(Luận văn thạc sĩ) xây dựng quy trình phân tích đa hình gen cyp2c93 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac
y

an
d

Ph
arm

NGUYỄN THỊ NGA

,V
NU

KHOA Y DƯỢC

of

M

ed
ici
ne

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN
CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ
THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở
NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

NGÀNH Y ĐA KHOA

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Ph
arm

ac
y

,V
NU

KHOA Y DƯỢC

an
d

NGUYỄN THỊ NGA

ed
ici
ne

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH GEN

of

M

CYP2C9*3 LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG ĐIỀU TRỊ
THUỐC CHỐNG ĐÔNG ACENOCOUMAROL Ở
NGƯỜI BỆNH SAU THAY VAN TIM

Khóa:

QH.2013.Y

Người hướng dẫn:

ThS. Phạm Thị Hồng Nhung

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN

,V
NU

Khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Bác sĩ đa khoa của tôi không chỉ là kết

ac
y

quả cho sự cố gắng của bản thân mà còn do nhận được sự giúp đỡ, động viên của cô
thầy, bạn bè và người thân. Qua trang viết này tôi xin gửi lời cảm ơn tới những
người đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập – nghiên cứu vừa qua.
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn tới ThS. Phạm Thị
Hồng Nhung – người đã tận tình chỉ bảo, đồng hành cùng tơi trong suốt q trình

Ph
arm

thực hiện đề tài khóa luận. Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Lệ
Hằng đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại phịng thí
nghiệm. Các cơ khơng chỉ trang bị cho tôi kiến thức khoa học, các kỹ năng phịng
thí nghiệm mà cịn truyền cho tơi niềm cảm hứng, lịng đam mê với nghiên cứu.

ed
ici
ne

an
d

Tơi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Y Dược và Bộ môn Y Dược học
cơ sở đã hết lòng quan tâm, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và
hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi xin trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ kinh phí cho đề
tài mã số QG.17.29 do PGS.TS. Phạm Trung Kiên chủ trì và nghiên cứu của của tơi

là một phần trong đó.

M

Tơi xin cảm ơn tập thể nhân viên Bệnh viện Tim Hà Nội đã tạo điều kiện để
tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất. Tôi cũng xin gửi lời tri ân tới các người

of

bệnh đã tham gia vào nhóm nghiên cứu của đề tài.

Sc

ho

ol

Xin gửi lời cảm ơn tốt đẹp tới nhóm sinh viên nghiên cứu thuộc bộ môn Y
Dược học cơ sở đã luôn hỗ trợ kịp thời và giúp đỡ tôi khi tơi gặp khó khăn trong
q trình thực hành nghiên cứu.

@

Bên cạnh đó, xin cảm ơn Quỹ học bổng PDG Trust đã luôn tin tưởng và
đồng hành cùng tôi trong thời gian làm khóa luận nghiên cứu bậc đại học.

Co

py

rig

ht

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ sự yêu thương đến gia đình, bạn bè, những
người đã ln là điểm tựa để tơi n tâm hồn thành tốt nhất khóa luận này.
Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Thị Nga


,V
NU

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể)

Bp

Base pair (Cặp bazơ nitơ)

CYP

Cytochrome P450

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid (Axit Deoxynucleic)

dNTP

Deoxynucleotit triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic acid (Axit ethylene diamine
tetra-acetic)

INR

International normalized ratio (Thời gian prothrombin đo với tỷ

Ph
arm

an
d

lệ chuẩn hóa quốc tế)

ac
y

BMI

Optical density (Mật độ quang học)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PCR-CTPP

Polymerase Chain Reaction with confronting two-pair primers
( Phản ứng chuỗi polymerase với hai cặp mồi kép)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài
đoạn cắt giới hạn)

SNP

Single nucleotit polymorphism (Đa hình đơn nucleotit)

VKORC1

Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 (Phức hợp
reductase vitamin K epoxide, tiểu đơn vị 1)

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

ed
ici
ne

OD


,V
NU

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị

5

Bảng 3.1

Kết quả nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số

20

Bảng 3.2

22

Bảng 3.3

Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại đoạn gen
CYP2C9*3
Kết quả tần số alen và tần số kiểu gen CYP2C9*3

Bảng 4.1

Mối liên quan giữa đa hình di truyền gen CYP2C9 *3 tới chỉ

27

Ph
arm

ac
y

Bảng 1.1

23

an
d

định liều Acenocoumarol và nguy cơ chảy máu của một số
nhóm nghiên cứu Hà Lan
Các biến trong thuật tốn tính liều acenocoumarol ở nhóm

ed
ici
ne

Bảng 4.2

27

nghiên cứu người Tây Ban Nha

So sánh liều trung bình mg/tuần qua phân tích từ các thuật
tốn của các nhóm nghiên cứu khác nhau

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

Bảng 4.3

28


,V
NU

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang

Hình 1.1

Các giai đoạn của q trình đơng máu

Hình 1.2

Cơ chế tác động của chống đơng kháng Vitamin K tại gan

Hình 1.3

Phương pháp giải trình tự tự động

Hình 2.1

Sơ đồ nghiên cứu

Hình 3.1

Kết quả điện di DNA tổng số 10 người bệnh trong nhóm
nghiên cứu.

20

Hình 3.2

Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối

21

Ph
arm

ac
y

3
6

12
15

Hình 3.3

an
d

ưu nhiệt độ gắn mồi nhân dịng alen CYP2C9*3
Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % của thí nghiệm PCR tối

21

Hình 4.1

Tần số alen C của CYP2C9*3 trên một số quần thể người. Tần
số alen C ở các quần thể khác được lấy từ tài liệu số
Nguyên lý của phương pháp PCR-CTPP.

24

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

Hình 4.2

22

M

Hình 3.5

Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen CYP2C9*3 trên gel
agarose 1,5 %
Kiểu gen CYP2C9*3 xác định thơng qua giải trình tự

of

Hình 3.4

ed
ici
ne

ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA nhân dòng alen CYP2C9*3

23

25


,V
NU

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................... 3

ac
y

1.1.Khái qt q trình đơng máu và bệnh lý van tim ............................. 3
1.1.1 Q trình đơng máu ..................................................................... 3

Ph
arm

1.1.2. Bệnh lý van tim............................................................................ 4
1.2.Thuốc chống đông kháng vitamin K .................................................... 4
1.3.Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol ............................. 7
1.3.1 Dược động học Acenocoumarol ................................................... 7

an
d

1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol ............................................ 8

ed
ici
ne

1.4.Tổng quan về đa hình CYP2C9*3 ......................................................... 9
1.4.1. Enzym CYP2C9 ........................................................................... 9
1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 ...................................... 10
1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu ......................................... 10

M

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 14

of

2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 14
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh ............................................... 14

ol

2.1.2. Các tiêu chuẩn loại trừ .............................................................. 14
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................. 14

Sc

ho

2.2. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu ............................................ 14
2.2.1. Hóa chất.................................................................................... 14
2.2.2. Thiết bị ...................................................................................... 14

Co

py

rig

ht

@

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 15
2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm ....................................... 15
2.3.2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit ...... 16
2.3.3. Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3 .............................. 17
2.3.4. Kiểm tra chất lượng DNA .......................................................... 17
2.3.5. Giải trình tự DNA...................................................................... 18
2.3.6. Phân tích kết quả và xử lý số liệu .............................................. 18

2.4. Đạo đức nghiên cứu


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 20

,V
NU

3.1. Tách chiết DNA tổng số và kiểm tra chất lượng DNA ..................... 20
3.2. Khuếch đại đoạn gen chứa CYP2C9*3 .............................................. 20
3.2.1. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi với enzym Phusion Polymerase ........... 21

ac
y

3.2.2. Tối ưu nồng độ mồi và nồng độ DNA......................................... 21
3.3. Giải trình tự vùng gen chứa CYP2C9*3 ............................................ 23

Ph
arm

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................... 24
4.1. So sánh tần số CYP2C9*3 ở các quần thể khác nhau ....................... 24
4.2. Các phương pháp phân tích CYP2C9*3 được sử dụng hiện nay ..... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

ed
ici
ne

TÀI LIỆU THAM KHẢO

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

PHỤ LỤC

Co

an
d

4.3. Ứng dụng tính liều điều trị acenocoumarol ...................................... 26


ĐẶT VẤN ĐỀ

,V
NU

Bệnh lý van tim là một trong các bệnh phổ biến trên thế giới cũng như tại
Việt Nam, là nguyên nhân hàng đầu gây suy tim và đe dọa tính mạng của người
bệnh. Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh van tim là do di chứng của tổn thương van
tim trong bệnh thấp tim [10]. Từ khi có kỹ thuật sửa và thay van tim, cuộc sống của

ac

y

người bệnh mắc bệnh van tim đã được cải thiện đáng kể, mang lại cho họ cuộc sống
gần như bình thường. Tuy nhiên, trong quá trình hoạt động các van tim nhân tạo

Ph
arm

thường sinh ra các cục máu đông dễ gây tắc mạch, huyết khối. Do vậy, ngay sau khi
thay van tim người bệnh phải sử dụng thuốc chống đông. Tại Việt Nam, thuốc
chống đông kháng vitamin K đã được đưa vào sử dụng hơn 25 năm nay với biệt
dược chính là Sintrom (Acenoucomarol) có hiệu quả trong phịng và điều trị huyết

ed
ici
ne

an
d

khối đã được chứng minh. Tuy nhiên trong quá trình sử dụng thuốc chống đông
kháng vitamin K tỷ lệ gặp biến chứng khá cao, khoảng điều trị hẹp, tác dụng của
thuốc chịu ảnh hưởng nhiều bởi nhiều yếu tố (chế độ ăn, các thuốc khác như
aspirin, kháng sinh cephalosporin…) nên việc xác định liều lượng điều trị phù hợp
gặp nhiều khó khăn. Nếu liều dùng thuốc sử dụng thấp thì không đạt hiệu quả điều
trị nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy máu thậm chí gây tử vong.

M

Hiện nay các thầy thuốc lâm sàng điều chỉnh liều thuốc chống đông kháng

vitamin K chủ yếu dựa vào xét nghiệm INR (Thời gian Prothrombin đo với tỉ lệ
chuẩn hóa quốc tế- International Normalized Ratio) của người bệnh. INR yêu cầu

of

phải theo dõi hàng ngày để điều chỉnh liều, điều đó gây khó khăn việc này địi hỏi

Sc

ho

ol

phải theo dõi INR hàng ngày để điều chỉnh liều, gây nên những khó khăn về thời
gian và kinh tế cho người bệnh tiến hành xét nghiệm. Qua q trình theo dõi điều
trị, có sự khác nhau về kết quả điều trị người bệnh trong cùng một nhóm tuân thủ
điều trị như nhau. Vậy điều gì ảnh hưởng tới kết quả INR ở những người bệnh cùng

@

độ tuổi, cùng giới tính, cùng phác đồ là câu hỏi vẫn chưa có lời giải thích đầy đủ.

rig

ht

Kiểu gen thu được từ dự án giải trình tự bộ gen người năm 2000 đã mở ra
một kỷ nguyên mới cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào kiểu
gen đang trở thành một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng. Hơn 30

Co

py

gen đã được tìm thấy tham gia vào các hoạt động trao đổi chất của thuốc chống
đông máu họ Coumarin dạng uống, trong đó nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng
đa hình di truyền CYP2C9*3 (c.1075 A > C) là một trong các yếu tố di truyền quan
trọng ảnh hưởng đến sự đáp ứng thuốc chống đông kháng vitamin K. Một số nghiên
cứu cho thấy người bệnh mang kiểu gen đồng hợp đột biến CC, và dị hợp AC cần
1


,V
NU

giảm liều chống đông so với người bệnh đồng hợp kiểu dại AA [25, 42]. Do đó,
việc xác định được kiểu gen này đóng một vai trị quan trọng trong tiên lượng đáp
ứng thuốc điều trị ở từng người bệnh.

Trong bối cảnh của Việt Nam hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về mặt di

ac
y

truyền học liên quan tới việc chỉ định liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh.
Chính vì vậy, tơi tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng quy trình phân tích đa hình di
truyền gen CYP2C9*3 liên quan đến đáp ứng điều trị thuốc chống đông

Ph
arm

Acenocoumarol ở người bệnh sau thay van tim” với mục tiêu và nội dung nghiên
cứu như sau:
Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được quy trình tối ưu để xác định đa hình di truyền CYP2C9*3

-

an
d

trên mẫu máu người bệnh sau thay van tim.

Nội dung nghiên cứu

ed
ici
ne

Áp dụng được quy trình đã tối ưu để đánh giá mức độ đa hình di truyền
CYP2C9*3 trên 100 người bệnh sau thay van tim tại Việt Nam.

-

- Tối ưu hóa phản ứng PCR nhân dịng đoạn gen chứa đa hình CYP2C9*3.

M

- Giải trình tự và xác định kiểu gen của các đa hình CYP2C9*3.

Áp dụng quy trình phân tích gen để khảo sát tần số kiểu gen và tần số alen
trên 100 người bệnh sau thay van tim ở Việt Nam.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

-

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

,V
NU

1.1. Khái quát quá trình đơng máu và bệnh lý van tim
1.1.1 Q trình đơng máu

ac
y

Bình thường máu lưu thơng trong lịng mạch ở trạng thái lỏng, khơng đơng
nhờ có sự cân bằng giữa hệ thống đông cầm máu và ức chế đông máu. Khi xảy ra
tổn thương mạch máu, hệ thống đông cầm máu được khởi động nhằm tạo cục máu

Ph
arm

đông khu trú tại chỗ tổn thương, làm ngừng chảy máu. Sau khi hoàn thành chức
năng cầm máu, cục máu đông sẽ được tiêu đi, trả lại sự lưu thơng bình thường cho
lịng mạch. Tồn bộ q trình cần có sự tham gia của các thành phần: thành mạch,
tiểu cầu, các yếu tố đông máu, các chất ức chế đông máu, hệ thống tiêu sợi huyết.

an
d

Q trình đơng cầm máu gồm các giai đoạn: cầm máu nguyên phát (tạo nút

ed
ici
ne

cầm máu tạm thời), đông máu huyết tương (tạo nút cầm máu vĩnh viễn), tiêu cục
máu đông [6]. Cầm máu nguyên phát diễn ra ngay tức khắc, có hai yếu tố quan

trọng là tiểu cầu (kết hợp thành nút chặn tiểu cầu) và thành mạch (hiện tượng co
mạch). Tiểu cầu kết dính vào nơi thành mạch bị tổn thương trực tiếp hay thông qua

of

M

yếu tố Von-Willebrand. Cầm máu thứ phát (đông máu huyết tương) diễn ra chậm,
vài phút tới vài giờ. Sau khi ra khỏi lịng mạch 2-4 phút, máu bắt đầu đơng lại. Máu
đơng lại là do sự chuyển fibrinogen thành fibrin khơng hịa tan dưới xúc tác của
thrombin. Các fibrin trùng ngưng với nhau tạo thành mạng lưới giam giữ các tế bào
máu và huyết tương tạo thành cục máu đông. Sơ đồ thể hiện ở Hình 1.1.
Yếu tố ngoại sinh

ho

ol

Yếu tố nội sinh

Thrombokinase
Prothrombin

Thrombin

Co

py

rig

ht

@

Sc

Các yếu tố đơng máu được hoạt hóa kết hợp với Ca2+

Fibrinogen

Fibrin

Hình 1.1 Các giai đoạn của q trình đơng máu

3


1.1.2. Bệnh lý van tim

,V
NU

Bệnh lý van tim là tình trạng van tim bị bệnh lý hoặc bị tổn thương và có thể
ảnh hưởng đến dịng máu chảy qua tim. Có hai loại bệnh van tim chính. Hẹp
van: nghĩa là việc mở van bị giới hạn và van không mở ra hồn tồn. Vì vậy, làm

ac
y

hạn chế lưu lượng máu chảy qua van. Hở van: nghĩa là van khơng đóng đúng cách
và có dịng máu phụt ngược qua van bị hở. Đơi khi cịn được gọi là thiểu năng van,
hoặc rị van. Bất kỳ van tim nào cũng có thể bị ảnh hưởng bởi những vấn đề này.

Ph
arm

Tuy nhiên, van hai lá và van động mạch chủ thường gặp hơn [4].

Hầu hết các vấn đề về van tim có thể được điều trị bằng thuốc, can thiệp hay
phẫu thuật sửa chữa, thay thế. Tùy vào nguyên nhân gây hở van, mức độ nặng của
bệnh mà bác sĩ đưa ra khuyến cáo phù hợp cho người bệnh. Các thuốc điều trị hẹp,

an
d

hở van tim đã chứng minh có thể kiểm sốt hoặc làm giảm các triệu chứng, giảm

ed
ici
ne

gánh nặng cho tim và làm chậm tiến triển của bệnh. Các thuốc thường dùng gồm
thuốc lợi tiểu: giúp giảm gánh nặng cho tim; thuốc ức chế men chuyển hạ huyết áp
và giảm gánh nặng cho tim; chẹn beta giao cảm: giảm nhịp tim, kiểm soát nhịp tim
và hạ huyết áp; các thuốc trợ tim giúp ổn định nhịp tim và giúp tăng sức bóp cơ tim;
thuốc chống đơng: ngăn ngừa nguy cơ hình thành cục máu đông, đặc biệt sau phẫu
thuật van tim hoặc thay van bằng vật liệu tổng hợp.

of

M

Phẫu thuật tim hở hay can thiệp tim qua da, sẽ được bác sỹ quyết định dựa
trên mức độ tổn thương van. Can thiệp qua da được áp dụng với các trường hợp van

Sc

ho

ol

bị lỗi hoặc khuyết tật van tim bẩm sinh. Sửa chữa van tim đơn giản hơn thay van
tim vì tổn thương ít hơn, chi phí điều trị thấp hơn và hạn chế được nguy cơ bị nhiễm
trùng sau phẫu thuật. Thay thế van tim: khi khơng cịn khả năng sửa chữa, tiến hành
thay van tim bằng van tim cơ học hoặc van tim sinh học.

rig

ht

@

Van sinh học được làm từ mô tim động vật, mô tim của người hiến tặng hoặc
sử dụng mơ của chính người bệnh. Van sinh học không cần sử dụng thuốc chống
đông suốt đời. Van cơ học được làm bằng vật liệu tổng hợp, thiết kế để hoạt động
được nhiều năm tuy nhiên van cơ học đã được nghiên cứu và chứng minh tăng nguy
cơ tạo cục máu đơng do đó cần sử dụng thuốc chống đông suốt đời.

py

1.2. Thuốc chống đông kháng vitamin K

Co

Sau thay phẫu thuật thay van tim biến chứng hay gặp nhất là do sử dụng các
thuốc chống đơng máu. Có thể nói thay van tim là thay một “bệnh van tim” bằng
một “bệnh van tim nhân tạo”, do van tim nhân tạo khi hoạt động sẽ hình thành nên

4


,V
NU

các cục máu đơng có nguy cơ gây tắc mạch và huyết khối. Do vậy, tất cả người
bệnh sau thay van tim đều phải sử dụng thuốc chống đông nhằm ngăn ngừa hình
thành các cục máu đơng, tránh nguy cơ gây tắc mạch và/hoặc huyết khối.

Thuốc kháng vitamin K đường uống đã được sử dụng từ rất lâu (từ những năm

ac
y

1940), có một số nhóm thuốc kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol... Các
thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị tại Việt Nam được trình bày ở
Bảng 1.1.

Hoạt chất

Biệt dược

Dạng bào chế

Viên nén 4mg,
vạch chia ¼

ed
ici
ne

Sintrom
Acenocoumarol
Mini-

Viên nén 1mg

M

sintrom

Viên nén 2mg có
vạch chia

of

Coumadine

ol

Warfarin

Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày
Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày
Người lớn: Liều khởi đầu 4mg/ngày
Trẻ em: 0,05 đến 0,14mg/kg/ngày
Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày
Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày

Viên nén 5mg có
vạch chia

Người lớn: Liều khởi đầu 5mg/ngày

Viên nén 20mg,
vạch chia ¼

Người lớn: Liều khởi đầu 20mg/ngày

ho

Coumadine

Liều dùng

an
d

DẪN XUẤT COUMARIN

Ph
arm

Bảng 1.1 Các thuốc kháng vitamin K chính sử dụng trong điều trị

Trẻ em: 0,09 đến 0,32mg/kg/ngày

@

Sc

DẪN XUẤT INDANEDION

Previscan

Trẻ em: 0,37 đến 1,4mg/kg/ngày

rig

ht

Fluindion

Co

py

Thuốc chống đơng kháng vitamin K có khoảng an tồn rất hẹp, nếu dùng liều
thấp thì khơng đạt hiệu quả kháng đông, nhưng nếu quá liều sẽ gây biến chứng chảy
máu đe dọa tính mạng người bệnh. Do vậy, khi dùng thuốc chống đông kháng

vitamin K cần phải nêu rõ các thông tin sau (1) thuốc cụ thể được dùng (warfarin,

5


,V
NU

acenocoumarol, phenprocoumon), (2) khoảng INR đích đối với từng van, (3) INR
trung bình đạt được, (4) phương pháp kiểm sốt kháng đơng (bác sĩ hoặc điều
dưỡng kiểm sốt, hoặc người bệnh tự điều chỉnh ở nhà), và (5) thời gian điều trị.
Nếu người bệnh bị huyết khối van, thuyên tắc hoặc biến cố chảy máu thì phải nêu rõ
INR vào thời điểm xảy ra biến cố.

ac
y

Có nhiều loại thuốc chống đông, nhưng tại Việt Nam hiện nay được dùng nhiều
nhất là thuốc kháng vitamin K do giá thành hợp lý và nằm trong danh mục được bảo

Ph
arm

hiểm y tế chi trả. Cơ chế chống đơng được miêu tả như Hình 1.2
Vitamin K oxide Reductase

an
d

Thuốc kháng vitamin K

Yếu tố (II), (VII), (IX), (X)

Vitamin K bị oxy hóa

ed
ici
ne

Vitamin K bị khử

Yếu tố (II), (VII), (IX), (X) hoạt hóa

of

M

Carboxylase

ol

Hình 1.2 Cơ chế tác động của chống đông kháng Vitamin K tại gan

Sc

ho

Chống đông kháng vitamin K tác động bằng làm giảm chức năng carboxyl
hóa của vitamin K nhằm biến đổi các tiền chất thành các yếu tố đông máu gồm: yếu
tố prothrombin (yếu tố II), proconvertin (yếu tố VII), yếu tố anti hemophilia B (yếu

rig

ht

@

tố IX), và yếu tố Stuart-Prower (yếu tố X), sau cùng thành yếu tố đông máu bất
hoạt. Trong quá trình chuyển đổi, vitamin K bị oxy hóa thành expoxid vitamin K.
Như vậy các kháng vitamin K có tác dụng chống đông máu gián tiếp bằng cách
ngăn cản tổng hợp các dạng hoạt động của nhiều yếu tố đông máu kể trên.

Co

py

Đã có nhiều nghiên cứu và hướng dẫn việc sử dụng thuốc chống đông sau
thay van tim. Bourguigon T. và cộng sự theo dõi 505 người bệnh thay van tim cơ
học trong thời gian 8 năm thấy biến chứng gặp nhiều nhất là tắc mạch và chảy máu
có liên quan đến hoạt động của van [14]. Abhijit Trailokya và cộng sự khuyến cáo
liều acenocoumarol 4-8 mg/ngày từ ngày thứ hai và duy trì mức INR từ 3 đến 4 là
6


,V
NU

an toàn và hiệu quả [9]. Nghiên cứu của Alec Vahanian và cộng sự đã đưa ra được
những chỉ định rất cụ thể về sử dụng thuốc chống đông sau mổ thay van và đề xuất
mức INR cho người bệnh thay van tim cơ học từ 2,5 đến 4 [10]. Nghiên cứu của

Nashimura và cộng sự trên 650 người bệnh thay van tim thấy 0,62 % có tắc mạch

ac
y

và 0,95 % chảy máu, dùng thuốc chống đông kháng vitamin K liều 1-2,5 mg/ngày
có thể hạn chế được tắc mạch [16]. Isthyak Ashmed Mir nghiên cứu trên 127 người
bệnh sử dụng acenocoumarol sau thay van tim cho thấy nếu người bệnh duy trì

Ph
arm

được mức INR từ 2,5-3,5 sẽ giảm tối đa nguy cơ tắc mạch và chảy máu [27].
Elbardissi và cộng sự nghiên cứu 861 người bệnh thay van động mạch chủ thấy
rằng nếu sử dụng sớm thuốc chống đơng thì hầu hết không thấy tai biến huyết khối
tắc mạch sau thay van [22].

1.3.1 Dược động học Acenocoumarol

an
d

1.3. Dược động học và dược di truyền Acenocoumarol

ed
ici
ne

Việc hoàn thành dự án bộ gen người năm 2000 đã mở ra một kỷ nguyên mới
cho ngành khoa học sức khỏe. Y học cá nhân hóa dựa vào bằng chứng đang nổi lên

như một phương pháp điều trị mới trong thực hành lâm sàng trong thời gian gần

of

M

đây. Thuốc chống đông kháng vitamin K như warfarin, acenocoumarol và
phenprocoumon là thuốc thường được kê đơn nhất cho việc quản lý các vấn đề liên
quan đến đông máu ở người bệnh rung nhĩ, thay van tim, vùng sâu, huyết khối tĩnh
mạch, phổi thuyên tắc và với những người bệnh đã trải qua phẫu thuật chỉnh hình

ho

ol

[17, 40, 25, 18]. Nếu như tại Mỹ, hơn 2 triệu người bệnh được cho warfarin đơn liều
để ngăn ngừa huyết khối tắc mạch [31], thì ở Việt Nam, acenocoumarol (Sintrom)
được sử dụng rộng rãi để điều trị hơn warfarin.

Sc

Cấu trúc hoá học của acenocoumarol được đặc trưng bởi nhóm nitro ở vị trí

ht

@

para của vịng phenyl và tồn tại ở hai dạng đồng phân R (+) và S (-), trong đó R (+)
acenocoumarol có tác dụng chống đơng mạnh hơn so với S (-) acenocoumarol. Cơ
chế chống đông acenocoumarol cũng giống như nhóm thuốc chống đơng kháng

Vitamin K khác đã trình bày ở Hình 1.2

rig

Acenocoumarol được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa và đạt nồng

Co

py

độ tối đa (Cmax) 0,3 (± 0,05) mcg/mL trong 2-3 giờ. Acenocoumarol trong huyết
tương đa phần ở dạng liên kết với protein, chỉ 1,52 % tồn tại ở trạng thái tự do. Sau
khi uống, nồng độ thuốc trung bình đạt được trong huyết tương và thời gian bán thải
của Acenocoumarol lần lượt là 3,9 (± 0,7) mcg mL/giờ và 10,9 (± 1,5) giờ. Thời

7


,V
NU

gian để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc làm tăng thời gian prothrombin là từ 2430 giờ [27]. Acenocoumarol là thuốc có thời gian bán thải ngắn, do vậy nó được
đào thải ra ngồi một cách nhanh chóng.

Năm 1982 Tổ chức Y tế Thế giới đưa ra khái niệm INR (International

ac
y

Normalized Ratio). Định nghĩa INR như sau: INR = (PT người bệnh / trung bình

PT bình thường)ISI, trong đó ISI (International Sensitivity Index) là độ nhạy của lơ
thromboplastin được dùng so với thromboplastin chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới

Ph
arm

có ISI = 1 (ISI của mỗi lơ thromboplastin do nhà sản xuất cung cấp). Hiện nay INR
được xem là xét nghiệm chuẩn để đánh giá mức độ chống đơng bằng thuốc kháng
vitamin K. Vì khơng thể có được một giá trị INR cố định trong suốt quá trình điều
trị dài hạn, các hướng dẫn điều trị đưa ra một khoảng INR cần đạt đối với từng bệnh

an
d

lý (ví dụ đối với người có van 2 lá cơ học khoảng INR cần đạt là 2,5-3,5). Liều

ed
ici
ne

thuốc kháng vitamin K được điều chỉnh để đạt INR trong khoảng này. Duy trì INR
trong một khoảng là một cơng việc khó khăn. INR có thể dao động (dù liều thuốc
kháng vitamin K không thay đổi) do những thay đổi của lượng vitamin K trong
khẩu phần ăn (các loại thức ăn chứa nhiều vitamin K gồm bắp cải, bông cải, cải

M

xoăn, rau diếp, gan bò, gan lợn), do thay đổi của chức năng gan, do tương tác thuốc
hoặc do người bệnh không tuân thủ điều trị. Trên thực tế, để duy trì INR ổn định
trong một khoảng đích cần thực hiện xét nghiệm này một cách định kỳ, ít nhất 1

lần/tháng và mỗi khi có phối hợp thêm một thuốc có tương tác với thuốc kháng

of

vitamin K

ol

1.3.2. Dược di truyền của Acenocoumarol

Sc

ho

Nghiên cứu trong nhiều năm trở lại đây, di truyền học là một trong các yếu
tố quan trọng đóng vai trị tiên lượng và thay đổi liều điều trị để đạt được khoảng
INR mong muốn [12, 44]. Hơn 30 gen đã được tìm thấy có tham gia vào các hoạt

ht

@

động và sự trao đổi chất của thuốc chống đông đường uống, trong đó CYP2C9 (một
trong những gen mã hóa cho họ enzym chuyển hóa thuốc cytochrome P450) và
VKORC1 (gen mã hóa cho tiểu phần 1 của enzym khử vitamin K 2,3 epoxide thành
dạng hoạt động) là hai gen quan trọng nhất ảnh hưởng tới đáp ứng thuốc chống

rig

đông Acenocoumarol [36, 28, 43].

Co

py

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng khoảng 30% của phương sai liều
phụ thuộc vào đa hình đơn nucleotit (SNP) trên gen VKORC1 và khoảng 12% phụ
thuộc vào SNP trên gen CYP2C9 [19, 38]. Một nghiên cứu của hiệp hội genome mở
rộng cũng chỉ ra rằng VKORC1, CYP2C9 và CYP4F2 là các yếu tố di truyền chủ
8


,V
NU

yếu chịu trách nhiệm cho sự biến thiên liều của chống đông đường uống ở người
bệnh da trắng và trong đó các SNPs của gen VKORC1 và gen CYP2C9 có vai trò
quan trọng nhất [38].

Xét về phương sai liều, VKORC1 được chứng minh có ảnh hưởng lớn hơn

ac
y

CYP2C9 trong một số nghiên cứu gần đây [28, 17]. Tuy nhiên, liều lượng thuốc
điều trị cho một cá thể được xác định bằng sự tương tác của các yếu tố di truyền và
mơi trường. Vì vậy, trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã nỗ lực để phát

Ph
arm

triển các thuật toán hướng dẫn liều điều trị dựa trên các yếu tố di truyền cũng như
lâm sàng [13]. Điều này cho thấy dược di truyền đóng vai trị quan trọng trong việc
hướng dẫn liều điều trị cho các thuốc thuộc họ coumarin.

Đa số các công bố hiện nay nghiên cứu nhiều về dược di truyền của warfarin,

an
d

trong khi đó những hiểu biết về dược di truyền với thuốc acenocoumarol còn rất hạn

ed
ici
ne

chế. Năm 2016, Kalpana S.R và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đa hình di truyền
gen của VKORC1, CYP2C9 với liều acenocoumarol sử dụng cho người bệnh [28].
Tác giả Van Schie và cộng sự công bố chi tiết về các thuật toán tiên lượng liều sử
dụng cho acenocoumarol và phenprocoumon có sự khác biệt đáng kể so với thuật

M

toán tiên lượng liều sử dụng cho warfarin [43]. Đây là một nghiên cứu trong chuỗi
nghiên cứu về gen mã hóa cho enzym ảnh hưởng đến xác định liều thuốc chống
đơng.

of

1.4. Tổng quan về đa hình CYP2C9*3

Sc

ho

ol

1.4.1. Enzym CYP2C9
Cytochrom P450 (CYP) là siêu họ enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa
phần lớn các thuốc được sử dụng trên lâm sàng hiện nay như: thuốc chống ngưng
tập tiểu cầu (clopidogrel), chống động kinh (phenytoin)… trong đó CYP2C9 là

@

enzym đóng vai trị quan trọng trong oxy hóa các hợp chất nội và ngoại sinh, đồng
thời là enzym tham gia chuyển hóa thuốc acenocoumarol.

ht

Hàng trăm loại thuốc điều trị được chuyển hóa bởi CYP2C9 tại gan, bao gồm
cả các loại thuốc có chỉ định điều trị hẹp như acenocoumarol, warfarin và phenytoin

Co

py

rig

và các loại thuốc khác như tolbutamide, losartan, glipizide, cũng như một số loại
thuốc chống viêm khơng steroid. Ngồi ra CYP2C9 tham gia chuyển hóa các hợp

chất nội sinh quan trọng như 5 -hydroxytryptamine thành epoxygenase hoạt động,
các axit béo khơng bão hịa thành một loạt các sản phẩm có hoạt tính sinh học.

9


,V
NU

Gen CYP2C9 là một trong nhiều gen CYP2C nằm trong một khu vực có kích
thước khoảng 500 kb ở vị trí số 23 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 10
(10q23.33). CYP2C9 có tính đa hình cao. Hơn 50 nucleotit polymorphisms (SNPs)
đã được tìm thấy trên vùng mã hóa của gen CYP2C9 [21]. Một số SNP đã được

ac
y

chứng minh là có liên quan tới việc làm giảm hoạt tính khử của enzym so với dạng
kiểu dại.

Ph
arm

1.4.2. Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3
Đa hình đơn nucleotit (Single nucleotit polymorphism – SNP) là những vị trí
nằm trong hệ gen của người, mà ở những cá thể khác nhau lại xuất hiện một loại
nucleotit khác nhau (A, T, G hoặc C). Mỗi vị trí được coi là một SNP chỉ khi tần số
ít nhất xuất hiện một alen phải lớn hơn hoặc bằng 1 %. Mặc dù về lý thuyết, có thể

ed

ici
ne

an
d

xuất hiện 1 trong 4 loại nucleotit, song thông thường SNP lại chỉ xuất hiện 2 loại
alen [45]. Nguyên nhân là do SNP bắt nguồn từ một đột biến điểm xảy ra trong hệ
gen, chuyển một nucleotit này sang một nucleotit khác. Nếu đột biến được xảy ra
trong tế bào sinh sản của cơ thể, thì sẽ có các thế hệ sau ra đời mang đột biến này,
và qua nhiều thế hệ sẽ hình thành SNP trong quần thể. Nhiều SNP có thể giúp dự

truyền theo gia đình [43].

M

đốn đáp ứng của từng cá nhân với các loại thuốc điều trị, tính nhạy cảm với các
yếu tố mơi trường và nguy cơ mắc một số bệnh, cũng như theo dõi các bệnh lý di
Đa hình di truyền đơn gen CYP2C9*3 (c.1075 A > C) hay rs1057910 là đột

ho

ol

of

biến đồng hoán A thay thế bằng C. Đột biến này làm khung đọc mARN bị ngắn hơn
bình thường và tạo ra dạng enzym khơng có hoạt tính. Alen CYP2C9*3 là dạng alen
đột biến CYP2C9 phổ biến nhất. Tại vị trí đa hình này tạo ra 3 trường hợp kiểu gen:
đồng hợp tử kiểu dại AA, dị hợp tử AC và đồng hợp tử kiểu đột biến CC.

Sc

1.4.3. Tổng quan phương pháp nghiên cứu

@

Tách DNA tổng số

ht

Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit để tách DNA tổng số. Nguyên lý của
kit này dựa trên sự hấp thụ chọn lọc của các acid nucleic vào màng silica-gel trong

Co

py

rig

điều kiện nhất định với 4 giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải phóng DNA; DNA
liên kết với màng silica-gel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel với Wash Buffer;
và thu DNA.

10


Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

,V

NU

Nguyên lý của kỹ thuật PCR là dùng enzym polymerase để tổng hợp nên hai
phân tử DNA mới từ 1 phân tử DNA khuôn ban đầu sau mỗi chu kỳ. Thành phần
chính của phản ứng gồm có DNA khn, cặp mồi, dung dịch đệm, 4 loại

ac
y

deoxyrinucleotit triphosphate (dA, dT, dG, dC), DNA polymerase. Chu trình nhiệt
gồm 3 giai đoạn chính. Giai đoạn biến tính: Dùng nhiệt độ cao (95 °C) để tách hai
mạch của chuỗi DNA xoắn kép. Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ được hạ xuống tới

Ph
arm

nhiệt độ gắn mồi, tạo điều kiện cho tự bắt cặp của mồi vào sợi DNA khuôn. Nhiệt
độ này phụ thuộc vào thành phần và số lượng nucleotit của cặp mồi. Giai đoạn kéo
dài: Tại 72 oC, DNA polymerase sẽ hoạt động tổng hợp lên mạch polynucleotit mới
dựa vào mạch khuôn và sử dụng 4 loại deoxynucleotit triphosphate [21, 43]. Sau n

an
d

chu kỳ, từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tổng hợp được 2n phân tử DNA mới.
Đánh giá chất lượng DNA bằng đo hấp thụ quang và điện di

ed
ici
ne

Sản phẩm DNA sau quy trình tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp
đo hấp thụ quang. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh
ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Để tính nồng độ DNA cần xác

of

M

định giá trị mật độ đo quang ở bước sóng 260 nm (OD260). Trong đó, 1 đơn vị
OD260 tương ứng dung dịch có nồng độ 50 ng/ml DNA sợi đôi [1]. Trong khi đó,
protein hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước sóng 280 nm (OD280) do có cấu trúc
vịng thơm của axit amin tryptophan. Độ tinh sạch của dịch chiết DNA được xác

Sc

ho

ol

định thơng qua tỉ số OD260/OD280 hay cịn kí hiệu là OD260/280. Nếu tỉ số này trong
khoảng 1,8 - 2,2, dung dịch DNA được coi là có độ tinh sạch cao, ít tạp nhiễm. Nếu
OD260/280 > 2,2 thì dung dịch DNA đã bị biến tính hoặc phân hủy. Nếu OD260/280 <
1,8 thì dung dịch DNA có lẫn nhiều tạp chất [3].

rig

ht

@

Chất lượng DNA cịn có thể kiểm tra bằng phương pháp điện di. Nguyên lý
của điện di dựa trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức kéo của điện trường tác động
vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của giá thể. Dung dịch đệm là môi trường
dẫn điện và tạo điện trường. Dưới tác động của điện trường, các phân tử khác nhau
về kích thước, điện tích, mức độ xoắn và hình dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng)

Co

py

sẽ di chuyển qua giá thể (gel agarose hay gel polyacrylamide) với tốc độ khác nhau.
Sau khi điện di kết thúc, các phân tử có thể quan sát được nhờ sử dụng thuốc nhuộm
phát huỳnh quang (như ethidium bromide). Độ sáng, số lượng băng, hình dạng băng
(thẳng gọn hay không) là các yếu tố giúp đánh giá chất lượng DNA. Cuối cùng,

11


,V
NU

kích thước băng điện di của mẫu có thể ước lượng thơng qua so sánh vị trí của băng
DNA với các băng đã biết kích thước trên thang chuẩn DNA [1].
Xác định kiểu gen của từng SNP bằng phương pháp giải trình tự

Giải trình tự của gen là phương pháp giúp phát hiện trình tự sắp xếp của bốn

ac
y

loại nucleotit trên phân tử DNA. Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình
tự DNA hiện nay đều dựa trên phương pháp Sanger: bổ sung các dideoxynucleotit
(ddNTP) lần lượt tương ứng với mỗi loại nucleotit A – T – G – C, tức là các

Ph
arm

nucleotit đã mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C2 và C3 của phân tử đường pentose. Khi
ddNTP được gắn vào mạch, do thiếu nhóm C3’- OH nên sự tổng hợp mạch đơn sẽ

Sc

ho

ol

of

M

ed
ici
ne

an
d

dừng lại tại đó và tạo ra các đoạn DNA khác nhau (mơ tả trong Hình 1.3) [1].

@

Hình 1.3 Phương pháp giải trình tự tự động

rig

ht

Trong phương pháp Sanger, phản ứng được chia làm 4 ống nghiệm tách biệt,
trong mỗi ống gồm một hỗn hợp 4 loại dNTP thông thường, một trong những loại
dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang tổng hợp. Ngoài ra,

Co

py

mỗi loại ddNTP sẽ được thêm vào lần lượt mỗi ống với nồng độ bằng 1/10 loại
tương ứng. Khi tổng hợp mạch mới, dNTP sẽ tham gia, cùng với đó là ddNTP mỗi
loại, nhưng với nồng độ thấp, làm kết thúc quá trình sao chép. Do đó hình thành hỗn
hợp nhiều phân tử DNA được sao chép khơng hồn chỉnh giống nhau ở đầu 5’

12


,V
NU

nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’. Sản phẩm này sẽ được
phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự băng xuất hiện.
Máy giải trình tự gen tự động hoạt động dựa theo nguyên lý của phương

pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP khơng được đánh dấu phóng xạ mà

ac
y

được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại. Máy bao
gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý
tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ

Ph
arm

thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotit A, T, C, G.
Ưu điểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các
bước, tốc độ đọc và mức độ chính xác rất cao. Tuy nhiên hạn chế là khơng đọc được
các trình tự quá ngắn, sai số tăng lên khi đoạn DNA dài hơn 1000 bp, hoặc các đoạn

an
d

DNA mang nhiều trình tự lặp có xu hướng bị nén lại khi chạy qua cột chứa gel nên

ed
ici
ne

có các pic ở các vùng lặp đó lồng vào nhau, khó xác định trình tự chính xác [21,
43].
Hiện nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về dược di truyền liên quan
tới các gen chuyển hóa acenocoumarol. Từ những dữ liệu ở trên, trong khuôn khổ

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho

ol

of

M

đề tài này, tôi chọn CYP2C9*3 (1075 A > C) là đối tượng nghiên cứu chính đồng
thời chọn phương pháp giải trình tự bằng máy tự động để xác định đa hình di truyền
CYP2C9*3 trên người bệnh thay van tim sử dụng acenocoumarol.

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

,V
NU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn người bệnh

ac
y

100 Người bệnh mắc bệnh van tim có chỉ định thay van tim cơ học tại Bệnh
viện Tim Hà Nội tham gia cung cấp mẫu. Tiêu chuẩn chọn người bệnh theo Khuyến

2.1.2. Các tiêu chuẩn loại trừ

Ph
arm

cáo của Hội Tim mạch học Việt Nam [2].

Đang chảy máu ngồi hoặc có chảy máu tạng; Huyết động không ổn định;
Tai biến mạch não dưới 3 tháng; Mới phẫu thuật dưới 1 tuần; Chống chỉ định dùng
thuốc chống ngưng tập tiểu cầu; Nguy cơ cao chảy máu; Suy thận, suy gan giai
2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

an
d

đoạn cuối; Không đồng ý tham gia nghiên cứu.

ed

ici
ne

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1/2017 đến tháng 6/2018.
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội.

M

2.2. Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất

of

E.Z.N.A blood DNA Mini kit (hãng Omega – Biotek); Ultra Pure Agarose

ht

@

Sc

ho

ol

(hãng Invitrogen); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck); Ethylene
diamine tetra acetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate (hãng Affymetrix); Nước
khử ion (hãng Omega Bio-tek); 6X DNA loading dye (Thermo Scientific); Cặp mồi
được đặt tổng hợp tại công ty Phusa Biochem (Việt Nam); dNTPMix 2mM mỗi loại

(hãng Thermo Scientific); Phusion DNA Polymerase (hãng Thermo Scientific);
DNA marker 100bp-4kb (Lonza); Lamda/HindIII DNA Ladder (hãng Thermo
Scientific).

Co

py

rig

2.2.2. Thiết bị
Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica
(Châu Âu); Tủ lạnh sâu Panasonic (Nhật Bản); Máy quang phổ NP 80
Nanophotometer (Implen, Đức); Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ); Máy soi gel
Cole-Parmer (Mỹ); Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh).

14


2.3. Phương pháp nghiên cứu

of

M

ed
ici
ne

an

d

Ph
arm

ac
y

,V
NU

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ thể hiện trong Hình 2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu

ho

ol

2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu sinh phẩm

Sc

Về lượng mẫu: 2 ml máu lấy từ tĩnh mạch được chia đều vào 3 ống chuyên
dụng chứa sẵn EDTA chống đơng (tối thiểu 300 µL máu/ống). Mỗi ống máu đủ cho

@

1 lần tách DNA tổng số, ln đảm bảo cịn mẫu lưu và có thể lặp lại việc tách DNA
tổng số đến khi xác định được kiểu gen của người bệnh.

rig

ht

Cách bảo quản: Mẫu máu được giữ lạnh ở -20 đến -300C cho đến khi được sử
dụng. Nếu khơng có tủ lạnh -200C, mẫu cần được giữ ở ngăn đá tủ lạnh dân dụng

py

hoặc trong đá không quá 1 ngày và không được giã đông trước khi tách DNA hoặc
chuyển đến nơi có tủ -200C để bảo quản.

Co

Kí hiệu mẫu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thơng tin: mã người bệnh, tên,
tuổi, ngày lấy mẫu. Thông tin về mẫu máu của người bệnh phải được lưu trong sổ

15


,V
NU

với các thông tin: tên, tuổi, mã người bệnh, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được
bàn giao và khi sử dụng để tách DNA.
2.3.2. Tách chiết DNA tổng số bằng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit
Các bước thao tác được tiến hành như sau:

Rã đông mẫu máu trên đá và để hóa chất về nhiệt độ phịng.

Bước 2.

Lắc đều ống máu. Chuyển 250µL mẫu vào ống ly tâm vơ trùng

Bước 3.

Thêm 25 µL OB Protease Solutionvà 250 µL BL Buffer, vortex 10 giây

Bước 4.

Ủ 65 oC trong 10 phút. Sau khi ủ được 5 phút, vortex trong 15 giây

Bước 5.

Thêm 260 µL Ethanol 100%. Vortex trong 20 giây

Bước 6.

Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 giây để đảm bảo mẫu khơng dính trên

an
d

Ph
arm

ac
y

Bước 1.

thành và nắp ống

Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2 mL

Bước 8.

Chuyển toàn bộ mẫu vào cột (để pipet ở mức 790 µL)

Bước 9.

Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

ed
ici
ne

Bước 7.

Bước 10. Bỏ dịch lọc và Collection Tube

M

Bước 11. Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube 2mL mới

of

Bước 12. Thêm 500 µL HBC Buffer

ol

Bước 13. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

ho

Bước 14. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

Sc

Bước 15. Thêm 700 µL DNA Wash Buffer
Bước 16. Ly tâm trong 1 phút ở 14.000 vòng/phút

@

Bước 17. Bỏ dịch lọc và sử dụng lại Collection Tube

ht

Bước 18. Lặp lại các bước 14-16 cho bước rửa thứ 2 với DNA Wash Buffer
khô cột

py

rig

Bước 19. Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 vòng/p trong 2 phút để làm
Bước 20. Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2mL mới

Co

Bước 21. Thêm 100 µL Elution Buffer (đã làm ấm đến 65 oC). Ủ ở 65 oC trong 5
phút
16


Bước 22. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút

,V
NU

Bước 23. Thêm 50 µL Elution Buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 24. Ly tâm tại 14.000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 25. Thu và bảo quản DNA ở -20 oC

ac
y

2.3.3. Khuếch đại đoạn gen đích chứa CYP2C9*3
Để có quy trình nhân dịng đặc hiệu và ổn định, tơi tiến hành xác định nhiệt

Ph
arm

độ gắn mồi, nồng độ hoạt động tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR sử
dụng Phusion polymerase (Thermo Scientific). Đoạn mồi tự thiết kế được đặt tổng
hợp tại Công ty Phusa Biochem (Việt Nam) có trình tự lần lượt là: mồi xi 5’

an
d

GCA TCT GTA ACC ATC CTC TC 3’ và mồi ngược 5’ GTG TCA AGA TTC
AGT TCT TTC C 3’. Dựa trên trình tự DNA tham chiếu trên Trung tâm Thơng tin
Cơng nghệ Sinh học Quốc gia- Mỹ (National Center for Biotechnology Information
- NCBI), đoạn DNA nhân dịng có độ dài lý thuyết được xác định là 719 bp.

ed
ici
ne

2.3.4. Kiểm tra chất lượng DNA

DNA tổng số và sản phẩm PCR sẽ được đánh giá chất lượng thông qua hai
phương pháp được mô tả bên dưới.

M

Đánh giá chất lượng DNA thông qua phương pháp đo quang
Khởi động máy, chọn chế độ đo nồng độ DNA.

Bước 2.

Đo mẫu trắng: lấy 2 µL Elution buffer dùng để pha loãng DNA làm dung
dịch đo mẫu trắng.

Bước 3.

Đo mẫu DNA: lấy 2 µL mỗi mẫu DNA để đo, máy sẽ tự động tính tốn
nồng độ DNA và độ tinh sạch dựa vào giá trị OD260 và OD280 thu được.

Sc

ho

ol

of

Bước 1.

Đánh giá chất lượng DNA thông qua điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Cho 1,5 g agarose pha trong 100 ml đệm
TAE 1X. Đun trong lị vi sóng cho agarose tan hồn tồn, sau đó để
nguội đến 50 – 60 oC thì đổ vào khay điện di có cài sẵn răng lược để tạo
các giếng tra mẫu. Sau khoảng 30 phút, gel đã đông lại, gỡ lược ra và đặt
bản gel vào bể điện di, phần giếng nằm gần phía cực âm của máy. Đổ
đệm TAE 1X vào bể điện di ngập cách mặt gel 1 – 2 mm.

Bước 2:

Tra mẫu DNA: 5 µL mẫu DNA được trộn với 1 µL 6X DNA loading dye

Co

py

rig

ht

@

Bước 1:

đã nhuộm Ethidim Bromua trước khi tra vào giếng. 5 µL thang chuẩn
17