Phân lập các loài vi nấm kí sinh trên nấm linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh hại cây trồng của những loài có triển vọng​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ
MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC LOÀI VI NẤM KÍ SINH TRÊN NẤM
LINH CHI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG
NẤM BỆNH HẠI CÂY TRỒNG CỦA NHỮNG LOÀI
CÓ TRIỂN VỌNG

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110073

: NGUYỄN THÁI MINH HIẾU

Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả trong
Đồ án là trung thực. Mọi thông tin trích dẫn trong Đồ án đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu


LỜI CÁM ƠN

Xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học
Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn
thành tốt khóa học 2010 – 2014.
Xin cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Thực phẩm và Môi
trường đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng
kiến thức vững chắc để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công
việc thực tiễn.
Xin chân thành cám ơn TS. Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này.
Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa và đặc biệt là em Huỳnh
Nhi đã tận tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng em trải qua
những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn bên cạnh,
cổ vũ, động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt Đồ án tốt
nghiệp này.

Tp. HCM, Ngày 31 tháng 7 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Minh Hiếu


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC



-------

-------

MỤC LỤC................................................................................................................. i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................. v
DANH MỤC BẢNG............................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH.....................................................................................vii
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu....................................................................................... 2
3. Mục tiêu nghiên cứu........................................................................................ 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3
1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi........................................................................... 3
1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)......................3
1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001)..................4
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ.............5
1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam. .6
1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)............7

1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma.................................................................. 12
1.2.1. Phân loại............................................................................................. 12
1.2.2. Đặc điểm hình thái.............................................................................. 12
1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J. Samuels, 2004)............................ 13
1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh
cây trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005)........14
1.2.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma trên thế giới và
ở Việt Nam..................................................................................................... 18
-i-


Đồ án tốt nghiệp
1.3. Giới thiệu với nấm Aspergillus ....................................................................
1.3.1. Phân loại.................................................................................................
1.3.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh ....................................................................
1.3.4. Một số nghiên cứu và ứng dụng của nấm Aspergillus trên thế giới và ở
Việt Nam ..........................................................................................................
1.4. Bệnh do nấm Rhizoctonia spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,
2005) .................................................................................................................... 23

1.5. Bệnh do nấm Fusarium spp. gây ra (Vũ Triệu Mân, 2007; Roger Shivas,
2005) ....................................................................................................................
1.6.

Bệnh do nấm Colletotrichum spp. gây ra ..........

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................
2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .....................

2.2.

Vật liệu ...............................................................

2.2.1. Nguồn mẫu phân lập .............................................................................
2.2.2. Nguồn nấm bệnh ....................................................................................
2.2.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................
2.2.4. Hóa chất ...............................................................................................
2.2.5. Các loại môi trường ...............................................................................
2.3.

Nội dung nghiên cứu ..........................................

2.4.

Phương pháp nghiên cứu ....................................

2.4.1.Phương pháp phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi (Agrios,
2005)................................................................................................................
2.4.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) ....

- ii -


Đồ án tốt nghiệp
2.4.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo kiểm chứng tác nhân gây bệnh
(Agrios, 2005)............................................................................................... 36
2.4.4. Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase,

chitinase) của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh (Tô Duy Khương, 2007) 37
2.4.5. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối
với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro (Laila Naher và
cộng sự, 2012)............................................................................................... 38
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm................................................. 39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 40
3.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi.........................40
3.1.1. Kết quả phân lập nấm kí sinh trên nấm Linh chi.................................40
3.1.2. Đặc điểm hình thái của 3 chủng nấm T1, T2, A1................................. 41
3.1.3. Kết quả định danh đến loài của 3 chủng nấm T1, T2 và A1................44
3.1.4. Kiểm chứng tác nhân gây bệnh theo quy tắc Koch ở điều kiện in vitro
47
3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase và chitinase) của hai
loài Trichoderma virens và Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi 51
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng của 2 loài nấm Trichoderma virens và
Trichoderma harzianum kí sinh trên nấm Linh chi đối với các nấm bệnh gây hại
cây trồng trong điều kiện in vitro...................................................................... 52
3.3.1. Khả năng đối kháng với nấm Fusarium sp.......................................... 53
3.3.2. Khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia sp...................................... 55
3.3.3. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp1...............................57
3.3.4. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp2...............................59
3.3.5. Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp3...............................61
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................ 64
- iii -


Đồ án tốt nghiệp
4.1. Kết luận...................................................................................................... 64
4.2. Kiến nghị.................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 66

PHỤ LỤC

- iv -


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
-------



-------

1. CMC: Carboxymethyl cellulose
2. ĐC:Đối chứng
3. MSM: Minimal Synthetic Medium
4. PGA: Potato D-Glucose Agar
5. TN:Thí nghiệm
6. VSV: Vi sinh vật

-v-


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC BẢNG

-------



Bảng

------Trang

Bảng 1.1. Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm................................. 10
Bảng 2.1. Nguồn nấm Linh chi bị bệnh..................................................................................... 31
Bảng 3.1. Tần suất xuất hiện các chủng nấm phân lập được trên nấm Linh chi bệnh
41
Bảng 3.2. Tỷ lệ tai nấm Linh chi bị nhễm bệnh sau khi lây bệnh nhân tạo..................48
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của T. virens và T. harzianum phân lập ban đầu.........50
Bảng 3.4. Đường kính vòng phân giải của hai loài nấm Trichoderma virens và
Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy.......................................................................... 52
Bảng 3.5. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium .. 54

Bảng 3.6. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Rhizoctonia
sp............................................................................................................................................................... 56
Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp1............................................................................................................................. 58
Bảng 3.8. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp2............................................................................................................................. 60
Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp3............................................................................................................................. 62

- vi -


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

-------



-------

Hình

Trang

Hình 1.1. Nấm Linh chi (Gerdonama luciadum)..................................................................... 3
Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ............................................................................. 5
Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm................................................................... 9
Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum.................................................................. 12
Hình 1.5. Trichoderma kí sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở cây họ đậu
(Nấm Trichoderma (màu vàng) tấn công nấm Pythium (màu xanh)).............................15
Hình 1.6. Trichoderma tiết enzyme chitinase và kháng sinh peptaibols phân hủy
vách tế bào nấm bệnh....................................................................................................................... 16
Hình 1.7. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum

bởi chất kháng sinh

được tiết ra từ Trichoderma hazianum....................................................................................... 17
Hình 1.8. Hệ bào tử đính của giống nấm sợi Aspergillus.................................................... 21
Hình 1.9. Biểu hiện bệnh do Rhizoctonia gây ra.................................................................... 25
Hình 1.10. Héo Fusarium trên cây chuối do F. oxysporum f.sp.cubense......................26
Hình 1.11. Biểu hiện bệnh héo vàng do nấm Fuasarium spp. gây ra trên cây cà
chua.......................................................................................................................................................... 27
Hình 1.12. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. gây ra trên các
loại trái cây nhiệt đới........................................................................................................................ 28

Hình 1.13. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum acutatum gây ra trên
trái ớt và lá ớt...................................................................................................................................... 29
Hình 1.14. Biểu hiện bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra
trên trái thanh long và cành thanh long...................................................................................... 30
Hình 2.1. Phương pháp cấy đối kháng trực tiếp..................................................................... 40
Hình 3.1. Hình thái đại thể chủng nấm T1 nuôi cấy trên môi trường PGA..................42
Hình 3.2. Hình thái vi thể chủng nấm T1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X
42
Hình 3.3. Hình thái đại thể chủng nấm T2 nuôi cấy trên môi trường PGA..................43
- vii -


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.4. Hình thái vi thể chủng nấm T2 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X
43
Hình 3.5. Hình thái đại thể chủng nấm A1 nuôi cấy trên môi trường PGA.................44
Hình 3.6. Hình thái vi thể chủng nấm A1 quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính
40X........................................................................................................................................................... 44
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự 28S rRNA vả tra cứu trên BLAST SEARCH của
chủng nấm T1....................................................................................................................................... 45
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của
chủng nấm T2....................................................................................................................................... 46
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH của
chủng nấm A1...................................................................................................................................... 47
Hình 3.10. Biểu hiện nhiễm bệnh trên nấm Linh chi sau 15 ngày lây bệnh nhân tạo
49
Hình 3.11. Vòng phân giải chitin và CMC của 2 loài nấm Trichoderma virens và
Trichoderma harzianum sau 2 ngày nuôi cấy.......................................................................... 53
Hình 3.12. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm Fusarium
sp............................................................................................................................................................... 55

Hình 3.13. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Rhizoctonia sp...................................................................................................................................... 57
Hình 3.14. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp1............................................................................................................................. 59
Hình 3.15. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp2............................................................................................................................. 61
Hình 3.16. Khả năng đối kháng của T. virens và T. harzianum với nấm
Colletotrichum sp3............................................................................................................................. 63

- viii -


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nấm Linh chi hiện đã được biết đến là loài nấm có giá trị sử dụng cao để làm
dược liệu và được sản xuất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Beta glucan và
chitine là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào của nấm Linh chi (Pai-Feng
Kao và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, Kumar và cộng sự (2011) cho biết, trong quá
trình sinh trưởng, phát triển, nấm Linh chi bị kí sinh bởi nhiều loài nấm, trong đó có
các loài nấm Trichoderma. Tác giả cũng đánh giá đây là nhóm nấm có triển vọng
trong quản lý bệnh hại cây trồng. Enzyme là nhân tố quan trọng giúp Trichoderma
có khả năng tấn công trực tiếp lên nấm Linh chi các loài nấm khác. Trong số các
enzyme được tiết ra từ nấm Trichoderma spp. thì Endochitinase và Glucanase 1,3beta-glucosidase đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động kí sinh của nấm
Trichoderma spp. (Margolles Clark và cộng sự, 1995). Hầu hết vách tế bào nấm
bệnh đều có cấu bởi chitin và glucan (Agrios, 2005). Vì vậy, các loài nấm kí sinh
trên nấm Linh chi sẽ có khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh khác. Một số
chủng Trichoderma cũng đã được thông báo có khả năng phòng trừ được nấm
Colletotrichum (Stanley Freeman và cộng sự, 2004). Đây là loài nấm nguy hiểm cho

sản xuất nông nghiệp vì gây hại trên rất nhiều loại cây trồng và trong bảo quản sau
thu hoạch nhiều loài hoa quả (Agrios, 2005).
Cũng như trên thế giới, nấm Linh chi đang được trồng khá phổ biến ở nhiều
tỉnh thành của Việt Nam. Theo Lê Duy Thắng (2001), nấm Linh chi bị một số loài
nấm kí sinh gây hại. Trong số này có nấm Trichoderma là loài gây hại nghiêm trọng
nhất, nhóm mốc này tấn công trên bịch đã có tơ ăn đầy, thậm chí trên cả tai nấm
Linh chi và ức chế mạnh lên sự phát triển của tơ nấm. Nấm Trichoderma đã được
nghiên cứu và sử dụng nhiều ở Việt Nam nhưng chủ yếu được phân lập từ đất và để
phòng trừ nấm gây hại cây trồng có trong đất (Dương Minh và cộng sự, 2005). Việc
phân lập nấm Trichoderma từ nấm Linh chi và lợi dụng chúng để phòng trừ bệnh
hại cây trồng chưa được quan tâm. Bên cạnh đó, biện pháp quản lý nấm gây hại trên
lá và quả các loài cây trồng chủ yếu nhờ vào các loại thuốc hóa học và chưa có tác
-1-


Đồ án tốt nghiệp

nhân sinh học nào tỏ ra có hiệu quả đối kháng với loài nấm bệnh này. Vì vậy, việc
phân lập và lợi dụng các chủng nấm kí sinh trên nấm Linh chi để quản lý một số
bệnh hại cây trồng trên mặt đất là khả thi và rất cần thiết.
Xuất phát từ lý do trên, sinh viên tiến hành đề tài “ Phân lập các loài vi nấm
kí sinh trên nấm Linh chi và đánh giá khả năng đối kháng nấm bệnh gây hại
cây trồng của những loài có triển vọng”.
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và định danh đến loài các vi nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh
chi. Tuyển chọn các loài vi nấm có triển vọng ứng dụng kháng nấm bệnh hại cây
trồng.
3. Mục tiêu nghiên cứu
−

Phân lập nấm kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi và định danh đến loài các
chủng nấm phân lập được.

−

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) của một số
chủng nấm kí sinh gây bệnh.

−

Khảo sát khả năng đối kháng của một số chủng nấm kí sinh gây bệnh có tiềm
năng với các nấm bệnh gây hại cây trồng trong điều kiện in vitro.

-2-


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về nấm Linh chi
1.1.1. Phân loại (Sissi Wachtel-Galor và Iris F.F.Benzie, 2011)
Nấm Linh chi có trên khoa học là Ganoderma lucidum, thường được tìm
thấy ở các nước Á Đông. Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước
châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo dược để giúp tăng cường
sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người. Đây là một loại nấm lớn, màu tối, vỏ
ngoài nhẵn bóng và nhìn giống như một khúc gỗ… Ở mỗi nơi nấm Linh chi được
gọi bằng nhiều tên khác nhau như Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc),
Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih (Đài Loan). Ngoài ra còn một số tên gọi khác
như nấm vạn niên (Nhật bản) hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo 2 cuốn sách
rất nổi tiếng mô tả về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao

Jing” (25- 220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang
Mil” của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6
chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250 loại nấm
Linh chi được đề cập.
Nấm Linh chi xuất thân từ loài nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có
hàng trăm loài khác nhau cùng họ nấm gỗ (Ganodermataceae). Trong đó, chi
Ganoderma có đến 80 loài có màu sắc khác nhau thay đổi từ vàng, cam, đỏ tía . .
.rất đa dạng.Vị trí phân loại của nấm Linh chi như sau:
– Giới:Fungi
– Ngành: Basidiomycota
– Lớp:Agaricomycetes
– Bộ:Polyporales
– Họ :Ganodermataceae
– Chi:Ganoderma
– Loài:Ganoderma lucidum
Hình 1.1. Nấm Linh chi
(Gerdonama luciadum)
-3-


Đồ án tốt nghiệp

1.1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2001)
Nấm Linh chi là một loại nấm hóa mộc, cứng khi khô nhưng khi tiếp xúc
với nước trở nên hơi mềm. Quả thể nấm Linh chi gồm:
Mũ nấm: mặt trên thường có một lớp bóng màu nâu đỏ, mặt dưới nấm có
nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử nếu cắt ngang có dạng tổ ong. Ngoài thiên
nhiên, nấm luôn có dạng bất đối xứng, tức là cuống nấm thường ở một bên như vị
trí tay quạt. Đối với nấm trồng, mũ nấm tròn và gần như đối xứng, cuống nấm ở
giữa trung tâm do được trồng theo từng đơn vị, không có sự chèn ép và ảnh hưởng

môi trường bên ngoài.
Bào tử: hình thuẩn có gai lõm. Một đầu tròn lớn, một đầu nhỏ có lỗ, nơi đây
bào tử sẽ nảy mầm cho ra khuẩn ty ăn luồn vào thân cây. Bào tử nấm tương tự như
một loại phấn hoặc hạt mầm, có thể phát triển thành một cây nấm hoàn chỉnh,
nhưng khác ở chỗ nó được cấu tạo từ một tế bào duy nhất. Đường kính của bào tử
nấm Linh chi chỉ từ 5 – 8 µm. So sánh cùng trọng lượng, bào tử nấm Linh chi có
dược tính mạnh hơn quả thể 75 lần, gồm các dược chất thiên nhiên như
triterpenoids, polysaccharides (β - D - glucans), germannium và các hoạt chất
khác.
Cuống nấm: cuống nấm đặc và cứng, sậm màu, bám vào đài vật như thân
cây. Chân nấm có thể dài cũng có thể ngắn, là bộ phận giúp nấm lấy chất dinh
dưỡng.

-4-


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Hình thái quả thể nấm Linh chi đỏ: A: Nấm mọc tự nhiên; B: Nấm trồng
nhân tạo; C: Bào tử nấm; D: Hình thái cấu trúc giải phẫu nấm.
1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Linh chi đỏ
Thành phần trong nấm Linh chi tươi thì nước là chủ yếu, chiếm 90% khối
lượng. Trong 10% còn lại thì protein chiếm 10 - 40%, chất béo chiếm từ 2 - 8%,
carbohydrate chiếm 3 - 28%, chất xơ chiếm 3 - 32%, hàm lượng tro chiếm 8 10%. Ngoài ra, nấm Linh chi còn có các thành phần vi lượng như một số loại
vitamin và các khoáng chất khác nhau như là kali, can-xi, phốt pho, magiê, selen,
sắt, kẽm…(Borchers và cộng sự, 1999). Trong một nghiên cứu của các thành phần
không bay hơi của Linh chi cho thấy rằng nấm chứa tro 1,8%, 26 - 28%
carbohydrate, 3 - 5% chất béo thô, 59% chất xơ thô, và 7 - 8% protein thô (Mau và
cộng sự, 2001).
Hàm lượng của protein trong nấm Linh chi khoảng 7 - 8%, thấp hơn so với

nhiều loại nấm khác (Chang và cộng sự, 1996; Mau và cộng sự, 2001). Đặc biệt
thành phần protein của nấm Linh chi có rất nhiều các amino acid thiết yếu nhất là
lysine và leucine. Hàm lượng chất béo tổng thấp nhưng chứa nhiều acid béo không
bão hòa nhiều nối đôi, đây là các hợp chất rất có lợi cho sức khỏe của con người
(Chang và cộng sự, 1996 ; Borchers và cộng sự, 1999).
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất
sinh học có tác dụng dược lý trong nấm Linh chi bao gồm các nhóm chính:
polysaccharides, triterpenoids, protein, peptide, adenosine và nucleoside ( Zhou và
-5-


Đồ án tốt nghiệp

cộng sự, 2007; Zhang W và cộng sự, 2008).
Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào nhóm polysaccharides
và nhóm triterpenoids. Hơn 200 polysaccharides đã được phân lập từ quả thể và
sợi nấm của loại nấm này, trong số đó β - 1 - 3 và β - 1 - 6 D - glucans là những
thành phần có hoạt tính sinh học chính (Bao X và cộng sự, 2002). Nhiều tác dụng
dược lý của chúng chẳng hạn như điều hoà miễn dịch, chống oxy hóa, hoạt động
kháng u…đã được chứng minh trong nhiều mô hình động vật (Gou L và cộng sự,
2009; Chang KC và cộng sự, 2007). Cho đến nay, hơn 130 triterpenes đã được
phân lập từ G. lucidum và các hợp chất này được chú ý do tác dụng bảo vệ gan, ức
chế sự tăng trưởng khối u (Kimura Y và cộng sự, 2002). Đặc biệt trong nấm Linh
chi, có hàm lượng germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 – 8 lần) (Boh B và
cộng sự, 2007).
Ngoài ra, nấm Linh chi cũng có chứa một mạng lưới chitin, đây là thành
phần mà cơ thể người không tiêu hóa được và đóng vai trò tạo nên độ cứng cáp
cho nấm Linh chi (Upton và cộng sự, 2000).
1.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nấm Linh chi trên thế giới và Việt Nam
Linh chi đã được dùng cách đây hàng ngàn năm và đã được chọn lọc thành

những chủng thương phẩm, trồng nhiều ở các nước Châu Á như Nhật Bản, Trung
Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam…
Năm 1997 sản lượng Linh chi được thống kê trên thế giới như sau: 4.300
tấn trong đó Trung Quốc sản xuất đã là 3.000 tấn. Hàn Quốc là nước sản xuất Linh
chi nhiều thứ hai trên thế giới sau Trung Quốc, sản lượng của Hàn Quốc năm 1998
là 1307 tấn.
Hơn 90 thương hiệu của các sản phẩm Gerdonama lucidum đã được đăng kí và
bán trên thị trường quốc tế (Lin S, 2000). Tiêu thụ trên toàn thế giới hiện nay ước tính
khoảng vài ngàn tấn và thị trường đang phát triển nhanh chóng. Mặc dù không có
những dữ liệu gần đây công bố liên quan đến tổng giá trị các sản phẩm Linh chi trên
thế giới nhưng năm 1995, tổng giá trị ước tính hàng năm được đưa ra bởi các nguồn
thương mại khác nhau là 1628 triệu USD (Chang và Buswell, 1999). Nhiều sản phẩm

-6-


Đồ án tốt nghiệp

Gerdonama lucidum được sản xuất từ các bộ phận khác nhau của nấm, hiện đang
có sẵn trên thị trường (Chang và Buswell, 2008).
Tại Việt Nam, nấm Linh chi thương phẩm được trồng đầu tiên năm 1987 tại
“Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu Tp.HCM”. Sau đó, phong trào
trồng nấm Linh chi dần dần lan rộng khắp cả nước. Sau 25 năm, sản lượng Linh
chi của cả nước ước chừng 50 tấn/ năm. Trong đó, Trung tâm đã là 30 tấn, còn 20
tấn còn lại là do các trang trại hoặc các hộ nông dân của các tỉnh trồng.
Hiện nay trên thị trường cả nước và nhất là thành phố Hồ Chí Minh bày bán
các sản phẩm được chế biến từ Linh chi và nhiều nhất là tai nấm Linh chi. Linh chi
có nhiều chủng loại, giá bán thị trường tùy thuộc vào chất lượng và giá trị sử dụng
của nấm, hiện nay giá nấm cao nhất là nấm có nguồn gốc Hàn Quốc. Bên cạnh đó,
việc tiêu thụ Linh chi ở Việt Nam tương đối khó do phải bảo đảm chất lượng và giá

thành còn cao so với thu nhập kinh tế của người dân Việt Nam nên phong trào
trồng Linh chi ở Việt Nam không được mạnh so với các nước trong khu vực.
1.1.5. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2005)
Tương tự như bất kì loại vật nuôi hay cây trồng nào khác, nấm cũng có thể
bị rất nhiều bệnh. Trong hầu hết các trường hợp, bệnh làm giảm sản lượng và chất
lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng. Bệnh có thể xảy ra
ở bất kì giai đoạn nào của quá trình nuôi trồng nấm và có 2 dạng chủ yếu là bệnh
sinh lý và bệnh nhiễm.
Bệnh sinh lý là do sợi tơ nấm rất mỏng manh và yếu ớt nên dễ bị tác động
của các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, pH, oxy...và cả độ ẩm của môi
trường. Thường tơ yếu dần đến khi sức đề kháng giảm, dễ nhiễm bệnh và chết.
Bệnh nhiễm với yếu tố gây bệnh rất đa dạng đa số là các nhóm vi sinh vật như
vi khuẩn, nấm mốc, nấm nhầy… Trong đó, vi khuẩn và nấm mốc có tốc độ sinh sản
nhanh, đặc biệt bào tử nấm mốc phát tán rộng nên khả năng lây nhiễm của chúng
thường nhiều hơn. Các tác nhân này ảnh hưởng gián tiếp đến sinh trưởng và phát triển
của nấm, bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng, sống kí sinh hút dinh dưỡng hay thay đổi
pH của môi trường…Hậu quả là tai nấm mọc chậm, thưa, thậm chí ngừng lại. Quả thể

-7-


Đồ án tốt nghiệp

không tạo thành hoặc dị dạng, năng suất giảm. Bên cạnh đó, cơ chất dùng nuôi cấy
hoặc trồng nấm cũng có thể là thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật khác.
Đối với nhiễm bịch phôi có thể gặp mốc cam Neuroora.sp, đây là mốc hoại
sinh, xuất hiện giai đoạn đầu sau cấy giống. Mốc tăng trưởng nhanh sinh tơ ăn đầy
bịch phôi, tơ có màu vàng hoặc hồng. Sau đó xuất hiện khối thịt nấm màu cam qua
miệng bịch hoặc vết rách trên bịch. Bệnh lây lan nhanh nên cần cô lập và dập ngay
nguồn bệnh.

Tác nhân gây bệnh khác có thể gặp trong nuôi trồng là nấm nhầy Exomycetes.
Nguyên nhân do vệ sinh kém, nơi trồng ẩm ướt, nhà trồng hoặc dàn kệ bằng gỗ hay
nguyên liệu xử lý không tốt. Bệnh biểu hiện dạng bọt trắng hay đục sữa, nhưng phổ
biến vẫn là những vết lan thành hình rễ cây màu trắng hoặc vàng. Thể sinh sản gồm
các túi mang bào tử. Bệnh làm giảm chất lượng nấm và cạnh tranh một phần thức ăn,
nhưng nấm vẫn có thể tạo tai và phát triển bình thường.
Ngoài ra, nấm có thể bị bệnh mốc xanh gây ra bởi loài Trichoderma, là một vấn
đề nghiêm trọng cho những người trồng nấm trên toàn thế giới, bao gồm Croatia
(Hatvani L và cộng sự, 2012). Nhiều chủng nấm Trichoderma được phân lập xem như
là tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò
(Pleurotus ostreatus) nhiễm mốc xanh ở Croatia. Một nghiên cứu công bố loài
Trichoderma longibrachiatum là tác nhân gây bệnh nấm mốc xanh làm thiệt hại đáng
kể trong sản xuất nấm trồng, bao gồm nấm nút trắng (Agaricus biorus sp.) và nấm sò
(Pleurotus ostreatus) (Kredics và cộng sự, 2010). Đây là nấm mốc kí sinh và khả năng
gây hại rất lớn, thậm chí trên cả tai nấm (Linh chi) (Lê Duy Thắng, 2005).

Theo A. K. Mukherjee và cộng sự (2014) khi nghiên cứu tiềm năng kiểm
soát sinh học của các chủng Trichoderma phân lập trên nấm hoang dã và vỏ cây
cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum CICR-G được phân lập và xem là
một tác nhân kí sinh gây bệnh trên nấm Linh chi ngoài tự nhiên.

-8-


Đồ án tốt nghiệp

A B

C

Hình 1.3. Nấm bệnh thường gặp trong trồng nấm: A: Nấm mốc cam Neurospora
sp. nhiễm trên miệng bọc phôi trồng nấm; B: Nấm nhầy Exomycetes sp. nhiễm trên

phôi trổng nấm tạo; C: Nấm Trichoderma sp. kí sinh trên tai nấm Linh chi.
Trong nuôi trồng, nhiều khi xuất hiện những nấm ngoài ý muốn, gọi là nấm dại.
Nấm dại thực ra là một trong những loài nấm lớn. Chúng có sẵn trong nguyên liệu, do
không khử trùng hoặc khử trùng không đúng quy cách, bào tử của những nấm này tồn
tại và phát sinh trở lại trên cơ chất trồng nấm. Bào tử nấm dại cũng có thể xâm nhập
vào qui trình trồng nấm ở một giai đoạn nào đó. Chúng phát triển và cạnh tranh thức
ăn với nấm trồng, kết quả làm sản lượng giảm và đôi khi cản trở sự phát sinh quả thể
của nấm trồng. Thường gặp nhất là loài Coprinus (nấm đậu...). Quả thể nấm tương tự
nấm rơm, tai nấm lúc non dạng búp, trưởng thành có dạng dù, nhưng mau tàn, mũ
nhanh chóng chảy rữa ra thành dịch nước đen, nên còn có tên gọi nấm mực hoặc hắc
thủ… Nấm phát triển tốt trên cơ chất có nhiều urê, pH thấp và độ ẩm cao, là một trong
những đối tượng cạnh tranh với nấm rơm và một số loài nấm trồng khác.

Ngoài Coprinus, nhiều loài nấm phá hoại gỗ khác, như Schizophyllum
commun, Trametes sp., Poria sp., Hypoxylon sp.…. Các loài này chủ yếu cạnh
tranh về thức ăn với nấm trồng và thường xuất hiện khi trồng với gỗ khúc…

-9-


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Một số loài nấm mốc thường gặp trong nuôi trồng nấm (Lê Duy Thắng, 2001)

STT

1

2

3

4

-10-


Đồ án tốt nghiệp

5

6

7

-11-


Đồ án tốt nghiệp

1.2. Giới thiệu về nấm Trichoderma
1.2.1. Phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc
định danh, phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại
vẫn chưa được biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào
sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh
sản bào tử vô tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:

Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Sordariomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Hypocreaceae

Chi:

Trichoderma

Hình 1.4. Hình thái nấm Trichoderma harzianum
( />1.2.2. Đặc điểm hình thái
Sợi nấm của Trichoderma có tốc độ phát triển rất nhanh, chúng có thể đạt
đường kính khuẩn lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy. Trên môi trường PGA ban
đầu có màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục
trắng. Ở một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch

-12-


Đồ án tốt nghiệp

của môi trường PGA hóa vàng (Bùi Xuân Đồng, 1982).
Sợi nấm Trichoderma không màu, có vách ngăn, cành bào tử không màu,
cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn
mang các bào tử đính ở đỉnh. Bào tử thường có màu xanh, hình tròn, elip hoặc
hình oval tùy từng loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 µm.
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà
Trichoderma harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp
chất dinh dưỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng
sống sót của Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng
nên Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Gary
J. Samuels, 2004).
1.2.3. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa (Gary J. Samuels, 2004)
Nấm Trichoderma phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận
nhiệt đới, chúng hiện diện trong đất, trên rễ cây hay sống trên xác bã hữu cơ hay kí
sinh trên những loại nấm khác. Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở
trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5. Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5. Nhiệt độ để
0

Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 – 30 C. Một vài dòng phát triển tốt ở
0

0

35 C. Một số ít phát triển được ở 40 C. Hình thái khuẩn lạc và bào tử của
0

Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 35 C chúng tạo ra
những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường,
0

ở 37 C không tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic
(enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2
enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối
kháng với Trichoderma. Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nẩy
mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được nghiên cứu nhiều.

-13-


Đồ án tốt nghiệp

1.2.4. Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh cây
trồng (Gary J. Samuels, 2004; Gary E. Harman và cộng sự, 2005)
Nấm Trichoderma đã được biết đến từ những năm 1920 là yếu tố kiểm soát
chống lại mậm bệnh gây hại cây trồng. Chi Trichoderma có khả năng đối kháng
nhiều loại nấm gây bệnh thực vật. Các cơ chế chính để kiểm soát nấm hại được
biết đến bao gồm tính kí sinh nấm (giao thao sợi nấm, tiết enzyme phân hủy vách
tế bào), tiết kháng sinh kháng nấm, cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian sống.
Cho đến nay, nấm Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại
nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis
spp. và Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt,
sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà
chua…(Susanne Zeilinger và Markus Omann, 2007).

a. Kí sinh nấm
Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Weidling
(1932) đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma kí sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho
hiện tượng đó là “giao thoa sợi nấm”.
Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” là hiện tượng tấn công trực tiếp của nấm
này lên một nấm khác. Nó là một quá trình rất phức tạp bao gồm các bước chính
sau: đầu tiên là nhận biết sự có mặt của nấm bệnh, sau đó là quá trình tấn công,
xuyên qua thành tế bào và cuối cùng giết chết nấm bệnh. Một số chi tiết của cơ chế
này ở Trichoderma đã được nghiên cứu và làm sáng tỏ.
Để giải thích rõ hiện tượng “giao thoa sợi nấm” chúng ta có thể chia quá
trình tấn công của nấm Trichoderma đối với nấm bệnh làm 3 giai đoạn.
Giai đoạn 1: Bước đầu tấn công nấm bệnh
Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm kí chủ. Hiện
tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma (Elad và cộng sự, 1983). Sau
khi tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và
cuộn quanh tơ nấm kí chủ, ép chặt sợi nấm và phát triển song song với nấm kí chủ.
Kết thúc giai đoạn đầu, nấm Trichoderma bước qua giai đoạn 2 là tiết enzyme.
-14-