Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật và chitosan lên sự tạo chồi lan cattleya hybrid white​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA
SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ CHITOSAN LÊN
SỰ TẠO CHỒI LAN CATTLEYA HYBRID WHITE

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Thu Hương
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Gia Lộc

MSSV: 1515100012

Lớp: 15HSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên
cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Thị Thu Hương – giảng

viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện
trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí
nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm –
Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số
liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực.
Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian
lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

TP.HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Gia Lộc

i


LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công
Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành
Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến
thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được
tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án
mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin.
Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Thị Thu
Hương – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và
cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm
ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai.
Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại
học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi
nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức

đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn
Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án.
Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình
trong suốt quá trình làm đồ án.
Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp trồng người.
TP.Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện đồ án

Nguyễn Gia Lộc

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................................... ii
MỤC LỤC........................................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................. v
DANH MỤC BẢNG.............................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH............................................................................................... vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ........................................................................................ viii
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề........................................................................................................................................ 1
2. Mục đích của đề tài....................................................................................................................... 2
3. Nội dung của đề tài....................................................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu..................................................... 2
5. Kết quả đạt được của đề tài....................................................................................................... 3
6. Kết cấu của đồ án.......................................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 4

1.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy.................................................................................. 4
1.1.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô thực vật..................................................... 4
1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam......................................................... 4
1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro................................................................................... 5
1.1.4. Ưu và nhược điểm của quá trình nhân giống.............................................................. 6
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro........................................ 7
1.2. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.............................................. 9

iii


1.3. Sự phát sinh hình thái.............................................................................................................. 10
1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các yếu tố ảnh hưởng........................... 11
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng về chitosan............................................................. 16
1.6. Giới thiệu về cây Cattleya...................................................................................................... 18
1.6.1. Giới thiệu chung về cây phong lan................................................................................. 18
1.6.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và phát triển phong lan trên thế giới và ở
Việt Nam................................................................................................................................................ 25
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................... 32
2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài................................................................................ 32
2.1.1. Địa điểm thí nghiệm............................................................................................................. 32
2.1.2. Thời gian tiến hành thí nghiệm......................................................................................... 32
2.2. Vật liệu.......................................................................................................................................... 32
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................................... 32
2.2.2. Môi trường nuôi cấy............................................................................................................. 32
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm............................................................................................................ 33
2.3. Phương pháp................................................................................................................................ 33
2.4. Bố trí thí nghiệm........................................................................................................................ 34
2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định
của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White........................................................... 34

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố
định lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White..................................................................... 44
2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA,
NAA cố định lên sự tạo chồi Cattleya Hybrid White........................................................... 35
2.5. Chỉ tiêu theo dõi......................................................................................................................... 36
2.6. Thống kê và xử lý số liệu....................................................................................................... 37
iv


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 38
3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên
sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy............................................... 38
3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên
sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy............................................... 45
3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA,
NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy............................51
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................... 58
4.1.Kết luận.......................................................................................................................................... 58
4.2. Kiến nghị...................................................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................... 59
PHỤ LỤC............................................................................................................................................... 1

v


DANH MỤC CHỮ
VIẾT TẮT
BA
DNA

6-benzyl-aminopurine
deoxyribonucleic acid

MS

Murashige và Skoog (1962)

NAA

Alpha-naphtalenacetic acid

TCN

Trước Công Nguyên

TP. HCM

Thành Phố Hồ Chí Minh

2,4-D

2,4-dichlopophenoxyacetic acid

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên
tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

34

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ BA cố định lên tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White

35

Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ BA, NAA cố
định lên tạo chồi lan Cattleya Hybrid White

36

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy

39

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy

46

Bảng 3.3. Ảnh hưởng chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA lên sự
tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy 52

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hoa lan Cattleya Hybrid White................................................................................ 21

Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2;
A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l)

41

Hình 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1; A2;
A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l)

42

Hình 3.3. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2;
B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l)

48

Hình 3.4. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự tạo
chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1; B2;
B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 g/l)

49

Hình 3.5. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA
lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0;
C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20;
25 g/l) 54
Hình 3.6. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA, NAA
lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (C0;

C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 5; 10; 15; 20;
25 g/l) 55

viii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp với nồng độ cố định của NAA lên sự
tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (A0; A1;
A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ BA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2;
2,5 g/l)

40

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của NAA kết hợp với nồng độ cố định của BA lên sự
tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi cấy, (B0; B1;
B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ NAA là: 0; 0,5; 1; 1,5; 2;
2,5 g/l)

47

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan kết hợp với nồng độ cố định của BA,
NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White sau 8 tuần nuôi
cấy, (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ chitosan là:
0; 5; 10; 15; 20; 25 g/l)

ix

53

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, đời sống con người ngày
càng được nâng cao, cả về mặt vật chất và tinh thần. Nhu cầu thưởng thức cái đẹp,
đặc biệt cái đẹp đến từ thiên nhiên, cỏ cây hoa lá dần đi vào đời sống mỗi người
dân.
Từ xa xưa, chơi hoa, trồng hoa và thưởng thức hoa đã được coi là một thú
vui nghệ thuật độc đáo và thú vị. Ngày nay, nghề trồng hoa và kinh doanh hoa đang
ngày càng được chú tâm và phát triển bởi nó không chỉ bó hẹp trong giá trị thưởng
thức mà còn mang lại giá trị kinh tế rất cao. Phong lan là một trong những loài hoa
có chất lượng cao, giá trị kinh tế lớn, được nhiều người yêu thích bởi có hoa đẹp,
cấu trúc hoa kiêu kỳ, phức tạp. Hơn nữa, màu sắc hoa vô cùng phong phú, hương
thơm quyến rũ, thời gian chơi dài.
Nhờ quá trình sưu tầm các loài lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các
thứ lan mới, số loài hoa lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100 ngàn loài.
Vì thế, trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thú chơi lan đã
trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị, tuổi tác, hoàn
cảnh kinh tế. Số người chơi và yêu chuộng hoa lan ngày càng tăng, hay nói cách
khác, nhu cầu sử dụng các chủng loại lan đã và đang tăng. Hoa lan hiện đang được
trồng và kinh doanh với 3 kiểu dáng: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu
treo hay bám trên giá thể và cây lan con từ 10 – 15 cm.
Được mệnh danh là “hoàng hậu” của các loài lan, Cattleya nổi bật với vẻ đẹp
kiêu sa, quý phái không chỉ ở cánh hoa mà ở tất cả các bộ phận của cây, cùng với
hương thơm dễ chịu làm mê đắm lòng người. Cattleya có thể sống được ở vùng
nóng và vùng ôn đới, đặc biệt đây là giống rất thích hợp với điều kiện khí hậu của
Việt Nam với biên độ rộng. Chính vì thế nó được trồng và phát triển mạnh ở tất cả
các nơi, các tỉnh phía Nam, phía Bắc và ngay cả trên vùng Cao Nguyên, tuy nhiên
mỗi nơi đều có cách trồng khác nhau. Đối với các nước có nền công nghiệp hoa lan
1

phát triển mạnh như Thái Lan, Hà Lan, Đài Loan và Trung Quốc, lan nói chung và
Cattleya nói riêng đều được đầu tư đi sâu nghiên cứu để không chỉ tạo ra giò lan
đẹp mà còn có giá cả cạnh tranh. Do đó việc giảm giá thành cây giống để cung cấp
cho người sản xuất, mở rộng diện tích đang là vấn đề bức xúc hiện nay.
Để giải quyết vấn đề này người ta áp dụng nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy
mô vì hệ số nhân cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các cây con giống có năng
suất và phẩm chất tốt như bố mẹ chọn lọc. Từ một cây mẹ ban đầu ta có thể nhận ra
hàng ngàn cây con có kích thước và chất lượng đồng đều như nhau, giúp việc nhân
giống được nhanh hơn. Mặt khác, cây con ổn định về di truyền, đồng thời giảm tác
hại cho cây giống và đem lại hiệu quả thiết thực trong việc nâng cao chất lượng cây
giống và giảm giá thành. Chính vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và chitosan
lên sự tăng trƣởng và nhân chồi Cattleya Hybrid White” nhằm mục đích tìm
hiểu rõ hơn về môi trường nuôi cấy.
2.

Mục đích của đề tài
Xác định nồng độ BA và NAA thích hợp nhất lên khả năng tạo chồi lan

Cattleya Hybrid White.
Đánh giá hoạt tính kích thích tạo chồi khi bổ sung chitosan trong môi trường
nuôi cấy mô cây lan Cattleya Hybrid White.
3.

Nội dung của đề tài
 Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.
 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid White.
 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên sự tạo chồi lan Cattleya Hybrid

White.

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nguyên cứu
Ý nghĩa khoa học:
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị
về môi trường nuôi cấy tăng trưởng lan và lan Cattleya nói riêng.

2


- Là cơ sở cho nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy các loài lan khác nói
chung.
Ý nghĩa thực tiễn:
- Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để tạo môi trường nuôi cấy thích hợp nhân
nhanh giống lan Cattleya Hybrid White ở quy mô lớn, tạo cây con sạch bệnh
nhằm cung cấp cho sự đa dạng giống lan tại Việt Nam.
5.

Kết quả đạt đƣợc của đề tài
- Xác định được nồng độ BA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya
Hybrid White.
- Xác định được nồng độ NAA thích hợp cho quá trình tạo chồi lan Cattleya
Hybrid White.
- Xác định được nồng độ chitosan thích hợp cho quá trình tạo chồi lan
Cattleya Hybrid White.

6.

Kết cấu của đồ án
Đồ án bao gồm các chương sau:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

3


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về phƣơng pháp nuôi cấy
1.1.1. Khái niệm về phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô (tissue culture) là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào
thực vật và các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật trên môi trường nuôi cấy
được xác định rõ. Việc nuôi cấy được duy trì dưới điều kiện kiểm soát. Kỹ thuật
nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền (giống cây
trồng), sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo
quản các nguồn gen quý. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như
muối khoáng, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và đường.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở
miền Nam và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ năm
1980. Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là lĩnh vực
nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhiều tỉnh thành trong cả nước đã xây
dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ cao để phát triển lĩnh vực nuôi
cấy mô này và đã mang lại nhiều thành tựu nổi bật:


Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm để đưa ra sản xuất

nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ điển, nhờ vậy mà một người có thể sản
xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng.


Ở miền Bắc, nhân giống vô tính ở thực vật được ứng dụng ở hầu hết các

loài thực vật nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương
(loại gỗ tiết tinh dầu dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm), cây Đăng lấy gỗ, Chè
vang (một loại chè rất khó trồng). Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống
Lúa chịu hạn DR1, nhân giống nhiều loại khoai tây, mía,...


Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm

cung cấp hàng vạn cây giống Bạch đàn Eucalyptus urophylla.

4




Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc ứng

dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống cây Lô
hội, một loài dược liệu quý ở địa phương.


Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất Phong lan lớn trong khu vực.

Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây trồng Phú
Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay
100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy mô.


Năm 2002, Lê Thị Kim Đào và cộng sự tại Trung tâm Ứng dụng Khoa học

Kỹ thuật Bình Định đã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm hương, Bạch đàn
Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho chất lượng
cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao.


Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: nhân

giống thành công giống sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) quý hiếm từ một
số tế bào gốc của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên
cứu học viện Quân y đã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn
bộ quy trình chỉ mất 10 đến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6
năm sâm mới cho thu hoạch. Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi
nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là loài lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) –
loài lan duy nhất có hương thơm trên thế giới.
1.1.3. Ứng dụng của nhân giống in vitro
 Nhân nhanh giống, tạo cây con đồng đều về hình thái, đồng nhất về di
truyền.
 Tạo cây trồng sạch bệnh.
 Sản xuất cây đơn bội.
 Lai xa.
 Bảo quản nguồn gene.

5

1.1.4. Ƣu và nhƣợc điểm của quá trình nhân giống
Ưu điểm:


Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng lớn

cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1 – 10 mm.
Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít
nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5 – 20
cm.
 Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo được sẽ
không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài.


Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng lớn cây

giống sạch virus.
 Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh
của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng
thực vật,… theo ý muốn.


Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng lớn cây giống trong một
6

12

thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 3 – 10 /năm,

như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống
cao hơn.


Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu sự chi phối của điều kiện ngoại

cảnh, của thời vụ.


Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được

trong thời gian dài ở điều kiện in vitro.
Nhược điểm:
 Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhưng cây giống tạo ra kích thước nhỏ và
đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn.
 Cây giống in vitro được cung cấp nguồn carbohydrate nhân tạo nên khả
năng
tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được
nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão
6


hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây
hiện tượng héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều
kiện ex vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện
bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh, nhiệt độ cao thường không
ổn định, nghèo dinh dưỡng.
 Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.
 Những vấn đề tồn tại trong vi nhân
giống: o Tính bất định về mặt di truyền.

o

Sự nhiễm mẫu.

o Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy.
o Hiện tượng thuỷ tinh thể.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nhân giống in vitro
 Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và
chỉ cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô.
Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài Thuốc lá được
sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các
genome qua nuôi cấy sinh trưởng mô lõi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990)
ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy
hạt phấn Cà chua Lycopersicon esculentum Mill.
 Chọn cơ quan
Murashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng
sử dụng nuôi cấy in vitro. Ông cho rằng mẫu nuôi cấy khác nhau ở các loài khác
nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy, theo Doerschung và Miller (1976)
cho rằng chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt.
 Tuổi và sinh lý
Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy
cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hoá tế bào và tuổi sinh lý. Có nhiều
7


nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy, theo Pierik
(1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già.
 Mẫu in vitro
Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro

có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn
ươm như ở cây Azalea (Economou và Read, 1986). Tuy nhiên, Lu et al., (1991) ghi
nhận nuôi cấy túi phấn đạt tỷ lệ thành công cao khi nuôi cấy túi phấn trên cây đồng
ruộng.
 Sức sống của mẫu
Điều cần thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in
vitro. Morel (1952, 1955) nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để loại virus sản xuất những
cây sạch bệnh và điều này nói lên rằng cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là
đối với những cây bệnh, nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn những
cây bệnh được nhân lên.
 Điều kiện nuôi cấy
o Điều kiện vô trùng
Theo Nguyễn Quang Thạch nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô
trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường bị
nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự
thành bại của của nuôi cấy mô in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng
nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi
khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết
định. Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống
cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl 2 0.1%, NaHCl 10%, cồn
o

76 ,… để khử trùng.
Phương tiện khử trùng: nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng,
phòng nuôi cấy.
8


o

Nhiệt độ
o

Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là 20 – 27 C, nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc
đến sinh trưởng và phát triển cây in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp
hay hình thành tế bào hay cơ quan.
o

Cường độ ánh sáng

Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng
đến khả năng nuôi cấy in vitro cây có lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ
với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối.
Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng 1000 lux (Dương Công
Kiên, 2002).
o

Quang kỳ và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng: ảnh hưởng sâu sắc đến những đáp ứng sinh lý ở cây
trồng.
Chất lượng ánh sáng: ảnh hưởng trực tiếp đến cây in vitro, vì ánh sáng cao
hơn ánh sáng đỏ hay ánh sáng đỏ có ảnh hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây
như ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in
vitro.
o

Các chất khí:

Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng của
cây in vitro. O2, CO2 và ethylene là những chất được khảo sát nhiều. CO 2 có thể bị
giới hạn trong bình nuôi cấy và sử dụng nắp bình có lỗ thông khí, sử dụng bình có
bổ sung CO2 và làm giàu CO2 trong phòng dưỡng cây có thể cho vi nhân giống hạ
giá thành. O2 có giới hạn trong nuôi cấy mô. Ethylene xem như là chất làm giảm
sinh trưởng trong nuôi cấy mô. Auxin hưởng đến sự phóng thích ethylene. Nâng cao
hàm lượng ethylene làm giảm sinh trưởng mô sẹo.
1.2. Ý nghĩa của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong công nghệ
sinh học. Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen để tạo các giống cây trồng mới,
9


chúng ta đều cần đến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì phương pháp này có
những ưu điểm đáng kể:
 Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn.
 Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
 Có thể thực hiện bất kỳ địa điểm nào.
 Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không đòi hỏi phải có một diện
tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao.
 Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương pháp
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh.
 Dễ dàng học hỏi và trao đổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế giới.
 Bảo quản giống dễ dàng bằng cách tạo ra thể phôi hoặc bảo quản lạnh.
1.3. Sự phát sinh hình thái
Định nghĩa
Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ những thay đổi của cơ
quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm sự phát sinh
chồi bất định, phát sinh rễ bất định, tạo phôi soma,…
Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của

sinh học. Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu
trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trọng các
biến đổi hình thái và cấu trúc đó. Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp
riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó. Những kỹ thuật từ
nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di
truyền học đều có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái.
Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng
nhất là:
 Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát
triển
sau đó.

10




Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời

của một cơ thể thực vật. Trong phương pháp này, nên áp dụng các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật ngoại sinh vì mẫu cấy có kích thước nhỏ, rất khó tiến hành
nghiên cứu sinh lý học.
Trong phát sinh cơ quan, chồi thường được cảm ứng và tăng trưởng trước, rễ
được tạo ra sau. Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau đó mới hình thành chồi như
trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi được cảm ứng bởi Agrobacterium
rhizogenes (James et al., 1988). Với những cây thân gỗ cứng, chồi thường được cảm
ứng trực tiếp từ bộ lá.
1.4. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật và các yếu tố ảnh hƣởng
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (gồm các sản
phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo). Chúng có tác

dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Tuy nhiên, các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật chỉ làm tăng cường quá trình trao đổi chất mà
không tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất. Nó không thể dùng để thay thế
chất dinh dưỡng. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật gây nên tác dụng mạnh mẽ với
một lượng vô cùng bé đến trao đổi chất của tế bào, ở nồng độ cao chúng có thể hoạt
động như chất kìm hãm.
Trong thành phần môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật làm việc như chiếc chìa khoá đóng mở sự hoạt động của gen, điều khiển sự phát
sinh hình thái và tổng hợp hoạt chất. Tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng thực
vật liên quan đến hiện tượng kìm hãm và cảm ứng tổng hợp enzyme trong cơ thể
thực vật, hoạt hoá các bộ phận của phân tử DNA.
Mỗi một chất điều hòa sinh trưởng thực vật đều mang một chức năng riêng,
nhưng trong cơ thể của thực vật, để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng
tham gia vào thường không phải là một mà là vài chất. Tùy mỗi giai đoạn nuôi cấy,
giai đoạn phát triển của thực vật, sự kết hợp các chất này có khác nhau, có hai nhóm
chính là auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberellin và ethylene cũng là nhóm
11


chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan (Vũ Văn Vụ và
cộng sự, 2006).
Auxin
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Trong muôi cấy mô tế
bào thực vật auxin được dung cho sự phân chia tế bào, phân hoá rễ và ức chế sự
thành lập chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1999).
Auxin có tác dụng kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia
điều chỉnh sự phân hoá của rễ, chồi,… (Vũ Văn Vụ, 1999).
Auxin có vai trò thúc đẩy sự sinh trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách
tế bào thông qua sự hoạt hoá các enzyme tổng hợp vách và làm giãn nở tế bào
(Đặng Phương Trâm, 1997).

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), việc bổ sung auxin
vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết vì chúng rất cần cho phân chia tế bào và quá
trình phân biệt hoá tế bào.
Auxin được chia thành hai loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. Auxin tự
nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là
indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-dichloro phenoxy aceticacid (2,4-D), 1-naphthalene
acetic acid (NAA) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1 – 2,0
mg/l vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2006).
Theo Lê Võ Thùy Ngân (2011) cho rằng ít có loài thực vật nào có thể ra rễ
ngay trong môi trường nhân giống. Nguyên nhân là do cytokinin hiện diện trong
môi trường nuôi cấy đã ức chế sự hình thành rễ vì vậy cần có một môi trường
chuyên biệt để cảm ứng sự tạo rễ. Do đó cần phải có auxin để cảm ứng tạo rễ và nhu
cầu này sẽ giảm sau khi rễ được khởi tạo. Các loài cây thân gỗ cần auxin ở nồng độ
cao hơn cây thân thảo để ra rễ. Một trong các loại auxin có hiệu quả cao nhất trong
sự kích thích tạo rễ là NAA.

12


Nếu sử dụng loại auxin mạnh như NAA với nồng độ cao thì có thể có sự tạo
mô sẹo từ mẫu cấy. Ngoài ra còn có các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ là chất điều
hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất (chất
làm đặc môi trường), ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện môi trường nuôi cấy cũng có thể
ảnh hưởng đến sự ra rễ của chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Cytokinin
Cytokinin là những hợp chất adenine được thay thế, nó kích thích sự phân
chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin
(Nguyễn Minh Chơn, 2010).
Kinetin và Benzyl adenine được tổng hợp đầu tiên nhưng gần đây người ta

chứng minh là tạo ra tự nhiên ở một vài loại cây. Cytokinin đóng vai trò chính trong
sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Ở nồng
độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng
thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy (Vũ Văn Vụ và cộng sự, 2006).
BA và kinetin là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. Nồng độ sử dụng 0,1
– 2 mg/l. Tuy nhiên trong trường hợp không bổ sung cytokinin thì sau 10 – 12 ngày
cũng cho ra chồi nhưng tỷ lệ rất thấp (Dương Công Kiên, 2007).
Ethylene
Ethylen là chất điều hòa sinh trưởng thực vật dạng khí. Ethylene có rất nhiều
tác dụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật. Đã từ lâu vai trò của
ethylene đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã được ứng dụng rất
nhiều. Trong những năm gần đây đã xem xét ứng dụng của ethylene lên sự kéo dài
thân, rễ và kích thích tế bào phát triển về bề ngang, kích thích nảy mầm, tạo lông,
rễ, ức chế vận chuyển ngang và xuống của auxin.
Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các
vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là Thiamine HCl
(vitamin Bl), nicotinic acids (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol.
13


Carbohydrate
Hầu hết môi trường nuôi cấy mô thực vật đều cần bổ sung thêm nguồn
carbohydrate bên ngoài. Carbohydrate cần cho việc nuôi cấy tạo mô sẹo (White,
1934; Gautheret, 1955). Sucrose được sử dụng làm nguồn carbohydrate đầu tiên
White (1940) và sau đó nhiều nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng hiệu quả.
Có nhiều nghiên cứu về nhu cầu carbohydrate đối với phôi non và phôi
trưởng thành của thực vật, đặc biệt là ở họ Lan. Verma và Dougall (1977) cho rằng
các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự tăng trưởng và
phát sinh phôi ở Cà rốt hoang dại. Các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng

khác nhau lên sự biến dưỡng ở thực vật. Theo Gleddie và cộng sự, (1983) sucrose là
nguồn carbon tốt nhất cho sự phát sinh phôi.
Ngoài vai trò là nguồn carbon, các carbohydrate còn có tác dụng như một yếu
tố điều hòa sự phát sinh hình thái. Carbohydrate có tác dụng lên sự hình thành diệp
lục. Diệp lục trong mô sẹo nuôi cấy có ảnh hưởng lên khả năng phát sinh phôi. Các
gen biểu hiện nhanh trong sự biệt hóa của các diệp lục cảm ứng ánh sáng xanh cũng
có biểu hiện trong sự phát sinh phôi vô tính ở Chenopodium rubrum và Cà rốt
(Aleith và Richter, 1991). Sự hình thành và biểu hiện của các protein trong giai
đoạn đầu của quá trình phát sinh phôi vô tính được tìm thấy trong lục lạp của Đậu
Hà Lan (Koonen và Jacobson, 1991). Sự kích thích quá trình phát sinh phôi vô tính
trong nuôi cấy mô sẹo tế bào noãn ở Citrus trên môi trường chứa lactose có liên
quan đến sự hình thành diệp lục trong mô sẹo (Button, 1978).
Các chất hữu cơ
Nước dừa (CW-coconut) được dùng thông dụng trong nuôi cấy mô. Nước
dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid, chất sinh trưởng
và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế bào hay mầm còn non
chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa thường dùng ở nồng độ 15%. Từ
việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thức vật được ghiền tách chiết và bổ sung vào môi
trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển như cây chà là, chuối, mầm lúa
14


mì… Nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trông
không cùng nguồn gốc.
Than hoạt tính
Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác dụng
hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0,3% than hoạt tính trong
môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả chồi. Ngoài ra việc bổ
sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm tăng nhanh protocorm và sự
phát triển của cây con.

Ảnh hưởng của pH
Là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH môi trường là yếu tố duy trì trao
đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào
pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các
vitamin. pH của môi trường thường ở 5,5 – 5,8 trước khi khử trùng. Giá trị pH đầu
tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của tế
bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hoá các enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm
sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hoá của tế bào trong mô nuôi cấy. Giá trị pH
đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 – 5,9. Vì hầu hết
trong các môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi
trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm
nhanh chóng xuống 4,0 – 4,5 trong vòng 24 – 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi
trường nuôi (Stewart et al., 1987; Peril, 1994; Ziv và Hadar, 1991; Jay et al., 1994).
Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ ammonium của tế bào.
Agar
Agar là một polysaccharide thu được từ một số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar
được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi
cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8 – 1,0%. Nếu sử dụng với
nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng
như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào (Collin, 1998; Bhojwani và Razan, 1983).
15