Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược

Khoa học nông nghiệp

Phương pháp đánh giá khả năng

kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược
Nguyễn Tài Năng

TĨM TẮT
Hướng nghiên cứu để tìm ra các chất kháng sinh mới từ nguồn thảo dược đang thu hút sự quan tâm
của nhiều nhà khoa học hiện đại nhằm đối phó với các chủng vi khuẩn kháng thuốc cũng như sự quay trở
lại và lan rộng của các bệnh truyền nhiễm tưởng chừng đã được khống chế trước kia. Các bước cơ bản cũng
như một số định hướng cho việc sử dụng phương pháp phù hợp để đánh giá khả năng kháng khuẩn của
dịch chiết thảo dược sẽ được đề cập trong bài viết này.
Key words: Thảo dược, khả năng kháng khuẩn, kháng thuốc, dịch chiết.

1. Mở đầu
Phương pháp đánh giá sự
mẫn cảm của vi khuẩn với
kháng sinh là một trong những
kỹ thuật căn bản trong nghiên
cứu (Ymele-Leki et al., 2012). Nó
được sử dụng trong lâm sàng để
xác định sự kháng thuốc của vi
khuẩn cũng như sự mẫn cảm của
chúng với các loại kháng sinh.
Nó được sử dụng để đánh giá
khả năng chống vi sinh vật cũng
như định hướng cho sự phát
triển các sản phẩm thuốc kháng
sinh mới. Ngày nay, hiện tượng
kháng thuốc ngày càng trở nên

phổ biến. Một loại kháng sinh
mới được tìm ra phải mất rất
nhiều thời gian, trong khi đó tốc
độ kháng thuốc của vi khuẩn lại
rất nhanh. Nguy cơ hình thành
một số loại vi khuẩn kháng với
hầu hết các loại kháng sinh hiện
có gây khó khăn rất lớn cho q
trình điều trị (Jorgensen and
Ferraro, 2009).
Kháng sinh có nguồn gốc
thảo dược đang thu hút sự quan
tâm của các nhà khoa học. Việc
sử dụng thảo dược như chất
kháng khuẩn, chống viêm đã
có từ rất lâu trong các bài thuốc

đơng y. Khoa học hiện đại cũng
đã chứng minh khả năng kháng
khuẩn của rất nhiều loại thảo
dược (Cowan, 1999). Kháng
sinh thảo dược được cho là ít gây
kháng thuốc, an tồn và khơng
gây tồn dư trong cơ thể. Nghiên
cứu khả năng kháng khuẩn của
các dịch chiết từ thảo dược có
vai trò quan trọng trong việc tìm
ra các loại kháng sinh mới cũng
như khẳng định cơ sở khoa học
của việc sử dụng thảo dược. Có

nhiều phương pháp xác định
khả năng kháng khuẩn của các
dịch chiết thảo dược được các
nhà khoa học sử dụng. Sử dụng
phương pháp khác nhau có ảnh
hưởng trực tiếp đến kết quả
đánh giá hoạt tính kháng khuẩn
của thảo dược. Bài viết này sẽ
thảo luận về các phương pháp
hiện đang được sử dụng để đánh
giá khả năng kháng khuẩn của
dịch chiết thảo dược bao gồm
từ việc lựa chọn ngun liệu, lựa
chọn dung mơi, phương phát
chiết xuất và phương pháp kiểm
tra khả năng kháng khuẩn của
dịch chiết.
2. Nội dung
2.1. Phương pháp chuẩn bị

dịch chiết thảo dược
2.1.1. Chuẩn bị ngun liệu
Việc lựa chọn ngun liệu
làm thảo dược thường dựa trên
kinh nghiệm và các hướng dẫn
truyền thống. Các phần khác
nhau như thân, lá, rễ, củ, hoa,
quả... hoặc một số phần hoặc tất
cả các phần có thể thu hái được
sử dụng làm thuốc. Ngun

liệu sau khi lựa chọn phải được
làm sạch, thơng thường là bằng
nước.
Thảo dược có thể được sử
dụng ở dạng tươi hoặc khơ để
chuẩn bị dịch chiết. Tuy nhiên,
các nhà khoa học thường sử
dụng dưới dạng khơ với nhiều
lý do khác nhau. Thứ nhất, do
lượng nước có trong ngun liệu
tươi làm tăng khối lượng mẫu và
lượng dung mơi cần thiết cũng
như làm giảm nồng độ và hiệu
quả chiết xuất hoạt chất. Thứ hai,
đa số các loại thảo dược truyền
thống được sử dụng dưới dạng
khơ. Để làm khơ ngun liệu có
thể được phơi nắng, hong khơ,
sấy khơ. Trong các phương pháp
này, sấy khơ ở nhiệt độ thấp 40
- 600C được cho là có nhiều ưu
điểm như: hạn chế sự mất hoặc

Đại học Hùng Vương - ­Khoa học Công nghệ 55


Khoa học nông nghiệp
giảm hoạt tính của thảo dược
do tác động của ánh nắng mặt
trời và nhiệt độ cao, cũng như sự

giảm chất lượng của ngun liệu
do nấm mốc.
2.1.2. Lựa chọn dung mơi
Sử dụng dung mơi chiết xuất
thảo dược ảnh hưởng lớn đến
hiệu quả chiết xuất cũng như
hoạt tính sinh học của các chất.
Sự thành cơng của việc xác định
hoạt tính sinh học của các chất
trong thảo dược phụ thuộc rất
lớn vào dung mơi sử dụng trong
q trình chiết xuất. Dung mơi
được sử dụng phải đảm bảo các
yếu tố như tính độc thấp, dễ
bay hơi ở nhiệt độ thấp, hòa tan
nhanh và giữ được hoạt tính của
các chất trong ngun liệu. Lựa
chọn dung mơi nào phụ thuộc
vào mục đích sử dụng của sản
phẩm chiết xuất được. Sau khi
chiết xuất rất khó có thể loại bỏ
hết dung mơi, do vậy dung mơi
phải đảm bảo ít ảnh hưởng đến
các thí nghiệm tiếp theo.
Lựa chọn dung mơi cũng sẽ
phụ thuộc vào các hợp chất đích
mà ta muốn chiết xuất ra khỏi
thảo dược. Hầu hết các dung
mơi sử dụng trong nghiên cứu
khả năng kháng khuẩn của dịch

chiết thảo dược là Methanol,
Ethanol và nước. Ngồi ra một
số dung mơi hữu cơ khác cũng
được sử dụng nhưng khơng phổ
biến như: Acetic acid, Aceton,
Dichloromethan. Trong cách sử
dụng thảo dược truyền thống
thì nước được sử dụng phổ biến
làm dung mơi. Tuy nhiên những
nghiên cứu gần đây thấy rằng,
sử dụng dung mơi hữu cơ hoạt
tính kháng khuẩn của dịch chiết
thu được có độ ổn định hơn so
với dung mơi là nước. Những
nghiên cứu gần đây thường sử
dụng dung mơi cồn Methanol
hoặc cồn Ethanol (Jeyaseelan et

al., 2012).
2.1.3. Phương pháp chiết
Lựa chọn phương pháp chiết
xuất thường dựa trên cơ sở thời
gian chiết dài hay ngắn, đặc tính
lý hóa của dung mơi, nhiệt độ
chiết, kích thước thảo dược cũng
như tỷ lệ giữa lượng dung mơi
và thảo dược sử dụng. Ngun
tắc căn bản là phải nghiền nhỏ
thảo dược để tăng diện tích bề
mặt và tăng hiệu quả chiết xuất.

Tùy theo độ nhỏ cũng như đặc
tính của ngun liệu, khả năng
hòa tan vào dung mơi của hoạt
chất và điều kiện ngâm tĩnh, kết
hợp lắc, siêu âm... mà thời gian
chiết có thể từ 5 phút đến vài giờ
hoặc vài ngày. Tỷ lệ giữa ngun
liệu và dung mơi có thể dùng ở
mức 1:10 đến 1:5.
Phương pháp chiết được sử
dụng rộng rãi hiện nay bao gồm
việc nghiền nhỏ ngun liệu,
khuấy đều trong dung mơi 5 10 phút, ngâm qua đêm sau đó
lọc lấy dịch chiết. Dịch chiết có
thể được lọc qua giấy lọc hoặc
ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút
trong 10 phút để loại bỏ cặn
hoặc kết hợp ly tâm trước và lọc
sau. Dịch chiết sau khi lọc được
cơ đặc trong điều kiện áp suất
thấp.
2.2. Phương pháp kiểm tra
tính kháng khuẩn của dịch chiết
2.2.1. Phương pháp khuếch
tán trên thạch
- Phương pháp sử dụng
khoanh giấy
Việc sử dụng khoanh giấy
kháng sinh trên bề mặt đĩa
thạch để đánh giá khả năng

kháng khuẩn được sử dụng từ
những năm 40 của thế kỷ XX và
đã được cải tiến nhiều. Hiện nay
kỹ thuật này vẫn được sử dụng
nhiều để đánh giá khả năng
kháng khuẩn của dịch chiết thảo
dược. Phương pháp này bao gồm

56 Đại học Hùng Vương - K
­ hoa học Công nghệ

các bước: đĩa thạch được cấy vi
khuẩn sau đó đặt khoanh giấy
thấm dịch chiết lên bề mặt đĩa
thạch. Lượng vi khuẩn được cấy
ở nồng độ 108 CFU/ml (CFU:
Colony Forming Unit, hay đơn
vị khuẩn lạc). Đường kính
khoanh giấy thấm khoảng 6 mm
được thấm dịch chiết trước hoặc
sau khi đặt lên mơi trường thạch
Muller Hinton. Sau đó đĩa thạch
được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ
và thời gian thích hợp (từ 25 370C và từ 18 đến 48 giờ). Đánh
giá khả năng kháng khuẩn qua
đường kính vơ khuẩn xung
quanh khoanh giấy. Đường kính
vơ khuẩn được đo trên vùng
xung quanh khoanh giấy nơi
lượng vi khuẩn mọc giảm 80%

so với khu vực xa khoanh giấy
và có thể phân biệt được bằng
mắt thường (Klancnik et al.,
2010).
- Phương pháp đục lỗ thạch
Phương pháp này cơ bản
giống với phương pháp sử dụng
khoanh giấy. Điểm khác duy
nhất là thay bằng dùng khoanh
giấy thấm dịch chiết, người ta
đục một lỗ trên đĩa thạch đường
kính khoảng 6 - 8 mm để cho
dịch chiết vào, mỗi lỗ có thể
chứa từ 0,05 đến 0,1 ml dịch
chiết.
2.2.2. Phương pháp pha lỗng
trong mơi trường lỏng
Đây là phương pháp quan
trọng, cho phép đánh giá định
lượng nồng độ ức chế tối thiểu
(MIC) của kháng sinh hay dịch
chiết đối với vi khuẩn. Trong
phương pháp này, kháng sinh
hoặc dịch chiết được pha lỗng
theo cơ số 2 bằng mơi trường
ni cấy vi khuẩn. Vi khuẩn
giống được pha sẵn ở nồng độ
106 CFU/ml và được cho một
lượng đồng đều vào mơi trường
ni cấy có kháng sinh hay dịch

Khoa học nông nghiệp
chiết ở các nồng độ khác nhau.
Phương pháp này có thể thực
hiện trên phiến có nhiều giếng
ni cấy hoặc trên ống nghiệm.
Với phương pháp sử dụng phiến
ni cấy dung tích 0,2 ml/giếng
thường kết hợp với máy đọc độ
cản quang và dùng thuốc thử
như INT (một dạng muối của
tetrazolium) để đọc kết quả.
Còn phương pháp sử dụng ống
nghiệm thì có thể kiểm tra độ
đục của mơi trường ni cấy và
đọc kết quả bằng mắt thường,
tuy nhiên phương pháp này cần
nhiều mơi trường ni cấy hơn.
Ở nồng độ kháng sinh hay dịch
chiết thấp nhất nào bắt đầu có
sự suy giảm mạnh sự mọc của vi
khuẩn thì được xác định là nồng
độc ức chế tối thiểu (Klancnik et
al., 2010).
2.2.3. Phương pháp pha lỗng
trong mơi trường thạch
Phương pháp pha lỗng
trong mơi trường thạch được
tiến hành trên đĩa thạch với

nồng độ dịch chiết khác nhau.
Để chuẩn bị các đĩa thạch này,
thạch chứa mơi trường ni
cấy được làm tan chảy và hấp
khử trùng, hạ nhiệt độ xuống
và giữ trong nước nóng 500 C.
Dịch chiết được bổ sung vào
mơi trường thạch ở các nồng độ
khác nhau bằng cách sử dụng
chính mơi trường thạch còn
tan chảy để pha lỗng theo cơ
số 2 sau đó đổ ra đĩa. Các đĩa

thạch ni cấy chứa dịch chiết
ở nồng độ khác nhau được để
đơng cứng và khơ bề mặt sau
đó cấy vi khuẩn trải đều trên bề
mặt thạch. MIC được xác định
ở nồng độ dịch chiết thấp nhất
trong mơi trường thạch mà ở đó
ức chế hồn tồn sự hình thành
khuẩn lạc hoặc có số khuẩn lạc
rất ít hơn 4 trên một đĩa thạch
đường kính 90 mm (NIHE,
2013).
3. Kết luận
Thảo dược là nguồn ngun
liệu tự nhiên có rất nhiều thành
phần kháng khuẩn tiềm năng.
Phương pháp thu hái, chế biến

có thể làm ảnh hưởng đến thành
phần và hoạt tính của thảo dược.
Phương pháp xác định, đánh giá
khả năng kháng khuẩn của dịch
chiết thảo dược bao gồm cách
quy trình thu hái, chiết xuất,
kiểm tra hoạt tính cần được tối
ưu và tiêu chuẩn hóa để có được
kết quả chính xác, đảm bảo độ
tin cậy.
Tài liệu tham khảo
1. COWAN, M. M. 1999,
Plant products as antimicrobial
agents. Clin Microbiol Rev, 12,
564-82.
2.
JEYASEELAN,
E.
C.,
JENOTHINY,
S.,
PATHMANATHAN,
M.
& JEYADEVAN, J. 2012,
Antibacterial
activity
of
sequentially extracted organic
solvent extracts of fruits, flowers

and leaves of Lawsonia inermis
L. from Jaffna. Asian Pac J Trop
Biomed, 2, 798-802.
3. JORGENSEN, J. H.
& FERRARO, M. J. 2009,
Antimicrobial
susceptibility
testing: a review of general
principles and contemporary
practices. Clin Infect Dis, 49,
1749-55.
4.
KLANCNIK,
A.,
PISKERNIK,
S.,
JERSEK,
B. & MOZINA, S. S. 2010,
Evaluation of diffusion and
dilution methods to determine
the antibacterial activity of plant
extracts. J Microbiol Methods,
81, 121-6.
5. YMELE-LEKI, P., CAO,
S., SHARP, J., LAMBERT, K. G.,
MCADAM, A. J., HUSSON, R.
N., TAMAYO, G., CLARDY, J. &
WATNICK, P. I. 2012, A highthroughput screen identifies a
new natural product with broadspectrum antibacterial activity.
PLoS One, 7, e31307.

6. NIHE. 2013, Quy trình
xác định nồng độ kháng sinh
tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC)
[Online]. Available: http://
w w w. n i h e . org . v n / n e w - v n /
thuong-quy-va-huong-dan-kythuat/937/Qui-trinh-xac-dinhnong-do-khang-sinh-toi-thieuuc-che-vi-khuan-MIC.vhtm
[Accessed].

SUMMARY
Nguyen Tai Nang
Hung Vuong University
D
Key words:

Đại học Hùng Vương - ­Khoa học Công nghệ 57