Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh β lactam bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE c4d)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGÔ HỮU TUỆ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR
ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C4D)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGÔ HỮU TUỆ

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH β-LACTAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR
ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC (CE-C4D)

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS. TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng

Hà Nội – 2019


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hƣờng đã giao đề
tài, nhiệt tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình
thực hiện luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo tại bộ môn Hóa Phân tích, Trƣờng Đại
Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo và truyền đạt
kiến thức để em hoàn thành các môn học trong khóa học.
Em rất cảm ơn NCS. Lê Thái Bình và CN. Trần Thị Thanh Phƣơng khóa K59D
Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã nhiệt tình hƣớng
dẫn, giúp đỡ và phối hợp thực hiện nghiên cứu này.
Nghiên cứu này đƣợc tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia
4

(NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2018.305 và sự hỗ trợ thiết bị CE-C D của
công ty 3SAnalysis (www.3sanalysis.vn).
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên em
trong suốt quá trình học và quá trình hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2019

Học viên

Ngô Hữu Tuệ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN............................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về kháng sinh.......................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam........................................................... 3
1.2.1. Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm β-lactam...................................... 4
1.2.2. Tính chất, cơ chế, độc tính và phạm vi điều trị của các kháng sinh β-lactam.....6
1.3. Giới thiệu về các kháng sinh trong nghiên cứu......................................................... 7
1.4. Các phƣơng pháp phân tích riêng rẽ, đồng thời các hoạt chất kháng sinh..............12
1.4.1. Các phƣơng pháp phân tích riêng rẽ các hoạt chất kháng sinh........................12
1.4.1.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)......................................12
1.4.1.2. Phƣơng pháp điện hoá.................................................................................. 13
1.4.2. Các phƣơng pháp phân tích đồng thời các hoạt chất kháng sinh.....................14
1.4.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)......................................... 14
1.4.2.2. Phƣơng pháp điện di mao quản (CE)............................................................ 17
1.4.2.2.1. Tổng quan một số nghiên cứu xác định hàm lƣợng các hoạt chất trong một
số dạng mẫu dƣợc phẩm....................................................................................... 17
4

1.4.2.2.2. Nguyên tắc chung của phƣơng pháp điện di mao quản CE-C D...............19
1.4.2.2.3. Cấu tạo của một hệ CE cơ bản................................................................... 19
1.4.2.2.4. Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE................................................................ 21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM..................................................................................... 23
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu............................................................................ 23
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu......................................................................................... 23
2.1.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 23
2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hoá chất......................................................................... 24
2.2.1. Trang thiết bị, dụng cụ..................................................................................... 24
2.2.1.1. Thiết bị.......................................................................................................... 24

2.2.1.2. Dụng cụ:........................................................................................................ 24
2.2.2. Hoá chất:.......................................................................................................... 25
2.2.2.1. Chất chuẩn:................................................................................................... 25
2.2.2.2. Hóa chất dung môi:....................................................................................... 25
2.2.2.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất................................................................... 25


2.3. Thông tin mẫu và phƣơng pháp xử lý mẫu thuốc................................................... 26
2.3.1. Thông tin các mẫu thuốc.................................................................................. 26
2.3.2. Phƣơng pháp xử lí mẫu.................................................................................... 27
2.4. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích................................28
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp
phân tích................................................................................................................ 28
2.4.2. Độ chụm (độ lặp lại) của phƣơng pháp............................................................ 28
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp........................................................... 28
CHƢƠNG 3: K T QUẢ VÀ THẢO LU N................................................................. 31
3.1. Nghiên cứu khảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 1 b ng
4

phƣơng pháp điện di mao quản CE-C D.............................................................. 31
3.1.1. Tối ƣu hoá các điều kiện phân tích.................................................................. 31
3.1.1.1. Khảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm điện di..................................... 31
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ hệ đệm điện di.........................................33
3.1.1.3. Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản.................................................. 34
3.1.1.4. Khảo sát thời gian bơm mẫu......................................................................... 36
3.1.1.5. Khảo sát chiều cao bơm mẫu........................................................................ 37
3.1.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phƣơng pháp phân tích........................... 38
3.1.2.1. Đƣờng chuẩn xác định bốn hoạt chất kháng sinh Cefalexin, Cefotaxime
Natri, Sulbactam và Cefixime............................................................................... 38
3.1.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)............................40

3.1.2.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)................................. 41
3.2. Nghiên cứu khảo sát phân tích đồng thời bốn hoạt chất kháng sinh nhóm 2 b ng
4

phƣơng pháp điện di mao quản CE-C D.............................................................. 41
3.2.1. Tối ƣu hoá điều kiện phân tích........................................................................ 41
3.2.1.1. Khảo sát loại đệm và pH của dung dịch đệm................................................ 41
3.2.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm điện di.............................................. 43
3.2.1.3. Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản.................................................. 44
3.2.1.4. Khảo sát thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu..................................... 45
3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn và đánh giá phƣơng pháp phân tích........................... 46
3.2.2.1. Đƣờng chuẩn xác định bốn hoạt chất kháng sinh Amoxcillin, Ampicillin,
Cefoperazone và Sulbactam.................................................................................. 46
3.2.2.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)............................48
3.2.2.3. Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) của phƣơng pháp.......................................... 48
3.3. Phân tích mẫu thực tế.............................................................................................. 49


3.3.1. Các mẫu dƣợc phẩm chứa hoạt chất nhóm 1................................................... 49
3.3.2. Các mẫu dƣợc phẩm chứa hoạt chất nhóm 2................................................... 51
4

3.4. Phân tích đối chứng phƣơng pháp CE-C D với phƣơng pháp LC-MS/MS............54
K T LU N.................................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 57
PHỤ LỤC...................................................................................................................... 63


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin.................................................... 4

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin............................................. 6
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản........................19
Hình 1.4. Mặt cắt ngang bề mặt mao quản..................................................................... 20
Hình 1.5. Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản........................................................ 20
Hình 1.6. Các phƣơng pháp bơm mẫu trong phƣơng pháp điện di mao quản...............22
4

Hình 2.1. Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C D......................................................................... 24
Hình 3.1. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau...32
Hình 3.2. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau..........32
Hình 3.3. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau.........32
Hình 3.4. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Tris trong hệ đệm điện di.........34
Hình 3.5. Kết quả khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản......................................35
Hình 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian bơm mẫu.....................................36
Hình 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của chiều cao bơm mẫu....................................38
Hình 3.8. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Arg/Ascobic ở các pH khác nhau...42
Hình 3.9. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Arg/Ace ở các pH khác nhau..........42
Hình 3.10. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Tris/Ascobic ở các pH khác nhau . 43
Hình 3.11. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của đệm Tris/Ace ở các pH khác nhau.......43
Hình 3.12. Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Tris trong hệ đệm điện di.......44
Hình 3.13. Kết quả khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản....................................45
Hình 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu.......................................... 45
Hình 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng chiều cao bơm mẫu......................................... 46
Hình 3.16. Điện di đồ phân tích mẫu CFX1................................................................... 50
Hình 3.17. Điện di đồ phân tích mẫu CFL4................................................................... 50
Hình 3.18. Điện di đồ phân tích mẫu CFT2 ống tiêm.................................................... 50
Hình 3.19. Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AM1.......................................................... 52
Hình 3.20. Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AP1............................................................ 52
Hình 3.21. Điện di đồ phân tích mẫu thuốc APvSB1 ống tiêm......................................53
Hình 3.22. Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AMvSB1.................................................... 53

Hình 3.23. Điện di đồ phân tích mẫu thuốc AMvSB3.................................................... 53
Hình 3.24. Đồ thị tƣơng quan kết quả phân tích một số mẫu dƣợc phẩm b ng phƣơng
4

pháp CE-C D và LC-MS/MS................................................................................ 55


Hình PL.1. Đƣờng chuẩn Cefalexine theo diện tích pic................................................ 70
Hình PL.2. Đƣờng chuẩn Cefotaxime Natri theo diện tích pic...................................... 70
Hình PL.3. Đƣờng chuẩn Sulbactam theo diện tích pic................................................. 71
Hình PL.4. Đƣờng chuẩn Cefixime theo diện tích pic................................................... 71
Hình PL.5. Đƣờng chuẩn Amoxcillin theo diện tích pic................................................ 73
Hình PL.6. Đƣờng chuẩn Ampicillin theo diện tích pic................................................. 73
Hình PL.7. Đƣờng chuẩn Cefoperazone theo diện tích pic...........................................74
Hình PL.8. Đƣờng chuẩn Sulbactam theo diện tích pic................................................. 74
Hình PL.9. Điện di đồ phân tích mẫu CFX2.................................................................. 75
Hình PL.10. Điện di đồ phân tích mẫu CFX3................................................................ 76
Hình PL.11. Điện di đồ phân tích mẫu CFL5................................................................. 76
Hình PL.12. Điện di đồ phân tích mẫu CFL-CH1.......................................................... 76
Hình PL.13. Điện di đồ phân tích mẫu CFX-QT1......................................................... 77
Hình PL.14. Điện di đồ phân tích mẫu CFL-QT1.......................................................... 77
Hình PL.15. Điện di đồ phân tích mẫu CFL-QD1......................................................... 77
Hình PL.16. Điện di đồ phân tích mẫu CFX-KD1......................................................... 78
Hình PL.17. Điện di đồ phân tích mẫu CFL-KD1......................................................... 78
Hình PL.18. Điện di đồ phân tích mẫu AM2.................................................................. 78
Hình PL.19. Điện di đồ phân tích mẫu AM3.................................................................. 79
Hình PL.20. Điện di đồ phân tích mẫu AM4.................................................................. 79
Hình PL.21. Điện di đồ phân tích mẫu AP2................................................................... 79
Hình PL.22. Điện di đồ phân tích mẫu AM-CH1........................................................... 80
Hình PL.23. Điện di đồ phân tích mẫu AM-CH2........................................................... 80

Hình PL.24. Điện di đồ phân tích mẫu AP-QT1............................................................ 80
Hình PL.25. Điện di đồ phân tích mẫu AM-QD1........................................................... 81
Hình PL.26. Điện di đồ phân tích mẫu AP-QD1............................................................ 81
Hình PL.27. Điện di đồ phân tích mẫu AM-KD1........................................................... 81
Hình PL.28. Điện di đồ phân tích mẫu AP-KD1............................................................ 82
Hình PL.29. Điện di đồ phân tích mẫu CPvSB ống tiêm............................................... 82
Hình PL.30. Điện di đồ phân tích mẫu AMvSB2 ống tiêm............................................ 82
Hình PL.31. Điện di đồ phân tích mẫu APvSB2 ống tiêm............................................. 83
Hình PL.32. Sắc kí đồ phân tích mẫu AM2 và AM3 b ng pp LC-MS/MS.....................83
Hình PL.33. Sắc kí đồ phân tích mẫu AM4 và Amoxcillin của (AMvSB1, AMvSB2)
b ng pp LC-MS/MS............................................................................................... 84
Hình PL.34. Sắc kí đồ phân tích mẫu AP1, AP2 và Ampicillin (APvSB1) b ng pp.......84


Hình PL.35. Sắc kí đồ phân tích mẫu CPvSB (Cefoperazone) b ng pp LC-MS.............85
Hình PL.36. Sắc kí đồ phân tích hoạt chất Sulbactam của (ABvSB1, CPvSB,..............85


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại, cấu trúc một số penicillin................................................................ 5
Bảng 1.2. Công thức, đặc điểm và tác dụng của các kháng sinh nghiên cứu...................8
Bảng 1.3. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phƣơng.......12
Bảng 1.4. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng.....................13
Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phƣơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)........................................................................ 15
Bảng 1.6. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định kháng sinh β-lactam b ng phƣơng pháp
điện di mao quản................................................................................................... 17
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1........................................... 26
Bảng 2.2. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2........................................... 26
Bảng 3.1. Kết quả sự phụ thuộc diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc)............33

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của bốn chất vào chiều...........35
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của 4 chất vào thời.................36
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của Spic và tdc của 4 chất vào chiều...............37
4

Bảng 3.5. Điều kiện tối ƣu cho phân tích bốn chất b ng phƣơng pháp CE-C D...........38
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ các chất........................................... 39
Bảng 3.7. Phƣơng trình đƣờng chuẩn, hệ số tƣơng quan của 4 chất nhóm 1................39
Bảng 3.8. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của đƣờng chuẩn nhóm 1............40
Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của bốn chất...............................40
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc Spic và tdc của bốn chất vào nồng độ đệm điện di.................. 43
Bảng 3.11. Sự phụ thuộc Spic và tdc của các chất vào chiều dài hiệu dụng của mao quản
44
Bảng 3.12. Điều kiện tối ƣu cho phân tích nhóm 2 (Amoxcillin, Ampicillin,
4

Cefoperazone và Sulbactam) b ng phƣơng pháp CE-C D....................................46
Bảng 3.13. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ các chất................................... 47
Bảng 3.14. Phƣơng trình đƣờng chuẩn, hệ số tƣơng quan của 4 chất nhóm 2..............47
Bảng 3.15. Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của đƣờng chuẩn nhóm 2..........48
Bảng 3.16. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của 4 chất.................................48
Bảng 3.17. Hàm lƣợng hoạt chất Cefalexine, Cefotaxime, Sulbactam và Cefixime......49
Bảng 3.18. Hàm lƣợng các hoạt chất Amoxcillin, Ampicillin, Cefaperazone và
Sulbactam trong các mẫu dƣợc phẩm................................................................... 51
Bảng 3.19. Kết quả phân tích hàm lƣợng một số mẫu thuốc b ng phƣơng....................54


Bảng PL.1. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 1........................................ 63
Bảng PL.2. Thông tin các mẫu thuốc chứa hoạt chất nhóm 2........................................ 65
4

Bảng PL.3. Kết quả xác định độ lặp lại của phƣơng pháp CE-C D trong định lƣợng bốn
chất thuộc nhóm 1................................................................................................. 72
Bảng PL.4. Độ thu hồi của nhóm 1 (Cefalexine, Cefotaxime Natri, Cefixime và
Sulbactam)............................................................................................................ 72
Bảng PL.5. Độ thu hồi của nhóm 2 (Amoxcillin; Ampicillin; Cefoperazone và
Sulbactam)............................................................................................................ 75


D
Tên viết tắt
Ace
AMO
AMP
AOAC
Arg
Asc
4

CD
CE
CFL
CFP
CFT
CFX
CRM
EOF
His
HPLC
ID

LC-MS/MS
LOD
LOQ
MEKC
RSD
SBT
SD
Tris
UV-Vis


MỞ ĐẦU
Kháng sinh là những chất kháng khuẩn đƣợc chiết xuất từ các chủng vi sinh vật,
nấm, đƣợc tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự
phát triển của vi khuẩn khác một cách đặc hiệu. Nhờ có thuốc kháng sinh đã giúp kiểm
soát đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra. Kháng sinh là nhóm thuốc
thiết yếu trong y học, quan trọng nhất là nhóm β-lactam gồm các kháng sinh có cấu trúc
hóa học chứa vòng β-lactam. Sự liên kết của vòng này với các cấu trúc khác sẽ hình
thành các phân nhóm khác nhau nhƣ: penicilin, cephalosporin và các β-lactam khác.
Lƣợng kháng sinh β-lactam đang sử dụng trong y học là rất lớn và phổ biến với nhiều
chế phẩm khác nhau trên thị trƣờng. Trên thế giới, nhu cầu sử dụng thuốc kháng sinh
ngày càng tăng, đặc biệt ở các nƣớc đang phát triển, vì nhiễm khuẩn n m trong số
những bệnh lý hàng đầu cả về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong. Theo tổ chức y tế Thế giới
(WHO), Việt Nam đƣợc xếp vào nhóm các nƣớc có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và
thuộc nhóm sử dụng nhiều kháng sinh nhất [3,8,20].
Yếu tố chính quyết định đến chất lƣợng thuốc kháng sinh là hàm lƣợng các hoạt
chất chính có trong thuốc. Nếu hàm lƣợng vƣợt quá mức cho phép sẽ gây ra tình trạng
nhờn thuốc, kháng thuốc và làm mất tác dụng của thuốc. Nếu hàm lƣợng hoạt chất
chính bị thiếu so với quy định sẽ không đủ hiệu lực để có thể kháng lại các vi khuẩn gây
bệnh và cũng làm giảm hoặc mất tác dụng của thuốc. Do đó, việc kiểm nghiệm hàm

lƣợng các hoạt chất trong mẫu thuốc đóng vai trò rất quan trọng.
Một số phƣơng pháp đƣợc dùng để phân tích riêng rẽ hoặc đồng thời các hoạt
chất kháng sinh trong mẫu thuốc nhƣ: Phƣơng pháp phân tích quang phổ hấp thụ phân
tử (UV-Vis), phƣơng pháp điện hóa, phƣơng pháp sắc ký (HPLC), phƣơng pháp điện di
mao quản (CE). Để giảm chi phí và tiết kiệm thời gian phân tích thì việc xây dựng các
phƣơng pháp định lƣợng đồng thời nhiều kháng sinh nhóm β-lactam là rất cần thiết.
Nhận thấy phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE4

C D) có tiềm năng trong việc kiểm nghiệm thuốc, nguyên liệu và bán thành phẩm
thuốc, cũng nhƣ các hoạt chất kháng sinh trong thuốc. Do có nhiều ƣu điểm nhƣ thời
gian phân tích nhanh, chính xác, xử lý mẫu đơn giản, thiết bị nhỏ gọn phù hợp để phân
tích ngay tại hiện trƣờng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu định lượng một số kháng sinh β4

lactam bằng phương pháp diện di mao quản sử dụng detector (CE-C D)” đƣợc lựa
chọn, với hi vọng sẽ góp một phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình kiểm nghiệm các
hoạt chất kháng sinh trong một số mẫu thuốc đang lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay.
1


Ngoài ra, cũng hƣớng đến mục tiêu áp dụng một cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân
tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/ hoặc ở các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều
loại kháng sinh, gồm các thuốc đơn hoạt chất và thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau.

2


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về kháng sinh
Kháng sinh từ khi ra đời đã trở thành một loại thuốc thiết yếu, một công cụ hỗ trợ
cho sức khỏe con ngƣời, góp phần đẩy lùi nhiều loại bệnh tật và cứu sống hàng trăm

triệu ngƣời trên khắp thế giới. Sự kiện Alexander Fleming phát hiện ra penicillin
(1928) đƣợc đánh giá là một trong những thành tựu vĩ đại nhất trong lịch sử y học hiện
đại và mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [22].
Waksman năm 1942 đã phát hiện ra streptomycin và đƣa ra định nghĩa: “Một chất
kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có
khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác”.
Baron năm 1950 đã bổ sung nhƣ sau: “Kháng sinh là những chất đƣợc tạo ra bởi
những cơ thể sống, có khả năng ức chế sự phát triển hay tồn tại của một hay nhiều
chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”.
Hiện nay quan niệm về kháng sinh đã mở rộng hơn: “Kháng sinh là các chất có
nguồn gốc tự nhiên từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, ở liều điều trị có khả
năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật ở nồng độ thấp”.
Kháng sinh đƣợc chia làm ba loại: Kháng sinh phổ rộng (có hoạt tính trên nhiều
loại vi khuẩn khác nhau), kháng sinh phổ hẹp (có hoạt tính trên một số ít vi khuẩn),
kháng sinh đặc hiệu (chỉ tác dụng trên một loại hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định).
Chia theo nhóm gồm nhiều nhóm khác nhau nhƣ: β-lactam, Aminosid, Macrolid,
Tetracyclin, Peptid … Trong số các nhóm chính đƣợc chia ra các phân nhóm nhỏ hơn
nhƣ: β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem, monobactam),
(glycopeptid, lipopeptid,…), … Trong đó nhóm quan trọng nhất là β-lactam.

Peptid

1.2. Tổng quan về các kháng sinh nhóm β-lactam
Kháng sinh nhóm β-lactam là các kháng sinh mà phân tử chứa các dạng vòng βlactam. Gồm các phân nhóm: Vòng có 5 cạnh bão hòa gồm các penicillin, vòng có 6
cạnh không bão hòa gồm các cephalosporin, vòng có 5 cạnh không bão hòa gồm các
imipenem và ertapene, các monobactam không có vòng. Trong đó hai phân nhóm đƣợc
sử dụng nhiều và phổ biến nhất là phân nhóm penicillin và cephalosporin.
Phân nhóm penicillin (penicillin G, procaine penicillin, benzathine penicillin,
penicillin V), đƣợc Fleming tìm ra từ năm 1928 thu đƣợc từ nấm Penicillium hay đƣợc
điều chế bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

+

3


+
Phân nhóm cephalosporin đƣợc chiết xuất từ nấm Cephalosporium acremonium
hoặc bán tổng hợp, đều là dẫn xuất của axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) có mang
vòng β-lactam, tùy theo tác dụng kháng khuẩn chia thành 4 thế hệ [1,2,12].
Các kháng sinh này là các hoạt chất chính trong trong các mẫu dƣợc phẩm, có tác
dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nhờ đó
mà ta điều trị và loại bỏ đƣợc nhiều dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn gây ra, các hoạt
chất chính này đƣợc công bố trên nhãn sản phẩm. Vì vậy, cần thiết phải định lƣợng các
hoạt chất này nh m kiểm chứng chất lƣợng của sản phẩm kháng sinh, làm căn cứ cho
việc điều trị.
1.2.1. Phân loại, cấu trúc của các kháng sinh nhóm βlactam a) Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: Vòng β-lactam gắn kết với
vòng thiazolidin và quyết định hoạt tính của kháng sinh, có 5 nhóm khác nhau. Sự kết
hợp này làm cho vòng β-lactam hoạt động hơn so với từng vòng β-lactam riêng biệt.
R
C
O
N
H

COOM
O
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin
Tên gọi chung của các penicillin khi chƣa có gốc R là: (2S,5R,6R3)3-dimethyl-7oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid
Khi thay thế gốc R b ng các gốc khác nhau, thƣờng là các cation (K, Na, H), thì

thu đƣợc các penicilin khác nhau có độ bền, dƣợc động học và phổ kháng khuẩn khác
nhau [1,2]. Dựa vào nguần gốc có thể sắp xếp các penicillin thành 3 nhóm chính với
hoạt tính khác nhau và đƣợc trình bày ở Bảng 1.1.

4


Bảng 1.1. Phân loại, cấu trúc một số penicillin

khángpenicilliiase

(nhómII)

Nhómpenicillintự

Tên kháng sinh

6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyloxazole-4-carbonyl]amino}

Nhóm

penicillinphổ

Nhómpenicillin

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4carbonyl)amino]

6-([(2R)-2-amino-2phenylacetyl]amino)

5


NH2 NH2
CH-

Amoxicillin
HO

(AMO)

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino}
b) Các cephalosporin
Cephalosporin đƣợc Abraham và các cộng sự (1948) đã phân lập ra từ
Cephalosporium acremonium, các Cephalosporin hiện nay đƣợc chia thành 4 thế hệ do
sự thay đổi các nhóm thế khác nhau đã thu đƣợc các kháng sinh mới có hoạt tính tốt
hơn. Tác dụng tốt trên các vi khuẩn gram (+) nhƣng tác dụng yếu trên vi khuẩn gram
(-), đồng thời là nhóm kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều nhất trên lâm sàng hiện nay và có
cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng 1 dị vòng 6 cạnh và vòng β-lactam 4 cạnh.
R2
R1

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin
Tên gọi chung của các cephalosporin khi chƣa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid
Từ công thức ta thấy khi thay đổi các gốc R thì thu đƣợc các cephalosporin mới
có đồ bền, dƣợc động học và tính kháng khuẩn khác nhau [1,2].
1.2.2. Tính chất, cơ chế, độc tính và phạm vi điều trị của các kháng sinh β-lactam
a) Tính chất:
Các kháng sinh β-lactam thƣờng kết tinh ở dạng bột màu trắng hoặc màu vàng
(Cefixime), đa phần chứa đồng thời hai nhóm (–COOH) và (–NH 2), do đó dễ tan trong

dung dịch axit và kiềm loãng, dạng axit ít tan trong nƣớc, ở dạng muối natri và kali dễ
tan, tan đƣợc cả trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải.


Các kháng sinh β-lactam nhóm axit (–COOH) có pK a= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác nhau làm cho
dạng phổ thay đổi khác nhau.
6


b)

Cơ chế:

Các penicillin diệt khuẩn b ng cách can thiệp vào sự phát triển của vi khuẩn, làm
cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không đƣợc thực hiện. Khi vi khuẩn phân chia
phát triển, chúng phải tạo ra màng tế bào nhờ một enzym xúc tác đặc biệt. Enzym này là
một chuỗi amino axit và penicillin cắt đứt tiến trình hình thành, sinh tổng hợp vách tế
bào bị ngừng lại. Do đó, penicillin đã tranh mất các vị trí phản ứng của tiền chất tạo
enzym nên enzym sẽ không hình thành, có nghĩa là màng tế bào không đƣợc tái tạo, kết
quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
c)

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam có độc tính thấp, nhƣng so với thuốc khác tỷ lệ dị ứng
khá cao (1 – 10)%, từ phản ứng rất nhẹ đến từ vong do choáng phản vệ, có dị ứng chéo
với mọi β-lactam và cephalosporin, gây ra một số dị ứng thuốc nhƣ: Mày đay, vàng da,
gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…
Khuyến cáo thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống

chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc.
d) Phạm vi điều trị:
Kháng sinh là thuốc có khả năng ức chế vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi
khuẩn, nhờ các thuốc kháng sinh mà y học có thể loại bỏ đƣợc các dịch bệnh nguy hiểm
đối với con ngƣời và động vật nhƣ dịch hạch, dịch tả, thƣơng hàn và điều trị hiệu quả
nhiều loại bệnh gây ra bởi vi khuẩn. Đối với các nƣớc đang phát triển nhƣ ở Việt Nam
ta thuốc kháng sinh giữ một vị trí rất quan trọng và đƣợc dùng phổ biến, do mức sống
còn thấp và điều kiện vệ sinh kém nên thƣờng xảy ra các dịch tả, kiết lị, nhiễm khuẩn
đƣờng hô hấp, các bệnh nhiễm trùng,.…
1.3. Giới thiệu về các kháng sinh trong nghiên cứu
Các kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu thuộc nhóm β-lactam (Cephalexin,
Cefotaxime Natri, Cefixime, Cefoperazone, Amoxcillin, Ampicillin và Sulbactam). Các
kháng sinh này đang đƣợc sử dụng rất phổ biến trong y học và có nhiều chế phẩm khác
nhau rất đa dạng trên thị trƣờng, giúp điều trị hiệu quả các dịch bệnh nguy hiểm nhƣ
dịch tả, thƣơng hàn và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh nhiễm trùng gây ra do vi khuẩn.
Thông thƣờng trong sản xuất dƣợc phẩm (trong nƣớc và trên thế giới), các kháng
sinh đƣợc phối hợp đồng thời thuộc cùng một nhóm hoặc có cấu trúc tƣơng tự . Ngoài
ra trong các chế phẩm khác nhau kháng sinh nhóm β-lactam thƣờng đƣợc sử dụng ở
dạng đơn hoạt chất hoặc kết hợp với một tác nhân làm tăng hiệu quả điều trị, trong đó
Sulbactam là một tác nhân đƣợc sử dụng rất phổ biến. Sulbactam là một chất ức chế
7


β-lactam, nên chất này thƣờng đƣợc dùng kết hợp với các hoạt chất nhƣ Amoxcillin,
Ampicillin hay Cefaperazone theo một tỉ lệ nhất định để ức chế β-lactam.
4

Đề tài nh m nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích b ng phƣơng pháp CE-C D
để định lƣợng các kháng sinh nhóm β-lactam trong chế phẩm, để có thể áp dụng một
cách linh hoạt, hiệu quả quy trình phân tích này vào các phòng kiểm nghiệm và/hoặc

các nhà máy sản xuất đồng thời nhiều loại kháng sinh (gồm các thuốc đơn hoạt chất và
thuốc kết hợp các hoạt chất khác nhau). Các hoạt chất nghiên cứu đƣợc chia theo hai
nhóm:
+
Nhóm 1 là nhóm chế phẩm riêng rẽ chỉ chứa đơn hoạt chất nhóm β-lactam:
Cephalexin, Cefotaxime Natri, Cefixime và Sulbactam
+
Nhóm 2 là nhóm chế phẩm phối hợp giữa các hoạt chất nhóm β-lactam và
Sulbactam: Amoxcillin, Ampicillin, Cefaperazone và Sulbactam
Các kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu có công thức, đặc điểm và tác dụng
đƣợc trình bày trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Công thức, đặc điểm và tác dụng của các kháng sinh nghiên cứu
Tên

Cephalexin

chất

Công thức

.H2O
C16H17N3O4S.H2O

(M = 347,39g/mol)
Tên gọi: (7R)-3-Methyl-7- (αD -phenylglycylamino) -3cephem-4-carboxylic acid
monohydrate


8

Natri
Cefotaxime

C16H17N5O6S2Na
Tê n gọi: (6 R , 7 R , Z ) -3-

(M= 462g/mol)

(Acetoxymetyl) -7- (2- (2aminothiazol-4-YL) -2(metoxyimino) acetamido) -8oxo-5-thia-1-azabicyclo [4.2.0]

Cefixime

oct-2-ene-2-carboxylat sodium

C16H15N5O7S2
(M = 453,452g/mol)
Tên gọi: (6 R, 7 R) -7 - [(Z) -2
(2-Amino-4-thiazolyl) -2
(carboxymethoxyimino)
glyoxylamido] -8-oxo-3-vinyl-


5-thia-1-azabicyclo axit [4.2.0]
ortho-2-ene-2-carboxylic