Xây dựng quy trình xác định đa hình gen CYP2C19

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN CYP2C19
Triệu Tiến Sang*; Đào Văn Đôn*; Trần Văn Khoa*
Trương Ngọc Nam*; Lê Thị Hải Yến*; Nguyễn Hoàng Hiệp**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng thành công quy trình phát hiện đa hình gen CYP2C19. Đối tượng và
phương pháp: 10 mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân (BN) sau đặt stent động mạch vành qua
da tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103. Sử dụng phương pháp giải trình tự gen dựa trên
nguyên lý của Sanger. Kết quả: đã phát hiện các đa hình của gen CYP2C19. Kết luận: đã xây
dựng thành công quy trình xác định đa hình gen CYP2C19.
* Từ khóa: Gen CY2C19; Đặt stent động mạch vành; Giải trình tự gen.

Construction of Protocol for Screening CYP2C19 Polymophism Gene
Summary
Objectives: To construct successfully protocol screening CYP2C19 polymorphism gene.
Subjects and methods: 10 patients with venous blood transfusions were placed at Department
of Cardiology, 103 Hospital using a sequencing method based on Sanger's principle. Results:
CYP2C19 polymorphism was detected. Conclusion: CYP2C19 gene polymorphism has been
successfully established.
* Keywords: Gene CYP2C19; Coronary stent; Sequencing.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cytochrome - P450 - 2C19 (CYP2C19)
là một enzym thuộc siêu họ cytochrom
P450, tham gia vào quá trình chuyển hóa
các chất ngoại lai, bao gồm các thuốc
kháng tiểu cầu như clopidogrel, thuốc
chống động kinh, mephenytoin, omeprazol,
diazepam và một số loại thuốc an thần...
Khả năng chuyển hóa của CYP2C19 có

thể được phân loại như sau: chuyển hóa
siêu nhanh, chuyển hóa bình thường,
chuyển hóa trung gian, hoặc chuyển hóa

kém. Điều này dẫn đến có sự khác nhau
trong phản ứng chuyển hóa thuốc và đáp
ứng giữa các cá thể.
Clopidogrel là một tiền thuốc chưa có
tác dụng, sau quá trình chuyển hóa bởi
CYP2C19 ở gan, clopidogrel sẽ được
chuyển hóa thành chất có tác dụng chống
kết tập tiểu cầu, ngăn ngừa cục máu
đông và giảm hình thành huyết khối.
Việc xác định được kiểu gen CYP2C19
có vai trò rất quan trọng trong tiên lượng đáp
ứng thuốc, đặc biệt những thuốc chịu sự
chuyển hóa qua enzym này như clopidogrel.

* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Triệu Tiến Sang ()
Ngày nhận bài: 02/06/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/09/2017
Ngày bài báo được đăng: 26/09/2017

45


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
Một số hướng dẫn điều trị về can thiệp
tim mạch đã đề cập đến việc cần làm xét

nghiệm gen CYP2C19 trước khi chỉ định
dùng clopidogrel. Để làm được điều đó,
mỗi phòng thí nghiệm cần tối ưu hóa quy
trình, ổn định điều kiện thí nghiệm trước
khi áp dụng quy trình một cách thường quy.
Với mong muốn đưa ra quy trình xác
định kiểu gen CYP2C19, góp phần nâng
cao hiệu quả điều trị, giảm biến chứng và
nâng cao chất lượng cuộc sống người
bệnh, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này
nhằm: Xây dựng quy trình xác định đa
hình gen CYP2C19.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu.
10 mẫu máu tĩnh mạch của BN sau đặt
stent động mạch vành qua da tại Khoa
Tim mạch, Bệnh viện Quân y 103.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí
nghiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền Y
học, Học viện Quân y.
2. Phương pháp nghiên cứu.
Áp dụng phương pháp giải trình tự
dựa trên nguyên lý Sanger, tiến hành
theo 7 bước:
- Xử lý mẫu.
- Tách chiết ADN tổng số.
- Kiểm tra chất lượng ADN tổng số.
- Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP:
CYP2C19*2, CYP2C19*3.

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR.
- Tinh sạch, giải trình tự.
- Phân tích, đánh giá kết quả.
* Xử lý mẫu:
Cách lấy mẫu: lấy 4 ml máu từ tĩnh
mạch BN vào ống lấy mẫu EDTA sau đặt
46

sten động mạch vành qua da, đảm bảo
không nhiễm khuẩn, ký hiệu mẫu và bảo
quản ở điều kiện -4OC.
* Tách chiết ADN tổng số:
Nguyên lý: sử dụng E.Z.N.A blood
ADN mini kit để tách ADN tổng số.
Nguyên lý của kít này dựa trên sự hấp
thụ chọn lọc của axít nucleic vào màng
silica-gel trong điều kiện nhất định với 4
giai đoạn chính: phá vỡ tế bào để giải
phóng ADN; ADN liên kết với màng silicagel; loại bỏ tạp chất trên màng silica-gel
với Wash Buffer; thu ADN.
* Kiểm tra chất lượng ADN tổng số:
Nguyên lý: phương pháp điện di dựa
trên nguyên tắc hoạt động nhờ vào sức
kéo của điện trường tác động vào phân
tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền.
Sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện
và tạo điện trường đề. Bản gel giúp phân
tách các phân tử và thuốc nhuộm khác
nhau để phát hiện vị trí phân tử trên gel
sau khi điện di. Tốc độ di chuyển của

ADN trong điện trường phụ thuộc vào
kích thước đoạn ADN, điện tích, mức độ
xoắn và dạng phân tử. Như vậy, so sánh
kích thước các mẫu ADN với thang chuẩn
sẽ đánh giá được chất lượng ADN.
* Khuếch đại đoạn gen chứa SNP
quan tâm:
Nguyên lý: sử dụng kỹ thuật PCR để
khuếch đại ADN. Dùng enzym polymerase
để tổng hợp ADN mới từ 1 ADN khuôn
ban đầu. Thành phần chính của phản
ứng gồm: ADN khuôn, mồi, dung dịch
đệm, 4 loại deoxyrinucleotid triphosphate
(dNTP), ADN polymerase. Với 3 giai đoạn
chính: giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn
mồi và giai đoạn kéo dài.


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
* Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR:
Sử dụng phương pháp điện di, nguyên
lý và cách tiến hành tương tự như điện di
kiểm tra chất lượng ADN sau khi tách
chiết. Điện di trên giá thể là agarose pha
trong đệm TAE 1X.
* Tinh sạch và giải trình tự ADN:
Nguyên lý: phương pháp giải trình tự
Sanger dựa vào hoạt động của enzym ADN

polymerase và dideoxynucleotid (ddNTP)

tham gia vào quá trình tổng hợp ADN. Khi
ADN polymerase xúc tác kéo dài mạch
ADN mới gặp nucleotid không có nhóm
3’OH (dideoxynucleotid), phản ứng tổng
hợp dừng lại và tạo ra các đoạn ADN
chênh lệch nhau 1 nucleotid. Điện di đoạn
ADN giúp xác định được trình tự ADN [3].
* Phân tích kết quả: dựa trên phần
mềm BioEdit.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả tách chiết ADN.
Bảng 1:
Mẫu

Nồng độ ADN (ng/µl)

A260/A280

1

19,42

1,7

2

25,62

1,8

3

19,49

1,85

4

19,33

2,72

5

27,9

1,79

6

26,24

1,9

7

19,6

2,03

8

22,51

2,13

9

24,1

2,04

10

30,98

2,1

Nồng độ ADN trung bình 26.874 ng/µl. Tỷ lệ A260/A280 trung bình 1.923 (trong
khoảng 1,8 - 2), nhìn chung dịch chiết ADN sạch và đủ nồng độ cho các nghiên cứu
tiếp theo.
2. Kết quả điện di sản phẩm PCR.
Chúng tôi đã thiết kế được 2 cặp mồi dùng để xác định đa hình gen CYP2C19*2 và
CYP2C19*3, đã tối ưu được thời gian và nhiệt độ phản ứng của 2 cặp mồi.
CYP*2-F: 5’-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3’
CYP*2-R: 5’-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3’
CYP*3-F: 5’- AAATTGTTTCCAACATTTAGCT-3’
CYP*3-R: 5’-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3’
Chu trình nhiệt phản ứng: 96oC - 1 phút, 25 chu kỳ [96oC - 10 giây, 50oC - 5 giây,

60 C - 4 phút], 4oC.
o

47


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
Thành phần phản ứng: master mix (promega): 12,5 µl; primer F: 0,5 µl; primer R:
0,5 µl; nước deion: 6,5 µl; ADN 5 µl.

Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm PCR.
(a) Gen CYP2C19*2

Gen CYP2C19*3

(F-/F+: các đối chứng âm/dương; M: Marker; 01 - 06: thứ tự các mẫu)
Các mẫu có chất lượng tốt cho băng điện di sáng, rõ, có 1 băng duy nhất tương
ứng với băng 140 bp (*2), 240 bp (*3). Đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào,
chứng tỏ kết quả PCR đáng tin cậy.
3. Kết quả giải trình tự gen CYP2C19.
* Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2:

Hình 2: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 3.
Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy
định chuyển hóa bình thường.

Hình 3: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 1.
Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*2 quy định chuyển
hóa trung bình.
48

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017

Hình 4: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*2 của mẫu số 5.
Không xuất hiện tín hiệu G, chỉ có tín hiệu A, gen đồng hợp với kiểu gen *2/*2 quy
định chuyển hóa kém.
* Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3:

Hình 5: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 1.
Không xuất hiện tín hiệu A, chỉ có tín hiệu G, gen đồng hợp với kiểu gen *1/*1 quy
định chuyển hóa bình thường.

Hình 6: Kết quả giải trình tự gen CYP2C19*3 của mẫu số 6.
Đồng thời xuất hiện tín hiệu A và G, gen dị hợp với kiểu gen *1/*3 quy định chuyển
hóa trung bình.
49


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017
4. Kết quả bước đầu phân tích đa
hình gen CYP2C19*2, *3.
Bảng 4: Kết quả phân tích đa hình kiểu
gen CYP2C19*3.
Kiểu hình
Chuyển hóa bình
thường
Chuyển hóa trung
bình

Kiểu gen

Tổng

Tỷ lệ

*1/*1

4

4/10

4

4/10

2

2/10

*1/*2
*1/*3
*2/*2

Chuyển hóa kém

*2/*3
*3/*3

Dựa vào kết quả phân tích đa hình gen

CYP2C19*2,*3, bước đầu rút ra: tỷ lệ BN
mang kiểu gen chuyển hóa bình thường
bằng với BN mang kiểu gen chuyển hóa
trung bình (tỷ lệ BN có kiểu gen chuyển
hóa bình thường *1/*1 là 4/10, tỷ lệ BN có
kiểu gen chuyển hóa trung bình *1/*2
hoặc *1/*3 là 4/10). Trong đó, tỷ lệ giữa
kiểu gen *1/*1 và *1/*2, *1/*3 cũng xấp xỉ
1:1.
KẾT LUẬN
Đã xây dựng thành công quy trình xét
nghiệm gen CYP2C19*2, *3 trên 10 mẫu
máu tĩnh mạch của BN đặt stent mạch
vành qua da.
KIẾN NGHỊ
Do thời gian thực hiện đề tài tương đối
ngắn, đề tài phân tích kiểu gen trên một

50

cỡ mẫu khiêm tốn nên chưa đưa ra được
tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 ở
quần thể BN đặt stent mạch vành. Chúng
tôi kiến nghị tiếp tục mở rộng cỡ mẫu
nghiên cứu để cung cấp được tần số kiểu
gen CYP2C19 mang tính đại diện cho
quần thể BN đặt stent mạch vành.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Collet J.P, Hulot J.S, Pena A et al.
Cytochrome P450 2C19 polymorphism in

young patients treated with clopidogrel after
myocardial infarction: a cohort study. Lancet.
2009, 373 (9660), pp.309-317.
2. Lee S.S, Lee S.J et al. Comparisons of
CYP2C19 genetic polymorphisms between
Korean and Vietnamese populations.
Therapeutic Drug Monitoring. 2007, 29 (4),
pp.455-459.
3. Sanger F, Coulson A.R. A rapid method
for determining sequences in DNA by primed
synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol.
1975, 94 (4), pp.441-448.
4. Yu Chen, Xiaohong Huang et al. Both
PON1 QQ192R and CYP2C19*2 influence
platelet reponse to clopidogrel and ischemic
events in Chinese patients undergoing
percuteaneous coronary intervention. Int J
Clin Exp Med. 2015, 8 (6), pp.9266-9274.
5. Simon T, Verstuyft C, Mary-Krause M et
al. Genetic determinants of response to
clopidogrel and cardiovascular events. N Engl
J Med. 2009, 360 (4), pp.363-375.