Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (docynia indica (wall ) decne) ở việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

LÊ XUÂN DUY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY
TRÌNH CƠNG NGHỆ CHIẾT XUẤT ĐỂ TẠO SẢN PHẨM CĨ
GIÁ TRỊ TỪ QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA (WALL.)
DECNE) Ở VIỆT NAM

Chun ngành: Kỹ thuật Hóa học
Mã số: 9.52.03.01

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2020


Cơng trình được hồn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS Vũ Đình Hồng
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS Nguyễn Mạnh Cường

Phản biện 1: …

Phản biện 2: …
Phản biện 3: ….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng …
năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN

BÀI BÁO QUỐC TẾ
1. Xuan Duy Le, Manh Cuong Nguyen, Dinh Hoang Vu, Minh Quan
Pham, Quoc Long Pham, Quang Tung Nguyen, Tuan Anh Nguyen,
Van Thinh Pham, Long Giang Bach, Tuong Van Nguyen.
“Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Total Phenolic
and Total Flavonoid from Fruits of Docynia indica (Wall.) Decne.
Using Response Surface Methodology”. Processes 7.8 (2019): 485.
(SCI-E, Q2), Doi:10.3390/pr7080485.
2. Le Xuan Duy, Le Ba Vinh, Gao Dan, Vu Dinh Hoang, Tran
Quoc Toan, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong “Soluble
epoxide hydrolase inhibitors from Docynia indica (Wall.)
Decne.”. Nat. Prod. Res. (2020): 1-6 (SCI-E, Q2), DOI:
10.1080/14786419.2020.1774759.
 BÀI BÁO TRONG NƯỚC

3. Lê Xuân Duy, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành, Cầm Thị Ính,
Đỗ Hữu Nghị, Hà Việt Hải, Vũ Đình Hồng, Đỗ Thị Nguyệt,
Phạm Quốc Long. “Một số kết quả nghiên cứu về thành phần
hóa học quả táo mèo (Docynia indica Wall.) Việt Nam”. Tạp
chí Khoa học công nghệ, tập 53 số 4C (2015) Tr 81-87.
4. Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Do Huu Nghi, Le Tat Thanh,
Vu Dinh Hoang, Young Ho Kim, Nguyen Manh Cuong.
“Triterpene acids from Docynia indica fruits and their cytotoxic
activity”. Vietnam J. Technol 56 (2018): 199-204
5. Le Xuan Duy, Nguyen Manh Cuong, Vu Dinh Hoang, Pham
Minh Quan, Lai Phuong Phuong Thao, Pham Quoc Long, Tran
Quoc Toan. “Process optimization for the extraction of
phenolics from the fruits of Vietnam Docynia indica (Wall.)
Decne.” Proceeding of international workshop (2019), pp. 506513 (ISBN:978-604-965-263-9).


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng nguồn thực vật tự nhiên để
chăm sóc sức khỏe, phịng ngừa và điều trị bệnh. Trong những năm trở lại
đây, xu hướng sử dụng các loại thảo dược trong phòng và chữa bệnh ngày
một gia tăng. Ngày nay, thảo dược không chỉ được sử dụng ở dạng thô
theo y học cổ truyền mà đã được áp dụng những công nghệ hiện đại trong
lĩnh vực Hóa học, Sinh học kết hợp cơng nghệ bào chế để tạo ra các sản
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, tính chất dược lý mạnh.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc thù nên có
nguồn thực vật phong phú và đa dạng ước tính có trên 13.000 nghìn lồi.
Theo y học dân tộc, có hơn 4000 lồi được sử dụng làm thuốc hoặc chăm
sóc sức khỏe con người. Với định hướng phát triển các loài cây dược liệu

để phục vụ đời sống, hiện nay ở nước ta đã hình thành nhiều khu vực canh
tác, trồng cây dược liệu ở quy mô lớn. Đặc biệt, Tại một số Tỉnh Tây bắc
như Yên bái, Sơn la, Điện biên những năm gần đây đang phát triển rất
mạnh loài táo mèo để phục vụ nhu cầu của người tiêu dùng.
Táo mèo có tên khoa học là Docynia indica (Wall.) Decne, thuộc họ
Hoa hồng (Rosaceae). Ở nước ta, táo mèo phân bố ở độ cao từ 1500m đến
2000m ở các tỉnh vùng núi Tây Bắc. Theo Y học cổ truyền, táo mèo có vị
chua chát, hơi ngọt, tính ấm, có tác dụng kiện vị, thuộc nhóm tiêu thực
hóa tích, chủ yếu điều trị các chứng rối loạn tiêu hóa do ăn nhiều thịt, dầu
mỡ, ăn không tiêu, giúp ăn ngon miệng. Quả táo mèo khi sấy khô là một
vị thuốc của Đông y giúp dịch vị tăng bài tiết axit mật và pepsin dịch vị,
chống rối loạn chuyển hóa lipit và giảm mỡ máu… Các nghiên cứu hiện
đại gần đây đã cho thấy dịch chiết quả táo mèo có tác dụng kháng khuẩn,
chống rối loạn trao đổi glucid và lipid; Một số thành phần hóa học phân
lập được từ quả táo mèo có tác dụng có tác dụng kháng viêm và hạ đường
huyết.
Việc nghiên cứu, chế biến quả táo mèo tạo sản phẩm chăm sóc sức
khỏe, hỗ trợ điều trị một số bệnh lý đang rất được quan tâm. Tuy nhiên
cho đến nay, các nghiên cứu về quả táo mèo cả trong và ngồi nước cịn
rất khiêm tốn. Do đó, cần các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học cũng
như hoạt tính sinh học của quả táo mèo đồng thời mở rộng nghiên cứu các
công nghệ khai thác, làm giàu các thành phần hóa học có hoạt tính sinh
học cao (cụ thể là nhóm hoạt chất phenolic) trong quả táo mèo để đáp ứng
yêu cầu về bào chế tạo các sản phẩm có chất lượng cao. Từ những vấn đề
nêu trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và


2
xây dựng quy trình cơng nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ
quả táo mèo (Docynia indica (Wall.) Decne) ở Việt Nam”.

2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc hóa học và thăm dị hoạt tính
sinh học của các thành phần hóa học trong quả táo mèo; Nghiên cứu tối
ưu quy trình cơng nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm từ quả táo mèo.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc một số thành phần hóa
học ở phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo Docynia
indica (Wall.) Decne): Điều chế cặn chiết, phân lập các hợp
chất bằng phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học
bằng các phương pháp hóa lý hiện đại.
 Đánh giá hoạt tính sinh học: Tác dụng bảo vệ tim mạch, chống
oxy hóa và ức chế một số dịng tế bào ung thư của cao chiết tổng,
cao chiết phân đoạn và một số hợp chất phân lập được
 Nghiên cứu, tối ưu hóa các quy trình cơng nghệ chiết xuất, sấy
phun để tạo sản phẩm bột cao chiết táo mèo giàu phenolic quy mơ
phịng thí nghiệm
4. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 148 trang với 76 bảng và 63 hình. Bố cục luận án cụ
thể như sau: Mở đầu 2 trang, tổng quan 26 trang, đối tượng và phương
pháp nghiên cứu 8 trang, thực nghiệm 11 trang, kết quả và thảo luận 87
trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, danh mục các cơng trình cơng bố 01
trang, tài liệu tham khảo 10 trang
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Phần tổng quan gồm 4 phần chính: Phần 1 giới thiệu về chi táo mèo
(Docynia), họ hoa hồng (Rosaceae); các thông tin về cây táo mèo, quả táo
mèo như phân bố và sản lượng quả táo mèo ở nước ta; thành phần hóa học
và tác dụng sinh học của quá táo mèo. Phần 2 giới thiệu về tình hình khai
thác, chế biến và sử dụng quả táo mèo ở nước ta, các công nghệ chế biến
táo mèo hiện nay. Phần 3 giới thiệu về nhóm hoạt chất phenolic chiếm
hàm lượng lớn trong quả táo mèo, đặc điểm chung và các phương pháp

chiết xuất phenolic hiện đại. Phần 4 giới thiệu về phương pháp đáp ứng bề
mặt (RSM) và tối ưu hóa quy trình cơng nghệ.


3
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Quả táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne, thu hái tại Huyện Bắc
Yên, Tỉnh Sơn La vào tháng 9 năm 2014 và tháng 10 năm 2017. Mẫu
nghiên cứu được định danh khoa học bởi TS Nguyễn Qc Bình, Bảo
tàng thiên nhiên Việt Nam - VAST.
2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp định lượng một số thành phần hóa học
2.2.1.1. Phương pháp định lượng phenolic tổng
Hàm lượng tổng phenolic được xác định theo phương pháp của
Singleton và cộng sự (1999) bằng cách sử dụng thuốc thử Folin –
Ciocalteu và chất chuẩn là acid gallic.
Hàm lượng phenolic tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ phenolic xác
định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m:
Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

2.2.1.2. Phương pháp định lượng flavonoid tổng
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp của
Zhishen và cộng sự (1999). Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên sự
tạo phức màu vàng giữa flavonoid với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ
lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm.
Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu
Hàm lượng flavonoid tổng = C.V/m; Với C: Nồng độ flavonoid xác
định theo đường chuẩn (µg/mL); V: Thể tích dịch chiết tổng (mL); m:

Khối lượng cao chiết thu được ứng với lượng mẫu đem chiết (g)

2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học
2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất
+ Phương pháp chiết vi sóng: Chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng
+ Phương pháp chiết siêu âm: Chiết xuất có hỗ trợ của siêu âm
+ Phương pháp chiết hồi lưu: Chiết xuất có gia nhiệt bằng bếp điện,
dung môi được hồi lưu bằng hệ thống sinh hàn
+ Phương pháp chiết soxhlet: Sử dụng thiết bị chiết soxhlet để chiết
xuất nhằm định lượng cao chiết toàn phần.
2.2.2.2. Phương pháp phân lập các thành phần hóa học
+ Sắc ký cột: silica gel pha thường, pha đảo, selphadex...
+ Sắc ký lớp mỏng: thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn, phát hiện vệt
chất bằng soi đèn UV ở bước sóng 254 và 365 nm hoặc hiện màu bằng
thuốc thử.


4
2.2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Kết hợp giữa các thơng số hóa lý (điểm nóng chảy, độ quay cực) với
các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng (ESI-MS), phổ khối
phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-,
13
C-NMR và DEPT) 2 chiều ( HSQC, HMBC, NOESY...).

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
+ Hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) thông qua cơ chế ức chế enzyme
soluble epoxide hydrolase được đánh giá dựa trên việc phân tích huỳnh
quang với chất đối chứng dương sử dụng là Auda.
+ Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH (1,1diphenyl-2- picrylhydrazyl). Sự hấp thụ của DPPH ở bước sóng λ = 515

nm được xác định bằng máy đọc ELISA sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch
mẫu thử trên phiên vi lượng 96 giếng.
+ Hoạt tính gây độc tế bào được thử nghiệm bằng phương pháp MTT
[3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] trên hai
dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), và ung thư cổ tử cung (HeLa)
Các thử nghiệm được thực hiện Khoa Dược, Trường Đại học
Chungnam, Hàn Quốc và Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các
hợp chất thiên nhiên - VAST.
2.2.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy
trình cơng nghệ
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình cơng
nghệ được áp dụng theo mơ hình bậc hai của Box-Willson hoặc BoxBehnken tùy vào từng bài toán cụ thể. Sau khi xây dựng được mơ hình ta
cần đánh sự hội tụ của mơ hình thơng qua phân tích phương sai. Nếu mơ
hình hội tụ thì ta xác định phương trình hồi quy và tiến hành tối ưu hóa
thơng số cơng nghệ bằng phương pháp hàm nguyện vọng của Harrington
(1965). Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để xây dựng mơ hình và
tối ưu hóa thơng số cơng nghệ quá trình.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM
3.1. Điều chế cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn
Quả táo mèo tươi 15 kg được phân loại, rửa sạch và thái lát. Sấy
diệt men ở 1100C trong 20 phút và sấy mẫu tới khô ở 600C (hàm ẩm ≤
10%). Táo mèo khô được nghiền mịn bằng máy nghiền (đường kính lỗ
sàng 0.2 mm) thu dược 5 kg bột. Bột nguyên liệu táo mèo 2 kg được
chiết siêu âm với methanol ở nhiệt độ phịng, tỷ lệ dung mơi/ngun liệu
(3/1, v/w). Lọc dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay áp suất giảm thu


5
được 652 g cặn chiết methanol. Hòa tan cặn methanol với nước cất và
chiết phân bố lần lượt với các dung môi các độ phân cực tăng dần là nhexan, dichloromethane và ethyl acetate. Tiến hành lọc và cô đặc các

dịch chiết phân bố thu được các cặn chiết tương ứng là cặn n-hexan
(36,2 g); cặn dichloromethane (65 g); cặn ethyl acetate (258,8 g) và cặn
nước (289,4 g).
3.1.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc quả táo mèo
Lấy 114 g cặn chiết ethyl acetate (EtOAc), tiến hành sắc ký cột silica gel
pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (100:0 
0/100) chia thành 8 phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E8. Kiểm tra các phân
đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện màu bằng thuốc thử
H2SO4 5% hoặc kiểm tra bằng máy soi UV ở bước sóng 254 nm và 365
nm. Gom các phân đoạn giống nhau rồi cô quay đuổi dung môi thu được
cao chiết các phân đoạn. Từ các phân đoạn E1 đến E8 tiếp tục tiến hành
các phương pháp sắc ký để phân lập, thu các hợp chất sạch. Sơ đồ phân
lập được thể hiện ở hình 3.1.1.

Hình 3.1.1. Sơ đồ phân lập các thành phần hóa học từ quả táo mèo
3.1.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất (xem luận án)
3.2. Quy trình chiết phenolic và thiết lập mơ hình nghiên cứu
3.2.1. Chiết xuất bằng phương pháp soxhlet
Chuẩn bị bộ dụng cụ chiết soxhlet. Cân chính xác 10g bột nguyên
liệu táo mèo cho vào túi giấy lọc, buộc kín. Đưa túi lọc chứa nguyên liệu
vào ngăn chiết. Nạp 500 mL ethanol thực phẩm 96% vào bình cầu 1000
mL. Tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu kết nối thiết bị chiết soxhlet. Bật bếp


6
điện gia nhiệt lên 650C, thời gian chiết là 10 giờ. Kết thúc q trình chiết,
dịch chiết được cơ quay đuổi dung mơi để thu cao chiết tổng. Sau đó sẽ
tiến hành định lượng và phân tích hàm lượng phenolic tổng, flavonoid
tổng. Hàm lượng cao chiết tổng Y (%) được tính theo khối lượng mẫu
đem chiết. Kết quả nghiên cứu được sử dụng làm tiêu chuẩn để so sánh

với các phương pháp chiết phenolic dưới đây
3.2.2. Chiết xuất sử dụng vi sóng
3.2.2.1. Tiến hành thí nghiệm
100g bột ngun liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL, thêm
500 ml dung môi (được pha với nồng độ ethanol và độ pH cần nghiên
cứu) vào bình cầu. Đưa bình cầu vào lị vi sóng và tiến hành lắp sinh hàn
hồi lưu. Bật sinh hàn, bật lị vi sóng ở các mức cơng suất cần nghiên cứu.
Thời gian chiết xuất được tính bắt đầu khi bật lị vi sóng. Kết thúc q
trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu
được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng
phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao
chiết) trong cao chiết.
3.2.2.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Thời gian chiết
xuất (phút); Z2: Nồng độ ethanol chiết xuất (%); Z3: Cơng suất vi sóng
(W) và Z4: Độ pH dung môi chiết. Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng
phenolic tổng), Y2 (Hàm lượng flavonoid tổng) và Y3 (Hàm lương cao
chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A,
B, C và D. Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Willson với k = 4, chọn
cánh tay đòn α = 1.414 và số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm
của ma trận là 27 thí nghiệm.
3.2.3. Chiết xuất sử dụng siêu âm
3.2.3.1. Tiến hành thí nghiệm
100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL hoặc
2000 mL loại 3 cổ, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung mơi là
5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu (theo bố trí thí
nghiệm). Lắp sinh hàn, nhiệt kế và thiết bị siêu âm đầu dị sau đó tiến
hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết siêu âm ở các điều kiện nhiệt độ, công
suất siêu âm và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch
chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng.

Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg
GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết.


7
3.2.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Tỷ lệ dung
môi/nguyên liệu (v/w), Z2: Nhiệt độ chiết siêu âm (0C), Z3: Công suất
siêu âm (W) và Z4: Thời gian chiết (phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm
lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa
của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D. Lựa chọn mô hình
khảo sát theo Box-Behnken với k = 4, số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số
thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm.
3.2.4. Chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu
3.2.4.1. Tiến hành thí nghiệm
100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 2000 mL,
dung mơi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào
bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu. Lắp sinh hàn và tiến hành gia nhiệt bằng
bếp điện, chiết hồi lưu ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian cần nghiên
cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner
và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng
(%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng
(mg QE/g cao chiết) trong cao chiết.
3.2.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Thời gian
chiết xuất (phút), Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) và Z3: Nhiệt độ
chiết xuất (0C). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm
lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu
là A, B, và C. Với k = 3, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.215 và số thí nghiệm
tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm

3.3. Quy trình sấy phun và thiết kế mơ hình
3.3.1. Tiến hành thí nghiệm
Dịch sau chiết được lọc và cơ đặc thu được 2.1 lít dịch có hàm lượng
chất khơ đạt 15-20%. Bổ sung chất trợ sấy maltodextrin với tỷ lệ nghiên
cứu vào dịch chiết cô đặc. Bật máy khuấy dịch chiết, bật bơm lưu lượng,
điều chỉnh lưu lượng dòng cấp ứng với điều kiện nghiên cứu và tiến hành
quá trình sấy phun, tác nhân sấy (khí nóng) được thổi vào buồng phun
dịch. Nhiệt độ tác nhân sấy được thay đổi theo điều kiện nghiên cứu. Thiết
bị sử dụng nghiên cứu là máy sấy phun Buchi B290 mini spray dryer, tốc
độ bơm dịch (15-35 mL/phút), nhiệt độ khí nóng đầu vào (120 – 2200C),
lưu lượng khí nóng tối đa 35 m3/giờ, cơng suất bay hơi 1 L H2O/giờ (Viện
Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội). Bột sau
sấy phun được phân tích hàm lượng phenolic tổng và hàm ẩm.


8
3.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm
Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Hàm lượng
chất trợ sấy maltodextrin (%, w/w), Z2: Nhiệt độ khí nóng đầu vào (0C) và
Z3: Tốc độ phun dịch (mL/phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng
phenolic tổng của sản phẩm sau sấy phun), Y2 (độ ẩm của sản phẩm sau
sấy phun). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B,
và C. Lựa chọn mơ hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 3, số thí
nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Các hợp chất phân lập được từ cặn EtOAC quả táo mèo
Từ cặn chiết ethyl actate quả táo mèo đã phân lập và xác định được
25 hợp chất trong đó gồm:
+ 19 hợp chất phenolic (TM1, TM2, TM3, TM5, TM7, TM8, TM9,
TM10, TM12, TM13, TM15, TM16, TM17, TM18, TM30, TM33, TM35,

TM36, TM37). Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3S-thunberginol C
6-O-β- D-glucopyranoside (TM17)
+ 5 hợp chất triterpenoid (TM20, TM22, TM23, TM24, TM25)
+ 1 dẫn xuất của axit mạch thẳng: (TM6)
Bảng 4.1. Các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAC quả táo mèo
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14

Kí hiệu

TM1
TM2
TM3
TM5
TM6
TM7
TM8

TM9
TM10
TM12
TM13
TM15
TM16
TM17
(Chất mới)
15
TM18

Chlorogenic acid methyl ester
Quercetin
Protocatechuic acid
Hyperin
4-methyl malate
Naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside
Phlorizin
3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid
Astilbin
Gallic acid
Methyl gallate
Chrysin
Naringenin
3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside

Khối
lượng
(mg)
45,5

21,0
6,8
13,5
32,0
11,0
10,8
12,2
22,0
19,0
6,5
9,5
5,6
6,5

1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose

12,0

Tên chất


9
16
17
18
19
20
21

TM20

TM22
TM23
TM24
TM25
TM30

22

TM33

23
24
25

TM35
TM36
TM37

Pomolic acid
Euscaphic acid
23-Hydroxy ursolic acid
Ursolic acid
Maslinic acid
(2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D
glucopyranosie
Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D
glucopyranoside)
Cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside
Myricitrin
2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone

8,0
7,6
10,5
22,0
11,2
8,2
11,3
7,6
7,2
4,4

4.1.1. Hợp chất 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside
(TM17) – Hợp chất mới
Hợp chất TM17 thu được ở dạng chất rắn màu trắng. Trên phổ khối
phân giải cao HR-ESI-MS của TM17 xuất hiện các píc ion giả phân tử lần
lượt là [M - H]¯ tại m/z 433.1119, [M + 35Cl]¯ tại m/z 469.0890 và [M +
37
Cl]¯ tại m/z 471.0870. Tính tốn lý thuyết cho ion [C21H21O10]¯có m/z
433.1129, ion [C21H22ClO10]¯ có m/z 469.0896 tương ứng với đồng vị 35Cl
và 471.0876 tương ứng với đồng vị 37Cl. Từ các dữ kiện trên phổ khối
phân giải cao, CTPT của TM17 được xác định là C21H22O10. Độ quay cực
của hợp chất TM17 là [α]D = - 690 (c = 0.1, MeOH)
[M + 35Cl]¯

CTPT: C21H22O10
[M + 37Cl]¯
[M - H]¯

Hình 4.1.1.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TM17

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất TM17 xuất hiện hệ spin AABB [δH
6.80 (d, J= 8.5 Hz, H-3′, 5′); 7.32 (d, J= 8.0 Hz, H-2′, 6′)] cho phép xác
định vòng phenyl thế 2 lần trong hợp chất TM17. Bên cạnh đó, vịng thơm
của nhân isocoumarin đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển


10
dịch hóa học [δH 6.54 (br s, H-5); 6.52 (d, J= 2 Hz, H-7, TM17a); 6.51 (d,
J= 2 Hz, H-7, TM17b)], trong khi vịng lactone xuất hiện với các tín hiệu
cộng hưởng ở δH 5.61 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17a); 5.59 (t, J= 2.5 Hz, H-3,
TM17b); 3.11 và 3.07 (H-4a); 3.34 (m, H-4b).

Hình 4.1.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất TM17
Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy có 21 tín hiệu của ngun
tử carbon bao gồm 2 carbon nhóm methylene (-CH2), 12 carbon nhóm
methine (-CH) và 7 carbon khơng liên kết với hydro. Trong đó có 1 tín
hiệu của nhóm keton liên kết với nguyên tử oxy (O-C=O) đặc trưng của
khung dihydroisocoumarin xuất hiện tại δC 169.25/169.18 ppm, 2 cặp tín
hiệu carbon đối xứng của vịng B tại δC (ppm) 128.22/ 128.20 và 115.18
chứng tỏ vòng B bị thế ở 2 vị trí đối xứng nhau trên vịng (C-1’ và C4’), 2
tín hiệu carbon đặc trưng của vịng lactone tại δC (ppm) 80.0 và 33.66; Bên
cạnh đó sự xuất hiện của 6 tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học δC
(ppm) 99.77/99.67; 73.06; 76.44; 69.51; 77.11 và 60.52 gợi ý đây là 6 tín
hiệu carbon của 1 cấu tử đường.
Trên phổ 2 chiều HMBC đã thể hiện sự tương tác của proton
anomeric δH (ppm) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) với
nguyên tử carbon C-6 của phần aglycon. Hằng số tương tác của proton
anomer J= 7.5 – 8.0 Hz cho phép khẳng định đây là đường dạng beta. Phổ
HMBC cũng thể hiện các tương tác giữa H-7 (δH 5.51/5.52) với C-5 (δC
107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-4 (δH 3.08/3.34) với C-5 (δC

107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-5 (δH 6.55) với C-4 (δC 33.66);
H-3 (δH 5.61/5.59) với C-10 (δC 142.15), C-6’ (δC 128.22/ 128.20), C2’(δC 128.22/128.20); H-2’(δH 7.32), H-6’(δH 7.32) với C-4’ (δC 157.76);


11
H3’(δH 6.80), H-5’(δH 6.80) với C-1’(δC 128.47/128,45). Các tương tác
trên cho phép xác định vị trí 2 nhóm thế hydroxyl tại C-8 và C-4’.

Hình 4.1.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất TM17

Hình 4.1.1.5. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất TM17
Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR nêu trên có thể khẳng
định phần aglycon của TM17 chính là thunberbinol C [72]
Tiến hành thủy phân TM17 và chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao với các
đối chứng chuẩn đã xác định được cấu tử đường trong phân tử TM17 là
đường β-D-glucose.


12

Hình 4.1.1.6. Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường
Trong cấu trúc hóa học của hợp chất TM17, vị trí carbon C-3 là
carbon bất đối. Do đó, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất TM17,
chúng tơi tiến hành đo phổ lưỡng sắc tròn (phổ CD). Kết quả trên phổ CD
cho các hiệu ứng cotton âm xảy ra ở các bước sóng 227 nm (Δε -2.29), 255
nm (Δε -4.85) và 305 nm (Δε -1.21). Trong đó hiệu ứng cotton âm xảy ra
mạnh nhất ở bước sóng 255 nm (Δε -4.85) (Hình 4.1.1.9). Tiến hành so
sánh phổ CD của hợp chất TM17 với các hợp chất có cấu trúc hóa học và vị
trí carbon bất đối tương tự hợp chất TM17 như các hợp chất: 3Shydrangenol 4’-O-glucoside, 3S-thunberginol I 4’-O-glucoside và 3Sflorahydroside. Ở 3 hợp chất vừa nêu, trên phổ CD của chúng đều xảy ra
hiệu ứng cotton âm mạnh nhất lần lượt tại 260 nm (Δε -3.76), 255 nm (Δε

-8.30) và 255 nm (Δε -0.79) [72-74]. Điều này chỉ ra hợp chất TM17 phù
hợp với cấu hình dạng 3S của 3-aryl dihydroisocoumarin. Do đó, hợp chất
TM17 được khẳng định là 3S-thunberginol C 6-O-β-D-glucopyranoside.
Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên.
Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu kép
xuất hiện theo các cặp tín hiệu rất sát nhau (như trong bảng dữ liệu phổ
4.1.1). Chúng tôi đặt giả thuyết hợp chất TM17 tồn tại đồng thời ở 2 cấu
dạng bền khác nhau nên khi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân sẽ xảy ra hiện
tượng như trên. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiến hành tính
tốn lý thuyết năng lượng bền của các cấu dạng có thể của hợp chất TM17
thơng qua việc tính tốn enthalpy tương đối (ΔH) của hợp chất này, sử
dụng phương pháp DFT (density functional theory method). Kết quả tính
tốn lý thuyết đã cho thấy 02 cấu dạng nửa thuyền tồn tại ở trạng thái năng
lượng bền với ethalpy tương đối lần lượt là H = 0.0 kcal/mol và H = 0.2
kcal/mol. Điều này đã làm sáng tỏ giả thuyết nêu trên của chúng tôi rằng
hợp chất 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside tồn tại ở 2 loại cấu
dạng bền khác nhau (a/b).


13

Hình 4.1.1.7. Cấu trúc hóa học của
TM17

(a)

Hình 4.1.1.8. Phổ CD của TM17

(b)

Hình 4.1.1.9. Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền của hợp chất TM17
Bảng 4.1.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM17 và chất so sánh
thunberginol C
Vị
trí
C
1

TLTK (DMSO-d6) [72]
δH (ppm)
δC
(ppm)

TM17 (DMSO-d6)
δH (ppm)
δC (ppm)

169.4

169.25 /
169.18
80.0

3

5.54 (1H, t, J= 3.0 Hz)

79.7

4

3.03 (1H, dd, J= 3.0;
17.0 Hz, H-4a)
3.24 (1H, dd, J= 3.0;
17.0 Hz, H-4b)
6.3 (1H, d, J= 2.0 Hz)

33.6

5
6
7

6.22 (1H, d, J = 2.0
Hz)

106.8
164.4
100.9

5.61 (1H, t, J = 2.5 Hz) /
5.59 (1H, t, J = 2.5 Hz)
3.11 (1H, t, J= 2.5 Hz,
H-4a)/3.07 (1H, t, J= 2.5
Hz, H-4a)
3.35 (overlap, H-4b)
6.55 (1H, br s)

6.52 (1H, d, J= 2.0 Hz) /
6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz)

33.66

107.37 /
107.27
162.99
101.76


14
11.1 (-OH)

8
9

163.3
100.3

11.09 (-OH)

142.2
128.6

10
1’
2’

7.31 (1H, d, J=9.0 Hz)

128.0

7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz)

3’
4’
5’
6’

6.8 (1H, d, J=9.0 Hz)

115.1
157.6
115.1
128.0

6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz)

6.8 (1H, d, J=9.0 Hz)
7.31 (1H, d, J=9.0 Hz)

6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz)
7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz)
4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/
4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz)
3.24, m
3.37, m
3.18, m
3.2, m
3.46 (1H, m)
3.76 (1H, m)

1’’
2’’
3’’
4’’
5’’
6’’

163.28
102.56 /
102.54
142.15
128.47 /
128.45
128.22 /
128.20
115.18
157.76
115.18
128.22 /
128.20
99.77 /
99.67
73.06
76.44
69.51
77.11
60.52

4.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất phân

lập được
4.2.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH)
4.2.1.1. Đối với cao chiết
Cao chiết phân đoan n-hexan thì khơng thể hiện hoạt tính ở nồng độ
37.5 và 75 µM, thể hiện hoạt tính thấp ở 150 µM. Các phân đoạn cịn lại
thể hiện hoạt tính giảm dần: cao ethyl acetate > cao dichloromethane >
cặn nước > cao tổng methanol.
Bảng 4.2.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính sEH với cao chiết
TT
1
2
3
4
5
6
7

Phân Đoạn cao
chiết
Dichloromethane

Ethyl acetate

Cặn nước

Nồng độ thử
(µM)
37.5
75
150

37.5
75
150
37.5

Phần trăm ức
chế I (%)
28.0 ± 3.4
57.9 ± 0.1
83.8 ± 2.7
36.7 ± 2.5
68.7 ± 3.5
92.7 ± 1.2
25.4 ± 1.2


15
8
9
10
11
12

Cao tổng methanol

75
150
37.5
75
150

45.9 ± 0.2
68.4 ± 0.1
4.9 ± 0.5
12.8 ± 1.7
21.1 ± 2.2

4.2.2.2. Đối với các hợp chất phân lập được
Có 8 trên 25 hợp chất thể hiện hoạt tính bao gồm các chất là TM1,
TM5, TM8, TM10, TM16, TM24, TM33 và TM37. Giá trị IC50 (µM) của
8 hợp chất này nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó,
2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị
IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6 µM.
Bảng 4.2.2.2. Kết quả thử hoạt tính sEH với các hợp chất phân lập được
TT

Kí hiệu

1
2
3
4
5
6
7
8

đối chứng (+)
Auda
TM1

TM5
TM9
TM10
TM16
TM24
TM33
TM37

Phần trăm ức chế tại
nồng độ 100 µM (%)

IC50 (µM)
16.8 ± 0.5 nM

73.3 ± 1.1
72.8 ± 0.2
>100
79.9 ± 0.4
76.8 ± 0.06
74.0 ± 2.8
52.7 ± 0.2
>100

41.9 ± 1.1
30.5 ± 0.1
19.3 ± 2.2
22.9 ± 0.2
24.7 ± 2.5
36.1 ± 0.6
88.4 ± 0.2

10.0 ± 0.6

4.2.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Trong tổng số 25 hợp chất đem thử thì có tới 14 hợp chất thể hiện
hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69 đến
49.34 ± 1.22). Đặc biệt trong 14 hợp chất thể hiện hoạt tính có 1 hợp chất
thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả đối chứng dương là hợp chất TM12 có giá
trị SC50 là 18.05 (µg/mL).
Bảng 4.2.1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập
Ký hiệu
Đối chứng (+)
Ascorbic acid
TM1
TM2

Giá trị SC50
(µg/mL)
26.40 ± 0.44

Ký hiệu
TM12

Giá trị SC50
(µg/mL)
18.05 ± 0.69

35.48 ± 2.02
31.37 ± 0.12

TM15

TM16

30.12 ± 0,15
33.47 ± 0,51


16
TM3
TM5
TM7
TM9
TM10

28.18 ± 1.18
29.17 ± 1.67
49.34 ± 1.22
29.11 ± 0.17
42.32 ± 0.42

TM17
TM30
TM36
TM37

40.51 ± 0.78
41.81 ± 0.45
42.76 ± 2.12
29,12 ± 0.38

4.2.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết

Chỉ có 2 cao chiết phân đoạn n-hexan và dicholoromethane (CH2Cl2)
là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung hela với giá trị IC50
lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn cịn lại
khơng thể hiện hoạt tính.
4.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết phenolic từ quả táo
mèo quy mơ phịng thí nghiệm.
4.3.1. Kết quả chiết soxhlet thu cao chiết toàn phần
Phương pháp chiết soxhet cho hiệu suất chiết rất cao do đây là
phương pháp chiết kiệt nhất. Hàm lượng cao chiết tổng thu được trung
bình đạt 36,07%. Hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid tổng
cũng rất cao với giá trị trung bình lần lượt là 28,9 (mg GAE/g cao chiết)
và 20,0 (mg QE/g cao chiết).
4.3.2. Mơ hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic
bằng phương pháp chiết vi sóng
4.3.2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu
4.3.2.2. Thiết lập mơ hình và xác định phương trình hồi quy hàm
mục tiêu.
Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thơng số công nghệ
đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng tôi lựa chọn mơ hình nghiên cứu theo
mơ hình bậc 2 của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ bản) của các
yếu tố và hệ số α = 1.414 (với k= 4) được thể hiện ở bảng 4.3.2.2a
Bảng 4.3.2.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Tên biến, khoảng biến thiên
Biến Khoảng biến
Biến thực
mã
thiên (Δ)

Mức nghiên cứu
-α

-1

0

1

+α

Z1: thời gian chiết (phút)

A

15

9

15

30

45

51

Z2: Nồng độ ethanol (%)
Z3: Cơng suất máy vi
sóng (W)

B

20

32

40

60

80

88

C

160

175

240

400

560

625

Z4: độ pH

D

2

1.2

2

4

6

6.8


17
Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực
nghiệm với 27 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mơ hình thơng qua
phân tích phương sai. Kết quả mơ hình nghiên cứu được xác định là tương
hợp với thực nghiệm.
Sau khi loại bỏ các yếu tố khơng có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác
định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
+ Y1 = 29.42 + 2.93A + 0.88B + 1.78C + 0.76D – 0.89AB + 1.09AD –
1.02BC – 1.3B2 – 1.1D2 (1)
+ Y2 = 21.22 + 2.32A + 0.68B + 0.99C + 0.41D – 0.59AB + 0.62AD –
1.11BC + 0.39BD – 0.92B2 – 0.57D2 (2)
+ Y3 = 29.65 + 2.55A + 1.06B + 1.05C + 0.61D – 0.46AC + 0.49AD –
0.97BC – 0.91B2
(3)
4.3.2.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất
Quá trình chiết xuất cần được tối ưu sao cho cả 3 hàm mục tiêu Y1,

Y2 và Y3 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc giải
bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm
nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với
các mục tiêu đặt ra, chúng tôi lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục
tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 5); hàm Y2 (mức 3); hàm Y3 (mức 2). Tại
điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.2.4, giá trị dự đoán của các
hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.64 (mg GAE/g); Y2 = 25.1 (mg QE/g)
và Y3 = 33.33 (%).
Bảng 4.3.2.3a. Kết quả tối ưu các biến cơng nghệ
A

1.34

Biến mã hóa
B
C

D

0.23

0.7

0.26

Thời
gian
(phút)
50.1

Biến thực
Nồng độ
Cơng
ethanol
suất vi
(%,v/v)
sóng (W)
64.6
441.6

Độ pH
dung
mơi
5.4

Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực
nghiệm với kết quả tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất
nhỏ. Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ chính xác cao.
4.3.3. Mơ hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic
bằng phương pháp chiết siêu âm
4.3.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu
4.3.3.2. Thiết lập mơ hình và xác định phương trình hồi quy hàm
mục tiêu.


18
Bài tốn này dựa vào các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông
số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng lựa chọn mơ hình nghiên
cứu theo mơ hình bậc 2 của Box-Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (1) và mức cao (+1), của các yếu tố (với k= 4) và khoảng biến thiên được
thể hiện ở bảng 4.3.3.2a.

Bảng 4.3.3.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Biến thực
Z1: Tỷ lệ dung
môi/nguyên liệu (v/w)
Z2: Nhiệt độ chiết (0C)
Z3: Công suất siêu âm (W)
Z4: Thời gian chiết (phút)

Biến
mã
A

Khoảng biến
thiên (Δ)
2

B
C
D

15
40
15

Mức nghiên cứu
-1
0
1
5
7

9
30
100
45

45
140
60

60
180
75

Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực
nghiệm với 29 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mơ hình thơng qua
phân tích phương sai. Kết quả mơ hình nghiên cứu được xác định là tương
hợp với thực nghiệm.
Sau khi loại bỏ các yếu tố khơng có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác
định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
+ Y1 = 33.60 + 1.35B – 0.94C + 1.1D – 1.52AC + 1.7BC + 2.49BD +
1.63CD – 2.45A2 – 4.8B2 – 4.58C2 – 3.30D2 (1)
+ Y2 = 28.59 + 2.44A + 1.75C + 5.97D + 2.39AB + 5.33AD – 2.27BC –
4.72A2 – 2.75B2 – 2.9C2 – 2.17D2
(2)
4.3.3.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất
Tương tự như bài tốn trước đó, q trình chiết xuất nguyên liệu táo
mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 đều đạt giá trị
lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc tiến hành giải bài toán tối ưu
bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng
với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu

đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như
sau: Hàm Y1 (mức 5), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông số công
nghệ như bảng 4.3.3.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là
Y1 = 33.0 (mg GAE/g) và Y2 = 32.83 (%).
Bảng 4.3.3.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ
A

Biến mã hóa
B
C

D

0.29 0.27 0.05 0.61

Tỷ lệ dung
mơi/ngun
liệu (v/w)
7.58

Biến thực
Nhiệt độ
Công suất Thời gian
chiết siêu chiết siêu
chiết
âm (0C)
âm (W)
(phút)
49.05
142

69.15


19
Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực
nghiệm với kết quả tính tốn lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất
nhỏ. Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ chính xác cao.
4.3.4. Mơ hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic
bằng phương pháp chiết hồi lưu
4.3.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu
4.3.4.2. Thiết lập mơ hình và xác định phương trình hồi quy hàm
mục tiêu
Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn
biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mơ hình bậc
2, kế hoạch hóa thực nghiệm hỗn hợp trung tâm theo mô tả của BoxWillson. Các mức gốc (hay mức cơ bản) của các yếu tố và hệ số α = 1.215
(với k= 3) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.3.4.2a
Bảng 4.3.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Tên biến, khoảng biến thiên
Biến Khoảng biến
Biến thực
mã
thiên (Δ)

Mức nghiên cứu
-α

-1

0

1

+α

Z1: thời gian
A
chiết (phút)
60
227 240 300 360 373
Z2: Tỷ lệ dung
môi/nguyên liệu
B
(v/w).
2
4.57
5
7
9
9.43
Z3: Nhiệt độ
chiết (0C)
15
36.8 40
55
70 73.2
C
Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực
nghiệm với 15 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mơ hình thơng qua
phân tích phương sai. Kết quả mơ hình nghiên cứu được xác định là tương
hợp với thực nghiệm.

Sau khi loại bỏ các yếu tố khơng có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được
xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
+ Y1 = 31.28 + 2.82A + 3.4B + 2.63C + 1.32AC − 4.45A2 – 2.42B2 –
2.47C2 (1)
+ Y2 = 30.74 + 3.29A + 3.16B + 2.84C + 1.51AC − 4.34A2 – 2.2B2 –
2.4C2 (2)
4.3.4.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất
Cũng tương tư như các bài tốn trước, quá trình chiết xuất nguyên
liệu táo mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1và Y2 đều đạt


20
giá trị lớn nhất. Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu
sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1
(mức 4), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thơng số cơng nghệ như bảng
4.3.4.4, giá trị dự đốn của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.96 (mg
GAE/g) và Y2 = 33.21 (%).
Bảng 4.3.4.3. Kết quả tối ưu các biến cơng nghệ
Biến mã hóa
A
B
C
0.17

0.81

0.46

Thời gian
(phút)

310.2

Biến thực
Tỷ lệ dung môi/nguyên
liệu (v/w)
8.62

Nhiệt độ
chiết (0C)
61.9

Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực
nghiệm với kết quả tính tốn lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất
nhỏ. Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ chính xác cao.
4.3.5. So sánh, đánh giá các phương án công nghệ nghiên cứu
Từ kết quả so sánh hiệu quả chiết suất và phân tích các yếu tố liên
quan đến công nghệ cũng như khả năng triển khai, nâng cấp quy mô công
nghệ. Trong 3 phương pháp chiết xuất phenolic được nghiên cứu, chúng
tôi đánh giá phương pháp chiết siêu âm là phù hợp nhất để triển khai cơng
nghệ chiết xuất và có nhiều tiềm năng để áp dụng vào thực tế sản xuất.
4.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sấy phun dịch chiết táo mèo
quy mơ phịng thí nghiệm
4.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu
4.4.2. Thiết lập mơ hình và xác định phương trình hồi quy hàm
mục tiêu
Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thơng số cơng nghệ đơn
biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mơ hình bậc
2, kế hoạch hóa thực nghiệm theo mô tả của Box- Behnken. Các mức gốc
(0), mức thấp (-1) và mức cao (+1), của các yếu tố (với k= 3) và khoảng
biến thiên được thể hiện ở bảng 4.4.2a.

Bảng 4.4.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ
Biến thực

Z1: Hàm lượng
Maltodextrin bổ sung
(%, w/w)
Z2: Nhiệt độ khí sấy
vào (0C)

Biến
mã
A

Khoảng biến
thiên (Δ)

Mức nghiên cứu
-1
0
1

2

7

9

11

B

20

120

140

160


21
C
Z3: tốc độ bơm dịch
5
25
30
35
(mL/phút)
Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực
nghiệm với 15 thí nghiệm và đánh giá sự tương hợp của mơ hình thơng
qua phân tích phương sai. Kết quả mơ hình nghiên cứu được xác định là
tương hợp với thực nghiệm.
Sau khi loại bỏ các yếu tố khơng có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác
định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau:
+ Y1 = 13.52 – 2.13A – 0.78B – 0.067C – 0.47AB + 0.36AC + 0.18BC –
0.36 A2 – 0.33C2 (1)
+ Y2 = 6.85 + 0.46A – 0.9B + 0.13C – 0.4AB – 0.64B2 + 0.22C2 (2)
4.4.3. Tối ưu hóa quy trình sấy phun
Cũng tương tư như các bài tốn trước, q trình sấy phun dịch chiết táo
mèo cần được tối ưu để hàm mục tiêu Y1 (hàm lượng phenolic tổng) là lớn

nhất và Y2 (độ ẩm sản phẩm) là nhỏ nhất. Trong bài toán này, với các mục
tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu
là như nhau: Hàm Y1 (mức 3), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông
số công nghệ như bảng 4.4.3, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần
lượt là Y1 = 15.02 (mg GAE/g) và Y2 = 5.23(%).
Bảng 4.4.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ
Biến mã hóa

A

B

C

Biến thực

Hàm lượng
Nhiệt độ khí
Tốc độ
maltodextrin
sấy vào (0C)
bơm dịch
(%, w/w)
(mL/phút)
-1
1
-0.36
7
160
28.2

Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực
nghiệm với kết quả tính tốn lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất
nhỏ. Chứng tỏ mơ hình xây dựng có độ chính xác cao.
4.5. Thuyết minh quy trình cơng nghệ tạo sản phẩm bột cao chiết
táo mèo quy mơ phịng thí nghiệm.
1 kg bột nguyên liệu táo mèo sau khi tiền xử lý (độ ẩm ≤ 12%, độ
mịn d ≤ 2 mm) cho vào bình thủy tinh dung tích 15 lít. Thêm vào bình 7.6
lít ethanol thực phẩm 65%, độ pH 5.4 (pH dung môi được điều chỉnh bằng
dung dịch axit citric 0.1M với hệ đệm axit citric/natri citrate). Khuấy đều
5 phút để dung mơi ngấm đều vào ngun liệu. Đưa bình chiết vào thiết bị
bể siêu âm dung tích 20 lít (model: UCP-20, Jeiotech – Hàn quốc, công
suất siêu âm tối đa 500W). Điều chỉnh công suất siêu âm ở chế độ trung


22
bình (140-150W), cài đặt nhiệt độ chiết 49 ± 20C. Tiến hành chiết siêu âm
trong thời gian 70 phút. Kết thúc quá trình chiết xuất, tiến hành lọc thu
dịch chiết bằng phễu buchner thu được 7.2 lít dịch chiết. Sử dụng máy cô
cất chân không (model R300, Buchi – Thụy sĩ) cô đặc dịch chiết đến nồng
độ chất khô 15%, lượng dịch chiết thu được là 2.1 lít.
Q trình sấy phun dịch chiết được thực hiện trên máy sấy phun mini
Buchi B290 (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà
Nội). Bật máy sấy phun, điều chỉnh và ổn định nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào ở
1600C, đầu ra 900C. Chuẩn bị dịch sấy phun, bổ sung 7% (w/w) chất mang
maltodextrin vào dịch chiết và khuấy đều. Bật bơm lưu lượng, điều chỉnh tốc
độ bơm dịch đạt 28 mL/phút, tiến hành sấy phun. Kết thúc quá trình sấy phun
thu được 320 g bột cao chiết táo mèo giàu phenolic. Sản phẩm bột táo mèo thu
được có độ ẩm 5.2 %, hàm lượng phenolic tổng đạt 14.9 (mg GAE/g bột). Sản
phẩm được đóng túi hút chân không và bảo quản ở nhiệt độ 250C.
KẾT LUẬN

Luận án đã thực hiện được những kết quả bao gồm
1. Nghiên cứu thành phần hóa học
Từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate của quả táo mèo (Docynia indica
(Wall.) Decne) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 25 hợp
chất bao gồm: 19 hợp chất phenolic, 5 hợp chất triterpenoid và 1 dẫn xuất
của axit hữu cơ mạch thẳng. Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3SThunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside và 16 hợp chất khác lần đầu
phân lập từ quả táo mèo.
2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học
- Hoạt tính bảo vệ tim mạch
+ Các cao chiết phân đoạn: Cao chiết ethylcetate thể hiện hoạt
tính mạnh nhất, tiếp đến lần lượt là cao chiết dichloromethane, cao
nước và cao chiết methanol. Cao chiết n-hexan thể hiện hoạt tính thấp
ở nồng độ 150 µg/mL.
+ Các hợp chất phân lập được: Có 8 trong số 25 hợp chất thể hiện
hoạt tính với giá trị IC50 (µM) nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến
88.4 ± 0.2. Trong đó 2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính
mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6
µM.
- Hoạt tính chống oxy hóa: Có 14 trong số 25 hợp chất thể hiện
hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69
đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt, 2 hợp chất thể hiện hoạt tính bảo vệ