Tối ưu hóa quá trình thủy phân trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn bacillus sp trong thức ăn chăn nuôi thủy sản​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN TRÙN QUẾ
VÀ ỨNG DỤNG VÀO CHẾ PHẨM LÊN MEN TỪ VI
KHUẨN BACILLUS SP. TRONG THỨC ĂN CHĂN
NUÔI THỦY SẢN

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110243

: TRẦN THỊ NHỚ
Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những nội dung trong bài đồ án là do tôi thực hiện dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của cô CN. Đỗ Thị Tuyến. Tôi cam đoan các kết quả nghiên
cứu đưa ra trong luận án này dựa trên các kết quả thu được trong quá trình thực hiện
đề tài, hoàn toàn trung thực không sao chép bất kì kết quả nghiên cứu nào của tác
giả khác. Nội dung trong đồ án có tham khảo và sử dụng một số thông tin, tài liệu từ
các nguồn sách hay công trình nghiên cứu khác đều được đều được trích dẫn rõ ràng
và liệt kê trong danh mục tài liệu tham khảo. Nếu có vi phạm quy chế hay gian trá
tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với Ban
Giám Hiệu cùng các thầy cô của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí
Minh, đặc biệt là các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
Trường đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập tại trường cũng
như đã tạo điều kiện cho tôi thực tập để tích lũy kinh nghiệm cho công việc sau này.
Để hoàn thành tốt khóa luận này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô
CN. Đỗ Thị Tuyến đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên và
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt
Đới đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.
Bên cạnh sự cố gắng hết mình của bản thân, tôi cũng thầm biết ơn sự ủng hộ,
quan tâm và động viên của gia đình, bạn bè – những người thân yêu luôn là chỗ dựa
vững chắc cho tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong

sự nghiệp cao quý. Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Viện Sinh Học Nhiệt
Đới luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc.

Tôi xin chân thành cảm ơn!
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Nhớ


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt................................................................................................................. v
Danh mục các hình.............................................................................................................................. vi
Danh mục các bảng........................................................................................................................... vii
Danh mục các sơ đồ......................................................................................................................... viii
Danh mục các đồ thị........................................................................................................................ viii
Chương 1 MỞ ĐẦU........................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề..........................................................................................................1
1.2. Mục đích............................................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu............................................................................................................................................. 2
1.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................... 2
1.5. Kết cấu của đồ án......................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................... 3
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp......................................................................3
2.1.1. Phân loại..........................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus.....................................................................4
2.1.3. Khả năng tạo bào tử.........................................................................................4
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản.......................6

2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp.............7
2.2. Enzyme protease.................................................................................................8
2.2.1. Giới thiệu chung về protease...........................................................................8
2.2.2. Phân loại protease.......................................................................................... 10
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật................................................. 12
2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease.................13
2.2.5. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease.........15
2.2.6. Ứng dụng protease vi sinh vật....................................................................... 16
2.3. Trùn quế......................................................................................................................................... 17
2.3.1. Phân loại và đặc điểm của trùn quế................................................................ 17
2.3.2. Đặc tính sinh học của trùn quế....................................................................... 18

i


Đồ án tốt nghiệp

2.3.3. Đặc tính sinh lý của trùn quế............................................................................................. 19
2.3.4. Sự sinh sản và phát triển................................................................................ 20
2.3.5. Tác dụng của trùn quế.......................................................................................................... 20
2.3.6. Bổ sung Trùn quế và BIO – T trong chăn nuôi.............................................. 22
2.4. Chế phẩm probiotics......................................................................................... 24
2.4.1. Định nghĩa về Probiotics............................................................................... 24
2.4.2.Vai trò của probiotics trong chăn nuôi thủy sản..............................................24
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP...................................................................... 26
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................................... 26
3.2. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu......................................................... 26
3.2.1. Vật liệu.......................................................................................................... 26
3.2.2. Hóa chất......................................................................................................... 27
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu...................................................................... 28

3.3. Môi trường phân lập, định danh và giữ giống................................................... 28
3.4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 29
3.4.1. Sơ đồ tổng quan thí nghiệm........................................................................... 29
3.4.2. Phương pháp phân lập Bacillus sp................................................................. 30
3.4.2.1. Hoạt hóa giống Bacillus sp......................................................................... 30
3.4.2.2. Phân lập các chủng Bacillus sp..................................................................................... 30
3.4.2.3. Cấy giữ gống Bacillus sp............................................................................ 30
3.4.2.4. Tăng sinh chủng Bacillus sp....................................................................... 30
3.4.2.5. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.........................31
3.4.3. Phương pháp định danh bằng đặc điểm sinh lý, sinh hóa..............................31
3.4.3.1. Phương pháp nhuộm Gram......................................................................... 31
3.4.3.2. Test khả năng di động................................................................................. 33
3.4.3.3. Test catalase................................................................................................ 33
3.4.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh Indol................................................................ 34
3.4.3.5. Thử nghiệm Methyl Red (MR)................................................................... 35
3.4.3.6. Thử nghiệm khả năng sử dụng đường......................................................... 36

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học...................................................... 36
3.4.4.1. Khả năng kháng khuẩn............................................................................... 36
3.4.4.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme protease.............................. 37
3.4.4.3. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn sinh tổng hợp protease.....37
3.4.4.4. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme protease.................................... 38
3.4.5.Phương pháp xác định thành phần sinh hóa cơ bản cho trùn quế....................38
3.4.5.1. Phương pháp xác định độ ẩm ban đầu........................................................ 38
3.4.5.2. Phương pháp định lượng khoáng tổng số bằng quang phổ kế.....................39

3.4.5.3. Phương pháp xác định đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl (định lượng
Nitơ tổng số)............................................................................................................ 40
3.4.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson
cải tiến..................................................................................................................... 41
3.4.5.5. Phương pháp Lowry xác định hàm lượng acid amin...................................44
3.4.6. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease...................45
3.4.6.1. Xác định nhiệt độ tối ưu.............................................................................45
3.4.6.2. Xác định pH tối ưu.....................................................................................45
3.4.7. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn quế...........................46
3.4.7.1. Khảo sát nồng độ cơ chất............................................................................46
3.4.7.2. Khảo sát nồng độ enzyme...........................................................................47
3.4.7.3. Khảo sát thời gian thủy phân......................................................................47
3.4.8. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm.............................................................48
3.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu................................................49
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 50
4.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp......................50
4.1.1. Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm Probiotic..................50
4.1.2. Nhuộm Gram................................................................................................. 52
4.1.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa....................................................................... 52
4.1.3.1. Khả năng di động............................................................................................................... 52
4.1.3.2. Khả năng sinh catalase..................................................................................................... 53

iii


Đồ án tốt nghiệp

4.1.3.3. Khả năng sinh indol........................................................................................................... 54
4.1.3.4. Thử nghiệm methyl red.................................................................................................... 54
4.1.3.5. Khả năng lên men các loại đường................................................................................ 55

4.2. Đánh giá các hoạt tính sinh học........................................................................ 58
4.2.1. Đánh giá khả năng kháng khuẩn.................................................................... 59
4.2.2. Định tính khả năng sinh enzyme protease...................................................... 59
4.3. Xác định thành phần sinh hóa cơ bản của trùn quế........................................... 60
4.4. Kết quả xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme thu được từ chế
phẩm........................................................................................................................ 61
4.4.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease........................61
4.4.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease................................62
4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân.......63
4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy
phân......................................................................................................................... 65
4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân...................67
4.8. Thủy phân trùn quế với các điều kiện tối ưu đã chọn.................................................. 70
4.9. Quy hoạch thực nghiệm.................................................................................... 71
4.10. Đánh giá hiệu quả sản phẩm........................................................................... 77
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................. 78
5.1. Kết luận.......................................................................................................................................... 78
5.2. Kiến nghị....................................................................................................................................... 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 80

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
OD

Optical density

UI

Unit International

MR

Methyl red

CFU

Colonies Form Unit

TCA

Trichloroacetic acid

EDTA

Etilendiamin tetraaxetic axit

NL

Nguyên liệu

CPE

Chế phẩm enzyme

v

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 2.1. Bacillus sp.......................................................................................................................... 3
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử......................................................................................................... 5
Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease.............................................................................................. 8
Hình 2.4. Trùn quế............................................................................................................................ 18
Hình 2.5. Trùn quế trong chăn nuôi............................................................................................ 22
Hình 3.1. Mẫu chế phẩm probiotic dùng để phân lập.......................................................... 26
Hình 3.2. Chủng Escherichiacoli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus – Viện
Sinh Học Nhiệt Đới TP. HCM....................................................................................................... 27
Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc phân lập từ các mẫu.............................................................. 50
Hình 4.2. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng 1, 5 và 6................................................ 52
Hình 4.3. Kết quả thử khả năng di động của chủng 1, 5 và 6........................................... 53
Hình 4.4. Kết quả thử khả năng tạo catalase của 3 chủng 1, 5 và 6............................... 53
Hình 4.5. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh indol của 3 chủng 1, 5 và 6..................54
Hình 4.6. kết quả thử nghiệm methyl red của 3 chủng 1, 5 và 6..................................... 54
Hình 4.7. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 1..........................55
Hình 4.8. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 5..........................56
Hình 4.9. Kết quả thử khả năng lên men các loại đường của chủng 6..........................57

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease.................................. 13
Bảng 2.2. Hàm lượng dinh dưỡng của bột trùn và bột cá................................................... 22

Bảng 3.1. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Tyrosin................................................................ 42
Bảng 3.2. Xác định hàm lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu..........................42
Bảng 3.3. Lập đường chuẩn Albumin........................................................................................ 44
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (% w/v)............................................................. 46
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme (%).................................................................... 47
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân....................................................................... 48
Bảng 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus sp. từ các chế phẩm............................... 51
Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm các đặc tính sinh lý, sinh hóa của 3 chủng đã khảo sát

58
Bảng 4.3. Kết quả vòng tan xác định khả năng kháng khuẩn của 3 chủng..................59
Bảng 4.4. Kết quả xác định vòng phân giải casein của enzyme protease thu nhận từ
3 chủng sau 48 giờ............................................................................................................................. 59
Bảng 4.5. Thành phần sinh hóa trong thịt trùn quế dùng để thủy phân.........................60
Bảng 4.6. Điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân thịt trùn quế bằng enzyme thương

phẩm và enzyme chế phẩm............................................................................................................. 70
Bảng 4.7. Kết quả so sánh các chỉ tiêu giữa hai sản phẩm thịt trùn sau thủy phân ......
70
Bảng 4.8. Mã hóa các biến số thực nghiệm theo các yếu tố ảnh hưởng.......................71
Bảng 4.9. Ma trận kế hoạch hóa đối với 4 yếu tố.................................................................. 71
Bảng 4.10. Kết quả hàm lượng acid amin theo thực nghiệm và theo phương trình hồi

quy............................................................................................................................................................ 72
Bảng 4.11. Kết quả bj và bij............................................................................................................ 73
Bảng 4.12. Xử lý số liệu tại tâm................................................................................................... 73
Bảng 4.13. Bảng kiểm định Student........................................................................................... 74
Bảng 4.14. Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa các tỷ lệ trộn........................................ 77

vii

Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease............................................................................................ 10
Sơ đồ 3.1. Quá trình tiến hành thí nghiệm................................................................................ 29

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme chế phẩm............................61
Đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme chế phẩm...................................... 63
Đồ thị 4.3. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ cơ chất khác nhau......................................................................................................................... 64
Đồ thị 4.4. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qúa trình thủy phân với nồng
độ enzyme khác nhau........................................................................................................................ 66
Đồ thị 4.5. Kết quả xác định hàm lượng acid amin sau qua trình thủy phân với các
mức thời gian khác nhau.................................................................................................................. 68

viii


Đồ án tốt nghiệp

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme sản xuất ngày càng nhiều và được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực của đời
sống con người như: Công nghệp da, công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi,
y tế,...và là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự phát triển
của ngành chế biến thức ăn thủy sản. Trong những năm gần đây thủy sản đã trở thành

nền kinh tế mũi nhọn ở nước ta, sản lượng thủy sản ngoài đáp ứng nhu cầu tiêu thụ
trong nước mà còn xuất khẩu ra thị trường các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn
Quốc...Để tăng năng suất và lợi nhuận người nuôi đã tăng mật độ giống, sử dụng thuốc
hóa học để phòng và trị bệnh đã làm xáo trộn hệ sinh học tự nhiên, ô nhiễm môi trường
và thêm vào đó là ảnh hưởng đến chất lượng thủy sản. Với mục đích bảo vệ sức khỏe
cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi
các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, mà thay
vào đó là các sản phẩm sinh học giúp tăng cường sức đề kháng bệnh, tăng khả năng hấp
thụ dưỡng chất, hay làm sạch môi trường nước bằng cách bổ sung thêm những vi sinh
vật có lợi. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống
có lợi, có tính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của
hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học
còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những hệ enzyme

vi sinh vật, hoặc những sản phẩm chuyển hóa trong quá trình lên men của chúng),
giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh.
Thêm vào đó, việc ứng dụng trùn quế vào thức ăn làm tăng hàm lượng đạm hữu
cơ trong thức ăn chăn nuôi cũng là một trong những hướng nghiên cứu chính nhận
được nhiều sự quan tâm của cả các nhà khoa học và người chăn nuôi. Với hàm lượng
protein thô cao, hàm lượng đạm của trùn tương đương với bột cá, là thức ăn lý tưởng để
nuôi thủy sản. Trùn còn chứa nhiều loại acid amin,vitamin, chất khoáng cần thiết cho
gia súc, gia cầm và thủy sản. Đặc biệt, thịt trùn còn có các loại kích thích tố sinh trưởng
tự nhiên mà trong bột cá không có. Thức ăn chăn nuôi có bột trùn sẽ không

1


Đồ án tốt nghiệp

có mùi tanh và khét của cá và dầu cá, hấp dẫn với vật nuôi, lại bảo quản được lâu

hơn thức ăn có dùng bột cá. Tuy nhiên protein có trong thịt trùn tươi thường khó
tiêu hóa nên thủy phân bằng protease mang lại nhiều ưu điểm như: Không độc hại,
cắt đứt các liên kết peptid tạo các amino acid đơn giản giúp quá trình tiêu hóa, hấp
thụ tốt hơn. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa quá trình thủy phân
trùn quế và ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp. trong
thức ăn chăn nuôi thủy sản”.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Chọn lọc được chủng Bacillus sp. có khả năng sinh enzyme protease cao.
Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân trùn quế bằng
enzyme protease để ứng dụng vào chế phẩm lên men từ vi khuẩn Bacillus sp.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập chủng Bacillus sp. từ các chế phẩm thức ăn chăn nuôi thủy sản.
Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme protease.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein trùn quế bằng
enzyme protease: nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian thủy phân.
So sánh khả năng thủy phân của enzyme protease thương phẩm và enzyme
protease từ chế phẩm lên men vi khuẩn Bacillus sp.
Tối ưu hóa thực nghiệm quá trình thủy phân trùn quế.
1.4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp như: phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, phương
pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2013 và phần mềm statgraphics.

1.5. Kết cấu của đồ án
Đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
Chương 4: Kết quả và thảo luận.
Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

2


Đồ án tốt nghiệp

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus sp.
2.1.1. Phân loại
Bacillus có khả năng chịu đựng và tồn tại trong thời gian dài ở điều kiện bất
lợi, nên đa số chúng rất phổ biến và có thể phân lập được từ nhiều nguồn.
Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus được phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Fimicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Chi Bacillus là một chi lớn, đa dạng và thuộc họ Bacillaceae. Với một số loài
thường gặp trong tự nhiên như: Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus
mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus polymyxa, bacillus
Brevis, Bacillus simplex,...

Hình 2.1. Bacillus sp.
( />
3


Đồ án tốt nghiệp

2.1.2. Đặc điểm chung của chi Bacillus (Nguyễn Thị Yến Thu, 2011)

Vi khuẩn Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que hay trực khuẩn, Gram
(+), đường kính khoảng 0,2 – 2 µm, dài 2 – 8 µm, thường ở dạng đơn hoặc chuỗi
dài, chiều dài của chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong suốt quá trình
phát triển. Phần lớn các chủng vi khuẩn Bacillus có nhiệt độ sinh trưởng ở mức
o

trung bình, với nhiệt độ tối ưu vào khoảng 35 – 45 C, cũng có một số chủng có
o

nhiệt độ tối ưu khá cao khoảng 65 C.
Là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có khả năng sinh catalase, bất động
hay di động nhờ tiêm mao, có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ, muối rộng, tồn tại được
ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài như một số loài ưa lạnh có thể sinh trưởng và
o

hình thành nội bào tử ở 0 C, pH sinh trưởng rất khác nhau từ 2 – 11 nên đa số chúng
rất phổ biến trong tự nhiên và có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như: đất,
nước, thức ăn,…
Hầu hết là vi khuẩn hoại sinh, có mặt khắp nơi trong tự nhiên, phần lớn chúng cư
trú trong đất. Vi khuẩn Bacillus có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ đơn giản như
đường, amino acid, các acid hữu cơ và có thể chuyển hóa các nguồn carbon như
methanol, cellulose hay lên men các hỗn hợp carbonhydrat tạo glycerol và butanediol.

Các chủng Bacillus được nghiên cứu nhiều do có khả năng tổng hợp được
nhiều loại enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose, phytase,... tùy thuộc
vào nguồn cơ chất khác nhau sẽ sinh enzyme khác nhau như nguồn cơ chất là
cellulose thì sẽ sinh tổng hợp enzyme cellulase,...Nhiều trong số các enzyme ngoại
bào này là enzyme thủy phân của các phân tử hữu cơ lớn, chính vì thế vi khuẩn này
có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như công nghệ sản xuất chất tẩy
rửa, công nghiệp thực phẩm, bánh kẹo, đồ uống, công nghệ dược phẩm, công nghệ

thuộc da, công nghệ dệt và trong xử lý chất thải.
2.1.3. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng tạo bào tử trong
những điều kiện nhất định. Bào tử không hình thành trong suốt quá trình hoạt động
tăng trưởng và phân chia tế bào, thường khi gặp điều kiện bất lợi về môi trường, thiếu

4


Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng,…thì nội bào tử mới được hình thành. Bào tử có hình oval và có
khuynh hướng phình ra ở một đầu, do đặc điểm cấu tạo và đặc tính sinh lý nên bào
tử được cho là dạng tồn tại bền vững nhất được tìm thấy trong tự nhiên của tế bào,
tồn tại lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt.
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước:







Hình thành vách ngăn.
Sự tạo tiền bào tử.
Tạo lớp vỏ bào tử.
Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử

www.biol.lu.se/cellorgbiol/membprot/pop sv.html
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền
bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát
triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào
tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước
và bị trương ra. Sau đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát

5


Đồ án tốt nghiệp

triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai
Phương, 2004).
2.1.4. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi trồng thủy sản
Sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus trong môi trường với một số lượng lớn sẽ
xảy ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và
nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất
dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh
trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Thuận, 1976).
Triển vọng ứng dụng vi khuẩn Bacillus sp. trong nhiều lĩnh vực đời sống, đặc
biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn. Một số loài thuộc nhóm vi khuẩn
Bacillus như: B. subtilis, B. aterrimus. B. niger, B. pumilis, B. panis, B. vulgarus, B.
nigrificans, B. natto, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B.
mesentericus…đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:
 Cải thiện sức khỏe, cung cấp nguồn dinh dưỡng trực tiếp và hỗ trợ tiêu hóa.
 Tăng cường các phản ứng miễn dịch và cải thiện môi trường nước như
phân
hủy các chất thải hữu cơ, giảm chất độc NH3 và H2S, giảm chất dư thừa tích tụ ở

đáy ao, giảm phát sinh khí độc và mùi hôi.
 Ức chế các tác nhân gây bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng sinh, cạnh tranh

dinh dưỡng và môi trường sống.


Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát

triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh (như vi khuẩn Vibrio) giữ cho môi trường luôn

ở

trạng thái cân bằng là đặc tính nổi trội của nhóm vi khuẩn này.
Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh ra các hoạt chất có

hoạt tính sinh học và ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã
nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp. đóng vai trò quan trọng trong việc cải
thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong quá trình chuyển đổi
vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp. làm giảm tích lũy chất hữu cơ và
các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007). Một số loài của nhóm
vi khuẩn Bacillus sp. (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,…) dùng để làm

6


Đồ án tốt nghiệp

sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (protease, amylase, cellulase,
kitinase) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi
sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng

thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính, Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả
năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá
mức như Vibrio, Aeromnas,…(Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).
2.1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus sp.
Vijayabaska et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể là
nhóm vi khuẩn Bacillus sp. trong nuôi cá rô phi nhằm hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn
A. Hyrophila gây ra. Sugama, Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY
3

6

– 9 bổ sung vào bể (18 m ) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 10 CFU/ml. Kết quả
cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveji và tỉ
lệ sống của tôm ở giai đoạn OL  10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so
với đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi
khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao
nuôi được cải thiện, đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ sung Bacillus
thấp hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái
Lan đã sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng
nước và bùn đáy ao nuôi (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Huyền, 2012).
Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus lên chất lượng nước và mùn bã hữu
cơ trong bể nuôi tôm sú đã được nghiên cứu. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức bổ sung 3
loài vi khuẩn Bacillus bao gồm Bacillus B8, B37 và B38 với mật độ 105 CFU/ml và 1
đối chứng (không bổ sung vi khuẩn). Kết quả cho ta thấy tỉ lệ sống ở nghiệm thức B37
cao nhất (93,33 ± 1,65%), còn đối chứng thấp nhất (69,52 ± 1,65%) (p <
0,05). Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài và trọng lượng của tôm cao nhất ở B37
lần lượt là 1,659 ± 0,034 mm/ngày và 0,45 ± 0,02 g/ngày, trong khi đó ở nghiệm thức
đối chứng là thấp nhất với các chỉ số tương ứng là 0,677 ± 0,017 mm/ngày và 0,14 ±
0,01 g/ngày. Như vậy hiệu quả xử lí môi trường của các chủng vi khuẩn bổ

7


Đồ án tốt nghiệp

sung được khẳng định, trong đó hiệu quả xử lý tốt nhất ở nghiệm thức dòng B37
(Phạm Thị Tuyết Ngân, Trương Quốc Phú, 2010).
Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus:


Trong chăn nuôi: viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất

chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983 đến nay
Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho
người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm
mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM,

Probiotic.


Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như

nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae...Ngoài ra còn ứng dụng
nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm
Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất,
Bộ Nông Nghiệp tại TP. HCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ Hồng,
Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm
Subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp.

2.2. Enzyme protease

2.2.1. Giới thiệu chung về protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Hình 2.3. Cấu trúc 3D của protease
( />
8


Đồ án tốt nghiệp

Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptide CONH của phân tử protein và cắt liên kết peptide giữa các
L  acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh
vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...).
Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ưu điểm nhất như
vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc đã được gia tăng sử dụng như là một nguồn cung cấp
protease đã cải thiện được đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều
hơn. Đặc biệt vi khuẩn là nguồn sản xuất protease tương đối lí tưởng vì những ưu điểm
như: có hoạt tính mạnh như chỉ với một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng cơ
chất lớn, có cường độ sinh sản rất mạnh và tổng hợp enzyme với tốc độ rất nhanh
chóng, trong thời gian ngắn có thể thu được một lượng lớn enzyme. Hệ protease vi sinh
vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc,
khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất.
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật

thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử
dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học.
Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus

cereus, Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc:
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein gồm nhiều các amino
acid nối với nhau bằng liên kết peptide tạo nên một hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu
trúc rất phức tạp và chúng phân giải các liên kết peptide tạo các acid amin đơn giản, dễ
hấp thu. Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng, đậu tương…

9


Đồ án tốt nghiệp

2.2.2. Phân loại protease (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)

Aminop

Carbo

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân loại protease

Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất có thể chia protease thành hai nhóm:
 Endopeptidase: protease thủy phân peptide ở giữa mạch.
 Exopeptidase: protease phân cắt các liên kết peptide ở đầu mạch.

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:

 Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
 Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.


 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:

10


Đồ án tốt nghiệp

 Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động
xúc tác của enzyme. Các Serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng
kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
 Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
 Aspartic proteinase: hầu hết các Aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các Aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung
tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
 Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các Metallo

proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
 Protease acid: pH = 2 – 4 được ứng dụng trong sản xuất bia và công
nghiệp bánh kẹo.
 Protease trung tính: pH = 7 – 8 chúng thường được sản xuất từ các loài vi
khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus.
 Protease kiềm: pH = 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của các enzyme
protease này có serin.
Nhưng tác dụng tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất.
Vì cùng một protease của cùng một chủng vi khuẩn khi thủy phân casein,
hemoglobin hay gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.

11


Đồ án tốt nghiệp

Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
 Protease động vật: có trong tụy tạng (đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu
dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất) và dạ dày bê.
 Protease thực vật: có 3 loại protease thực vật như Bromelain (thu từ quả,
chồi và vỏ dứa), Papain (có trong nhựa của lá, thân, quả đu đủ) và Ficin (thu
được từ nhựa cây cọ).
 Protease vi sinh vật: phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…
gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium,
Streptomyces và một số và một số loại nấm men.
2.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật
Protease có thể ở 2 dạng chính là protease nội bào (hiện diện trong tế bào) và

protease ngoại bào (được tiết vào môi trường nuôi cấy) và có những vai trò khác
nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào thường phân giải
protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng
phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Cho đến nay, các loại protease ngoại
bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào.
Vi sinh vật tiết ra enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các
phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptide). Các chất này
tiếp tục phân hủy thành các acid amin nhờ Peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay
vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amin. Một phần các acid amin này được
vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được phân giải
tạo thành NH3 và các sản phẩm khác.
Protein

Protease

Peptidase

Polypeptid

Quá trình này được gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa. Đó là quá trình
chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH 3) (trích Nguyễn Thị Ngọc
Huyền, 2012).

12


Đồ án tốt nghiệp

Protease nội bào thì cho đến nay còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ
vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai

trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng như
phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào để hình thành các acid amin và
để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia trong
quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có nghĩa đối với việc
hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào cũng có thể tham gia
trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969).
Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng
hợp sai do đột biến, hoặc cũng có thể tham gia vào quá

trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích dẫn bởi Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005).
Bảng 2.1. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease
Vi khuẩn
Bacillus subtilis
Bac. cereus
Bac. thermophillus
Bac. circulans
Bac. brevis
Clostridium perfriugens
Cl. histoluticum
Cl. porogens
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)
2.2.4. Môi trường và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp Protease
Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng
trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần
môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi
sinh vật và tổng hợp enzyme.
Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng
cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất

13