Nghiên cứu quy trình giám định 11 nor 9 cacboxyl delta 9 tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH
11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL
TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH
11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL
TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS
Chuyên ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Trường

Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân Trường
đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành
luận văn này.
Em xin cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự nhiên
đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu,
đặc biệt là sự chỉ bảo của PGS.TS.Nguyễn Văn Ri.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Ngọc Mai, cùng các anh chị
Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất nhiệt tình giúp đỡ, động
viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho em.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn lãnh đạo phòng PC54 –CATP Hà Nội cùng các đồng
nghiệp trong đội giám định Hóa học- phòng PC54 – CATP Hà Nội đã hết sức tạo điều
kiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là chỗ
dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn.
Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Tuyến


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU......................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN....................................................................................................... 3
1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa........................ 3
1.1.1. Cần sa............................................................................................................................ 3

1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa............................................................................................. 5
1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa.............................................................................. 6
1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự.......7
1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa 9
1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu.................................................... 10
1.1.7. THC-COOH.............................................................................................................. 12
1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH............................................................ 13
1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng.................................. 13
1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí.................................... 17
1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký
khí đã được công bố............................................................................................................... 20
1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS . 22
1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS............................................................. 22
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM............................................................................................... 24
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu....................................................................... 24
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................... 24
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 24
2.1.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................... 25
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị........................................................................................ 26
2.2.1. Hóa chất..................................................................................................................... 26
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị.................................................................................................. 27
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 28
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu............................................................. 28
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu......................................................................................... 28


2.4. Thực nghiệm.................................................................................................................... 29
2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000........29
2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất......................................................... 30
2.4.3. Khảo sát dung môi chiết......................................................................................... 30

2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết............................................................................ 31
2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết.......................................................................................... 31
2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị.................. 31
2.4.7. Xây dựng đường chuẩn.......................................................................................... 32
2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích......................................................................... 32
2.4.9. Phân tích mẫu thực tế.............................................................................................. 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................ 34
3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS.........................34
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất.................................................. 40
3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết............................................ 40
3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết.......................................................................... 40
3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH)............................................................. 43
3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết........................................................................... 44
3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH...................................................................... 44
3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 44
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn.......................................................................................... 45
3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp............................................. 47
3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp...................................... 48
3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS................................. 49
3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế........................................................ 51
3.6. Hướng phát triển của đề tài........................................................................................... 51
KẾT LUẬN.................................................................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 53
PHỤ LỤC..................................................................................................................................... 56


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS........................... 7
Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa........................ 8

Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu......................................................... 9
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc
ký lỏng............................................................................................................................................ 15
Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc
ký khí.............................................................................................................................................. 21
Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ........................................................ 25
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết..................... 41
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết................................. 43
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết............................................................................ 44
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH..................................... 45
Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn............47
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp.................................................... 47
Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật..................................................................... 48
Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực............................................ 51


DANH MỤC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa................................................ 4
Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà............................................................................................... 5
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu............................................ 12
Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS...................................... 16
Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS................................... 16
Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành.................................................................. 19
Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH................................................................ 22
Hình 1.8. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS...................................................... 23
Hình 2.1. Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ........................................................................... 24
Hình 3.1. Phổ khối của THC-COOH chuẩn......................................................................... 35
Hình 3.2. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I...................................................... 36
Hình 3.3. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I........................................................ 37

Hình 3.4. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II.................................................... 38
Hình 3.5. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II...................................................... 39
Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết.................................................... 42
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết................................................................ 43
Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH.................................................................... 46
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu..........50


THC
CBN
CBD
THC-COOH
TMCS
BSTFA
TMS
IS
PFPA/PFPOH
MSTFA
EtOAc
LOD
LOQ
HPLC
GC
GC-MS
LC-MS
KHHS
CTN


MỞ ĐẦU

Từ lâu người ta đã biết đến ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi
trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra sự
phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó.
Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được hành
vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia tăng liều
lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Đó là nguyên nhân
làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người, cướp của, mại dâm,
là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu, gian lận, tham nhũng [3].
Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội như
thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm
Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine, các
thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat, hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần sa đang
ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều.
Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng, chóng
mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai thậm chí
gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người 61 chất khác nhau,
với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN (canabinol),
CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng tâm lý tới người
sử dụng cần sa.[16]
Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50%
lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong toàn
cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp theo. Khi
bài tiết trong nước tiểu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH (11-nor-9cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol) và các sản phẩm liên hợp với một hoặc hai
phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3]. Đây chính là các đối tượng để kiểm tra
việc sử dụng cần sa.

1


Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân tích

miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay bằng sắc ký khí (GC), tuy nhiên
HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá thành dung môi tương đối đắt. Phương
pháp sắc ký khí có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, độ nhạy và độ
chọn lọc cao. Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký khí khối phổ để xác
định THC-COOH.
Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người sử
dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này chúng tôi
tập

trung

“Nghiên

cứu

quy

trình

giám

định

11-nor-9-cacboxyl-delta-9-

tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng thiết bị sắc ký khí khối phổ”
nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa
1.1.1. Cần sa
Cây cần sa được trồng phổ biến ở những vùng nhiệt đới từ hàng trăm năm nay
nhằm mục đích lấy sợi gai và là chất gây ra tác dụng tâm lý. Tại hầu hết các nước trên
thế giới, việc trồng trọt và buôn bán cây cần sa bị coi là bất hợp pháp vì đã được đưa
vào danh mục các chất ma túy bị cấm. Tuy nhiên, nó vẫn được trồng bất hợp pháp ở
nhiều vùng thuộc Bắc Mỹ, Nam Mỹ, khu vực Caribe, châu Phi và Đông Nam Á.
Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006, sau đến Châu Phi
(khoảng 22%) [21]. Ở Việt Nam, nó còn có tên gọi là cây gai dầu, trước đây mọc
nhiều ở khu vực Long Xuyên, Châu Đốc.
Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng trên hệ thần kinh là lá, quả và hoa. Các bộ
phận này được thu hoạch riêng, phơi khô, ép thành bánh hoặc bó lại để sử dụng bằng
cách hút, đôi khi dùng đường uống. Dưới đây là các đặc điểm hình thái đặc trưng của
cần sa [21]:

3


Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa A
- Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa đực
B - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa cái
1 - Chùm nhị hoa
2 - Nhị hoa (nhị khác và ngắn hơn)
3 - Nhị hoa
4 - Hạt phấn hoa

4

5 - Nhụy hoa cái có lá bắc
6 - Nhụy hoa cái không có lá bắc
7 - Bầu nhụy hoa cái (hình bổ dọc)
Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà, có
thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn chiếu sáng
nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và khó khăn trong công
tác điều tra phòng chống tội phạm.
Hiện nay, cần sa được sử dụng ở rất nhiều nơi, đặc biệt là bộ phận những
người trẻ tuổi. Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để hút
nhằm tạo cảm giác hưng phấn. Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá thành rất
đắt so với thuốc lá.

Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà
1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa
Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu. Các sản phẩm
hợp pháp cần sa gồm có hạt cần sa, dầu từ hạt cần sa và tinh dầu cần sa [9].

5


Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và cách
chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích buôn lậu và sử dụng bất hợp pháp, các chế
phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là: Cây cần sa, nhựa cần sa
và dầu cần sa do hàm lượng THC cao.
Nhựa cần sa là sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng THC
đạt 2-10% [4]. Nhựa cần sa được sản xuất tại khoảng 65 nước trên thế giới, chủ yếu là
tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi và Tây-Nam Á, đặc biệt là Afghanistan và
Pakistan [21].
Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với dụng

cụ chiết tương tự như chiết soxhlet. Các dung môi hữu cơ thường dùng là etanol,
clorofom, n-hexan, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30%. [16] 1.1.3. Tác hại
của việc sử dụng cần sa
Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người sử
dụng, thường tạo ra những khoái cảm, hưng phấn, nói nhiều. Nếu như người nghiện
heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người nghiện cần sa có thể trở
nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn. Khi sử dụng cần sa, các cơ quan cảm giác
như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác bị kích thích mạnh dẫn đến ảo giác, trí
nhớ lẫn lộn, không phân biệt được quá khứ, hiện tại. Người nghiện có thể quên đi mọi
lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình trôi nổi, bồng bềnh, không quan tâm đến việc gì, không
có mục đích rõ ràng. Từ đó dẫn đến những trang thái bất thường về hành vi, không
làm chủ được các hoạt động của bản thân. Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn
thần kinh, tình dục, giảm khả năng sinh sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn
nhiễm sắc thể. Cần sa có thể gây ra bất tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong.
Bên cạnh đó cần sa cũng có một vài công dụng dùng trong y học như chống lại
tác dụng gây nôn của các chất hóa trị liệu chống ung thư, làm thư giãn cơ, chống co
giật, hạ nhãn áp. Tuy nhiên việc sử dụng cần sa cho mục đích y học cần được kiểm
soát chặt chẽ.

6


1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự Bảng
1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS [21]
(-)- 9-trans-Tetrahydrocannabinol
Tetrahydrocannabinol, THC

9

(-)-∆ -trans-Tetrahydrocannabinolic

Acid, THCA

Cannabinol, CBN

Cannabidiol, CBD

7


Cannabigerol, CBG

Cannabivarin, CBV

Cannabichromene, CBC

Hàm lượng THC trong cần sa thực vật khoảng 0,5-5%. Các kết quả phân tích
hàm lượng THC trong cần sa thực vật ở Việt Nam khoảng 3-5%, tuy nhiên trong một
số mẫu, có thể đạt tới 10-12% [4].
Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa [21]
STT
1
2
3
4
Hàm lượng THC của các sản phẩm cần sa (cây, nhựa và dầu) là tỷ lệ của khối
lượng hoạt chất THC trên khối lượng của các phần của cây cần sa sử dụng.
Ví dụ như một nghiên cứu ở Thụy Sĩ năm 2006 cho thấy 2/3 vụ bắt giữ cây
cần sa có hàm lượng THC trong cây cần sa từ 2 – 12 %, 2/3 số vụ bắt giữ nhựa

8

cần sa có hàm lượng THC từ 4 – 21 %, tùy thuộc vào điều kiện và kỹ thuật canh tác
cụ thể, còn quá trình chiết nhựa và nụ hoa cần sa có thể cho ra sản phẩm dầu cần sa
có hàm lượng THC lên tới 60% [10].
1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa Chưa
có nghiên cứu nào chỉ ra thời gian chính xác để phát hiện mẫu dương tính với người sử
dụng cần sa, bởi nó phụ thuộc nhiều yếu tố như loại mẫu, độ
nhạy của thiết bị phát hiện, tần suất, liều lượng, thời gian sử dụng lần cuối cùng, hệ
thống tiêu hóa, di truyền, tình trạng trao đổi chất, hệ thống bài tiết của mỗi cá nhân,
đồng thời còn những yếu tố khác tác động vào như bệnh tật hay sử dụng cùng lúc các
loại ma túy khác. Dưới đây là thời gian gần đúng có thể phát hiện trên một số loại
mẫu sau khi lấy mẫu đối với người sử dụng cần sa [5].
Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu

Người sử

Người sử

Có thể kiểm tra huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để phát hiện cần sa
trong cơ thể người sử dụng, tuy nhiên việc xét nghiệm nước tiểu được thực hiện với
chi phí rẻ hơn, việc lấy mẫu nhanh chóng, thời gian phát hiện lâu hơn và xử lý mẫu
cũng dễ dàng hơn so với mẫu máu, mẫu tóc, nước bọt và hơi thở. Vì thế, lấy mẫu
nước tiểu sẽ thuận lợi đối với điều kiện tại các phòng thí nghiệm giám định Hóa học
của các tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện KHHS của Bộ công an hiện nay.
Thời gian để phát hiện được cần sa trong nước tiểu phụ thuộc rất lớn vào tần
suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một tuần),
dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong nước tiểu nồng độ có thể đạt hàng
trăm ng/ml [5].

9


Xét nghiệm nước tiểu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng
chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần sa. Các
nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được bài tiết trong
vòng 5 ngày, khoảng 20% trong nước tiểu và 65% trong phân [11]. Trong huyết tương
nồng độ THC cao nhất sau khi hút một liều thường rơi vào 2ng/ml trong 4-6 giờ, và
có thể phát hiện sau vài phút. Nước tiểu của người sử dụng cần sa có chứa THCCOOH ở cả dạng tự do và dạng liên hợp với axit glucuronic.
THC có thể tích lũy trong mô mỡ, tạo ra nồng độ bài tiết cao hơn và thời gian
phát hiện lâu hơn. Nếu có tiền sử sử dụng cần sa, xét nghiệm nước tiểu với người sử
dụng bình thường có thể phát hiện sau khi sử dụng 2 tuần, và có thể lâu hơn với
người sử dụng kinh niên. Bất kể thí nghiệm nào cũng cần đo cả dạng tự do và dạng
chuyển hóa, bao gồm cả thủy phân để tăng độ nhạy của phép phân tích.
Hoạt chất THC có thể hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa, tuy nhiên tốc độ
chậm và thất thường, mức độ hấp thu thường chỉ đạt 6-20% qua đường tiêm tĩnh
mạch, 18% qua đường hút. Do đặc tính ưa mỡ cao nên THC có thể phân bố rộng rãi
trong toàn bộ cơ thể. THC chuyển hóa ở phổi nếu dùng bằng cách hút, ở gan nếu
uống. [4]
Mặc dù trong cần sa có trên 60 chất Cannabis được tìm thấy nhưng hoạt chất
chính tạo ra tác dụng của cần sa là THC, CNB và CBD. Để xác định việc sử dụng cần
sa, cần thiết phải kiểm tra dạng chưa chuyển hóa của các chất cannabinoid chính là
THC, CBN, CBD. Tuy nhiên lượng chất chưa chuyển hóa này trong nước tiểu rất
thấp, với THC chỉ khoảng 0,005-0,01% liều sử dụng, và chỉ đào thải trong vòng vài
giờ [4]. Bởi vậy hiện nay đối tượng giám định chủ yếu là sản phẩm chuyển hóa của
THC là 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol (THC-COOH).
1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu
1.1.6.1. Cấu tạo THC
- Công thức phân tử: C21H30O2

10


- Công thức cấu tạo:

1.1.6.2. Tính chất vật lý THC
-

Ở dạng tinh khiết, THC ở trạng thái rắn kết tinh khi lạnh, dạng nhớt và dính

khi ấm.
-

Tan rất ít trong nước nhưng tan tốt trong hầu hết các dung môi hữu cơ.

-

Khối lượng phân tử: M = 314,46 g/mol.

-

Nhiệt độ sôi: 157 C

-

Độ tan trong nước: 0,0028 mg/ml ở 20 C

o

o

1.1.6.3. Tính chất hóa học và sự chuyển hóa THC
THC tan nhiều trong hầu hết các dung môi hữu cơ, đặc biệt là chất béo và
rượu. THC không bền với nhiệt độ cao và ánh sáng, dễ cháy. Nó tác dụng với oxoaxit
hay axit cacboxylic tạo ra este và nước. Nó có thể bị oxy hóa thành anđehit hoặc
xeton dưới điều kiện khác nhau.
Khi sử dụng cần sa, hoạt chất chính trong cần sa là THC bị hấp thụ vào cơ thể.
THC chứa một nhóm –OH được chuyển hóa trong gan, qua quá trình hydro hóa nhóm
–CH3 tạo thành THC-OH, thông qua quá trình oxy hóa một nhóm –OH xúc tác bởi
các enzyme Cytochrome P450 (CYPs) trong gan tạo thành THC-COOH chứa một
nhóm –COOH. Sau đó THC-COOH chứa 2 nguyên tử Hydro linh động, tác dụng với
axit glucuronic trong cơ thể người thành dạng muối của axit glucuronic, và được thải
ra ngoài bằng đường nước tiểu sau khi thận bài tiết. Quá trình chuyển hóa được thể
hiện qua sơ đồ sau:

11


Hydro hóa

THC
Oxy hóa

THC-COOH THC-COOH mono/diglucuronic

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu
1.1.7. THC-COOH
THC-COOH được hình thành trong cơ thể do quá trình oxy hóa THC bởi các
enzyme của gan. Sau đó, tiếp tục chuyển hóa thành dạng glucuronic, tạo thành một
hợp chất tan được trong nước và có thể dễ dàng bài tiết trong cơ thể người [13].

Công thức phân tử: C21H28O4
Khối lượng phân tử: 344,445 g/mol
Công thức cấu tạo:

12


Thời gian bán hủy: 5,2-6,2 ngày [8]
+

Do đặc điểm công thức cấu tạo có 2 nguyên tử H linh động của nhóm – OH
và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng của nguyên tử
+

H .
1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH
-

Phương pháp sắc ký bản mỏng: Việc định tính các cấu tử dựa vào tỷ số giữa

độ di chuyển của chất so với độ di chuyển của dung môi trong cùng thời gian chạy
sắc ký. Sau đó, dựa vào diện tích pic trong mẫu để bán định lượng cấu tử cần phân
tích.
-

Phân tích miễn dịch: Ưu điểm của phương pháp là không cần chiết và làm

sạch mẫu, thời gian phân tích nhanh và có thể áp dụng với một lượng mẫu lớn. Các
kháng thể sử dụng trong các kít thử thường có hoạt tính cao với sản phẩm chuyển hóa
THC-COOH, tuy nhiên còn có tác dụng chéo đối với các sản phẩm chuyển hóa khác.

Vì thế phương pháp này ít khi được sử dụng do tốn kém và không tin cậy.
Hiện nay, phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng được dùng
rộng rãi để phân tích THC cũng như THC-COOH vì có ưu điểm hiệu quả tách tốt, độ
nhạy và độ chính xác cao.
1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng
Để phân tích THC-COOH trên thiết bị HPLC, các bước chuẩn bị, xử lý mẫu
cũng tương tự như đối với sắc ký khí được trình bày trong mục 1.2.2 phía dưới. Tuy
nhiên đối với phương pháp này, chúng ta không cần thực hiện giai đoạn dẫn xuất
mẫu. Vì với thiết bị HPLC có thể phân tích được cả các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi
và khó bay hơi.
Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách chất dựa trên cả hiện tượng vật lý và hóa học.
Trong quá trình sắc ký, trong cột sắc ký luôn xảy ra cân bằng động giữa pha tĩnh và
pha động, nghĩa là sự vận chuyển và phân bố chất tan luôn được lặp đi lặp lại giữa hai
pha. Chất phân tích được di chuyển từng lớp qua pha tĩnh từ đầu đến cuối cột sắc ký
theo pha động với dòng chảy liên tục, tốc độ và thành phần nhất

13


định, hay gradient. Do tính chất và cấu trúc của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên
tốc độ di chuyển của mỗi chất cũng khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển
theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại bị pha tĩnh giữ lại trong
một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản
chất sắc ký của cột pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan, đồng thời cũng
phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung để rửa giải chất tan ra khỏi cột
sắc ký. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu, có chất tan bị lưu giữ ít
trên cột. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
Tùy theo tính chất và hàm lượng chất phân tích, trong sắc ký lỏng người ta đưa
ra một số phương pháp cơ bản sau:
-

Sắc ký lỏng pha thường (NP-HPLC).

-

Sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC).

-

Sắc ký trao đổi ion.

-

Sắc ký rây phân tử.

-

Sắc ký ái lực.

Mỗi phương pháp có đặc điểm riêng về pha tĩnh và pha động, detector cũng
như cách vận hành. [2]
Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký
lỏng đã công bố:

14


Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng
Tác nhân và nhiệt độ

STT

thủy phân

1

β-glucuronidase ở

[13]

37 C/20 giờ

2

KOH 10M

[6]

50 C/20 phút

3

β-glucuronidase/

[23]

arylsulfatase 37 C/5 giờ

o

o

o

15


Dưới đây là sắc ký đồ của THC-COOH được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối
phổ.

Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS

Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS

16


1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí
1.2.2.1. Thủy phân mẫu
Trên 80% lượng THC-COOH có trong nước tiểu dưới dạng liên hợp
glucuronic. Do vậy phải tiến hành thủy phân để tách gốc glucuronic ra khỏi THCCOOH. Đối với mẫu cần sa, thủy phân trong môi trường kiềm cho hiệu quả cao và ổn
định hơn các phương pháp thủy phân trong môi trường axit và men.
1.2.2.2. Phương pháp chiết
Sau khi tiến hành thủy phân để tách THC-COOH ra khỏi dạng liên hợp của nó
với axit glucuronic, thì việc quan trọng tiếp theo là phải tách chúng ra khỏi nước tiểu,
hiệu quả tách càng cao đồng nghĩa với việc phân tích càng chính xác. Có nhiều
phương pháp tách chiết, tuy nhiên cần lựa chọn phương pháp sao cho phù hợp với đối
tượng mẫu, yêu cầu phân tích cũng như điều kiện phòng thí nghiệm. Một số phương
pháp phù hợp để chiết THC-COOH từ nước tiểu là chiết lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi
chiết pha rắn.

Quá trình tách trong chiết pha rắn cũng tương tự như chiết lỏng- lỏng và
phương pháp sắc ký, chủ yếu dựa trên định luật phân bố chất tan giữa hai pha không
trộn lẫn vào nhau. Chiết pha rắn thuận lợi hơn so với việc chiết pha lỏng, nhưng trong
đề tài này để phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí nghiệm Kỹ thuật
hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước, chúng tôi lựa chọn chiết pha lỏng để
tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu.
1.2.2.3. Kỹ thuật dẫn xuất
Dẫn xuất: Kỹ thuật dẫn xuất hóa đóng vai trò quan trọng trong sắc ký khí
nhằm phân tích các chất khó bay hơi, đặc biệt là các hợp chất chứa một hoặc nhiều
nhóm chức, mà có khả năng hấp phụ đặc trưng gây ra sự giãn pic và làm biến dạng
pic, đặc biệt ở nồng độ thấp. Việc dẫn xuất hóa không chỉ tạo nên các pic cân đối mà
còn làm tăng độ phân giải, giúp định lượng chính xác. Các kiểu dẫn xuất thường dùng
là trialkyl silan hóa, este hóa, alkyl hóa…[1]
+

THCCOOH là hợp chất phân cực, chứa proton H , nên sử dụng dẫn xuất
alkylsilyl là phù hợp. Trong quá trình dẫn xuất, phản ứng phải được thực hiện

17