi

Bảng 1.2. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau [6]
Độ dày (nm)

Tài liệu tham khảo

Chuột nhắt

93±19

[40]

Chuột cống

51-112

[41]

Mèo

72±12

[42]

Chó

90-140

[43]

Người

250-450

[34]

Loài

1.1.2.2. Thành phần
Màng đáy bao gồm nhiều thành phần sắp xếp một cách có tổ chức. Một

số thành phần chính tạo nên bộ khung của màng bao gồm Coll IV, FN,
laminin và heparan sulfate proteoglycan. Ngoài ra màng cũng chứa các thành


6

phần khác như nidogen, tenascin, perlecan, agrin collagen I, II, III và
chondroitin sulfate proteoglycan [44-45].
Collagen IV là thành phần phong phú nhất trong chất nền ngoại bào, và
chỉ được tìm thấy trong màng tế bào. Coll IV có trọng lượng phân tử
khoảng 500 kD với chiều dài trung bình 400 nm [46] và cấu trúc bộ ba
xoắn ốc nguồn gốc từ 3 chuỗi α, bao gồm 2 chuỗi α1 giống hệt nhau và 1
chuỗi α2 [47]. Mỗi chuỗi chứa 3 vùng riêng biệt: đầu amino giàu cysteine
và lysin, vùng amino axit với chuỗi Gly-X-Y lặp lại khoảng 1400 lần và
đầu carboxyl chứa khoảng 230 amino axit [48]. Tổng thể cấu trúc của Coll
IV sắp xếp dạng như mạng tinh thể được tổng hợp khi vùng gen khởi động
tương tác với vị trí NC1 tại đầu tận carboxyl tạo nên các dimer [49]. Các
dimer này sau đó được liên kết chéo với nhau tại vùng 7S nằm tại đầu tận
amino [33]. Collagen có các vị trí kết dính tương tác trực tiếp với các
intergrin α1β1 và α2β1 cho phép tế bào kết nối với màng tế bào và khởi
động các tín hiệu tế bào [50]. Coll IV cũng tạo thành một giá đỡ để liên kết
các thành phần chất nền ngoại bào khác [51].

Hình 1.2. Cấu trúc màng đáy mao mạch [24]


7

Fibronectin, 1 glycoprotein lớn, là thành phần quan trọng của màng đáy
được biết đến với khả năng hoạt động như một chất keo phân tử và duy trì cấu

trúc phân tử ổn định của màng đáy. FN là một dimer bao gồm 2 tiểu đơn vị
lớn, giống hệt nhau, mỗi đơn vị nặng khoảng 250 kD được liên kết cộng hoá
trị thông qua liên kết disulfide ở đầu tận C [26-52-53]. Sau khi được tổng hợp,
FN tập hợp thành 1 mạng lưới sợi phụ thuộc integrin [26], sử dụng vị trí RGD
(Arg-Gly-Asp) bám vào vị trí α5β1 của integrin [52]. FN tạo điều kiện cho sự
kết dính của tế bào, di chuyển, tăng trưởng tế bào và biệt hoá thông qua các
tương tác đặc hiệu bao gồm các vị trí kết dính cho collagen, heparan và các
proteoglycan khác. FN gắn kết các thành phần chất nền ngoại bào thành một
cấu trúc có tổ chức, do đó đóng góp vào sự toàn vẹn và chức năng của chất
nền ngoại bào [52-54].
Laminin là 1 glycoprotein không chứa collagen, được tìm thấy chủ yếu
trong lớp lá sáng [55]. Laminin có trọng lượng phân tử khoảng 820 kD và
chứa 3 chuỗi polypeptid: α, β, và γ. Cả 3 chuỗi đều chứa nhánh dài xoắn ốc
(dài khoảng 75 nm), ngoài ra chuỗi α có thêm nhánh ngắn (dài khoảng 35 nm)
[56]. Phần cơ bản của nhánh dài là miền G chứa các chuỗi tương tự yếu tố
tăng trưởng biểu bì [56]. Chuỗi ba lần lặp đầu tiên, gọi là G1-3 chịu trách
nhiệm kết dính với các integrin, trong khi chuỗi 2 lần lặp cuối cùng (ví dụ G45) chịu trách nhiệm kết dính với các heparan [57]. Laminin tương tác với
collagen IV bằng cách cùng bám dính vào nhiều thành phần khác của chất nền
ngoại bào bao gồm FN và integrin [58]. Laminin là lớp chất nền ngoại bào
bao quanh bề mặt tế bào và đóng vai trò thiết yếu trong giá đỡ của nhiều mô
khác nhau [59]. Ngoài ra, laminin có vai trò trong kết dính, biệt hoá, di
chuyển của tế bào và sự sống còn của mô [58].
Heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) là một trong các thành phần
chính của màng đáy. Đây là loại glycosaminoglycan phổ biến trong các tế bào


8

nội mô [60]. HSPGs bao gồm các chuỗi glycosaminoglycan (mỗi chuỗi dài
khoảng 100-170 nm, trọng lượng phân tử khoảng 65 kD) liên kết với 1 lõi

protein chứa chuỗi polypeptide đơn (dài khoảng 80 nm, trọng lượng phân tử
khoảng 400 kD) [61]. Glycosaminoglycan đính vào lõi protein thông qua
vùng chứa axit glucuronic, galactose và xylose [33]. Họ HSPGs bao gồm
perlecan, agrin, và collagen XVIII [62] bám vào laminin của chất nền ngoại
bào [63]. Trong màng đáy, heparan sulfate tập trung nhiều nhất ở lá sáng và
có chức năng điều hoà kết dính tế bào bằng cách tương tác với các thành phần
khác của màng đáy [64]. HSPGs tương tác giữa các protein qua mối liên hệ
với anionic [60] và duy trì tính toàn vẹn cấu trúc của chất nền ngoại bào thông
qua hoạt động tương tác tế bào-chất nền ngoại bào [62].
1.1.2.3. Chức năng
Màng đáy mạch máu đóng vai trò là chất nền để gắn các tế bào, tạo
nên hàng rào có tính thấm chọn lọc và điều hoà sự sống của tế bào. Sự kết
dính tế bào được tạo thuận lợi bởi các integrin cho phép các thành phần đặc
hiệu của màng đáy thực hiện các chức năng tế bào bao gồm cả sự sống còn
của tế bào [65]. Tính đặc hiệu của integrin khi liên kết với chất nền phụ
thuộc vào sự kết hợp của integrin và các tiểu đơn vị α và β. Họ integrin
được xác định bởi các tiểu đơn vị β và đặc tính phối tử [66]. Họ integrin β1
chứa 3 phối tử đặc hiệu: α1,2,β1- các thụ thể đặc hiệu cho collagen, α 3,4,5β1 các thụ thể đặc hiệu cho FN, và α1,2,3,6β1 - các thụ thể đặc hiệu cho laminin
[44-66-67].
Đặc điểm hàng rào có tính thấm chọn lọc được điều hoà một phần bởi
các thành phần màng đáy và khả năng chúng tương tác với nhau để hình
thành lên cấu trúc hoàn chỉnh. Đặc biệt là, các vị trí anionic màng đáy võng
mạc được biết đến bởi vai trò đáng chú ý trong việc duy trì tính thấm mạch
máu võng mạc. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, mất tính đặc hiệu của các vị trí


9

anionic trong màng đáy mao mạch võng mạc có thể góp phần vào sự tăng tính
thấm trong đái tháo đường [68]. Thêm vào đó, màng đáy điều hoà sự sống

còn của các tế bào mao mạch võng mạc thông qua sự biểu hiện của các thành
phần màng đáy. Các nghiên cứu chỉ ra chất nền ngoại bào từ môi trường
glucose nồng độ cao cung cấp các tín hiệu thúc đẩy chết tế bào theo chương
trình trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc [7].
1.1.3. Tế bào quanh mạch
Tế bào quanh mạch có những nhánh bào tương dài bao quanh thành
mạch và màng đáy bao lấy chúng ở cả phía trong và phía ngoài. Trong
bào tương có những bào quan như bộ Golgi, ti thể, lưới nội bào. Tế bào
quanh mao mạch có khả năng co rút, kiểm soát dòng máu lưu thông trong
các vi mạch [23].
1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường
Hiện nay, chuột được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm do có kích thước nhỏ, dễ thực hiện các kỹ thuật và chi phí
không cao. Tuổi thọ của chuột ngắn, sự khởi phát tăng đường huyết và các
triệu chứng của bệnh võng mạc đái tháo đường xuất hiện sớm cho phép thực
hiện nghiên cứu trong thời gian ngắn. Thêm vào đó, sự sẵn có của các dòng
chuột biến đổi gen tạo thuận lợi cho nghiên cứu các gen đặc hiệu tham gia
vào cơ chế sinh bệnh và tiến triển của tổn thương võng mạc do đái tháo
đường. Hơn nữa, kỹ thuật bảo quản, nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu võng
mạc chuột không quá phức tạp và tỷ lệ thành công cao [69]. Đặc biệt, các
nghiên cứu cơ chế sinh bệnh chủ yếu được thực hiện trên chuột do chúng biểu
hiện tổn thương võng mạc đái tháo đường giai đoạn sớm tương tự con người.
Sau khi khởi phát tăng đường huyết vài tuần, chuột xuất hiện tăng số lượng tế
bào hình sao và thần kinh đệm, đồng thời giảm tốc độ dòng chảy của động
mạch và tĩnh mạch. Khoảng 2 đến 4 tháng sau, chuột xuất hiện tăng tính thấm


10

thành mạch, rò rỉ mạch máu võng mạc và tăng độ dày màng đáy mao mạch.

Sau 6 đến 9 tháng đái tháo đường, võng mạc chuột xuất hiện mao mạch
không có tế bào và chết tế bào ngoại mạch [69-70].

Hình 1.3. Hiện tượng rò mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường
ở chuột [19]

Hình 1.4. Hiện tượng mao mạch không có tế bào ở võng mạc chuột đái
tháo đường [19]


11

1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thƣơng mao mạch võng mạc do tình
trạng đƣờng huyết cao.
1.2.1. Dày màng đáy mao mạch võng mạc
Một chất hoà tan muốn qua hàng rào mạch máu võng mạc phải qua ít
nhất hai lớp là lớp tế bào nội mô mạch máu và lớp màng đáy. Vì vậy bất kỳ
sự thay đổi nào trong cấu trúc hoặc thành phần của màng đáy có thể gây ảnh
hưởng nghiêm trọng tới tính thấm thành mạch. Màng đáy mạch máu dày lên
là dấu hiệu mô học đặc trưng của bệnh võng mạc đái tháo đường [41-71].
Màng đáy võng mạc đái tháo đường không đều và có hình dạng giống "miếng
pho mát Thuỵ Sỹ" [72]. Mặc dù hiện tượng dày màng đáy võng mạc đã được
biết đến từ lâu, những nghiên cứu gần đây mới làm sáng tỏ dần vai trò của nó
trong bệnh võng mạc đái tháo đường thông qua các nghiên cứu trong thí
nghiệm và thực nghiệm. Mạch máu võng mạc dày lên góp phần gây tăng tính
thấm thành mạch quá mức và tăng sinh tân mạch trong bệnh võng mạc đái
tháo đường [6-32-73]. Dưới tác động của tăng đường huyết, quá trình tổng
hợp Coll IV, FN và laminin tăng, góp phần gây dày màng đáy mạch máu.
Những thay đổi sinh học trong thành phần màng đáy mạch máu võng mạc có
thể được phát hiện sớm trước khi xuất hiện những tổn thương hình thái của

bệnh võng mạc đái tháo đường [74-75]. Tăng mức độ biểu hiện của các thành
phần màng đáy có thể là nguyên nhân gây thay đổi cấu trúc của mao mạch
võng mạc bình thường. Nghiên cứu của Oshitari và cộng sự cho thấy sử dụng
antisense oligonucleotide tác động lên chất nền ngoại bào làm giảm độ dày
màng đáy mao mạch có hiệu quả ngăn ngừa dày màng đáy mao mạch, giảm
đáng kể mạch máu không có tế bào, chết tế bào ngoại mạch, và ngăn ngừa rò
rỉ mạch máu ở bệnh võng mạc đái tháo đường [22-74].
Mức độ biểu hiện của Coll IV tăng ở tế bào nội mô mao mạch võng mạc
trong môi trường nồng độ glucose cao, ở võng mạc của động vật đái tháo
đường và tế bào mạch máu võng mạc bệnh nhân đái tháo đường [6-21-22-76].


12

Ức chế quá trình tăng biểu hiện Coll IV đã được chứng minh là có tác dụng
giảm hiện tượng tăng tính thấm thành mạch ở bệnh võng mạc đái tháo đường
[22]. Cả nghiên cứu trong ống nghiệm và trong thực nghiệm đã chỉ ra rõ rằng
trong bệnh đái tháo đường, tình trạng đường huyết cao gây tăng tổng hợp FN
trong các tế bào mạch máu [41-77]. Tăng mức biểu hiện FN được phát hiện
trong võng mạc của các mô hình chuột mắc đái tháo đường do tiêm
Streptozotocin, chuột mắc đái tháo đường do chế độ ăn giàu glactose và ở
người mắc võng mạc đái tháo đường [74-78]. Trong bệnh đái tháo đường,
tăng mức biểu hiện FN góp phần gây dày màng đáy mạch máu, phá vỡ kết nối
tế bào, và từ đó thúc đẩy sự rò rỉ mạch máu [74-78]. Thí nghiệm trên động vật
mắc đái tháo đường cho thấy ngăn chặn sự biểu hiện quá mức của FN có thể
giúp cải thiện tình trạng rò rỉ mạch máu [22]. Laminin cũng được chỉ ra là
tăng biểu hiện tại tế bào mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ
glucose cao và ở võng mạc của chuột gây đái tháo đường bằng tiêm
Streptozotocin [21-22]. Với chuột đái tháo đường, ức chế sự tăng biểu hiện
của laminin giúp ngăn ngừa tăng tính thấm thành mạch [22]. Ngược lại, họ

HSPG, trừ agrin, giảm biểu hiện trong tình trạng đường huyết cao [79-81].
Các nghiên cứu cũng đã đánh giá ảnh hưởng của tăng đường huyết lên
các thành phần khác của tế bào bao gồm tenascin, nidogen-1, collagen I,
perlecan và agrin. Vai trò của các thành phần này trong quá trình dày màng
đáy là không đáng kể. Tenascin, 1 loại glycoprotein chất nền ngoại bào lớn,
được báo cáo là tăng biểu hiện trong bệnh võng mạc đái tháo đường [82].
Thêm vào đó, trong bệnh nhân bệnh võng mạc đái tháo đường, mRNA
tenascin và mức protein cũng tăng đáng kể so với nhóm không mắc đái tháo
đường [25]. Nidogen, còn gọi là entactin, bám vào mạng lưới Coll IV và
laminin vì vậy cũng đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và sự toàn vẹn của
chất nền ngoại bào [83]. Với chuột đái tháo đường, hoạt động của nidogen
giảm ở màng Bruch và màng giới hạn trong [58]. Bên cạnh đó, thông tin liên