Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và người hiến bằng kỹ thuật PCR SSO để định hướng ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----***-----

LÊ XUÂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÒA HỢP HLA GIỮA
BỆNH NHÂN VÀ NGƢỜI HIẾN BẰNG KỸ THUẬT
PCR-SSO ĐỂ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TẾ BÀO GỐC
TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH THALASSEMIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI 12/2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----***-----

LÊ XUÂN THỊNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÒA HỢP HLA GIỮA
BỆNH NHÂN VÀ NGƢỜI HIẾN BẰNG KỸ THUẬT
PCR-SSO ĐỂ ĐỊNH HƢỚNG GHÉP TẾ BÀO GỐC
TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH THALASSEMIA
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. BS Trần Ngọc Quế
2. PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

HÀ NỘI 12/2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được nhiều sự chỉ
bảo tận tình, sự giúp đỡ to lớn đầy trách nhiệm và tình cảm từ các Thầy, Cô, đồng
nghiệp, bạn bè và gia đình, đặc biệt những bệnh nhân, những người hiến tế bào gốc
máu dây rốn đã cho em những số liệu quý giá. Với tình cảm và sự biết ơn sâu sắc,
em xin kính gửi lời cảm ơn trân trọng đến:
- Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, khoa Sinh học và Bộ môn Di
truyền học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
- Ban Giám đốc Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian công tác và học tập.
Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Hồng Vân, Trưởng Bộ môn Di truyền học cùng toàn thể các Thầy, Cô trong bộ môn,
những người Thầy nhiệt huyết đã dành cho em những tình cảm tốt đẹp, những kiến
thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.
Em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS.BS. Trần Ngọc
Quế, Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc, Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương;
người Thầy, người Lãnh đạo luôn bên cạnh em, động viên em những lúc khó khăn
hết lòng giúp đỡ, chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian công tác,
học tập và làm luận văn.
Em xin trân trọng cảm ơn tập thể Ngân hàng Tế bào gốc, khoa Di truyền sinh học
phân tử, Trung tâm Thalassemia và nhiều khoa phòng khác đã luôn tạo điều kiện cho
em trong quá trình công tác, học tập cũng như quá trình hoàn thành luận văn.

Em xin trân trọng cảm ơn các bạn học viên K24 về sự gắn bó, chia sẻ với em

những khó khăn vất vả và những thành công trong học tập.
Em xin trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những bệnh nhân,
người hiến tế bào gốc đã cho em những số liệu quý giá, nhờ đó mà bản luận văn của
em được hoàn thành.
Nhân dịp này, em kính trọng tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cha, Mẹ, Vợ, Con và
các Anh, các Chị, các Em và những người thân trong gia đình, đã giành tất cả để em
học tập, phấn đấu và trưởng thành trong cuộc sống và sự nghiệp.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè đã dành cho em nhiều sự giúp đỡ quý báu.
Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2017
Học viên
Lê Xuân Thịnh


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU............................
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................
1.1.Kháng nguyên hệ bạch cầu ngƣời .....................
1.1.1. Khái niệm human leukocyte antigen .......................................................
1.1.2.Danh pháp .........
1.1.3.Hệ thống HLA ...
1.1.4. Chức năng của HLA ................................................................................
1.1.5. Phân bố gen HLA trong cơ thể ................................................................
1.1.6. Kỹ thuật định danh HLA .........................................................................

1.2.Tế bào gốc ..........................................................
1.2.1. Khái niệm tế bào gốc .............................................................................
1.2.2. Tế bào gốc huy động ra máu ngoại vi ...................................................
1.2.3. Tế bào gốc từ máu dây rốn ....................................................................

1.3.Ghép tế bào gốc trong điều trị bệnh thalassem
1.3.1.Bệnh thalassemia
1.3.2. Ghép tế bào gốc .....................................................................................

1.4.Nghiên cứu hòa hợp HLA ở Việt Nam và trên
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................
2.1.Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị ...........................
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................
2.1.2.Hóa chất ............
2.1.3.Thiết bị ..............

2.3.1.
2.3.2.
2.3.3.
2.3.4.
2.3.5.

2.2.Địa điểm và thời gian nghiên cứu .....................
2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................
Thiết kế nghiên cứu ...............................................................................
Các bước tiến hành nghiên cứu .............................................................
Chỉ số nghiên cứu ..................................................................................
Xử lý số liệu ..........................................................................................
Đạo đức nghiên cứu ...............................................................................

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................
3.1.Đặc điểm chung của đối tƣợng nghiên cứu .....
3.1.1.Đặc điểm đối tượ

3.1.2. Đặc điểm đối tượng người hiến cùng huyết thống...............................29
3.1.3. Đặc điểm đối tượng người hiến không cùng huyết thống.....................30
3.2. Kết quả xác định HLA của bệnh nhân, ngƣời hiến..................................32
3.2.1 Kết quả xác định các alen của locus HLA-A........................................ 32
3.2.2 Kết quả xác định các alen của locus HLA-B........................................ 35
3.2.3 Kết quả xác định các alen của locus HLA-DRB1................................37
3.3. Nhận xét về mức độ hòa hợp HLA bệnh nhân và ngƣời hiến.................40
3.3.1. Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân có người hiến cùng huyết thống.......40
3.3.2. Kết quả tìm kiếm cho bệnh nhân không có người hiến cùng huyết thống
từ Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng.............................................................. 42
KẾT LUẬN............................................................................................................. 45
KIẾN NGHỊ........................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 47
Tài liệu Tiếng Việt.................................................................................................. 47
Tài liệu Tiếng Anh.................................................................................................. 48
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được........................................................................................ 5
Bảng 1.2: Một số đặc điểm và phân bố gen HLA trong cơ thể........................................... 9
Bảng 3.1: Đặc điểm của bệnh nhân có chỉ định ghép.............................................. 27
Bảng 3.2: Đặc điểm của người hiến cùng huyết thống............................................ 29
Bảng 3.3: Kết quả định lượng của ADN tách từ mẫu tế bào ối................................30
Bảng 3.4: Đặc điểm chung của đơn vị MDR........................................................... 30
Bảng 3.5: Đặc điểm thể tích và tế bào có nhân của đơn vị MDR............................31
Bảng 3.6: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của bệnh nhân............................................... 32
Bảng 3.7: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của người hiến.............................................. 33
Bảng 3.8: Tỷ lệ gặp các alen HLA-A của máu dây rốn cộng đồng..........................33
Bảng 3.9: Tỷ lệ % một số alen HLA-A hay gặp ở một số quần thể.........................34

Bảng 3.10: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của bệnh nhân............................................. 35
Bảng 3.11: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của người hiến............................................ 35
Bảng 3.12: Tỷ lệ gặp các alen HLA-B của máu dây rốn cộng đồng........................36
Bảng 3.13: Tỷ lệ % một số alen HLA-B hay gặp ở một số quần thể.......................36
Bảng 3.14: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của bệnh nhân..................................... 37
Bảng 3.15: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của người hiến..................................... 38
Bảng 3.16: Tỷ lệ gặp các alen HLA-DRB1 của máu dây rốn cộng đồng................38
Bảng 3.17: Tỷ lệ % một số alen HLA-DRB1 hay gặp ở một số quần thể................39
Bảng 3.18: Kết quả tìm kiếm giữa bệnh nhân và người hiến cùng huyết thống......41
Bảng 3.19: Số mẫu máu dây rốn cùng huyết thống được lưu trữ............................41
Bảng 3.20: Tỷ lệ người hiến cùng huyết thống hòa hợp HLA của bệnh nhân.........42
Bảng 3.21: Tỷ lệ tìm thấy đơn vị MDR hòa hợp HLA............................................ 42
Bảng 3.22: Số mẫu máu dây rốn trung bình hòa hợp HLA tìm kiếm được..............43
Bảng 3.23: Số mẫu máu dây rốn hòa hợp HLA đủ liều tế bào tối thiểu...................43


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc tên HLA...................................................................................... 4
Hình 1.2. Bản đồ vùng gen mã hoá HLA.................................................................. 5
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II......................................................... 6
Hình 1.4. Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể.................................................... 9
Hình 1.5. Kỹ thuật PCR-SSP................................................................................... 10
Hình 1.6. Kỹ thuật PCR-SSO.................................................................................. 11
Hình 1.7. Hạt nhựa được nhuộm với chất màu huỳnh quang..................................13
Hình 1.8. Hệ thống đọc Luminex............................................................................ 13
Hình 1.9. Hệ thống cảm biến Luminex................................................................... 14
Hình 1.10. Kỹ thuật giải trình tự dựa trên điện di.................................................... 14
Hình 1.11. Phần mềm phân tích kết quả xác định alen của HLA............................23
Hình 1.12. Sơ đồ các bước nghiên cứu.................................................................... 24
Hình 1.13. Biểu đồ đặc điểm dân tộc...................................................................... 28

DANH MỤC CHỮ

ABO

MCV

CD

MDR

CDC

MDRCĐ
NST

DMSO

PCR

G-CSF

SBT
SC

GVHD

SSO

Hb
HH-TM TW

SSP

HLA

TBCN

HST

TBG

KN-KT

TSC

MCH

VIẾT TẮT


Hệ nhóm máu ABO

Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu người)

Cluster of
differrenciation (Cụm
kháng nguyên biệt hóa)

Huyết sắc tố

Complement dependent
cytotoxicity
(Kỹ thuật vi độc tế bào
phụ thuộc bổ thể)
Dimethyl sulfoxide
Granulocyte colony stimulating factor
(Yếu tố phát triển dòng
bạch cầu hạt)
Graft-versus-host
disease (Bệnh ghép
chống chủ)
Hemoglobin
Huyết học - Truyền
máu Trung ương

Kháng nguyên - kháng thể
Mean corpuscular hemoglobin
(Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu)
Mean corpuscular volume (Thể tích trung bình hồng cầu)
Máu dây rốn
Máu dây rốn cộng đồng
Nhiễm sắc thể
Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
Sequencing based typing (Định nhóm dựa trên trình tự)
Stem cells (Tế bào gốc)
Sequence specific oligo - nucleotide
(Sợi oligonucleotid đặc hiệu trình tự)
Sequence - specific primer (Mồi đặc hiệu trình tự)
Tế bào có nhân
Tế bào gốc

Totipotent stem cells (Tế bào gốc toàn năng)


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh
học

MỞ ĐẦU
Thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng
bởi sự suy giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi globin và là bệnh di truyền phổ biến nhất
Đông Nam Á và trên thế giới [14]. Theo ước tính của Liên đoàn Thalassemia Thế
giới, có khoảng 7% dân số mang gen bệnh thalassemia và hàng năm có khoảng
300.000 đến 400.000 trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia mức độ nặng [58]. Ở Thái Lan
tỷ lệ người mang gen α-thalassemia là 14%, β-thalassemia từ 3-9%, HbE là 13%.
Với 1% dân số mang gen thì hàng năm có khoảng 12.000 trẻ sinh ra mắc căn bệnh
này [68]. Cũng theo ước tính trên, tại Việt Nam có khoảng 10% dân số mang gen
bệnh này và mỗi năm có 20.000 đứa trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia [16]. Người
bệnh thalassemia phải điều trị thường xuyên bằng truyền máu, thải sắt và điều trị
các biến chứng. Chi phí điều trị bệnh thalassemia lớn làm kinh tế gia đình suy giảm,
bệnh nhân trở thành gánh nặng cho xã hội và ảnh hưởng tới chất lượng giống nòi.
Hiện nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, tiến bộ của các phương pháp
điều trị giúp cải thiện sức khỏe cho bệnh nhân thalassemia. G ện nay đượ
halassemia [76]. Đặc biệt số ca
ghép tế bào gốc lấy nguồn từ anh/chị em ruột ngày càng tăng và cho kết quả cải thiện đáng kể trong ba thập kỷ qua [75, 76]. Việc
ghép thành công tế bào gốc đòi hỏi cần phải có nguồn cho tế bào gốc hòa hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA-Human
leukocyte antigen). Các locus thường sử dụng để xác định sự hòa hợp trong ghép tế bào gốc đồng loài bao gồm các locus quy
định HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 và HLA-DQB1, trong đó yêu cầu hòa hợp HLA đối với nguồn tế bào gốc là máu dây
rốn chỉ cần tối thiểu 4/6 locus HLA-A, HLA-B, HLA-DR ở độ phân giải cao [39]. Khả năng hòa hợp HLA của người nhận với
người cho cùng huyết thống cao hơn so với người trong cộng đồng [75, 76]. Trong gia đình càng có nhiều ngườ

ợc người cho hòa hợp

ỷ lệ ghép thành công càng lớ Tuy
nhiên, đối với những trường

hợp bệnh nhân không có anh/chị/em ruột hòa hợp HLA để hiến tế bào gốc thì cơ hội


Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
1


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh
học

điều trị ghép gần như không còn. Để giải quyết khó khăn này, nhiều trung tâm lớn
trên Thế giới cũng như tại Việt Nam, Ngân hàng Tế bào gốc của Viện Huyết học Truyền máu Trung ương đã triển khai xây dựng Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng
[11]. Nguồn tế bào gốc này có một số ưu điểm nổi bật như sẵn có, thu thập dễ dàng,
không ảnh hưởng đến sức khỏe của người hiến và đặc biệt là yêu cầu về hòa hợp HLA
giữa người hiến và bệnh nhân không cao. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài: “Nghiên cứu xác định hòa hợp HLA giữa bệnh nhân và ngƣời hiến bằng kỹ
thuật PCR-SSO để định hƣớng ghép tế bào gốc trong điều trị

bệnh thalassemia” với 2 mục tiêu:
1. Xác định được HLA của bệnh nhân thalassemia và người hiến tế bào gốc
bằng kỹ thuật RCR-SSO.
2. Đánh giá được mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân thalassemia và người
hiến để định hướng ghép tế bào gốc.
Nội dung nghiên cứu gồm:
‐ Xác định HLA của bệnh nhân thalassemia có chỉ định ghép tế bào gốc và
người hiến cùng huyết thống;

‐ Đánh giá mức độ hòa hợp HLA của bệnh nhân có người hiến cùng huyết
thống với người hiến và của bệnh nhân không có người hiến cùng huyết
thống với các đơn vị máu dây rốn cộng đồng.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
2


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh
học

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kháng nguyên hệ bạch cầu ngƣời
1.1.1. Khái niệm human leukocyte antigen
HLA (Human Leucocyte Antigen) là tên gọi tắt quốc tế của kháng nguyên
bạch cầu người. Việc khám phá ra phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (Major
Histocompatibility Complex - MHC) và vai trò của nó trong thải ghép, đáp ứng
miễn dịch và cơ sở di truyền bệnh dẫn đến sự ra đời của một lĩnh vực khoa học mới
là di truyền miễn dịch [60]. Đây là lĩnh vực quan trọng không chỉ trong nghiên cứu
y sinh học cơ bản mà còn trong y học lâm sàng. Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu ở
người là hệ thống kháng nguyên bạch cầu người được quy định bởi vùng gen nằm
trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6 (6p21) [61, 62].
HLA lần đầu tiên được phát hiện trên bề mặt tế bào bạch cầu nhờ vai trò trong
thải ghép [71]. Hiện nay khoa học đã chứng minh các protein của hệ thống gen HLA
hiện diện trên bề mặt tế bào của đa số động vật có xương sống, kháng nguyên HLA
tham gia vào nhiều công đoạn trong nhận diện miễn dịch bao gồm tương tác giữa
các tế bào lympho khác nhau cũng như giữa các tế bào lympho với các tế bào trình
diện kháng nguyên [60]. Do vậy, việc xác định các kháng nguyên HLA hay định
nhóm HLA (HLA typing) còn được gọi là định nhóm mô (tissue typing) [56].
1.1.2. Danh pháp

Theo Marsh SG và cộng sự (2010) danh pháp HLA như sau [69]:
Tên gen + dấu * + mã số alen + dấu : + mã số protein HLA riêng + dấu : + mã
số ADN tương ứng trong vùng mã hóa + dấu : + mã số ADN ngoài vùng mã hóa +
Hậu tố:
- Hậu tố N: alen không được biểu hiện (Null);
- Hậu tố L: alen của protein biểu hiện ở bề mặt tế bào thấp hơn bình thường (Low);

- Hậu tố S: alen của protein tan nhanh nhưng không biểu hiện trên bề mặt tế
bào (Secret);

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
3


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

- Hậu tố C: alen của protein ở trong tế bào chất chứ không ở bề mặt tế bào
(Cytoplasm);

- Hậu tố A: khi nghi ngờ protein có được biểu hiện không (Aberrant);
- Hậu tố Q: alen có đột biến trước đó đã được chứng minh là có ảnh hưởng
đến việc biểu hiện trên tế bào nhưng chưa được xác nhận vị trí và vẫn còn nghi
vấn (Questionable).

Hình 1.1. Cấu trúc tên HLA [69]
Ví dụ: Khi viết alen HLA-A*11:01 thì có nghĩa là: locus HLA-A, alen 11, protetin 01.

1.1.3. Hệ thống HLA
Dựa trên cấu trúc và chức năng, các kháng nguyên HLA được chia thành hai
lớp: HLA lớp I và HLA lớp II (Hình1.2). Kích thước tổng thể của hệ thống gen HLA

là khoảng 3,5 triệu cặp bazơ niơ [62]. Trong đó, vùng gen HLA lớp I và lớp II
chiếm khoảng 1/3 mỗi loại. Phần còn lại là vùng gen HLA lớp III mã hóa bổ thể,
hormon, xử lý peptide nội bào và một số chức năng khác. Do đó, vùng gen HLA lớp
III không thực sự là một phần của hệ thống HLA, nhưng chúng nằm trong khu vực
HLA và có liên quan đến các chức năng của kháng nguyên HLA hoặc có cơ chế
kiểm soát tương tự như các gen HLA [60].
Cho tới nay, người ta đã biết khoảng 17330 alen của hệ thống HLA, các alen
này tạo ra kháng nguyên và phát hiện được bằng kháng thể đặc hiệu.

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
4


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

Bảng 1.1: Số alen HLA phát hiện được (2017)
+ Loci A có 3997 alen
+ Loci B có 4859 alen
+ Loci C có 3605 alen
Hệ thống HLA chia làm 3 lớp: Lớp I, II, III (Class I, Class II, Class III).
Class I: Có các nhóm (loci): ký hiệu là A, B, C, E, F, G, J… trong đó A, B, C
có vai trò quan trọng trong chức năng của lớp I.
Class II: Có các nhóm DR, DQ, DN, DN, DP. Trong đó, DR, DQ có vai trò
quan trọng trong chức năng của lớp II.
Class III: Vùng của các thành phần tế bào và bổ thể: C2, C4, Bf, TNF α, TNF β.

HLA lớp I

Hình 1.2. Bản đồ vùng gen mã hoá HLA [69]

HLA lớp I gồm 3 locus chính là HLA-A, B, C, mã hóa cho các glycopeptide,
chúng biểu hiện trên bề mặt của hầu hết các tế bào có nhân của cơ thể. Ngoài ra,
chúng được tìm thấy ở dạng hòa tan trong huyết tương và được hấp phụ lên bề mặt
của tiểu cầu. Hồng cầu cũng hấp phụ kháng nguyên HLA lớp I ở mức độ khác nhau
tùy thuộc vào đặc trưng (ví dụ như HLA-B7, A28 và B57 được nhận biết trên hồng
cầu còn được gọi là kháng nguyên "Bg"). Các nghiên cứu miễn dịch học chỉ ra rằng
HLA-B có tính đa hình cao nhất và cũng là locus HLA lớp I có vai trò quan trọng

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
5


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

nhất, tiếp theo là HLA-A và sau đó HLA-C. Ngoài ra, HLA lớp I còn có các locus
khác như HLA-E, F, G, H, J, K và L nhưng hầu hết trong số này không có vai trò
trong "trình diện peptide" [56].
Các kháng nguyên HLA lớp I bao gồm một chuỗi nặng glycopeptide xuyên
màng (45 kDa) với ba domain (α1, α2, α3), liên kết không đồng hóa trị với một
chuỗi nhẹ ngoại màng β2-microglobulin (12 kDa, mã hóa bởi một gen ngoài hệ
thống HLA, không có tính đa hình) đóng một vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ
cấu trúc của chuỗi nặng. Các phân tử HLA lớp I được tổng hợp bên trong tế bào và
cuối cùng định vị trên bề mặt tế bào với một phần ở lớp lipid kép của màng tế bào
và có một phần đuôi ngắn nằm trong tế bào chất [71].
Về mặt cấu trúc không gian, phân tử HLA lớp I tạo ra một khe có thể chứa được
một peptide dài 9 axit amin. Do sự đa hình của các locus lớp I, nhất là vùng mã hóa
domain α1 và α2, số peptide có thể tổ hợp được rất đa dạng lên tới 10

11

[60].

Phần ngoài màng

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử HLA lớp I và lớp II [69]
Trong thực tế, nếu một tế bào bị nhiễm virus, các protein trong tế bào sẽ “cắt xén”
virus thành các peptide nhỏ, sau đó những peptide được gắn vào khe liên kết của các
phân tử HLA lớp I. Vai trò của các phân tử HLA lớp I là trình diện những mảnh peptide
(kháng nguyên) này trên bề mặt tế bào nhiễm cho tế bào T CD8 trong các

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
6


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

phản ứng miễn dịch (nhờ domain α3 tương tác với CD8). Các thụ thể trên tế bào T
CD8 sẽ nhận diện phức hợp kháng nguyên - HLA lớp I, tạo ra tín hiệu đầu tiên để
hoạt hoá các tế bào. Ngoài ra phân tử CD8 và các cặp phân tử bám dính khác trên
hai tế bào này sẽ hoàn tất mối tương tác. Kết quả là tế bào T CD8 sẽ được hoạt hoá,
tiết ra chất Perforin gây ly giải tế bào nhiễm [60]. Vai trò quan trọng như vậy của
HLA lớp I là lý do chúng cần có mặt trên tất cả các tế bào [56].

HLA lớp II
HLA lớp II gồm HLA-DR, DQ, DP, cũng có bản chất glycopeptide. Sự phân
bố của kháng nguyên HLA lớp II được giới hạn trên các tế bào "có thẩm quyền
miễn dịch", bao gồm lympho B, đại thực bào, tế bào đuôi gai, các tế bào nội mô và
lympho T đã hoạt hóa. Trên các tế bào này, HLA lớp II không được biểu hiện
thường xuyên mà được kích thích bởi các cytokine như interferon và trong ghép,
điều này có liên quan đến tình trạng thải ghép cấp tính [60].

Phân tử HLA lớp II gồm hai chuỗi xuyên màng α (có hai domain α1, α2) và β
(có hai domain β1, β2), đều được mã hóa bởi gen trong hệ thống HLA. Khối lượng
chuỗi α khoảng 33-35 kDa, chuỗi β khoảng 26-28 kDa [60]. Tương tự như phân tử
HLA lớp I, cấu trúc không gian của HLA lớp II tạo ra một khe có thể liên kết với
một peptide kích thước 12-24 axit amin. Các tế bào T liên kết với các phân tử HLA
lớp II (nhờ domain β2), là những tế bào T CD4. Vi khuẩn, protein ngoại lai… được
các tế bào lympho B, đại thực bào, tế bào đuôi gai thu tóm và xử lý thành các
peptide kháng nguyên. Phân tử HLA lớp II liên kết với peptide kháng nguyên này
tạo phức hệ bộc lộ trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên. Tế bào T CD4
nhận diện kháng nguyên thông qua thụ thể tế bào T tạo ra tín hiệu đầu tiên để hoạt
hóa các tế bào. Ngoài ra phân tử CD4 và các cặp phân tử bám dính trên cả hai tế bào
sẽ hoàn tất mối tương tác. Cuối cùng tế bào T CD4 hoạt hoá sản xuất các cytokin để
tự kích hoạt và kích hoạt các tế bào hiệu ứng miễn dịch khác thực hiện chức năng
tiêu diệt kháng nguyên [71].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
7


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh
học

1.1.4. Chức năng của HLA
HLA lớp I có chức năng hoạt hóa tế bào lympho T gây độc. Trực tiếp tham gia
vào phản ứng trung gian tế bào, tiêu diệt tế bào đích có kháng nguyên lạ đặc hiệu.
HLA lớp I có tác dụng tiêu diệt tế bào mang virus khi có peptid là virus trên bề mặt
tế bào và tiêu diệt tế bào ung thư. HLA lớp I dùng để nhận diện kháng nguy
ế bào của cơ thể bị biến đổi.
HLA lớp II tham gia hoạt hóa tế bào trình diện kháng nguyên. Các kháng
nguyên phân tử lớn từ bên ngoài vào cơ thể, đại thực bào ăn kháng nguyên này, rồi

xử lý kháng nguyên thành các mảnh nhỏ, các nhóm quyết định kháng nguyên sẽ
chuyển lên màng tế bào, lắng đọng trên màng tế bào thực bào. Thực bào lúc này trở
thành tế bào trình diện kháng nguyên. Tiếp theo tế bào trình diện kháng nguyên sẽ
chuyển thông tin kháng nguyên cho tế bào miễn dịch (lympho T, B). HLA lớp II
đóng vai trò quan trọ ạt hóa đại thực bào trong quá trình trình diện kháng nguyên,
đồng thời tạo ra các cytokin và khuếch đại phản ứng miễn dịch của cơ thể.
HLA lớp I và II hợp tác trong quá trình miễn dịch bao gồm cả

ễn

dịch và phản ứng kháng nguyên-kháng thể của miễn dịch tế bào (HLA lớp I với TCD8) và miễn dịch thể dịch (HLA lớp II với T-CD4 và lympho B). Thiếu HLA tế
bào miễn dịch sẽ không nhận biết được kháng nguyên, do đó khi ghép cơ quan tổ
chức việc lựa chọn người cho tương đồng hệ HLA nhằm mục đích giảm nhận biết
kháng nguyên lạ của tế bào miễn dịch thông qua hệ HLA [7].
HLA có ý nghĩa quan trọng trong ghép tế bào gốc và ghép tạng, hệ thống
kháng nguyên bạch cầu HLA đóng vai trò rất quan trọng để tìm người cho hòa hợp
HLA. Sự không hòa hợp hoàn toàn sẽ gây ra hiện tượng thải ghép sớm và bệnh
ghép chống chủ càng nhiều, mức độ hòa hợp HLA tối thiểu là 4/6 cơ thể có thể chấp
nhận được, mức độ hòa hợp HLA càng ít thì nguy cơ đào thải ghép càng cao và
ngược lại [51].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
8


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

1.1.5. Phân bố gen HLA trong cơ thể
Bảng 1.2: Một số đặc điểm và phân bố gen HLA trong cơ thể.
Antigen

Phân bố trên các
tế bào

Cấu trúc
Quan hệ phân tử
với các tế bào
1.1.6. Kỹ thuật định danh HLA
Từ khi bắt đầu những ca ghép tủy (tế bào gốc: TBG) đồng loài đầu tiên, người
ta đã xác định sự hòa hợp HLA của người cho và người nhận [29]. Các kỹ thuật đã
và đang được sử dụng để định nhóm HLA bao gồm:



Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể (complement dependent cytotoxicity test:

CDC).

Hình 1.4. Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể [78]


Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
9


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh
học

Đây là kỹ thuật đầu tiên định nhóm HLA được thực hiện từ những năm 1980
[78]. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý cơ bản của miễn dịch: sử dụng các kháng thể đơn

dòng đặc hiệu với nhóm HLA và cho thêm vào đó bổ thể nên kỹ thuật này được gọi với
tên vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể (complement dependent cytotoxicity-CDC).

Các tế bào có mang kháng nguyên HLA tương ứng với kháng thể đặc hiệu với
sự hiện diện của bổ thể. Tế bào này sẽ bị gây độc và chết do sự hình thành phức hợp
tấn công màng của bổ thể gắn vào kháng thể tương ứng. Từ đó, ta có thể suy ra tế
bào mang nhóm kháng nguyên nào. Các kỹ thuật thuộc nhóm huyết thanh thường
chỉ cho kết quả tốt với định danh HLA nhóm I và dưới nhóm DR ở lớp II, còn khó
khăn hơn với DQ. Kỹ thuật này về cơ bản chỉ có thể xác định được nhóm HLA ở độ
phân giải thấp với các protein chính đại diện cho alen HLA (ví dụ HLA-A*02).



primer).

Kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi đặc hiệu - SSP (sequence - specific

Hình 1.5. Kỹ thuật PCR-SSP [81]
Kỹ thuật PCR-SSP là kỹ thuật sử dụng các cặp mồi đặc hiệu với các gen cần
quan tâm, thông qua phản ứng PCR để khuếch đại các đoạn gen này và sau đó xác
định sự có mặt của các đoạn gen đó thông qua điện di tren gel agarose [34, 81].
Kỹ thuật này được ứng dụng khá rộng rãi trong các trường hợp xác định hòa
hợp ghép TBG tạo máu đồng loại với người cho cùng huyết thống, ghép tạng. Tuy

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017


10

Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

nhiên một hạn chế của kỹ thuật là số lượng alen HLA phân tích không nhiều, do đó
thường được sử dụng định nhóm HLA ở độ phân giải thấp [34].



Kỹ thuật PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu - SSO (sequence specific oligo nucleotide).

Hình 1.6. Kỹ thuật PCR-SSO [81]
Cùng với sự ra đời của kỹ thuật Luminex với khả năng xử lý số lượng mẫu
lớn, kỹ thuật PCR-SSO đã giúp cải thiện được đáng kể tính chính xác cũng như cho
kết quả định nhóm HLA ở độ phân giải tốt hơn so với kỹ thuật PCR-SSP [29]. Về
nguyên lý, kỹ thuật này gồm các bước như sau:
DNA của mẫu được tách và ủ đoạn mồi đặc hiệu tương ứng với các gen HLA;
sử dụng PCR để khuếch đại các gen này; sản phẩm PCR sau đó được ủ với các hạt
nhựa đặc biệt. Trên các hạt nhựa này có gắn các đoạn đầu dò DNA đặc hiệu với
HLA ở độ phân giải cao đã biết và đồng thời mỗi loại hạt còn được mã hóa riêng
bằng màu laser; sau khi lai, tiến hành chạy các hạt nhựa này trên máy đọc để xác
định các hạt nhựa có gắn với sản phẩm PCR; thông qua mã màu để xác định tên hạt
nhựa nào có gắn sản phẩm PCR, qua đó biết được tên đầu dò DNA gắn trên hạt
nhựa đó và tìm ra HLA của mẫu đó.
Nhờ số lượng hạt nhựa có thể mã hóa tối đa lên đến tối đa 100 loại khác nhau,
đồng thời số lượng đầu dò DNA gắn lên hạt rất nhiều nên kỹ thuật PCR-SSO đã giải

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
11


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học

quyết được khó khăn của PCR-SSP, đó là phân tích được nhiều gen HLA hơn và độ
phân giải được nâng cao hơn.Thường kết quả định nhóm HLA của xét nghiệm này
có độ phân giải từ trung bình đến cao với mức chi tiết từ 4 chữ số trở lên (ví dụ:
A*02:03) so với độ phân giải thấp cho kết quả 2 chữ số của các xét nghiệm khác
như HLA-SSP (ví dụ A*02). Với kết quả độ phân giải ở mức trung bình, xét nghiệm
này là đủ để áp dụng cho việc tìm kiếm người cho có nguồn tế bào gốc đòi hỏi mức
độ hòa hợp vừa phải như máu dây rốn.
Hệ thống Luminex là một hệ thống phân tích dựa trên nguyên lý Flow
cytometry được thiết kế để đáp ứng nhu cầu của mọi labo nghiên cứu. Hệ thống cho
phép thực hiện tới 100 phân tích trong một giếng đơn và với lượng mẫu cần dùng
rất nhỏ.
Hệ thống Luminex là sự kết hợp của 3 công nghệ xMAP then chốt. Thứ nhất
là hệ thống vi hạt xMAP, là các hạt nhựa polystyren 5.6 micron, được nhuộm huỳnh
quang và hoạt động với vai trò là chất chỉ thị cũng như là bề mặt cứng (giá đỡ) để
thực hiện xét nghiệm. Thứ 2 là thiết bị Flow cytometry, còn gọi là máy phân tích
Luminex, có tích hợp các thành phần để nhận biết xMAP như hệ thống laser, quang
học, dịch lỏng và bộ xử lý tín hiệu kỹ thuật số. Thứ ba là xét nghiệm thực hiện dựa
trên hạt nhựa đó [82].



Công nghệ xMAP

Công nghệ xMAP sử dụng hạt nhựa polystyren 5.6 micron được nhuộm sẵn
với chất màu huỳnh quang đỏ và hồng ngoại. Sử dụng những tỷ lệ khác nhau của 2
loại màu này ta sẽ tạo ra được khoảng 100 loại hạt nhựa. Mỗi hạt sẽ khác biệt với
phổ tín hiệu riêng tùy thuộc vào tỷ lệ trộn lẫn của 2 loại màu này. Vì mỗi hạt có một
tín hiệu khác nhau nên hệ thống phân tích xMAP có thể xác định được nguồn gốc
của nó. Do đó, có thể thực hiện tới khoảng 100 xét nghiệm cùng lúc [82].

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
12


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học



Hình 1.7. Hạt nhựa được nhuộm với chất màu huỳnh quang [82]
Hệ thống đọc Luminex
Hệ thống này bao gồm 2 đèn laser, hệ thống dịch lỏng, hệ thống xử lý tín

hiệu số để phân biệt được tới 100 loại hạt có mã hóa màu khác nhau, mỗi loại sẽ
dành cho một xét nghiệm. Hệ thống đọc là công cụ thiết yếu để thực hiện chức năng
của công nghệ này [82].



Hệ thống dịch

Máy đọc được các hạt riêng lẻ nhờ vào cơ chế của tế bào dòng chảy (Flow
cytometry). Hệ thống dịch lỏng sắp xếp các hạt di chuyển theo dòng đơn, trong
dòng chảy của dung dịch chạy máy sheath fluid đi qua buồng flow. Khi các hạt di
chuyển thành dòng đơn, mỗi hạt sẽ được phân tích một cách riêng lẻ dựa trên màu
huỳnh quang của hạt và màu huỳnh quang của xét nghiệm (màu nhuộm hạt và mật
độ huỳnh quang PE) [82].

Hình 1.8. Hệ thống đọc Luminex [82]

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
13


Lê Xuân Thịnh K24 - Sinh học



Laser:
Máy đọc sử dụng hệ thống đèn laser xanh 532 nm để phát hiện màu huỳnh

quang PE của xét nghiệm (streptavidin PE). Laser đỏ 635 nm dùng để phân biệt
màu của hạt và quyết định màu, vùng và phân biệt chúng [82].



Cảm biến

Máy đọc có 4 cảm biến, mỗi cảm biến dành cho một chiều của hệ thống
quang học. Các cảm biến được dùng để đo lường mật độ huỳnh quang của xét
nghiệm, để quyết định tên của hạt (1-100) và để phân biệt hạt đơn hay hạt bị ngưng
kết [82].



Hình 1.9. Hệ thống cảm biến Luminex [82]
Kỹ thuật giải trình tự (SBT-sequencing based typing).

Hình 1.10. Kỹ thuật giải trình tự dựa trên điện di [81]

Luận văn thạc sĩ khoa học 2015 - 2017
14