Nghiên Cứu Quá Trình Tiền Xử Lý Và Hệ Vi Sinh Vật Phân Giải Vỏ Quả Cà Phê Vối (Coffea Robusta)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI
(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG
MSNCS: P1114004

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI
(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã ngành: 62.54.01.01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS. LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY

TS. PHẠM VĂN TẤN

2020


LỜI CẢM ƠN
Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực của
chính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thân
cùng bạn bè. Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị.
Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Lê Nguyễn Đoan Duy,
người hướng dẫn chính và TS. Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ. Hai thầy
đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có
những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của
tôi. Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình.
Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy.
Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Hồ Quảng Đồ, PGS.
TS. Nguyễn Văn Mười, PGS. TS. Lý Nguyễn Bình, PGS. TS. Nguyễn Công
Hà, PGS. TS. Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt tiến trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa
Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực
phẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường.
Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ
Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh
lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Nhà trường và Viện đã hỗ trợ kinh phí,
điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường
Đại học Cần Thơ. Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảm và sự quan
tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xin cảm ơn các bạn
rất nhiều.

Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn
luôn ủng hộ, sát cánh bên tôi. Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng.
NCS
Đỗ Viết Phương
i


TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích
hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta). Đồng thời, nghiên
cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập
được từ quả cà phê. Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy
phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thương mại. Bên
cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập các thông số cho
quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenol
trong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích ly
thông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêu
âm. Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiền
xử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đến mức
độ suy giảm hemicellulose và lignin. Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập
nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn: đất trồng,
quả cà phê, thân cành lá. Sau đó là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm
mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khác nhau bao gồm:
(NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone. Enzyme thu nhận được cùng với enzyme
thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả kinh
tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3. Bên cạnh đó, để đảm bảo cho quá
trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phải được kiểm tra và loại
bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men. Nội dung cuối cùng là khảo sát
một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như là khảo sát một

số phương pháp lên men khác nhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằng
phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và 87,7%
(đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại. Tuy nhiên, vì lý
do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thường bằng nước
nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol. Khi so sánh các
phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phương pháp kết
hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4%
hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điều
kiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở 120oC
trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng 20 phút.
Trong số 5 dòng nấm mốc phân lập được thì chủng Trichoderma asperellum
QT5 (phân lập từ quả) có khả năng sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao nhất
và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng cơ bản.
Sau đó enzyme cellulase thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ
ii


enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL).
Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủy phân
và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởi enzyme
cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằng enzyme
thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp
hơn 13,8%. Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF
cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt
thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu quả thủy phân
cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian như nhau.
Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum, thu
nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê.

iii


ABSTRACT
The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment
method for coffee pulp (Coffea robusta). In addition, the study also focused on
recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries. After that, this enzyme
was used in hydrolysis of the coffee pulp. Hydrolysis efficiency of the enzyme
was compared with that of commercial enzymes. Besides, the condition of
hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process
were also studied.
The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from
coffee pulp using three different extraction methods including maceration,
microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction. Then,
experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid,
alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on
removing of hemicellulose and lignin. In the second research, the isolation of
mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various
sources such as soil, branches, trunks, coffee pods. The third research was the
recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various
precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone. The cellulase
enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee
pulp. Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared
between the two enzymes. Besides, to ensure that the fermentation was perfect,
the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to
yeast. The final content was to study some main factors affecting the
fermentation process as well as to investigate some different fermentation
methods.
The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and
polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3%

and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively. These were higher than
those of the other methods. However, due to economic aspects and feasibility,
the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process.
When comparing different pretreatment methods, it revealed that the
pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the
most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was
retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed
under treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes, alkali
pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, and microwave
at 327 W for 20 minutes. Among five strains of molds isolated, Trichoderma
asperellum QT5 had the highest activity of cellulase biosynthesis and reached
iv


to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium.
Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was
1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL). In addition,
when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentation
processes, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzate using
the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercial
Viscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower. Furthermore,
result of the study also showed that the SHF fermentation method was more
effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring the fermentation time.
By contrast the SSF fermentation method was more effective hydrolysis than
the others in the same fermentation time.
Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp,
enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum.

v

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên
cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận
án cùng cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày

tháng

Người hướng dẫn

Người thực hiện

Lê Nguyễn Đoan Duy

Đỗ Viết Phương

vi

năm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT ................................................................................................................... ii
ABSTRACT ............................................................................................................... iv
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. x

DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................ xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................... xv
Chương 1: GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................... 3
1.2.1 Mục tiêu tổng quát .............................................................................................. 3
1.2.2 Mục tiêu cụ thể .................................................................................................... 3
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................... 3
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: ........................................................................................ 3
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu:............................................................................................ 3
1.4 Ý nghĩa của luận án ................................................................................................ 4
1.4.1 Ý nghĩa khoa học ................................................................................................ 4
1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 4
1.5 Điểm mới của luận án ............................................................................................ 4
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
2.1 Nguyên liệu cà phê ................................................................................................. 5
2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối........................................................................... 5
2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê ...................................................................... 8
2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol ................................... 10
2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học) ....................... 11
2.2.1 Cấu tạo và tính chất của cellulose ..................................................................... 13
2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose ............................................................. 15
2.2.3 Cấu tạo và tính chất của lignin .......................................................................... 18
2.3 Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê ...................................................................... 19
2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose .................................................................. 20
2.3.2 Cơ chế thủy phân hemicellulose ....................................................................... 22
2.3.3 Cơ chế phân hủy lignin ..................................................................................... 26
2.4 Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose ..................................... 27
2.4.1 Tiền xử lý bằng acid .......................................................................................... 28
2.4.2 Tiền xử lý bằng kiềm ........................................................................................ 31

vii


2.4.3 Tiền xử lý bằng vi sinh vật ................................................................................ 33
2.5 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus và Trichoderma ........................................... 36
2.5.1 Giới thiệu về Aspergillus niger ......................................................................... 36
2.5.2 Giới thiệu về Trichoderma ................................................................................ 37
2.5.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
cellulase ...................................................................................................................... 38
2.6 Thực trạng sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam .................................... 42
2.6.1 Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới ............................................................ 42
2.6.2 Tình hình sản xuất ethanol ở Việt Nam ............................................................ 44
2.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................................... 46
2.7.1 Một số nghiên cứu về tiền xử lý sinh khối lignocellulose ................................ 46
2.7.2 Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose ................. 48
Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 52
3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 52
3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 52
3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................... 52
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 53
3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 54
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu ............................................................................... 54
3.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc .............................................................. 55
3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả ............................................................. 56
3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................. 57
3.3.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối............................. 58
3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê .................................. 58
3.3.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc ....................................... 66
3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân .............. 70

3.3.5 Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men ........................ 74
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 78
4.1 Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối ........................................... 78
4.2 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm lượng cellulose,
hemicellulose và lignin .............................................................................................. 79
4.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol
.................................................................................................................................... 79
4.2.2 Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol ........................ 82
4.2.3 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng
cellulose, hemicellulose và lignin .............................................................................. 84
4.2.4 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng
cellulose, hemicellulose và lignin ............................................................................... 90

viii


4.2.5 Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P. chrysosporium .......................... 93
4.2.6 Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả
cà phê ......................................................................................................................... 96
4.3 Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc ............................................................ 103
4.3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm
Aspergillus và Trichoderma ..................................................................................... 103
4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc phân lập được
.................................................................................................................................. 105
Định danh năm dòng nấm mốc phân lập được......................................................... 108
4.3.3 Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T. asperellum QT5 ........... 109
4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối (NH4)2SO4 ..... 115
4.3.5 Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối NaCl .............. 116
4.3.6 Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng dung môi ethanol và
acetone...................................................................................................................... 117

4.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê bởi hệ enzyme
cellulase .................................................................................................................... 120
4.4.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy phân ...................... 120
4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân.............................. 123
4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân ....................... 125
4.4.4 Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận từ
nấm mốc T. asperellum QT5 .................................................................................... 127
4.4.5 Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân ................................................ 131
4.5 Nghiên cứu quá trình lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê ............................ 135
4.5.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên men
.................................................................................................................................. 135
4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được ............... 136
4.5.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được .............. 137
4.5.4 Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được ....... 139
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................ 142
5.1 Kết luận .............................................................................................................. 142
5.2 Đề xuất ............................................................................................................... 142
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 143
PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH ..................... 160
PHỤ LỤC B: BẢNG KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ...................... 172
PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH ............................................ 200
PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM .......................................... 209

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của quả cà phê vối ................................................. 5
Bảng 2.2: Thành phần hóa học lớp vỏ quả cà phê vối ................................................. 6
Bảng 2.3: Thành phần hóa học của lớp vỏ nhớt và vỏ trấu của quả cà phê vối ........... 7

Bảng 2.4: Thành phần chất xơ có trong sinh khối lignocellulose .............................. 13
Bảng 2.5: Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose ... 32
Bảng 2.6 Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose..... 39
Bảng 2.7: Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu ........................................................... 43
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc ......................................... 56
Bảng 4.1: Thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối ............................................... 78
Bảng 4.2: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu ......................................................... 82
Bảng 4.3: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF .......................... 82
Bảng 4.4: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy ............. 83
Bảng 4.5: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm......................... 84
Bảng 4.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ H2SO4
.................................................................................................................................... 85
Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong vỏ quả cà
phê theo tỷ lệ NaOH................................................................................................... 90
Bảng 4.8: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin theo thời gian và
độ ẩm nguyên liệu ...................................................................................................... 94
Bảng 4.9: Số dòng nấm mốc được phân lập từ một số nguồn ................................. 104
Bảng 4.10: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase ................ 106
Bảng 4.11: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase từ các dòng nấm mốc
.................................................................................................................................. 107
Bảng 4.12: Kết quả định danh các chủng nấm mốc phân lập được ......................... 109
Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng thu nhận enzyme
cellulase .................................................................................................................... 115
Bảng 4.14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase
.................................................................................................................................. 117
Bảng 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase
.................................................................................................................................. 118
Bảng 4.16: Ảnh hưởng của nồng độ acetone đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase
.................................................................................................................................. 118
Bảng 4.17: So sánh hiệu quả tinh sạch cellulase bằng các tác nhân kết tủa khác nhau

.................................................................................................................................. 119
Bảng 4.18: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose giải
phóng sau quá trình thủy phân ................................................................................. 121
Bảng 4.19: Chi phí thủy phân của các loại enzyme khác nhau ................................ 122
Bảng 4.20: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu...................................................... 128
Bảng 4.21: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF ...................... 128
Bảng 4.22: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy ......... 129
Bảng 4.23: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm..................... 131
Bảng 4.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được .... 138
Bảng 4.25: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF ............................... 140
Bảng PL B.1: Ảnh hưởng của các phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và
polyphenol ................................................................................................................ 172
Bảng PL B.2: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ
H2SO4 ....................................................................................................................... 172

x


Bảng PL B.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay
đổi hàm lượng cellulose ........................................................................................... 173
Bảng PL B.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay
đổi hàm lượng hemicellulose ................................................................................... 174
Bảng PL B.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay
đổi hàm lượng lignin ................................................................................................ 176
Bảng PL B.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ
NaOH ....................................................................................................................... 178
Bảng PL B.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay
đổi hàm lượng cellulose ........................................................................................... 178
Bảng PL B.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay
đổi hàm lượng hemicellulose ................................................................................... 180

Bảng PL B.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay
đổi hàm lượng lignin ................................................................................................ 182
Bảng PL B.10: Tiền xử lý bằng chủng nấm P. chrysosporium................................ 183
Bảng PL B.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổi
hàm lượng đường khử có trong dịch tiền xử lý........................................................ 185
Bảng PL B.12: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau .................. 185
Bảng PL B.13: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình
thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân vỏ quả cà phê ........... 186
Bảng PL B.14: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase .......... 187
Bảng PL B.15: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase .......................... 189
Bảng PL B.16: Hoạt tính CMCase theo các điều kiện nuôi cấy .............................. 189
Bảng PL B.17: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối
(NH4)2SO4 ................................................................................................................ 191
Bảng PL B.18: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối NaCl
.................................................................................................................................. 191
Bảng PL B.19: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với ethanol
.................................................................................................................................. 192
Bảng PL B.20: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với acetone
.................................................................................................................................. 193
Bảng PL B.21: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose
được giải phóng sau quá trình thủy phân ................................................................. 194
Bảng PL B.22: Chi phí khi sử dụng các loại enzyme khác nhau ............................. 194
Bảng PL B.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase bổ sung vào quá trình thủy phân
.................................................................................................................................. 195
Bảng PL B.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng đường khử ...... 195
Bảng PL B.25: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử .... 196
Bảng PL B.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình
thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân ...................................................... 196
Bảng PL B.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 . 197
Bảng PL B.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến quá trình lên men ...... 197

Bảng PL B.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol .............. 198
Bảng PL B.30: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol ............. 198
Bảng PL B.31: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF ......................... 199

xi


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Cấu tạo quả cà phê vối ................................................................................. 5
Hình 2.2: Các thành phần của vỏ qủa cà phê ............................................................... 6
Hình 2.3: Quy trình chế biến cà phê nhân ở Việt Nam ................................................ 7
Hình 2.4: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ vỏ quả cà phê................................. 8
Hình 2.5: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn cellulose trong vỏ quả cà phê
...................................................................................................................................... 9
Hình 2.6: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn hemicellulose trong vỏ quả cà
phê ................................................................................................................................ 9
Hình 2.7: Cấu trúc của lignocellulose ........................................................................ 12
Hình 2.8: Mô phỏng cấu trúc của sinh khối lignocellulose ....................................... 12
Hình 2.9: Cấu trúc cellulose ....................................................................................... 14
Hình 2.10: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ hạt kín ..................... 16
Hình 2.11: Arabino – 4 – O – methylglucuronoxylan từ hạt trần .............................. 16
Hình 2.12: Glucomannan từ hạt kín ........................................................................... 17
Hình 2.13: O – acetylgalactoglucomannan từ hạt trần ............................................... 17
Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin .................................................................... 19
Hình 2.15: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases ......................................... 20
Hình 2.16: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases ......................................... 21
Hình 2.17: Cơ chế hoạt động của Exo-β-1,4-glucanases ........................................... 21
Hình 2.18: Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulase ............................................ 22
Hình 2.19: Quá trình thủy phân hemicellulose bởi acid/kiềm ................................... 23
Hình 2.20: Sơ đồ chung quá trình thủy phân hemicellulose ...................................... 24

Hình 2.21: Sơ đồ hình thành furfural từ đường 5C .................................................... 24
Hình 2.22: Sơ đồ hình thành HMF từ đường 6C ....................................................... 25
Hình 2.23: Hydrate hóa HMF .................................................................................... 25
Hình 2.24: Tóm tắt sơ đồ hình thành một số chất gây độc ........................................ 26
Hình 2.25: Quá trình phân hủy lignin bởi kiềm ......................................................... 27
Hình 2.26: Quá trình phân hủy lignin bởi acid .......................................................... 27
Hình 2.27: Cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi tiền xử lý ..................................... 28
Hình 2.28: Phanerochaete chrysosporium trên môi truờng nuôi PGA ..................... 35
Hình 3.1: Quả và vỏ cà phê vối tươi .......................................................................... 52
Hình 3.2: Các kích thước vỏ quả cà phê sau khi nghiền và sàng ............................... 55
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................. 57
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời
gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ................................ 61
Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ, nhiệt độ và thời gian
tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ ........................................ 63
Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử
lý bằng nấm mục trắng P. chrysosporium đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ ......... 64
Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 cho vào
để khử độc dịch thủy phân ......................................................................................... 73
Hình 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và
polyphenol .................................................................................................................. 80
Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi
hàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê .............................................................. 87
Hình 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi
hàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê ...................................................... 87
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi
hàm lượng lignin có trong vỏ quả cà phê ................................................................... 87

xii

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi
hàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê .............................................................. 91
Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi
hàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê ...................................................... 91
Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi
hàm lượng lignin có trong vỏ quả cà phê ................................................................... 91
Hình 4.8: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổi hàm
lượng đường khử có trong dịch tiền xử lý ................................................................. 98
Hình 4.9: Sự thay đổi thành phần chất xơ trong vỏ quả cà phê theo các phương pháp
tiền xử lý khác nhau ................................................................................................... 98
Hình 4.10: Bề mặt của vỏ quả cà phê sau khi được tiền xử lý bằng các phương pháp
khác nhau dưới kính hiển vi điện tử (SEM) ............................................................. 100
Hình 4.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành
đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân ............................................ 101
Hình 4.12: Sự thay đổi tỷ lệ các thành phần có trong vỏ quả cà phê qua các bước tiền
xử lý khác nhau ........................................................................................................ 103
Hình 4.13: Sự thay đổi màu sắc, hình dạng của nguyên liệu qua các bước tiền xử lý
khác nhau ................................................................................................................. 103
Hình 4.14: Khuẩn lạc của Aspergillus phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và từ
đất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) ..................................................... 105
Hình 4.15: Khuẩn lạc của Trichoderma phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và
từ đất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) ................................................. 105
Hình 4.16: Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng nấm mốc .................. 108
Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt lực CMCase... 110
Hình 4.18: Ảnh hưởng của pH và nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase
.................................................................................................................................. 112
Hình 4.19: Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase ........................ 113
Hình 4.20: Ảnh hưởng của cơ nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase ... 114
Hình 4.21: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy ................ 124

Hình 4.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử
.................................................................................................................................. 125
Hình 4.23: Đường khử tạo thành ở 50oC giữa enzyme thu nhận được với enzyme
thương mại ............................................................................................................... 125
Hình 4.24: Mối tương quan giữa các nhân tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử ở
các mức tối ưu .......................................................................................................... 130
Hình 4.25: Mối tương quan giữa giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán của hàm lượng
đường khử ................................................................................................................ 131
Hình 4.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành
HMF và furfural có trong dịch thủy phân ................................................................ 132
Hình 4.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 ........ 134
Hình 4.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol và đường
glucose...................................................................................................................... 135
Hình 4.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được ...... 136
Hình 4.30: Ethanol thu được theo thời gian lên men ............................................... 138
Hình PL D.1: P. chrysosporium nuôi cấy 7 ngày .................................................... 209
Hình PL D.2: Nhân giống chủng P. chrysosporium ................................................ 209
Hình PL D.3: Quả cà phê mốc ................................................................................. 210
Hình PL D.4: Đất trồng cà phê ................................................................................ 210
Hình PL D.5: Thân cành cà phê ............................................................................... 210
Hình PL D.6: Vi sinh vật phát triển trên đất, cành lá và quả cà phê ........................ 211

xiii


Hình PL D.7: A. niger và T. asperellum phân lập được từ cà phê ........................... 211
Hình PL D.8: T. longibrachiatum và P. Chrysosporium phân lập được từ cà phê .. 211
Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu .......................................................................... 212
Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý ............................................................... 212
Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ ........................................................... 212

Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý .................................................................. 213
Hình PL D.13: Tiền xử lý bằng chủng P. chrysosporium sau 10, 15 và 20 ngày .... 213
Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thô .......................................................................... 213
Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn ................................................................... 214
Hình PL D.16: Nhân giống nấm men....................................................................... 214
Hình PL D.17: Dịch thủy phân ................................................................................ 214
Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân .................................................................. 214

xiv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AAO

: Aryl alcohol oxidases

ABTS

: 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

AOAC

: Association of Official Analytical Chemists

CBH

: Cellobiohydrolase

CBU

: Cellobiose unit

CK

: Chất khô

CMC

: Carboxymethyl cellulose

CMCase

: Carboxymethyl cellulase assay

CTAB

: Cetyl-trimethylammonium bromide

ĐC

: Đối chứng

DNS

: 3,5-dinitrosalicylic acid

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

FC

: Folin–Ciocalteu reagent

FPU

: Filter paper unit

GLOX

: Glyoxal oxidase

HMF

: 5-Hydroxymethylfurfural

HPLC

: High-performance liquid chromatography

LiP

: Lignin peroxidase

MnP

: Manganese peroxidase

MTBE

: Methyl tert butyl ether

NL

: Nguyên liệu

NLSH

: Năng lượng sinh học

PGA

: Potato glucose agar

PPNN

: Phụ phẩm nông nghiệp

PTN

: Phòng thí nghiệm

SEM

: Scanning electron microscopy

SHF

: Separate hydrolysis and fermentation

SSF

: Simultaneous saccharification and fermentation

TN

: Thí nghiệm

TP.HCM

: Thành phố Hồ Chí Minh

TXL

: Tiền xử lý

VSV

: Vi sinh vật

xv


Chương 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam hiện nay là nước xuất khẩu cà phê vối đứng thứ nhất trên5
3.23
4.715
6.25
7.975

8.61

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

Bảng PL B.12: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau
Phương pháp TXL
Nguyên liệu
Đối chứng
Acid
Kiềm
Kiềm-Acid
Acid-Kiềm
Acid-Kiềm-Vi sóng
VSV

Cellulose
(g/100g khô)
25,88±0,2a
25,51±0,4a
23,95±0,38b
18,44±0,31d
18,21±0,26d
17,02±0,36e

16,97±0,28e
20,51±0,21c

Hemicellulose
(g/100g khô)
3,67±0,17a
3,18±0,16b
2,06±0,19c
1,94±0,12cd
1,66±0,12d
1,15±0,18e
1,05±0,05e
3,2±0,07b

Lignin
(g/100g khô)
20,07±0,26a
19,56±0,25b
19,23±0,16b
4,69±0,09d
4,54±0,09de
4,32±0,12de
4,17±0,08e
9,99±0,14c

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests hàm lượng cellulose theo các phương pháp tiền xử lý
Phuong phap TXL
Acid-Kiem-Vi song

Acid-Kiem
Kiem-Acid
Kiem
VSV
Acid
Doi chung
Nguyen lieu

Count
3
3
3
3
3
3
3
3

Mean
16.97
17.02
18.21
18.44
20.505
23.945
25.505
25.875

Homogeneous Groups
X

X
X
X
X
X
X
X

185


Bảng Multiple Range Tests hàm lượng hemicellulose theo các phương pháp tiền xử
lý
Phuong phap TXL
Acid-Kiem-Vi song
Acid-Kiem
Kiem-Acid
Kiem
Acid
Doi chung
VSV
Nguyen lieu

Count
3
3
3
3
3
3

3
3

Mean
1.05
1.15
1.655
1.935
2.06
3.18
3.2
3.665

Homogeneous Groups
X
X
X
XX
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hàm lượng lignin theo các phương pháp tiền xử lý
Phuong phap TXL
Acid-Kiem-Vi song
Acid-Kiem
Kiem-Acid
Kiem
VSV

Acid
Doi chung
Nguyen lieu

Count
3
3
3
3
3
3
3
3

Mean
4.17
4.32
4.54
4.685
9.985
19.225
19.56
20.065

Homogeneous Groups
X
XX
XX
X
X

X
X
X

Bảng PL B.13: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự
hình thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân vỏ quả cà phê
Phương pháp TXL
VSV
Acid-Kiềm-Vi sóng
Kiềm-Acid
Acid-Kiềm
Kiềm
Acid
Đối chứng

Glucose (g/L)
5,42±0,2f
26,39±0,68a
21,96±0,56c
24,52±0,71b
20,36±0,64d
9,26±0,33e
4,63±0,17f

Đường khử (g/L)
13,19±0,56e
34,14±0,9a
30,29±1,12b
32,77±0,89a
28,21±0,71c

19,58±0,84d
8,15±0,56f

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests hàm lượng glucose theo các phương pháp tiền xử lý
Phuong phap TXL
Doi chung
VSV
Acid
Kiem
Kiem-Acid
Acid-Kiem
Acid-Kiem-Vi song

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
4.625
5.415
9.26
20.355
21.96

24.515
26.385

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hàm lượng đường khử theo các phương pháp tiền xử lý
Phuong phap TXL
Doi chung
VSV
Acid
Kiem
Kiem-Acid
Acid-Kiem
Acid-Kiem-Vi song

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
8.15
13.19
19.58
28.205
30.285
32.77
34.14

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

186


Bảng PL B.14: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase
TT

Dòng nấm

1
2
3

4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24

DA1
DA2
QA1
QA2
QA3
QA4
QA5
QA6

CA1
CA2
CA3
CA4
CA5
DT1
DT2
QT1
QT2
QT3
QT4
QT5
CT1
CT2
CT3
CT4

Đường kính vòng phân giải CMC (mm)
24 giờ
36 giờ
48 giờ
ik
hij
4,3±0,1
7,8±0,4
10,6±0,6l
4,9±0,2ef
8,8±0,8gh
11,9±0,2jk
6,8±0,1c

12,3±0,4b
16,7±0,3de
6,0±0,1e
9,1±0,1g
12,8±0,3i
7,9±0,2a
13,9±0,9a
18,3±0,4b
5,1±0,1e
7,4±0,4ij
11,8±0,2jk
6,8±0,1c
11,9±0,7bc
16,3±0,4ef
4,1±0,1kl
6,9±0,4jk
10,5±0,1l
6,7±0,1c
12,4±0,5b
17,7±0,4c
6,4±0,1d
10,7±0,4ef
15,6±0,1g
3,9±0,1l
6,3±0,4kl
9,3±0,3m
4,1±0,1kl
6,9±0,5jk
10,2±0,3l
4,5±0,1gh

6,2±0,3kl
9,5±0,3m
4,5±0,1hi
7,5±0,4ij
10,3±0,3l
3,1±0,3m
5,5±0,6l
11,3±0,3k
5,8±0,2e
10,4±0,6f
13,3±0,4hi
4,6±0,1gh
8,3±0,7ghi
11,7±0,2jk
5,8±0,2e
9,2±0,3g
13,5±0,4h
6,4±0,2d
11,6±0,3bcd
16,1±0,1fg
6,4±0,2d
14,2±0,3a
19,8±0,3a
6,3±0,2d
11,1±0,1def
15,7±0,2g
7,1±0,3b
9,2±0,3g
16,8±0,1de
4,8±0,2fg

8,4±0,4ghi
12,1±0,1j
6,3±0,2d
12,4±0,7b
17,1±0,3cd

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests đường kính vòng phân giải ở 24 giờ
Dong nam
DT2
CA3
CA4
QA6
DA1
DT1
CA5
QT2
CT3
DA2
QA4
QT3
QT1
QA2
CT1
CT4

Count
3
3

3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

Mean
3.13333
3.93333
4.1
4.1
4.26667
4.5
4.53333
4.56667
4.76667
4.93333
5.06667
5.83333
5.83333
6.0

6.3
6.33333

Homogeneous Groups
X
X
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XX
X
X
X
X
X
X

187


QT5
QT4
CA2
CA1
QA5
QA1

CT2
QA3

3
3
3
3
3
3
3
3

6.36667
6.43333
6.43333
6.7
6.8
6.83333
7.1
7.86667

X
X
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests đường kính vòng phân giải ở 36 giờ
Dong nam
DT2
CA5
CA3
CA4
QA6
QA4
DT1
DA1
QT2
CT3
DA2
QA2
CT2
QT3
QT1
CA2
CT1
QT4
QA5
QA1
CA1
CT4
QA3
QT5

Count
3
3

3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

Mean
5.5
6.2
6.3
6.85
6.9
7.4

7.45
7.75
8.3
8.4
8.75
9.1
9.2
9.2
10.4
10.7
11.1
11.6
11.9
12.25
12.35
12.4
13.85
14.2

Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
XX
XX
XX
XXX
XXX
XXX

XX
X
X
X
X
XX
XXX
XXX
XX
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests đường kính vòng phân giải ở 48 giờ
Dong nam
CA3
CA5
CA4
DT1
QA6
DA1
DT2
QT2
QA4
DA2
CT3
QA2
QT1

QT3
CA2
CT1
QT4
QA5
QA1
CT2
CT4
CA1
QA3
QT5

Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

3
3
3
3
3
3
3

Mean
9.3
9.5
10.2
10.3
10.5
10.6
11.3
11.65
11.75
11.85
12.1
12.8
13.25
13.45
15.6
15.65
16.1
16.3
16.7
16.8
17.1

17.65
18.25
19.8

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X
XX
XX
XX
X
X
XX
X
X
X
XX
XX
XX
XX
XX
X
X
X

188


Bảng PL B.15: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase
TT

Dòng nấm

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

CA2
CT1
QT4
QA5
QA1
CT2
CT4
CA1
QA3
QT5

Đường kính vòng phân giải
(mm)
15,6a
15,7a
16,1ab
16,3bc
16,7bcd
16,8cd
17,1de
17,7ef
18,3f
19,5g

Hoạt tính CMCase (U/mL)
0,72±0,03a
0,78±0,01ab
0,79±0,05ab
0,89±0,05bc
0,81±0,03bc
0,82±0,03cd
0,96±0,04d
0,95±0,06d
1,06±0,01e
1,17±0,01f

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase
Dong nam
CA2

CT1
QT4
QA1
CT2
QA5
CA1
CT4
QA3
QT5

Count
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

Mean
0.72
0.78
0.785
0.81
0.82
0.885
0.945

0.955
1.06
1.17

Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
XX
XX
X
X
X
X

Bảng PL B.16: Hoạt tính CMCase theo các điều kiện nuôi cấy
Hoạt tính CMCase U/mL
Thời
gian

Nhiệt độ

3

4

5

6

7

8

9

0,4±0,028f

0,61±0,014e

0,86±0,028d

1,12±0,028c

1,6±0,085a

1,49±0,049b

1,21±0,014c

30

35

40

45

50

b

a

b

c

0,56±0,014d

1,69±0,049
pH

5

6

7

8

9

b

b

a

e

0,9±0,042e

1,84±0,057

2,37±0,078

1,01±0,064

60

80

100

120

e

d

c

a

5,16±0,049b

3,73±0,035

4,62±0,028

5,51±0,014

CMC

Rơm rạ

Bã mía

Vỏ cà phê

Bột giấy

Cám gạo

Xơ dừa

b

e

d

c

d

a

2,26±0,078f

4,04±0,042

4,7±0,283

5,21±0,014

4,6±0,035

9,76±0,049

BaCl2

KCl

FeSO4

MgSO4

CaCO3

Đối chứng

e

a

f

b

c

9,7±0,127d

9,31±0,028
Nitơ

1,79±0,021

40

7,1±0,141
Khoáng

0,89±0,028

d

2,26±0,057
Cảm ứng

1,71±0,014

4
1,37±0,028

Khoai
tây

1,84±0,014

11,93±0,035

4,4±0,071

11,22±0,028

10,6±0,071

NH4NO3

Cao thịt

(NH4)2SO4

NH3

KNO3

Đối chứng

b

e

a

f

c

9,7±0,071d

12,67±0,099

6,84±0,014

13,6±0,071

5,91±0,106

10,2±0,113

Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05

189


Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo thời gian
Thoi gian
3
4
5
6
9
8
7

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
0.4
0.61
0.86
1.12
1.21
1.485
1.6

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo nhiệt độ
Nhiet do

50
45
30
40
35

Count
3
3
3
3
3

Mean
0.56
0.89
1.685
1.71
1.84

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo pH
pH
9

8
4
5
6
7

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
0.9
1.005
1.37
1.785
1.84
2.365

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo nồng độ dịch chiết khoa tây
Khoai tay
40
60
80
120
100

Count
3
3
3
3
3

Mean
2.26
3.725
4.62
5.155
5.51

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo cơ chất cảm ứng

Cam ung
Xo dua
Rom ra
Bot giay
Ba mia
Vo cafe
CMC
Cam gao

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
2.255
4.04
4.595
4.7
5.21
7.1
9.755

Homogeneous Groups
X
X

X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo khoáng bổ sung
Khoang
FeSO4
BaCl2
Doi chung
CaCO3
MgSO4
KCl

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
4.4
9.31
9.7
10.6
11.22
11.925

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính CMCase theo nitơ bổ sung
Nito
NH3
Cao thit
Doi chung
KNO3
NH4NO3
(NH4)2SO4

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
5.905
6.84
9.7

10.2
12.67
13.6

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X

190


Bảng PL B.17: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối
(NH4)2SO4
Protein
Hoạt tính Hoạt tính riêng
Hiệu suất
(NH4)2SO4 /cellulase
(mg/mL)
0,96a
0,314b
0,306b
0,28b
0,316b
0,283b
0,322b

thô (w/v)
Đối chứng
F35 ÷ 45%
F45 ÷ 55%
F55 ÷ 65%
F65 ÷ 75%
F75 ÷ 85%
F85 ÷ 95%

(U/mL)
13,6a
7,28cd
8,01c
9,57b
13,9a
6,79d
4,61e

(U/mg)
14,16d
23,16c
26.18c
34,12b
43,92a
24,05c
14,33d

thu hồi (%)
100
33,95

37,65
54,7
70,51
36,82
21,8

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests protein
(NH4)2SO4
F55÷65
F75÷85
F45÷55
F35÷45
F65÷75
F85÷95
Doi chung

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
0.28
0.2825

0.306
0.314
0.316
0.322
0.96

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính
(NH4)2SO4
F85÷95
F75÷85
F35÷45
F45÷55
F55÷65
Doi chung
F65÷75

Count
3
3
3
3

3
3
3

Mean
4.61
6.79
7.28
8.01
9.57
13.6
13.9

Homogeneous Groups
X
X
XX
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính riêng
(NH4)2SO4
Doi chung
F85÷95
F35÷45
F75÷85
F45÷55
F55÷65

F65÷75

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
14.1935
14.3072
23.2434
24.1841
26.2115
34.4487
43.9923

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X
X

Bảng PL B.18: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối

NaCl
Protein
Hoạt tính
Hoạt tính riêng
Hiệu suất
NaCl /cellulase thô
(w/v)
Đối chứng
0 ÷ 15%
15 ÷ 20%
20 ÷ 25%
25 ÷ 30%
30 ÷ 35%

(mg/mL)
0,96a
0,315d
0,374cd
0,496b
0,471bc
0,516b

(U/mL)
13,6b
6,09e
7,95d
12,12c
16,42a
14,15b

(U/mg)
14,16e
18,66d
21.44cd
24,03bc
33,42a
26,8b

thu hồi (%)
100
36,17
42,35
62,67
78,36
52,13

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

191


Bảng Multiple Range Tests protein
NaCl
0÷15
15÷20
25÷30
20÷25
30÷35
Doi chung

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
0.314683
0.374401
0.471161
0.496185
0.516493
0.96

Homogeneous Groups
X
XX
XX
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính
NaCL
0÷15
15÷20
20÷25
Doi chung

30÷35
25÷30

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
6.09
7.95
12.12
13.6
14.145
16.42

Homogeneous Groups
X
X
X
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính riêng
NaCl
Doi chung

0÷15
15÷20
20÷25
30÷35
25÷30

Count
3
3
3
3
3
3

Mean
14.16
18.66
21.44
24.03
27681
33.42

Homogeneous Groups
X
X
XX
XX
X
X

Bảng PL B.19: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với
ethanol
Ethanol/enzyme thô
(v/v)
Đối chứng
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0

Protein
(mg/mL)
0,96a
0,365d
0,4cd
0,44cd
0,47c
0,438cd
0,66b

Hoạt tính
(U/mL)
13,6c
7,2g
10,77f
12,41d
17,07b
21,72a

11,5e

Hoạt tính riêng
(U/mg)
14,16e
19,72d
26.92c
28,2c
36,32b
49,59a
17,42de

Hiệu suất
thu hồi (%)
100a
47,81b
68,85c
76,51d
82,49e
89,43e
69,41c

Các giá trị cùng một cột có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

Bảng Multiple Range Tests protein
Etahnol
1,5
2,0
3,5
2,5

3,0
4,0
Doi chung

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
0.365
0.4
0.4375
0.44
0.4695
0.66
0.96

Homogeneous Groups
X
XX
XX
XX
X
X
X

Bảng Multiple Range Tests hoạt tính
Ethanol
1,5
2,0
4,0
2,5
Doi chung
3,0
3,5

Count
3
3
3
3
3
3
3

Mean
7.205
10.77
11.5
12.41
13.6
17.065
21.715

Homogeneous Groups

X
X
X
X
X
X
X

192