Báo cáo thực tập sinh học phân tử

BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ THỰC NGHIỆM
I. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM CHUNG

1


II. NGUYÊN TẮC VÀ CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

NGUYÊN TẮC

Bước 1: PCR thu nhận gen EPN
1. Mỗi nhóm tiến hành đặt phản ứng PCR vào eppendorf
0,2ml (kèm theo mẫu chứng âm) biết nồng độ dung dịch
mẹ và nồng độ cuối cùng của các hóa chất trong phản
ứng như sau:
Hóa chất
Nồng độ cuối
Mạch khn
2 µl
Buffer
5 µl
MgCl2
5 µl
dNTPs
5 µl
Mồi F
2 µl
Mồi R
2 µl
Taq polymerase 0.5 µl

Nước
28.5 µl
Tổng thể tích
50 µl
2. Đậy chặt nắp eppendorf, trộn kỹ bằng cách búng nhẹ
hay huyền phù bằng pipet, spin kéo mẫu xuống và đặt
vào máy PCR. Chu kỳ nhiệt:

- PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một
đoạn DNA hoặc sản xuất và nhân bản nhiều mẫu DNA giống nhau theo cấp lũy
thừa dựa trên mạch khuôn.
- Các thành phần cần thiết:
• DNA mạch khn
• Mồi F (mồi xi) và R (mồi ngược)
• dNTPs
• MgCl2 chứa ion Mg2+ là cofactor của DNA polymerase
• DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase)
• Buffer giúp ổn định môi trường
- Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm 3 giai đoạn: biến tính, bắt cặp
mồi, tổng hợp mạch mới.
- Giai đoạn biến tính
+ Trong giai đoạn này, dung dịch chứa DNA mẫu và tất cả các thành phần khác
được đun nóng đến 95⁰C.
+ Nhiệt độ cao làm liên kết hydro giữa các base trong hai chuỗi DNA khuôn bị
phá vỡ, 2 sợi sẽ tách rời và hoạt động như các khuôn mẫu để tạo ra các chuỗi
DNA mới. Nhiệt độ được duy trì ở giai đoạn này đủ lâu để đảm bảo rằng các
sợi DNA đã tách hoàn toàn.
- Giai đoạn bắt cặp mồi
+ Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 55°C trong 30s để mồi gắn vào sợi DNA
đơn.

+ Nếu nhiệt độ quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu. Nếu q cao, mồi có thể
khơng gắn được.
- Giai đoạn tổng hợp
2


Bước 2: Tách chiết plasmid bằng phương pháp SDS
kiềm
1. Thu nhận toàn bộ sinh khối vào eppendorf bằng ly tâm
dịch nuôi cấy ở 10000v/p trong 5 phút.
2. Cho vào eppendorf chứa sinh khối 100ul dung dịch I,
vortex đến khi sinh khối huyền phù đều.
3. Thêm 200ul dung dịch II, đảo nhẹ eppendorf 6-8 lần.
Sau đó thêm tiếp 150 ul dung dịch III, đảo 6-8 lần.
4. Li tâm 13000v/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng.
5. Thu dịch nổi từ eppendorf trên vào một eppendorf mới
chứa sẵn 7ul RNAse, đảo nhẹ, ủ ở 37oC trong 2 giờ. Ước
tính thể tích của dịch nổi.
6. Cho vào mỗi eppendorf 1V phenol bão hòa trong TE pH
8:chloroform (tỉ lệ 1:1), đảo 6-8 lần, li tâm 10000v/phút,
5 phút, to phòng. Thu dịch nổi vào eppendorf khác. Ước
tính thể tích dịch nổi.
7. Cho vào eppendorf trên 1V chloroform, đảo 6-8 lần, li
tâm 10000v/phút, 5 phút, nhiệt độ phịng. Thu dịch nổi
vào eppendorf khác. Ứớc tính thể tích V của dịch nổi thu
được.

+ Trong bước này, nhiệt độ được tăng lên 72⁰C để các chuỗi DNA mới được tạo
ra nhờ DNA polymerase bằng cách sử dụng các sợi gốc làm mẫu.
+ DNA polymerase tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA khuôn bằng cách

thêm dNTP theo nguyên tắc bổ sung.
- Sau khi kết thúc chu kì cuối cùng vẫn phải duy trì ở nhiệt độ khoảng 72oC trong
10 phút để đảm bảo rằng tất cả DNA sợi đơn cịn lại đều được tổng hợp hồn tồn.
Sau đó chuyển sang 4oC để bảo quản sản phẩm của phản ứng.
- Sol I chứa:
+ 50mM glucose: tạo áp suất thẩm thấu giúp tế bào không bị vỡ
+ 25mM Tris HCl: giúp ổn định pH
+ 10mM EDTA: có vai trị bắt giữ Mg2+ khiến DNAse không hoạt động được
→ Sol I có chức năng huyền phù tế bào, giúp cho sol II tiếp xúc đều với các tế bào
để phá màng tế bào.
- Sol II chứa 0,2N NaOH và 1% SDS có vai trị phá màng tế bào, làm biến tính
DNA và protein.
- Sol III chứa 5M CH3COOH, CH3COONa có vai trị trung hịa Sol II, giúp DNA
hồi tính. Đồng thời sol III làm các DNA có kích thước lớn (DNA genome) bị kết
tủa, còn DNA plasmid vẫn tan trong dịch nổi.
- Thu nhận dịch nổi, lúc này trong dịch là hỗn hợp gồm DNA plasmid, protein,
RNA va2 RNAse. Để thu được DNA plasmid ta tiếp tục tiến hành loải bỏ tạp chất
cịn lại bằng phenol và chloroform:
+ DNA tích điện âm do các nhóm photphat nên tan trong nước mà khơng tan
trong phenol do phenol ít phân cực như nước.
+ Phenol có vai trị biến tính protein và tách protein ra khỏi nước bằng cách
làm protein bộc lộ các vùng kị nước để tan trong phenol.
+ Kết quả là khi li tâm, dung dịch thu được sẽ tách thành 2 lớp: lớp trên là pha
nước chứa DNA plasmid, lớp dưới là pha dung mơi hữu cơ có chứa protein
các sản phẩm cần loại bỏ khác.
3


8. Thêm vào eppendorf trên 2.5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ
tối thiểu 30 phút ở -30oC, li tâm 13000v/phút, 10 phút,

4oC. Đổ bỏ dịch nổi (lưu ý dung giấy thấm miệng
eppendorf).
9. Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh, li tâm
13000v/phút, 10 phút, 4oC. Đổ bỏ dịch nổi (lưu ý thấm
dịch cịn sót lại trong eppendorf), phơi khơ tự nhiên hay
ủ 50oC.
Hịa tủa vào 20µl nước cất vơ trùng. Giữ ở -20oC.
Bước 3: Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di
Nạp mẫu vào gel
1. Trộn 5µl of DNA với 1µl loading dye (6X) (đã được nhỏ
sẵn lên một tấm paraffin), trộn đều bằng pipet (tránh tạo
bọt khí).
2. Nạp 6 µl mẫu vào giếng trên gel.
3. Mỗi gel chạy sản phẩm PCR chứa 1 thang DNA và 1
mẫu chứng dương (do TG chuẩn bị). Mỗi gel chạy sản
phẩm tách chiết plasmid chứa 1 thang DNA, 1 mẫu
chứng dương plasmid chưa cắt và 1 mẫu plasmid cắt mở
vòng (do TG chuẩn bị).
4. Chạy điện di ở 135V trong 30-45 phút.
5. Ghi chú lại vị trí mẫu của nhóm mình trên miếng gel
nào.
Phân tích gel
1. Ngâm gel trong ethidium bromide trong 10 phút, rửa lại
bằng nước.
2. Đặt gel lên bàn đèn soi UV.
3. Quan sát, chụp hình gel

+ Chloroform ít tan trong nước, giúp hỗ trợ phenol biến tính protein đồng thời
trung hịa lượng phenol cịn dư.
- Thu nhận dịch nổi phía trên có chứa plasmid nhưng với nồng độ thấp. Để tăng

nồng độ plasmid ta dùng ethanol ủ lạnh. Ethanol tạo liên kết hydro với nước làm
khả năng liến kết của DNA plasmid với nước giảm tạo kết tủa. Thu tủa hòa với
20µl nước ta nhận được dung dịch có nồng độ plasmid cao hơn ban đầu.

- Điện di DNA trên gel agarose là một kỹ thuật được sử dụng để phân tách các
đoạn DNA dựa trên kích thước và điện tích của chúng trong điện trường.
- Hỗn hợp cần phân tách được đổ vào giếng của gel agarose. Gel này được đặt
trong dung dịch điện di là TAE (Tris - Acetic acid - EDTA), trong đó:
+ Tris - Acetic acid có khả năng tách mạch DNA và giúp cân bằng pH của
môi trường
+ EDTA liên kết với các ion như Mg2+ là cofactor của DNAse giúp bảo vệ
DNA.
- Dưới tác dụng của điện trường, do DNA chứa các nhóm photphat tích điện (-)
nên chúng sẽ di chuyển từ cực (-) sang cực (+) của máy điện di tạo thành các vạch
khác nhau. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào
kích thước, cấu trúc và điện tích của phân tử
DNA đó. So sánh các vạch này với vạch trong
thang DNA giúp nhận biết sự có mặt của DNA
trong mẫu hay khơng.
*Kết quả điện di sản phẩm PCR của nhóm
+ Vị trí 1: Mẫu chứng dương
+ Vị trí 2: Mẫu chứng âm: xuất hiện 1 vạch
tương tự như chứng dương.
4


Bước 4: Cắt hạn chế plasmid
Thực hiện phản ứng cắt như sau:
Hóa chất
Nồng độ mẹ

Buffer
2 µl
EcoRV
1µl
Plasmid
10 µl
dH2O
7 µl
Tổng thể tích phản ứng
20 µl
1. Bổ sung đầy đủ thành phần phản ứng. Trộn đều bằng
búng nhẹ hay huyền phù đều bằng pipet và spin mẫu
xuống.
2. Ủ ở 37oC, trong 2 giờ.
Bước 5: Phân tích sản phẩm cắt plasmid bằng điện di
1. Nạp 5 µl mẫu sản phẩm cắt sau khi trộn với loading dye
vào gel agarose.
2. Chạy điện di ở 135V trong 30-45 phút, nhuộm ethidium
bromide và xem dưới bàn đèn soi UV.
3. Hình chụp bản điện di được gửi qua email cho nhóm
kèm thơng tin vị trí mẫu các nhóm.
Ghi chú lại kết quả

+ Vị trí 3: Mẫu sản phẩm PCR: xuất hiện vạch tương tự như chứng dương nhưng
khá mờ, chứng tỏ nồng độ DNA thu được không cao.
- Mẫu chứng âm cũng xuất hiện vạch DNA có thể là do trong quá trình thao tác để
PCR đã bị nhiễm DNA mạch khuôn.
- Plasmid pBluescript được cắt bởi enzyme cắt giới hạn EcoRV có 1 vị trí cắt trong
vùng MCS.
- Đây là enzyme cắt đầu bằng, nó sẽ cắt plasmid tại vị trí xác định tại ra đầu dính

tương ứng với gen mục tiêu cần nối vào.

- Nguyên tắc tương tự như điện di sản phẩm PCR ở bước 3.
- Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid:
+ Vị trí 1 (Chưa cắt): xuất hiện 2 vạch là
plasmid dạng vịng và dạng xoắn
+ Vị trí 2 (đã cắt): xuất hiện 1 vạch ở giữa 2
vạch của vị trí số 1 là plasmid dạng thằng
- Kết quả cho thấy plasmid đã được cắt hết
thành dạng thẳng, hiệu suất cắt cao nhưng nồng
độ sản phẩm còn thấp nên vạch khá mờ.

5


Bước 6: Tinh chế sản phẩm PCR và sản phẩm cắt
1. Mỗi nhóm nhận lại 01 eppendorf chứa sản phẩm PCR
(bài 1).
2. Hút chuyển sản phẩm PCR sang epp 1.5ml. Sau đó, bổ
sung nước cất hai lần vào epp. trên để đạt được tổng thể
tích 100μl.
3. Bổ sung chloroform với tỉ lệ 1:1V, đảo 6-8 lần.
4. Li tâm 10000rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Chuyển phần dịch nổi sang một epp. 1.5ml mới.
6. Bổ sung 1/10 V dung dịch NaOAC 3M, pH 5.2, đảo đều.
7. Bổ sung 1 ml ethanol tuyệt đối, lạnh, đảo đều và ủ ở 30oC trong ít nhất 30 phút.
8. Li tâm 13,000rpm trong 10 phút ở 40C.
9. Nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa.
10. Bổ sung 500l ethanol 70%, lạnh. Li tâm 13,000 rpm
trong 5 phút ở 4oC.

11. Nhanh chóng, nhẹ nhàng đổ bỏ phần dịch nổi, thu tủa và
làm khô tủa.
12. Hòa tan tủa trong 15l TE. Bảo quản ở -20oC. Nếu dùng
ngay, hoà trong 15l nước Milli-Q và giữ ở nhiệt độ
phòng.
Thực hiện tương tự đối với sản phẩm cắt.
Bước 7: Thực hiện phản ứng nối
1. Chuẩn bị phản ứng nối biết thành phần như sau:
Plasmid cắt mở vòng
12 µl
Gen A
5 µl
T4 DNA ligase buffer (10X) 2 µl
T4 DNA ligase (1U/µl)
1 µl

- Dịch sản phẩm PCR bao gồm enzyme Taq, DNA khuôn, mồi, muối, gen EPN.
- Dịch plasmid cắt bao gồm plasmid cắt, plasmid chưa cắt, plasmid đứt gãy,
EcoRV.
- Để loại bỏ các thành phần khác và giữ lại plasmid cắt, ta tiến hành tinh sạch nhờ
chloroform và NaOAc, các chất này làm giảm tính tan của DNA plasmid, tạo tủa.
- Ethanol có ái lực với nước mạnh hơn DNA cũng làm giảm tính tan của DNA và
tạo tủa.

- Plasmid cắt được ủ với gen cần chuyển và được nối với nhau nhờ enzyme nối T4
ligase, enzyme này xúc tác để hình thành liên kết phosphodiester ở các đầu sợi đơi
hoặc đơn giữa nhóm 3′-OH và 5′-phosphate.
- Nếu q trình nối chính xác, gen mục tiêu sẽ được nối vào vị trí trong vùng MCS
(nằm giữa gen mã hóa enzyme β-galactosidase).

6


Tổng thể tích phản ứng
20 µl
Ủ ở 22°C trong 1 giờ.
Bước 8: Tạo tế bào có tính khả nạp
1. Hút dịch ni cấy vào eppendorf, tiến hành li tâm 6000
vịng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.
2. Lặp lại bước trên thêm 2 lần nữa. Sau đó, thu tủa, cho
CaCl2 vào epp, tiến hành li tâm, thu tủa.
3. Cho CaCl2 vào hòa tan tủa, đảo đều và thêm glycerol
20%, ủ lạnh.
Bước 9: Biến nạp E. coli
1. Chuẩn bị 1 epp ký hiệu “+” cùng tên nhóm, chuyển
100µl tế bào khả nạp vào (huyền phù đều trước khi hút).
Epp chứa phần tế bào khả nạp còn lại ký hiệu “-“ cùng
tên nhóm.
2. Cho tồn bộ sản phẩm nối vào epp “+”, trộn đều.
3. Để trên đá trong 5 phút, sau đó sốc nhiệt ở 45oC trong
60 giây, tiếp tục để lạnh trên đá trong 5 phút.
4. Cho 1ml môi trường LB vào eppendorf, lắc ở 37oC trong
30 phút.
5. Trãi 50µl dung dịch X-gal 20 mg/ml lên 02 đĩa LB
ampicillin.
6. Ly tâm eppendorf biến nạp 6000rpm, 5 phút, hút bỏ 1ml
dịch nổi để loại bớt môi trường.
7. Huyền phù sinh khối trong mơi trường cịn lại rồi trải
tồn bộ lên mỗi đĩa mơi trường LB có ampicillin-X-gal.
Lưu ý ghi chú đĩa “+” và “-“ cùng tên nhóm và ngày

thực hiện lên mặt dưới của đĩa.

- Màng tế bào và plasmid đều tích điện âm (do có nhóm photphat) nên cần sử dụng
Ca2+ để nó liên kết với plasmid và đưa plasmid lại gần màng tế bào giúp tăng khả
năng DNA được đưa vào tế bào.
- CaCl2 giúp thành tế bào vi khuẩn tăng khả năng thấm DNA ngoại lai.
- Glycerol được bổ sung giúp tế bào không bị vỡ trong điều kiện nhiệt độ thấp.

- Khi tế bào bị sốc nhiệt ở nhiệt độ cao, màng tế bào bị lỏng tạo ra các lỗ hổng, lúc
này các DNA plasmid sát màng có thể lọt vào trong tế bào. Sau đó chuyển qua
nhiệt độ thấp, các lỗ hổng khép lại giữ plasmid ở trong.
- Các tế bào biến nạp được chuyển vào môi trường dinh dưỡng trong 30 phút để
gen được chuyển có thời gian phiên mã dịch mã.
- Trong đĩa môi trường trải có bổ sung ampicillin. Plasmid pBluescript có chứa gen
kháng ampicillin và gen mã hóa enzyme β-galactosidase (có chức năng phân giải
Xgal tạo thành khuẩn lạc màu xanh)
→ những tế bào nhận plasmid nhưng khơng có gen mục tiêu hoặc có gen mục tiêu
nhưng cát/nối khơng đúng vị trí sẽ có khuẩn lạc màu xanh.
- Vị trí cắt của EcoRV là ở giữa gen mã hóa β-galactosidase nên những tế bào nhận
được plasmid chuyển gen thành cơng thì khung đọc của gen β-galactosidase bị phá
vỡ dẫn đến không tạo được enzyme này → khuẩn lạc có màu trắng.
- Những tế bào không nhận được plasmid sẽ không kháng được ampicillin nên
khơng mọc được khuẩn lạc.
*Kết quả biến nạp của nhóm:
- Đĩa (-): khơng có khuẩn lạc nào.
- Đĩa (+): chỉ có 2 khuẩn lạc trắng chứng tỏ biến nạp thành công và hiệu suất cao.

7

8. Chồng 2 đĩa (úp ngược) lên nhau và gói lại. Ủ ở 37oC,
18-24 giờ.
Phân tích sản phẩm biến nạp
Đếm số khuẩn lạc trắng và xanh trên mỗi đĩa, phân tích hiệu
suất biến nạp.

8