Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................vii
MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Giới thiệu chung về nhóm thuốc glycoside tim..................................................2
1.1.1. Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nhiên nhóm glycoside tim............................2
1.1.2. Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim.............................................................2
1.1.3. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim........................3
1.1.4. Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim..................................4
1.1.5. Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim.........................................................5
1.1.6. Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim....................................................6
1.1.7. Tá dược trong thuốc glycoside tim..................................................................8
1.2. Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim...................................9
1.2.1. Phương pháp sắc ký........................................................................................9
1.2.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại............................................................. 12
1.3. Thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp...16
1.3.1. Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến..................................................... 16
1.3.2. Một số ứng dụng thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất.....21
1.3.3. Giới thiệu phần mềm Matlab........................................................................ 22
1.4. Phương pháp NIR kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến để định lượng........23
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM............................................................................... 25

i


2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu............................................................. 25
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 25
2.1.2. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 25
2.1.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 26

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị............................................................................ 26
2.2.1. Hóa chất........................................................................................................ 26
2.2.2. Thiết bị.......................................................................................................... 27
2.3. Phương pháp phân tích..................................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu................................................................................ 27
2.3.2. Phương pháp phân tích.................................................................................. 28
2.4

Câu lệnh thực hiện hồi quy đa biến trong Matlab.......................................... 29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 32
3.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ hồng ngoại tới quá trình xác định đồng
thời digoxin và digitoxin trong hỗn hợp................................................................... 32
3.1.1. Khảo sát lựa chọn số sóng thích hợp............................................................. 32
3.1.2. Khảo sát tỷ lệ trộn mẫu với bột KBr............................................................. 38
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng quá trình ép viên mẫu................................................... 39
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường............................................... 39
3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu chuẩn............................................ 40
3.1.6. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên....................................................... 41
3.2. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng digoxin trong
mẫu dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến................................................ 42
3.2.1. Chuẩn bị số liệu đầu vào của mô hình hồi quy đa biến.................................42
3.2.2. Lựa chọn số cấu tử chính.............................................................................. 44
ii


3.2.3. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng........................................................ 46
3.2.4. Phân tích mẫu thực tế.................................................................................... 47
3.3. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định đồng thời các hoạt chất50
3.3.1. Chuẩn bị số liệu đầu vào............................................................................... 50

3.3.2. Lựa chọn số cấu tử chính.............................................................................. 52
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)............................55
3.3.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp................................................ 56
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN....................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................ 59
PHỤ LỤC................................................................................................................ 63

iii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim................................................ 2
Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin................................................................... 7
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin................................................................. 7
Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose................................................................... 9
Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn.................................................................. 28
-1

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 4000-400 cm .......33
-1

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 4000-400 cm .........34
-1

Hình 3.3 Phổ hồng ngoại truyền qua của digitoxin trong vùng 3600-2800 cm .....35
-1

Hình 3.4 Phổ hồng ngoại truyền qua của digoxin trong vùng 3600-2800cm ........35
Hình 3.5 Phổ tổng cộng của digoxin và digitoxin................................................... 35
-1

Hình 3.6 Phổ hồng ngoại truyền qua của lactose trong vùng 4000-400cm và 3600 –
-1

2800 cm ................................................................................................................ 36
Hình 3.7 Phổ hồng ngoại truyền qua magie stearat trong vùng 4000-400cm

-1

và

-1

3600 – 2800 cm .................................................................................................... 37
-1

Hình 3.8 Phổ hồng ngoại truyền qua talc trong vùng 4000-400cm và 3600 – 2800
-1

cm ......................................................................................................................... 37
Hình 3.9 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn xác định digoxin...............................49
Hình 3.10: Sắc đồ của mẫu thực (D1 và D2)............................................................ 49

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim........................................................ 3
Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim..................................... 5
Bảng 1.3 Thành phần các glycoside trợ tim chính..................................................... 6

Bảng 3.1 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng với bột KBr đến độ hấp thụ quang
tại một số đỉnh pic đặc trưng................................................................................... 38
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát quá trình ép viên........................................................... 39
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ................................................. 40
Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng mẫu................................................. 40
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên tại một số

đỉnh pic đặc

trưng........................................................................................................................ 41
Bảng 3.6 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng......................................... 43
Bảng 3.7 Hàm lượng digoxin và tá dược trong ma trận kiểm tra............................. 44
Bảng 3.8 Độ lệch chuẩn của mô hình hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng
digoxin với các PC từ 1-4........................................................................................ 46
Bảng 3.9 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định riêng
digoxin.................................................................................................................... 47
Bảng 3.10 Mẫu dược phẩm chứa hoạt chất digoxin đang lưu thông trên thị trường 47

Bảng 3.11 Khối lượng trung bình của một viên thuốc và khối lượng digoxin trong
một viên thuốc......................................................................................................... 48
Bảng 3.12 Hàm lượng digoxin trong mẫu thực tính theo HPLC.............................50
Bảng 3.13 Khối lượng các chất trong Ma trận hàm lượng các chất chuẩn trong ma
trận chuẩn xác định đồng thời digoxin và digitoxin................................................ 51
Bảng 3.14 Khối lượng các hoạt chất và tá dược trong ma trận kiểm tra..................52

v


Bảng 3.15 Độ lệch chuẩn tương đối của mô hình hồi quy tuyến tính đa biến xác
định đồng thời digoxin và digitoxin với số cấu tử từ 1-4......................................... 54

Bảng 3.16 Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng
thời digoxin và digitoxin......................................................................................... 56
Bảng 3.17: Hàm lượng digoxin và digitoxin trong mẫu thêm chuẩn xác định theo
mô hình hồi quy đa biến tuyến tính......................................................................... 57

vi


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Bình phương tối thiểu thông thường
(classical least square)
Bình phương tối thiểu nghịch đảo
(inverse least square)
Bình phương tối thiểu từng phần
(partial least square)
Hồi qui cấu tử chính (principal
component regression)
Cấu tử chính (Principal component)
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High
performance liqid chromatography)
Giới hạn phát hiện
(Limit of detection)
Giới hạn đinh lượng
(Limit of quantity)

vii


MỞ ĐẦU
Glycoside tim đại diện cho một trong những nhóm dược liệu quan trọng của

các tác nhân điều trị bệnh tim. Tuy nhiên các hoạt chất thuộc nhóm này có cơ chế
tác dụng đặc biệt lên tim, đặc tính động học cao, thời gian tích lũy trong cơ thể rất
lâu vì thế khi ngộ độc thì bị kéo dài, dễ gây tử vong cho người bệnh. Chính vì thế
cần xác định chính xác hàm lượng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đưa
vào điều trị đạt hiệu quả cao. Yêu cầu đặt ra là phải có phương pháp phù hợp định
lượng các glycoside tim trong dược liệu, dược phẩm một cách nhanh chóng và
chính xác. Để định lượng chính xác glycoside có rất nhiều phương pháp như HPLC,
HPLC kết hợp với detecto UV…, tuy nhiên nhược điểm của các phương pháp này
là là phải thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại, tốn dung môi và yêu cầu xử lý
mẫu, tách chất nên khá mất thời gian … không thể dùng để phân tích nhanh, đại trà
[11,13].
So với các phương pháp trên thì phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm
nổi trội về đơn giản trong quá trình tiền xử lý mẫu, phân tích nhanh, không sử dụng
dung môi độc hại, có thể tiến hành đo trực tiếp mẫu rắn rất phù hợp cho việc phân
tích nhanh. Nhưng do vùng phổ hồng ngoại gần và trung bình gồm các bước sóng
của các liên kết cơ bản (C-C, C-H, N-H…) do vậy xảy ra sự chồng phổ, khó tách
phổ và quá trình phân tích mẫu rắn gặp rất nhiều khó khăn nên việc định lượng hoạt
chất trong dược phẩm rất khó khăn.
Trước thực trạng đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu xây dựng
quy trình phân tích các hoạt chất nhóm glycoside tim bằng phương pháp quang
phổ hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến”. Với việc kết hợp phương
pháp phổ hồng ngoại với kỹ thuật thống kê đa biến ta có thể định lượng đồng thời
nhiều hoạt chất trong dược phẩm mà không cần tách chiết chất.
Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa Việt Nam
và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần
và trung bình, kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính để kiểm định
nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định xu hướng đưa các
phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh trong thực tế, đồng
thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng tính thời sự của công
tác giám định chất lượng.

1


CHƯƠNG 1.
1.1.

Giới thiệu chung về nhóm thuốc g

1.1.1.

Lịch sử ra đời, phân bố trong tự nh
Glycoside tim bắt đầu được sử dụng trong y học bởi Withering vào năm 1985,

đây là những glycoside steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, được dùng để điều trị
suy tim. Trong số hơn 300 loại glycoside tim có trong tự nhiên thì digoxin và
digitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị hiện nay.
Glycoside tim có trong hơn 45 loài thực vật chủ yếu thuộc các họ:
Apocynaceae,
Euphorbiaceae,

Asclepiadaceae,

Fabaceae,

Liliaceae,

Celastraceae
Meliaceae,

(Dây

gối),

Moraceae,

Cruciferae,

Ranulculaceae,

Scrophulariaceae, Sterculiaceae, Tiliaceae (Đay)... và trong một số côn trùng. Ở
trong cây glycoside tim có ở các bộ phận: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ, nhựa mủ...
[8,11,13,23]
1.1.2. Cấu trúc phân tử nhóm glycoside tim
Glycoside tim cũng như các glycoside khác cấu trúc hoá học gồm hai phần:
phần đường và phần không đường (aglycon hoặc genin) được nối với nhau bằng
dây nối glycoside. Công thức cấu tạo chung của glycoside tim được trình bày ở hình
1.1 và bảng 1.1.

Hình 1.1 Công thức cấu tạo chung của glycoside tim

2


Bảng 1.1 Công thức các hợp chất glycoside tim.

+

Phần không đường (aglycon hoặc genin) có thể chia thành hai phần nhỏ:
Phần hydrocacbon: là dẫn xuất của 10,13 – dimetylxyclopentanopehydro

phenantren.
+ Phần mạch nhánh là vòng lacton, có tác dụng chống suy tim, được nối vào
vị
trí C-17 của khung.
Đính vào nhân này còn có các nhóm chức có oxy.
- Phần đường không có tác dụng dược lý, được nối vào -OH ở C-3 của aglycon.
Phần không đường có thể chia thành hai phần nhỏ:
+Phần hydrocacbon
+Mạch nhánh là vòng lacton.
-

Các loại dây nối:
+
Dây nối axetal gồm: O- glycoside, C- glycoside, S- glycoside, Nglycoside.
+

Dây nối este: Pseudoglycoside [11,13,23].

1.1.3. Tính chất vật lý và tính chất hóa học của nhóm glycoside tim
* Tính chất vật lý
Các glycoside tim là những chất kết tinh được, một số ở dạng vô định hình
hoặc lỏng sánh, đa số không màu có vị đắng. Glycoside thường tan trong nước, cồn,
ít tan hoặc không tan trong dung môi hữu cơ (benzen, ete …)


3


*

Tính chất hóa học

Các glycoside tim rất nhạy cảm với thay đổi pH môi trường, những glycoside
tim có đường 2-desoxy rất dễ thuỷ phân khi đun với axít vô cơ 0,05 N trong
metanol 30 phút trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó không thuỷ
phân được.
Trong môi trường kiềm các cacdenolid chuyển thành các dẫn chất iso và các
dây nối este bị cắt (nếu có) không hoạt tính. Glycoside dễ bị thuỷ phân bởi các
enzim. Thường thì các enzim này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt phần
glucose để chuyển thành các glycoside thứ cấp. Ví dụ: digilanidaza trong lá digitan
lông, digipuapidaza trong lá digitan tía, strophantobiaza trong hạt Strophanthus
courmonti, xilarenaza trong Scilla maritima. [11,13,23]
1.1.4. Tính chất dược lý và tác dụng của nhóm glycoside tim
Phần quyết định tác dụng lên tim là phần aglycol bao gồm nhân steroid và
vòng lacton chưa bão hoà. Nếu giữ vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzen
hoặc naphtalen thì mất tác dụng. Nếu giữ nhân steroid mà thay đổi vòng lacton bằng
vòng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất nhiều. Phần đường có ảnh hưởng đến
tác dụng nhưng ít, chủ yếu là ảnh hưởng đến độ hoà tan.Sự hấp thu qua dạ dày, tá
tràng, ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH của phần aglycon.
Digitoxin dễ hấp thu qua đường tiêu hoá và tái hấp thu qua thận và gan thì chỉ
có một nhóm -OH tự do trong phần aglycon. Digitoxin tích luỹ trong cơ thể.
Các hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim tác dụng lên tim theo cùng một cơ
chế. Glycoside tim làm tâm thu ngắn và mạnh, tâm trương dài ra, nhịp tim chậm lại.
Do đó bệnh nhân đỡ khó thở và nhịp hô hấp trở lại bình thường. Glycoside tim còn
làm giảm dẫn truyền nội tại và tăng tính trợ của cơ tim nên nếu tim bị loạn nhịp,
thuốc có thể làm đều nhịp trở lại.
Khi dùng với liều lượng cao, sẽ có hiện tượng nhiễm độc dẫn tới các dấu
hiệu tâm thần mê sảng, lú lẫn, giảm thị giác, nôn, chán ăn, tim đập chậm lại, loạn

4


nhịp ngoại tâm thu nhĩ, cuối cùng là ngừng đập. Điều trị ngộ độc bằng cách dùng
thuốc ức chế gắn tiếp tục glycoside tim vào tim (kali) và thải trừ calci là chất hiệp
đồng tác dụng với digitalis trên cơ tim (EDTA) và các thuốc chữa triệu chứng loạn
nhịp tim. Điều trị chủ yếu dựa vào mức độ nhiễm độc nặng hay nhẹ với các triệu
chứng loạn nhịp ra sao. [8]
1.1.5. Hấp thu và đào thải thuốc glycoside tim
Glycoside tim được khuếch tán thụ động qua ống tiêu hóa (dạ dày, tá tràng,
ruột non): thuốc càng tan tốt trong lipid, càng dễ khuếch tán. Các nhóm -OH của
genin là những cực ưa nước, làm hạn chế độ tan trong lipid của thuốc. Digitoxin có
một nhóm -OH tự do ở C14, nên dễ tan trong lipid, được hấp thu hoàn toàn khi
uống. Digoxin có 2 nhóm -OH tự do, hấp thu qua đường tiêu hóa tốt hơn
uabaigenin, nhưng không hoàn toàn như digitoxin.
Glycoside tim gắn nhiều vào mô, đặc biệt là tim, gan phổi, thận vì những cơ
quan này được tưới máu nhiều. [8]
Đặc tính dược động lực học của một số glycoside tim được trình bày ở bảng 1.2.

Bảng 1.2 Đặc tính dược động học của một số glycoside tim

Glycoside

Ouabain

Lanatozid C

Digoxin

Digitoxin

5


1.1.6. Một số hoạt chất thuộc nhóm glycoside tim
Trong số hơn 300 glycoside tim có trong tự nhiên thì chỉ có digoxin và
digitoxin được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim
và được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Vì vậy chúng tôi chỉ đi sâu nghiên cứu vào
hai hoạt chất digoxin và digitoxin trong luận văn này.
Bảng 1.3 Thành phần các glycoside trợ tim chính

Tên chun
Digitoxin(digi
Acetyldigito

Digoxin
Lanataglycosi

G strophanto

Scilaren A

1.1.6.1.

Digoxin

Công thức: C41H64O14 (780,95)
Tên quốc tế: Digoxin
Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp tim. Digoxin làm tăng sức bóp cơ tim và

giảm tính dẫn truyền xung điện qua nút nhĩ thất, do đó thường dùng trong điều trị
suy tim, kiểm soát nhịp tim trong rung nhĩ,cuồng động nhĩ, nhịp nhanh kịch phát
trên tâm thất.

6


Hình 1.2 Công thức cấu tao của digoxin
Tính chất vật lý: digoxin là chất kết tinh không màu. Tan trong cồn, pyridin,
hay hỗn hợp clorofom – ancol, tan nhiều trong cồn nóng 80%. Độ tan trong nước
64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C. Không tan trong ete, axeton….
Digoxin có thể dùng bằng cách uống hoặc tiêm tĩnh mạch. Thể tích phân phối
trung bình khoảng 7,3 l/kg. Thải trừ qua thận gần như hoàn toàn. Sự thải trừ không
phụ thuộc pH của nước tiểu. [3]
1.1.6.2.

Digitoxin

Công thức: C41H64O13 (764,95)
Tên quốc tế: Digitoxin
Loại thuốc: thuốc chống loạn nhịp. Là chất độc bảng A. Có cấu trúc và hiệu
ứng tương tự như digoxin, mặc dù các hiệu ứng lâu dài không giống như digoxin
(được loại bỏ ra khỏi cơ thể qua thận), nó được thải trừ qua gan, do đó có thể được
sử dụng ở những bệnh nhân có chức năng thận kém hoặc thất thường.

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của digitoxin

7

Tính chất vật lý: Digitoxin là chất kết tinh không màu. Tan tốt trong cồn,
o

clorofom, tan ít trong nước (1gam/100 lít ở 20 C). Không tan trong dung môi hữu
cơ benzen, ete….[3]
1.1.7. Tá dược trong thuốc glycoside tim
Dạng thuốc là sản phẩm cuối cùng của quá trình bào chế; có bao gồm dược
chất, tá dược, và bao bì. Dược chất hay hoạt chất chính là thành phần chính của
dược phẩm có tác dụng dược lý. Dược chất dùng để trị bệnh, phòng bệnh hoặc
chuẩn đoán bệnh.
Tá dược hay tá chất là các loại chất phụ thêm vào dược phẩm nhằm làm thuận
lợi cho quá trình sản xuất thuốc, tạo cho dược phẩm có thể chất, khối lượng, màu
sắc, mùi vị thích hợp hoặc tiện dụng, dễ bảo quản, tăng độ ổn định của thuốc, giải
phóng được chất tại nơi mong muốn, phát huy được tối đa tác dụng của dược chất,
hạn chế tác dụng phụ và độc tính. Như vậy, tá dược có vai trò là chất độn, chất
mang, dung môi hòa tan, và chất bảo quản.
Do thành phần tá dược trong mỗi mẫu thuốc glycoside tim đều thay đổi theo
mỗi nhà sản xuất. Tuy nhiên trong quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy lactose,
magie stearat, talc… là 3 loại tá dược được sử dụng nhiều nhất và chiếm khối lượng
phần trăm lớn (gần 98%).
1.1.7.1.

Talc

Bột talc là magie silicat tự nhiên đã được lựa chọn và làm thành bột mịn.
Công thức hóa học Mg3Si4O10(OH)2. Cấu trúc của talc bao gồm lớp bát diện
magie liên kết kẹp giữa hai lớp tứ diện silic.
Tính chất: bột talc rất mịn, nó cho cảm giác trơn bóng như xà phòng. Talc có
tính chất cách điện, cách nhiệt, nhiệt độ nóng chảy cao, độ giãn nhiệt thấp, bền hóa
học, hấp thụ dầu, kị nước, ưu hợp chất hữu cơ và diện tích bề mặt lớn [2].

8


1.1.7.2.

Magie stearat

Magie stearat là stearat là hỗn hợp các muối của magie và các axit béo.
Công thức: C36H70MgO4
Tính chất: magie stearat có dạng bột trắng mịn, là thành phần tá dược có tác
dụng chủ yếu để bôi trơn, chống dính, làm chất độn, không tan trong nước, etanol
hoặc ete, chủ yếu được sử dụng như một chất bôi trơn.
1.1.7.3.

Lactose

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của lactose
Tính chất
Lactose có dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Dễ tan nhưng tan chậm
trong nước, kém tan trong etanol 96%.
1.2.

Tổng quan về các phương pháp phân tích glycoside tim

1.2.1. Phương pháp sắc ký
Trong những năm gần đây, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong

mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là các lĩnh vực của hóa dược, sinh hóa, hóa thực
phẩm, nông hóa, hóa dầu, hóa học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng
độc hại, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.

9


1.2.1.1.

Phân tích định lượng bằng HPLC

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình
vừa có tính chất hóa học lại vừa có tính chất lý hóa. Trong cột sắc ký xảy ra những
cân bằng động giữa pha tĩnh và pha động. Chất tan luôn được vận chuyển và phân
bố lại giữa hai pha. Pha động chảy liên tục qua cột tách với tốc độ và thành phần
nhất định. Do cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ
dịch chuyển trung bình của mỗi chất là khác nhau, thời gian bị giữ lại trong cột sắc
ký khác nhau, dẫn đến quá trình tách của các chất trong cột sắc ký
Đại lượng đặc trưng cho một chất là thời gian lưu t Ri của chất đó trên cột tách,
dựa vào thời gian lưu này để định tính chất đó thông qua mẫu chuẩn. Sau đó dựa
vào các tín hiệu phân tích thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) đề định lượng
các chất.
b

H = k1.C

b

S = k2.C

Trong đó: H chiều cao pic sắc ký của chất
S diện tích pic sắc ký của chất
k hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b hằng số bản chất, nhận giá trị trong vùng 0
1

C nồng độ chất phân tích
Ở

vùng nồng độ nhỏ thì b = 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:
H = k1 .C = f(C)
S = k2 .C= f(C)
Để xác định nồng độ chất phân tích ta có thể sử dụng phương pháp đường

chuẩn hoặc thêm chuẩn. Phương pháp đường chuẩn thì nhanh, đơn giản, nhưng khi
thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần xác định nhỏ thì ta dùng phương pháp
thêm chuẩn. [4,6]
10


Youichi Fujii và các cộng sự đã đưa ra quy trình tách và định lượng các
glycoside tim trong thuốc bằng phương pháp micro – HPLC với điều kiện: Cột
Jasco SC-01 (165x0,5mm I.D), pha động là hỗn hợp acetonitrin –metanol – nước
với tỉ lệ thể tích bằng 1:1:1, tốc độ dòng 4 l/phút, detector UV đặt tại bước sóng ở
220 nm, thể tích bơm mẫu là 0,1l. Thứ tự các chất ra khỏi cột là: digoxin,
lanatoside B, gitoxin, lanatoside A, digitoxin, thời gian tách thay đổi trong khoảng
30 đến 45 phút.[26]
Digoxin và digitoxin cũng đã được nhóm nghiên cứu của Federica Pellati
phân tích xác định và tách trong lá cây mao địa hoàng với phương pháp HPLC trên

cột LiChrospher RP-18 (125 mm × 4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6
mm I.D.); SB-Aq (150 mm × 4.6 mm I.D); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D.,
trong điều kiện dung môi pha động là hỗn hợp của acetonitrin và nước, chạy
gradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 với tỉ lệ
H2O/ACN là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 được giữ trong 3 phút, nhiệt độ
o

cột đặt ở 20 C, thể tích bơm là 10l, tốc độ dòng là 1ml/phút, detector đặt tại bước
sóng 220nm. Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút. Thứ tự các chất ra khỏi cột:
digoxigenin; 2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin;
5, digoxin; 6, lanatoside C; 7, digitoxigenin; 8, -acetyldigoxin; 9, -acetyldigoxin;
10, lanatoside B; 11, gitoxin; 12, lanatoside A; 13, digitoxin.[19]
Sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để xác định digoxin trong thuốc
cũng đã được công bố bởi A. Jedlicka và các cộng sự. Digoxin sau khi được chiết
pha rắn được đưa vào phân tích với điều kiện: cột C18 (RP-18e, 5m, 125x4,0mm),
pha động là hỗn hợp của nước và acetonitrin với tỉ lệ H 2O/ACN = 72:28, phát hiện
o

chất ở bước sóng 118nm, thể tích bơm mẫu là 100l, nhiệt độ cột 50 C, tốc độ dòng
1,1ml/phút.[13]

11


1.2.2. Phương pháp quang phổ hồng ngoại
1.2.2.1.

Đại cương về phổ hồng ngoại

Vùng phổ hồng ngoại gần được phát hiện vào năm 1800 bởi William

Herschel. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành tổng hợp hữu cơ, các máy đo
quang phổ hồng ngoại càng trở nên thông dụng ở các phòng thí nghiệm cho mục
đích định dạng các vật liệu tinh khiết và cấu trúc của chúng, đã đóng góp rất nhiều
cho các công trình nghiên cứu về nông nghiệp, thực phẩm, dệt, polymer, xăng dầu,
dược phẩm…
Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật phân
tích khá hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp phổ
hồng ngoại vượt trội hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác đó là nó có
thể cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các tính toán hay
công đoạn chuẩn bị mẫu quá phức tạp.
1.2.2.2.

Các yếu tố ảnh hưởng tới tín hiệu đo phổ hồng ngoại

* Các yếu tố ảnh hưởng làm dịch chuyển tần số đặc trưng
Tần số dao động của các nguyên tử phụ thuộc vào cấu trúc của phân tử của
chất nghiên cứu và tương tác giữa các phân tử này. Ngoài ra còn có ảnh hưởng của
dung môi, nồng độ, nhiệt độ và trạng thái tập hợp tới vị trí của cực đại hấp thụ:
-

Dung môi: có ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của các cực đại hấp thụ tùy

theo độ phân cực của chúng
-

Nồng độ dung dịch: cũng gây ảnh hưởng đến sự thay đổi vị trí của đỉnh hấp

thụ, đặc biết đối với các chất có khả năng tạo cầu liên kết hidro như ancol, phenol,
amin…
-

Ảnh hưởng của nhóm thế: Các nhóm thế trong phân tử cũng gây ra ảnh

hưởng đến sự thay đổi vị trí đỉnh hấp thụ tùy theo nhóm thế gây hiệu ứng cảm ứng
hay liên hợp.

12


-

Phức chất: khi tạo phức, tần số hấp thụ đặc trưng của nhóm chức thay đổi

theo kim loại trung tâm và số phối trí. [9, 12, 13]
Ngoài ra H2O cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn tới phổ hấp thụ hồng ngoại,
do H2O hấp thụ mạnh trong vùng này nên các mẫu đem đo phổ phải đảm bảo không
chứa nước (mẫu phải bảo quản trong bình hút ẩm).
1.2.2.3.

Máy quang phổ hồng ngoại

Máy quang phổ hồng ngoại dùng để ghi phổ trong vùng từ 10000 cm
-1

-1

đến

-1

670 cm hoặc trong một vài trường hợp tới 200 cm . Máy quang phổ hồng ngoại
chuyển đổi Fourier (FTIR) sử dụng bức xạ đa sắc và tính toán phổ theo dải tần số từ
các dữ liệu gốc bằng chuyển đổi Fourier.
Thông thường phổ được xem là hàm số của độ truyền qua T: là tỷ số của
cường độ bức xạ truyền qua và cường độ bức xạ tới.
Độ hấp thụ ánh sáng (A) là logarit thập phân của nghịch đảo độ truyền qua. [2]

1.2.2.4.

Kỹ thuật đo phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại (IR) là một trong các kỹ thuật phân tích quan trọng. Một trong
các lợi thế vượt trội của nó là có thể phân tích được hầu hết các dạng vật chất: chất
lỏng, dung dịch, bột nhão, bột khô, phim, sợi, khí và các bề mặt…
Các kỹ thuật chụp gồm: truyền qua, phản xạ, tán xạ, phản xạ suy giảm toàn
phần trong đó phổ truyền qua hay được sử dụng nhiều nhất.
Phổ IR của các hợp chất có thể được ghi ở pha hơi, pha lỏng hay ở pha rắn.
Chuẩn bị mẫu
1. Pha hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ dài
10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua.
2.

Dạng màng chất lỏng: Giọt mẫu chất lỏng được nhỏ lên bề mặt một tấm cửa

số NaCl, lấy tấm cửa sổ NaCl còn lại xoa nhẹ để tạo lớp màng chất lỏng mỏng giữa

13


hai tấm cửa sổ đo. Đây là kỹ thuật ghi phổ đơn giản nhất, thường sử dụng cho chất

lỏng có độ nhớt cao và ít bay hơi.
3.

Dạng dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưa vào

cuvet đặc biệt có độ dài 0,1-1 mm và được làm bằng NaCl. Kỹ thuật thường sử
dụng cho các chất lỏng có độ nhớt thấp và dễ bay hơi.
4.

Ở trạng thái rắn: Đo mẫu dạng rắn có hai phương pháp đo:

Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi một
lớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy.
Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu với bột KBr, nghiền kỹ bằng cối mã
não, sau đó cho vào cối ép thành màng mỏng, đặt vào giá đỡ cuvet để đo trên máy.
Một vài yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chuẩn bị mẫu đo theo phương pháp
trộn KBr: nghiền không kỹ, trộn không đều, độ ẩm, các tạp chất trong môi trường
phân tích. [2, 9, 12, 13].
1.2.2.5.

Ứng dụng của phổ hồng ngoại

Ứng dụng của phổ hồng ngoại trong phân tích định tính để phân loại, nhận
dạng mẫu, ứng dụng trong hóa học, thực phẩm, sinh học là quan trọng nhất.
Phương pháp phổ hồng ngoại có thể được ứng dụng trong phân tích định
lượng một chất trong dung dịch hay hỗn hợp. Cơ sở của phương pháp dựa trên
phương trình định luật Lamber – Beer biểu hiện mối quan hệ giữa sự hấp thụ ánh
sáng và nồng độ chất:
Log

=

Đối với trường hợp đo trong dung dịch: theo phương trình trên, ở một bước
sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỉ lệ với nồng độ C và chiều dày cuvet d và bản
chất của mẫu đo. Như vậy, khi phân tích một chất, đo ở một bước sóng xác định với
một cuvet có chiều dày d đã biết thì độ hấp thụ quang A chỉ còn tỉ lệ với nồng độ C
của mẫu chất.

14


Phương pháp phân tích định lượng bằng phổ hồng ngoại cũng thực hiện theo
cách lập đường chuẩn. Pha một loạt mẫu với nồng độ khác nhau của chất cần xác
định ở dạng tinh khiết rồi đo giá trị A của chúng, sau đó vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ
thuộc A vào nồng độ C. Sau khi thiết lập được đồ thị đường chuẩn, cần chú ý là
đường chuẩn này chỉ sử dụng được trong phạm vi giới hạn nồng độ ứng với đoạn
đường thẳng của đường biểu diễn, bởi vì trong giới hạn này mới có sự tuyến tính
giữa độ hấp thụ quang A và nồng độ dung dịch. [9]
Ứng dụng phổ hồng ngoại trong phân tích dược phẩm
Phổ hồng ngoại gần chứa thông tin về cả các tính chất chất hóa học và các tính
chất vật lý của mẫu đo. Do đó, các thông số dược phẩm khác nhau có thể được phân
tích bằng NIRS như độ cứng, kích thước hạt, lực nén, độ ẩm...Theo tài liệu tham
khảo, việc phân tích định lượng bằng NIR đầu tiên là việc xác định độ ẩm của mẫu
nhờ vào dải phổ đặc trưng cho các liên kết trong phân tử của nước hấp thụ tại bước
sóng 1450 và 1940 nm.
-

Kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan sát thấy

dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài. Năm 1985, tác

giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ tại bất kì
bước sóng nào với kích thước hạt.
-

Độ ẩm: Do nước gây ra hệ số suy giảm lớn nhất trong phổ NIR của các vật

liệu dược phẩm nên nó cũng là một trong những chất được đo đạc nhiều nhất bằng
NIR. Derksen và đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định nước thông qua độ ẩm
của mẫu với nhiều loại hoạt chất.
-

Độ cứng: Một trong các ứng dụng về quản lý chất lượng của phổ NIR đó là

xác định độ cứng của viên thuốc mà không cần phá mẫu. Sự thay đổi về độ cứng
của thuốc có thể được quan sát dưới dạng đường phổ nền dốc dịch chuyển khi độ
cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên. Điều này rõ rệt hơn ở các bước sóng dài
bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng.

15


-

Xác định thành phần của hoạt chất trong các viên nén và viên con nhộng,

Xác định liều lượng nguyên vẹn trong thuốc… [9, 12, 13, 27]
L.K. Hearn và các cộng sự cũng đã sử dụng phổ hồng ngoại gần để xác định
hàm lượng glycoside có trong lá cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana). Đã làm thí nghiệm
33 mẫu lá được thu hoạch ở nhiều thời điểm khác nhau trong năm, sau đó cắt nhỏ,
0

sấy khô trong 48h ở nhiệt độ 80 C và đem đi đo phổ hồng ngoại gần. Kết quả thu
được hàm lượng glycoside chiếm từ 4,3 đến 11,1 % hàm lượng lá khô. [21]
1.3.

Thuật toán hồi quy đa biến xác định đồng thời các chất trong cùng hỗn hợp

1.3.1. Nguyên tắc phương pháp hồi quy đa biến
Phương pháp hồi quy đa biến là một mảng quan trọng trong Chemometric,
hiện nay được dùng phổ biến trong các phòng thí nghiệm hóa học, phương pháp này
giúp giải quyết các bài toán xác định đồng thời nhiều cấu tử có mặt trong hỗn hợp
mà không cần tách loại ra trước khi phân tích.
Thuật toán này đã được ứng dụng rộng rãi để giải quyết nhiều bài toán định
dạng phức tạp. Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy dung dịch chuẩn có mặt tất cả
các cấu tử cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x),
đo tín hiệu phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc
y và thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến
độc lập x (nồng độ các chất trong hỗn hợp). Dựa trên mô hình này có thể tìm được
nồng độ của các cấu tử trong cùng dung dịch định phân khi có tín hiệu phân tích của
dung dịch đó.
Nếu các cấu tử có mặt trong hỗn hợp cho tín hiệu đo có tính chất cộng tính thì
có thể sử dụng phương pháp hồi qui đa biến tuyến tính thông thường (multiple
linear regression- MLR) như phương pháp bình phương tối thiểu thông thường
hoặc hiệu quả hơn như bình phương tối thiểu từng phần, phương pháp hồi qui cấu tử
chính, …. Nhưng nếu trong hỗn hợp, các cấu tử có sự tương tác lẫn nhau làm mất
tính chất cộng tính ở tín hiệu đo thì phải sử dụng mô hình hồi qui đa biến phi tuyến
tính mà phổ biến là các phương pháp kết hợp với mạng nơron nhân tạo.
16