luận án tiến sĩ nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ
----------------------

N
G
U
Y
Ễ
N
C
Ẩ
M
H
À

NGHIÊN CỨU
SQUALENE TỪ VI
TẢO BIỂN DỊ


DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM
MANGROVEI PQ6 ĐỊNH
HƢỚNG LÀM NGUYÊN
LIỆU CHO THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ

PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM

LUẬN ÁN
TIẾN S SINH
HỌC

Hà Nội Năm
2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN CẨM HÀ

NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ
DƢỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6
ĐỊNH HƢỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC
PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ
DƢỢC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – Năm 2020


i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.
TS. Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng,
truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó
khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phịng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban
Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
giúp tơi hồn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Trong q trình viết luận án tơi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình
của TS. Hồng Thị Lan Anh. Ngồi ra tơi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng
nghiệp làm việc tại phịng Cơng nghệ Tảo: TS. Hồng Thị Minh Hiền, TS. Ngơ Thị
Hồi Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân
thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ q báu đó.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học
viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và
Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và
khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do
PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của

các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ
không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam “Nghiên cứu hồn thiện quy trình ni trồng lượng lớn sinh khối tảo
Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm
thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hồng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hồn thành luận án của mình.
Hà Nội, ngày
tháng năm 2020
Tác giả

Nguyễn Cẩm Hà


ii
Lời cam đoan
Tơi xin cam Ďoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã
Ďược cơng bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự Ďồng ý và cho phép
của các Ďồng tác giả;
Phần cịn lại chưa Ďược ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020
Tác giả

Nguyễn Cẩm Hà

iii

Trang phụ bìa
Lời cảm ơn……………………………………………………………………...
Lời cam Ďoan…………………………………………………………………...
Mục lục…………………………………………………………………………
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt…………………………………………..
Danh mục các bảng…………………………………………………….............
Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị…………………………………………………..
MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………....
1.1.

G

1.1.1.

Tí

1.1.2.

Ng

1.1.3

Cá

và
1.1.4

Ứ

1.1.5.

Cá

1.2.

Cơ

1.2.1.

Cơ

1.2.2.

Cá

1.3.

G

1.4.

G

1.4.1

Đặ

1.4.2.

Tì

ch
1.4.2.1.

Tì

ch
1.4.2.2.

Tì

sq
Chƣơng 2.

VẬ


2.1.

Vật liệu……

2.1.1.

Mẫu vật……

2.1.2.

Các bộ kít si

2.1.3.

Động vật thí

2.1.4.

Các dịng tế

2.1.5.

Hố chất……

2.1.6.

Dụng cụ và t

2.1.7.

Mơi trường n

2.2.

Phƣơng ph

2.2.1.

Nhóm phươn

Ďiều kiện nu

xuất squalen
2.2.1.1.

Phương phá

khối khơ……
2.2.1.2.

Phương phá

2.2.1.3.

Phương phá

tảo……………
2.2.1.4.

Phương phá

2.2.1.5.

Phương phá

2.2.1.6.

Phương phá

2.2.1.7.

Bố trí thí ngh

chủng/lồi ti

squalene cao
2.2.2.

Nhóm phươn

squalene từ S
2.2.2.1.

Phương phá

nhỏsqualene

PQ6…………
2.2.2.2.

Phương phá
squalene ở

PQ6…………
2.2.2.3.

Phương phá

squalene.. ...

2.2.2.4.
2.2.3.
2.2.4.

2.2.4.1

2.2.4.2.

2.2.5.
2.2.6.
Chƣơng 3.
3.1.
3.2.
3.2.1.
3.2.1.1.
ở cấp độ bình tam giác………………………………………………..67

3.2.1.2.Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm

lượng squale
3.2.1.3

Ảnh hưởng c

hàm lượng s
3.2.1.4.

Ảnh hưởng c

lượng squale
3.2.1.5.

Ảnh hưởng c

hàm lượng s
3.2.2

Tối ưu Ďiều

men 30 lít Ď


3.2.2.1.

Ảnh hưởng của

squalene của ch

hệ thống bình lên
3.2.2.2.

Ảnh hưởng của

của chủng S. ma

lên men 30 lít……
3.2.2.3

Ảnh hưởng của

trưởng và tích lũ
3.2.2.4

Ảnh hưởng của

squalene của chủ
3.3.

Xây dựng quy

mangrovei PQ6
3.3.1.

Tối ưu Ďiều kiệ

S. mangrovei PQ
3.3.1.1.

Tách chiết lipid

3.3.1.2

Tách chiết lipid

3.3.1.3.

Tinh sạch và địn

ký lỏng cao áp…
3.3.1.4.

Tách chiết, tinh

dung môi…………
3.3.2.

Xây dựng quy tr

pilot từ S. mangr
3.3.2.1.

Ảnh hưởng của
sinh khối khơ S.

3.3.2.2.

Tách chiết squa

q trình nuôi cấ
3.3.2.3.

Điều kiện tinh ch

3.3.2.4.

Xây dựng quy tr
từ sinh khối tảo

3.3.3.

Tách chiết và tin

3.3.4.

Phân tích các ch

loại của squalen
3.4.

Tính an toàn và


S.

viv
3.4.1.

Độ

ng
3.4.2.

Độ

th
3.4.2.1.

Ản

trọ
3.4.2.2.

Ản

sin
3.4.2.3.

Đá

dù
3.4.3.

Tá

ng
3.5.

Bƣ

sq

vit
3.5.1.

Đá

3.5.2.

Tá

th
3.5.2.1.

Tố

lư
3.5.2.2.

Tá

tro
3.5.3.

Cơ

ch
3.5.4.

Tá

ma
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………...
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ………………………………
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………
PHỤ LỤC


viii

Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
ABCA1
ABCG1
ALT
ApoE
AST
ATP
CCT
CNT
CYP7A1
DHA
DMAPP
DMEM

DNA
DO
DXP
EN
ER
EPA
FAS


ix
ESFA
FBS
FPP
GAPDH

GC
GPP
HDL-C

HMG-CoA
HMGR

HPLC

IPP
KLCT
KXPH
LD50

LDL-C

LDL-R

LXR
MĐTB


x
MEP
MJA
MVA
NMR
OA
ORO

PA
PBS
PCR
PUFA
RNA
SCF
SKK
SKT
TB
TG
TBNF
TBS
TLC
VLDL-C

VTBDD


DANH MỤ
Bảng 1.1.

Các thơn

Bảng 1.2

Một số ti

Bảng 1.3.

Tính chấ

Bảng 1.4.

Các phươ

Bảng 1.5.

Sự phân

Anderso

Beakes v
Bảng 2.1.

Danh sác

Bảng 2.2.

Trình tự

Bảng 2.3.

Địa Ďiểm

Bảng 3.1.

Sinh trưở

thuộc ch
Bảng 3.2

Ảnh hưở

trong quá

mangrov
Bảng 3.3.

Ảnh hưở

hàm lượn

chủng PQ
Bảng 3.4.

Ảnh hưở

hiệu suất

số của ch
Bảng 3.5.

Các chỉ t

tách chiế
Bảng 3.6.

Độc tính

Bảng 3.7.

Ảnh hưở

Bảng 3.8.

Ảnh hưở

trong má
Bảng 3.9.

Ảnh hưở

Bảng 3.10.

Ảnh hưở

Bảng 3.11.

Ảnh hưở


DANH
Hình 1.1.

Cấu trúc hóa học

Hình 1.2.

Tổng hợp squale

Tổng hợp squale

bào tan và MEP ở
Hình 1.3

Sinh tổng hợp sq

(A). Sinh tổng hợ

(B)………………
Hình 1.4.

Mối quan hệ

Thraustochytrids
Hình 1.5.

Các hệ thống bìn

vi tảo biển dị dưỡ
Hình 2.1.

Sơ Ďồ thí nghiệm

PQ6……………
Hình 3.1.

Ảnh hưởng của n

(B) ở các ngày nu

Hình 3.2.

Ảnh hưởng của n

lượng squalene (B
Hình 3.3.

Ảnh hưởng của n

lipit (B) của S. m
Hình 3.4.

Ảnh hưởng của n

suất squalene (B)
Hình 3.5.

Ảnh hưởng của n

khơ (B), hàm lượ
Hình 3.6.

Ảnh hưởng của t

(B), hàm lượng s
Hình 3.7.

Ảnh hưởng của c

và hàm lượng squ

Hình 3.8.Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose

ban Ďầu khác nh
Hình 3.9.

Ảnh hưởng của n


xiii
khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S.
mangrovei PQ6

78

Hình 3.10. Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở
các thời Ďiểm khác nhau khi ni lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất
trong bình 30 Lít
Hình 3.11.

80

Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S.
mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong ni cấy theo mẻ
có bổ sung cơ chất 81

Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm
lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi
cấy theo mẻ S. mangrovei PQ6

82

Hình 3.13. Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn ni cấy của q trình lên
men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ
sung glucose lên 22%

85

Hình 3.14. Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C),
số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G),
nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết
lipid 87
Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid khơng xà phịng hóa (A) và sắc ký Ďồ
squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) 92
Hình 3.16. Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối
S. mangrovei PQ6

92

Hình 3.17. Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch
sau quá trình làm giàu thơng qua quy trình 6 bước (B) 93
Hình 3.18. Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6

94

Hình 3.19. Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh
khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược
tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung mơi khác nhau
Hình 3.20. Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách
chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu

squalene trong mẫu squalene thơ Ďược tách chiết từ sinh khối tảo có

95


xiv
Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau q trình
chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có
mặt trong squalene thơ thu Ďược sau q trình chiết từ sinh khối có Ďộ
ẩm 20 và 100%.................................................................................................................... 96
Hình 3.21. Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C)
và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10.............................................. 97
Hình 3.22. Hàm lượng squalene thơ (A) và squalene có mặt trong squalene thô
(B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei
PQ6.......................................................................................................................................... 98
Hình 3.23. Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene
thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau................................... 99
Hình 3.24. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silicagel với hệ dung mơi rửa giải là nhexan/chloroform (9:1; v/v).......................................................................................... 100
Hình 3.25. Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là nhexane.................................................................................................................................... 100
Hình 3.26. Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6…………………..

102

Hình 3.27. Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn
hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ
sinh khối tảo chủng PQ6………………………………………………

103

Hình 3.28. Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ
sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)………………………………………
1

Hình 3.29. Phổ H (A) và

104

13

C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.

mangrovei PQ6……………………………………………………………….

104

Hình 3.30. Hình ảnh Ďại thể và mơ bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của
gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lơ Ďối chứng
(a, d, g, k), lơ thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lơ thí nghiệm 2 (c, f, i, m)….

114

Hình 3.31. Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene
ở các nồng Ďộ khác nhau………………………………………………

117

xv
Hình 3.32. Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h
(C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối
loạn chuyển hóa lipid………………………………………………….

118

Hình 3.33. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích
lũy hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng
Oil Red O (C) trong tế bào HepG2……………………………………

120

Hình 3.34. Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm
lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong
tế bào Ďại thực bào RAW264.7………………………………………..

120

Hình 3.35. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen
tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2 121
Hình 3.36. Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và
LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………..

122

Hình 3.37. Squalene Ďiều hịa q trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ
biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào
RAW264.7…………………………………………………………….

124

Hình 3.38. Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride
trong tế bào HepG2 125
Hình 3.39. Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm
cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………………...

126


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất
Ďa dạng, phong phú về thành phần lồi và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Trong Ďó vi tảo với ưu
Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với
miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, khơng Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng
cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của mơi trường, Ďược
coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn
biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan
trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khống chất,
protein, các acid béo khơng bão hịa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid PUFA)....Ďặc biệt là squalene.
Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật
thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ
phẩm và y học. Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp mỹ phẩm, có
tác dụng chống khơ da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh

sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Ďã cho thấy squalene ức chế hiệu
quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Ďộng vật
thực nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hố tự
nhiên có vai trị bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính
cao, có khả năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm
chức năng có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh
là cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim
mạch và ung thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm.
Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các
loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự
bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng,
mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần
cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu
cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm
Ďang ngày càng tăng.
Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn
truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà khoa học
trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Ďó, vi sinh vật nói chung và vi tảo
biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô


2
lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids
Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao
trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược
bắt Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học
ban Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương
pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện
ni trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene
cao; chưa có Ďược quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học

bảo Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo
vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện
Ďề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei
PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và
dƣợc phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện ni trồng thích hợp của chủng

Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản
xuất squalene.
- Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh

khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh
học, dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho
thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất

squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam
- Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene

cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mơ bình tam giác; bình lên men 30 Lít.
- Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối

chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch
squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược.
- Đánh giá tính an tồn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường

diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mơ hình Ďộng vật thực nghiệm).
- Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên

mơ hình in vitro (mơ hình tế bào).
4. Những đóng góp mới của luận án
- Luận án là cơng trình Ďầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có

hệ thống về: sàng lọc; ni trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6


3
có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene Ďạt Ďược sau q trình lên men theo
mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết,
làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết
Ďược là an tồn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng
lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mơ hình Ďộng vật thực nghiệm,
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
- Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S.

mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hịa biểu hiện của các
gen tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô
ngoại biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride
của squalene.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
- Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện ni trồng thích hợp của

chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang
vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi
trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6
- 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35)

g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene

Ďạt 6,9 g/L.
- Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei

PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm.
- Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm

cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein có tỷ
trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm cholesterol
gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự phát triển cân
nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mơ hình tế bào và Ďộng vật
thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh hướng làm nguyên
liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có.

6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39
trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết
luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các cơng trình Ďã cơng bố 2 trang; Tài liệu tham
khảo 18 trang gồm 179 tài liệu. Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục.


4

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về squalene
1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene
Squalene có cấu tạo (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22hexane) - là một chất trao Ďổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và
triterpenes ở Ďộng vật và thực vật.
Squalene là một chất lỏng dạng dầu, trong suốt với trọng lượng phân tử là

410,7 g/mol, tỷ trọng 0,858 g /mL, nhiệt Ďộ nóng chảy 20°C, hợp chất này có thể
hịa tan trong dung mơi hữu cơ nhưng khơng hòa tan trong nước [1, 2]. Bảng 1.1
Ďưa ra một số tính chất của squalene như Ďộ nhớt, tỷ trọng, Ďộ hịa tan và những
thơng số này khẳng Ďịnh bản chất kị nước mạnh mẽ của phân tử này.
Bảng 1.1. Các thơng số lý hóa của squalene [3]
Tính chất
Trọng lượng phân tử
Điểm nóng chảy
Chi số khúc xạ
o
Độ nhớt ở 25 C
Tỷ trọng
o
Điểm sôi ở 25 C
Điểm chớp cháy
Chỉ số Iod
Các Ďỉnh hồng ngoại
Sức căng bề mặt
Khả năng hòa tan của squalene trong nước
1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene
Squalene Ďược phát hiện vào năm 1096 bởi nhà nghiên cứu người Nhật, TS.
Mitsumaru Tsujimoto, một chuyên gia về dầu và chất béo tại trạm kiểm Ďịnh Cơng
nghiệp Tokyo. Ơng Ďã phân tách phần khơng xà phịng hóa từ dầu gan cá mập
“kuroko - zame” và khám phá ra sự tồn tại một lượng lớn hydrocacbon khơng bão
hịa. Tại thời Ďiểm Ďó, TS. Mitsumaru Tsujimoto khơng phân tách Ďược hợp chất
này. Tuy nhiên, ông Ďã thu Ďược thành phần bromine dưới dạng bột màu trắng,
o

phân hủy ở 155 C, trong Ďó chứa 26,93% C, 3,94% H và 69,28% Br. Ông Ďưa ra

5
công thức cho hợp chất này là C 10H18Br4. Mười năm sau, TS. Tsujimoto M. Ďã
thành công trong việc chưng cất chân không một phân Ďoạn của dầu từ gan của hai
con cá mập biển sâu, một hydrocacbon không bão hịa với cơng thức C 30H50, Ơng
gọi nó là “squalene”, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [4, 5].
Năm 1934, Robinson Ďã cơng bố cấu trúc vịng của squalene với phân tử
steroit. Năm 1936, cấu trúc sinh học của squalene Ďược mô tả lần Ďầu tiên bởi nhà
nghiên cứu Paul Karrer - người cũng Ďã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin
A và E [6].
Theo cơng bố của Kohno và cộng sự (1995) thì squalene là một hydrocarbon
hợp chất béo khơng bão hịa (C30H50), với 6 liên kết Ďôi, chứa 6 Ďơn vị isoprene
Ďể cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroit. Do cấu trúc của
liên kết Ďơi trong sáu nhóm CH3, các isoprenoid có tác dụng chống oxy hóa tự
nhiên một cách mạnh mẽ [7].
E

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó [8]
A - Cấu trúc hóa học của isoprene. Các cấu trúc khác nhau của squalene: B - Dạng

kéo dài, C - Dạng cuộn, D - Dạng giống như sterol E - Cấu trúc hóa học của
squalene
Do cấu trúc hóa học của squalene, Ďặc biệt là mức Ďộ khơng bão hịa cao nên
squalene khơng có tính ổn Ďịnh cao mà lại rất dễ bị oxy hóa. Hình 1.1 Ďã cho thấy các
liên kết Ďôi Ďã cho phép hình thành nên cấu trúc squalene ở dạng giống sterol, dạng
kéo dài hoặc cuộn. Thật thú vị khi cấu trúc squalene cũng có thể Ďược tổ chức ở cả
dạng giống với sterol. Hauss và cs (2002) Ďã chỉ ra squalane - một dạng hydro


6

hóa của squalene, Ďược gắn theo chiều ngang trong màng kép phospholipid. Các tác
giả nêu trên Ďã chỉ ra rằng cấu trúc liên kết như vậy có thể giúp bảo vệ việc chống
lại sự mất proton và ảnh hưởng tới protein màng [9]. Lohner và cs (1993) cũng Ďã
chứng minh squalene ở nồng Ďộ 6 % Ďã làm thay Ďổi cấu trúc lục giác bằng cách
tăng kích thước của các ống lục giác ngược. Trong trường hợp này cấu trúc squalene
Ďược cuộn lại và tích lũy trong lớp màng lipid kép (là màng hay một vùng của
màng chứa các phân tử lipid) [10]. Các thí nghiệm này cho thấy squalene trong
màng lưới nội chất có thể thích ứng với một dạng cấu trúc gần giống với ergosterol
trong khi cấu trúc cuộn trong màng huyết tương có thể chiếm ưu thế.
1.1.3. Các con đường sinh tổng hợp của squalene ở động vật, thực vật và vi sinh vật
Squalene là một hợp chất trung gian trong tổng hợp các hopanoid, phytosterol
và hơn 200 triterpenes quan trọng cho màng tế bào [11]. Squalene Ďược tổng hợp từ
các Ďơn vị isopentenyl, iso pentenyl di-phosphate (IPP) thông qua con Ďường
mevalonate (MVA) và dimethyl-allyl-diphosphate (DMAPP) thông qua con Ďường
methylerytritol phosphate (MEP) [12, 8]. Sự tổng hợp squalene thông qua con Ďường
MVA bắt Ďầu với sự kết hợp của một acetyl-CoA với một acetyl-CoA khác bởi
acetoacetyl-CoA synthase. Enzyme này Ďược gọi là transferyl acetyl-CoA hoạt Ďộng
từ sự hình thành của acetoacetyl-CoA. Chuỗi phản ứng từ acetoacetyl CoA Ďến
mevalonate tiếp tục tạo thành 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) với sự có
mặt của adenosine triphosphate (ATP) Ďể tạo thành mevalonate 5-phosphate [13]. Sau
Ďó, tiếp tục phosphoryl hóa bởi phosphomevalonate kinase với sự hiện diện của ATP
Ďể tạo thành mevalonate 5-diphosphate. Tiếp theo, decacboxyl hóa bằng decarboxylase
5-diphosphate mevalonate Ďể tạo thành IPP, từ Ďây nó là chất cơ bản Ďể xây dựng các
hợp chất polyprenyl. DMAPP sau Ďó Ďược tạo thành bằng cách Ďồng phân hóa IPP
thơng qua isopentanyl diphosphate isomerase. Phản ứng ngưng tụ của IPP với DMAPP
khi có mặt của farnesyl diphosphate synthase Ďã tạo thành geranyl diphosphate (GPP)
và sau Ďó có q trình ngưng tụ tiếp tục với một IPP khác Ďể tạo thành farnesyl
diphosphate (FPP). Cuối cùng, squalene synthase Ďược xác Ďịnh là enzyme xúc tác
cho sự hình thành gián tiếp NADPH của squalene với FPP là cơ chất [14, 15, 11]. Sinh
tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP do sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá

trình sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-Dxylulose-5-


7
phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia Ďể hình thành
IPP và DMAPP. Các bước cịn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con Ďường MVA.

Con đường sinh tổng hợp squalene ở động vật có vú [8]
Ở các tế bào Ďộng vật, sự tổng hợp cholesterol (Hình 1.2A) xảy ra thơng qua

con Ďường MVA/isoprenoid. Con Ďường này bắt Ďầu với acetyl-CoA, Ďược chuyển
thành HMG-CoA và sau Ďó Ďược khử bằng 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA
reductase (HMGR) thành MVA. Sự Ďiều hịa Ďược duy trì bằng cách kích hoạt hoặc
làm giảm HMGR. HMGR là một loại protein không thể tách rời của mạng lưới nội chất
chứa vùng cảm ứng sterol xuyên màng, Ďóng vai trị quan trọng trong sự thối hóa của
enzyme bởi proteasome. Các nghiên cứu gần Ďây cho thấy có sự kích thích trực tiếp và
gián tiếp của sự thối hóa bởi cholesterol, lanosterol và oxapseol.

A

B

Hình 1.2. Tổng hợp squalene thơng qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A) [8].
AACT - acetoacetyl-CoA thiolase; FPS - FPP synthase; HMGS - HMG-CoA synthase; HMGR HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphate isomerase; SQS - squalene synthase; SQE squalene epoxidase. Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA ở phần

bào tan (cytosol) và MEP ở lạp thể (plastid) (B). AACT-acetoacetyl-CoA thiolase; DMAPP dimethylallyl diphosphate; DXP - 1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate; DXR - DXP reductoisomerase;
DXS - DXP synthase; FPP - farnesyl diphosphate; FPS - FPP synthase; G-3-P - glycerol-3phosphate; GPP - geranyl diphosphate; GGPP - geranylgeranyl diphosphate; HMBPP - (E)-4hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate; HMG-CoA - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; HMGS HMG-CoA synthase; HMGR-HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphateisomerase;IPPisopentenyldiphosphate; MEP - 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MVA - mevalonate; SQSsqualene synthase; ER - endoplasmic reticulum.