(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài anopheles maculatus ở việt nam luận án TS sinh học62 42 70 10

Mục lục
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Mở đầu ............................................................................................................................... 1
Ch-ơng 1 : Tổng quan tài liệu ............................................................................. 4

1.1. Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình .......................................... 4
1.2. Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi .............................. 8
1.2.1. Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi ...... 8
1.2.2. Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền .......... 13
1.2.3. Đại c-ơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền
ở muỗi............................................................................................................. 19
1.3. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh và tính -a vật chủ của các vectơ .. 35
1.3.1. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi ..................... 35
1.3.2. Xác định tính -a vật chủ của vectơ ........................................................ 35
1.4. Những nghiên cứu về nhóm loài An. maculatus .............................................. 36
1.4.1. Những nghiên cứu ở n-ớc ngoài ............................................................ 37
1.4.2. Nghiên cứu trong n-ớc .......................................................................... 41
Ch-ơng 2

: Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu .................................... 43

2.1. Đối t-ợng nghiên cứu ........................................................................................ 43
2.2. Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu ..................................................... 43
2.3. Ph-ơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 43
2.3.1. Ph-ơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa ............................... 45

2.3.2. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm....................................................... 45
Ch-ơng 3

: Kết quả nghiên cứu .......................................................................... 60

3. 1. Đa hình dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus ....................................................................................................... 60
3.1.1. Đa hình các dấu hiệu hình thái của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ................................................................................................. 60
3.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus. ............................................................... 80
3.2. Đa hình di truyền tế bào và các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus ............................................................................... 89
3.2.1. Đa hình các dấu hiệu di truyền tế bào của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus........................................................................................... 89
3.2.2. Đa hình di truyền các đặc điểm điện di enzym của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus........................................................................ 92


3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP ở nhóm loài
An. maculatus ............................................................................................... 112
3.2.4. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào chỉ thị RAPD. ........................................... 116
3.2.5. Định loại các thành viên của nhóm loài An. maculatus bằng PCR đa
mồi ............................................................................................................... 126
3.2.6. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào kết quả giải trình tự đoạn ITS2 .................. 128
3.3. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus ..................................................................................................... 135
3.3.1. Bảng định loại các thành viên đà xác định tên trong nhóm loài ............ 135

An. maculatus .......................................................................................................... 135
3.3.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ................. 137
3.4. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ..... 141
Ch-ơng 4: Bàn luận .................................................................................................. 144

4.1. Đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus ...................................................................................... 144
4.1.1.Đa hình các dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ............................................................................................... 144
4.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam ........................................................... 155

4.2. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus ............................................................................................. 161
4.2.1. Xây dựng bảng định loại các thành viên đà đ-ợc định tên trong
nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam ............................................................ 161
4.2.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ................. 162

4.3. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ... 163
Kết luận ........................................................................................................................ 164
Các công trình của tác giả liên quan đến luận án đà công bố ........ 167
NHững đóng góp mới của luận án ..................................................................... 168
tài liệu tham khảo .................................................................................................. 169
Phụ lục .......................................................................................................................... 189


danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
ADN:

Acid Deoxyribonucleic

ALDOX:

aldehyde oxidase

An. :

Anopheles

ATP:

Adenosine triphosphate

bp:

cặp bazơ (Base pair)

COI:

Gen ti thể Cytochrome C oxidase I

cs:

Cộng sự

ctv:

Cộng tác viên

DN:

Khoảng cách di truyền (Genetic distance)

dATP:

deoxyadenosine triphosphate

dCTP:

deoxycytidine triphosphate

dGTP:

deoxyguanosine triphosphate

dNTP:

deoxynucleoside triphosphate

dTTP:

deoxythymidine triphosphate

(E.C):

M· sè enzym (Enzym code) (Enzym commission)

EC:

Cộng đồng Châu Âu (European commission)

EDTA:

Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISAs:

Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzym
(enzym linked immunosorbent assay)

EST:

Esterase

et al:

và những ng-ời khác

EtBr:

Ethidium bromide

FUM:

Fumerate hydratase

GPI:

Glucosephosphate isomerase

GPDH:

glycerophosphate dehydrogenase

HAD:

D-2- Hydroxy- Acid dehydrogenase

HK:

Hexokinase

IGS:

Intergenic space (Vïng ®Ưm néi gen)

ITS:

Internal transcripbed spacer (Vïng ®Ưm néi phiªn m·)

IDH:

Isocitrate dehydrogenase


IN :

Hệ số t-ơng đồng di truyền (Genetic Identity)

KST:

Ký sinh trùng

LAP:

Leucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Mabs:

Kháng thể đơn dòng ( Monoclone antibody)

MDH:

Malate dehydrogenase

ME:

Malic enzym

MPI:

Manosephosphate isomerase

NAD:

1-Naphthaleneacetamide

NST:

Nhiễm sắc thể

ODH:

Octanol dehydrogenase

P.:

Plasmodium

PCR:

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction)

PGM:

Phosphoglutamutase

QT:

Quần thể

RAPD:

Đa hình các đoạn nhân bản ngẫu nhiên
(Random Amplified Polymorphic DNA )

RFLP:

Đa hình các đoạn phân cắt giới hạn
(Restriction Fragment Length Polymorphism)

PGM:

Phosphoglucomutase

Rf:

Tốc độ chuyển dịch t-ơng đối của cấu tử điện di

ARN:

Acid ribonucleic Ribosome

SSCP:

Đa hình cấu tạo sợi đơn

r

( Single Strand Conformational polymorphism)
SDS:

Sodium dodecyl sulfate

TBE:

Tris-Borate-EDTA

TE:

Tris-EDTA

Viện SR-KST-CT TƯ: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -ơng
XDH:

xanthine dehydrogenase

WHO:

Tổ chøc y tÕ thÕ giíi
(World Health organization)


danh mục các bảng
Bảng 2.1: Các enzym giới hạn và trình tự giới hạn t-ơng ứng ...................................... 53
Bảng 2.2: Thành phần các chất tham gia phản ứng PCR .............................................. 53
Bảng 2.3: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng giới hạn của các enzym
Cfr131, Alul, XbaI, BamHI ................................................................................. 54
Bảng 2.4: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng giới hạn của các enzym
Msp1. EcoRI, HindII, HaeII, HeaIII, HindIII ..................................................... 54
Bảng 2.5: Trình tự các mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng RAPD- PCR ................ 55
Bảng 2.6: Thành phần các chất tham gia vào phản ứng RAPD- PCR ........................... 55
Bảng 2.7: Trình tự sắp xếp mẫu trong thử nghiệm ELISA ........................................... 57
Bảng 2.8: Trình tự mồi để xác định thoa trùng trong muỗi .......................................... 58
Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật thu đ-ợc từ các dòng gia đình để cung cấp dấu hiệu
phân loại các thành viên trong nhóm An. maculatus ........................................... 60

Bảng 3.2: Số l-ợng mẫu vật đà thu thập trong giai đoạn 2001-2005 ............................ 61
Bảng 3.3: Số l-ợng bọ gậy của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus thu
thập đ-ợc ở các kiểu ổ n-ớc khác nhau ............................................................... 81
Bảng 3.4: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An. maculatus thu thập
tại Quảng Bình giai đoạn 2001-2005 .................................................................. 86
Bảng 3.5: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An. maculatus thu thập
tại Sơn La giai đoạn 2001-2005 .......................................................................... 87
Bảng 3.6: Số l-ợng và tỷ lệ các loài muỗi thuộc nhóm loài An. maculatus thu thập
tại Hoà Bình giai đoạn 2001-2005 ...................................................................... 88
Bảng 3.7: Tần số các alen mà hóa enzym ODH của các thành viên nhóm An.
maculatus ........................................................................................................... 93
Bảng 3.8: Tần số các alen mà hóa enzym LDH của các thành viên nhóm An.
maculatus ........................................................................................................... 94
Bảng 3.9: Tần số các alen mà hóa enzym MDH của các thành viên nhóm An.
maculatus ........................................................................................................... 96
Bảng 3.10: Tần số các alen mà hóa enzym GOT của các thành viên nhóm An.
maculatus ........................................................................................................... 97
Bảng 3.11: Tần số các alen mà hóa enzym 6PGD của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 100
Bảng 3.12: Tần số các alen mà hóa enzym IDH của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 101
Bảng 3.13: Tần số các alen mà hóa enzym PGM của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 103
Bảng 3.14: Tần số các alen mà hóa enzym MPI của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 103
Bảng 3.15: Tần số các alen mà hóa enzym -GPD của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 105
Bảng 3.16: Tần số các alen mà hóa enzym MPI của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 106

Bảng 3.17: Tần số các alen mà hóa enzym HAD của các thành viên nhóm An.
maculatus ......................................................................................................... 107
Bảng 3.18: Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các
thành viên đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân
tích izozym....................................................................................................... 108
Bảng 3.19: Hệ số t-ơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các thành
viên trong toàn bộ nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích
izozym ............................................................................................................. 110
Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các
thành viên đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu
RAPD-PCR ...................................................................................................... 122
Bảng 3.21: Hệ số t-ơng đồng di truyền và khoảng cách di truyền giữa các thành
viên trong toàn bộ nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích
RAPD-PCR ...................................................................................................... 124
Bảng 3.22: So sánh các dấu hiệu đa hình di truyền kiểu hình và kiểu gen của các
thành viên nhóm loài An. maculatus ................................................................. 134
Bảng 3.23: Phân bố của các loài thành viên trong nhóm loài An. maculatus .............. 138
Bảng 3.24: Kết quả thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi
nhóm loài An. maculatus tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà .................. 141
Bảng 3.25: Kết quả thử nghiệm ELISA đánh giá vai trò truyền bệnh của muỗi
nhóm loài An. maculatus tại Đắc Ơ, Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc .......................... 141


Danh mục các hình vẽ, Đồ thị

Hình 1.1 Tháp Babel phát hiện các loài đồng hình .................................................6
Hình 1.2: Trình tự hình thái học ............................................................................7
Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình mới .........................7
Hình 2.1: Thiết kế nghiên cứu đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh nhóm

loài An. maculatus ở Việt Nam ....................................................................44
Hình 2.2: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 2
alen đồng trội...............................................................................................49
Hình 2.3: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 3
alen đồng trội...............................................................................................50
Hình 2.4: Hình thái điện di enzym có cấu trúc dimer đ-ợc quy định bởi 2 alen
đồng trội ......................................................................................................50
Hình 2.5: Hình thái điện di enzym có cấu trúc tetramer đ-ợc quy định bởi 2
alen đồng trội...............................................................................................50
Hình 2.6: Hình thái điện di enzym có cấu trúc monomer đ-ợc quy định bởi 2
alen một trội một lặn....................................................................................51
Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành của các thành viên thuộc nhóm
loài An. maculatus .......................................................................................64
Hình 3.2: Đa hình cơ quan sinh dục đực của các thành viên thuộc nhóm loài
An. maculatus ..............................................................................................66
Hình 3.3: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. maculatus.............67
Hình 3.4: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. maculatus dạng
3 ..................................................................................................................67
Hình 3.5: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. maculatus dạng
4 ..................................................................................................................68
Hình 3.6: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. maculatus dạng
5 ..................................................................................................................68
Hình 3.7: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. dravidicus ............69
Hình 3.8: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. notanandai ...........69
Hình 3.9: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An.pseudowillmori .....70
Hình 3.10: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An.
sawadwongporni dạng 1 ..............................................................................70
Hình 3.11: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An.
sawadwongporni dạng 2 ..............................................................................71
Hình 3.12: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An.

sawadwongporni dạng 3 ..............................................................................71
Hình 3.13: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái quăng của An. willmori .............72
Hình 3.14: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. maculatus ..........73
Hình 3.15: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. maculatus
dạng 3 ..........................................................................................................73


Hình 3.16: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. maculatus
dạng 4 ..........................................................................................................74
Hình 3.17: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. maculatus
dạng 5 ..........................................................................................................74
Hình 3.18: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. dravidicus .........75
Hình 3.19: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. notanandai ........75
Hình 3.20: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An.
pseudowillmori ............................................................................................76
Hình 3.21: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An.
sawadwongporni dạng 1 ..............................................................................76
Hình 3.22: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An.
sawadwongporni dạng 2 ..............................................................................77
Hình 3.23: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An.
sawadwongporni dạng 3 ..............................................................................77
Hình 3.24: Hình ảnh một số đặc điểm hình thái bọ gậy của An. willmori ............78
Hình 3.25: Đa dạng hình thái trứng của một số thành viên nhóm loài An.
maculatus ....................................................................................................79
Hình 3.26: ổ bọ gậy của An. notanandai và An. sawadwongporni ở suối lớn .....82
Hình 3.27: Vũng n-ớc đáy suối cạn có sỏi là ổ bọ gậy thích hợp của các loài
trong nhóm An. maculatus ...........................................................................83
Hình 3.28: ỉ bä gËy cđa An. dravidicus ë si cã đáy đá lớn ..............................83
Hình 3.29: ổ bọ gậy thích hợp của An. dirus, An. minimus đồng thời cũng bắt
đ-ợc An. pseudowillmori .............................................................................84

Hình 3.30: Hình ảnh bộ nhiễm sắc thể kiểu nhân của các thành các thành viên
nhóm loài An. maculatus .............................................................................91
Hình 3.31: Hình ảnh điện di enzym ODH của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ..............................................................................................93
Hình 3.32: Hình ảnh điện di enzym LDH của các thành viên trong phức hợp
An. maculatus ..............................................................................................95
Hình 3.33: Hình ảnh điện di enzym MDH của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ..............................................................................................97
Hình 3.34: Hình ảnh điện di enzym 6PGD của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ..............................................................................................99
Hình 3.35: : Hình ảnh điện di enzym IDH của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ............................................................................................ 101
Hình 3.36: Hình ảnh điện di enzym GPI của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ............................................................................................ 104
Hình 3.37. Hình ảnh điện di enzym HAD của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus ............................................................................................ 106


Hình 3.38: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích
izozym ....................................................................................................... 108
Hình 3.39: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong toàn bộ nhóm loài An. maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym . 111
Hình 3.40: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus bằng enzym HeaIII ............................................................ 112
Hình 3.41: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus bằng enzym HindII .................................................................. 113
Hình 3.42: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus bằng enzym HeaII .............................................................. 114
Hình 3.43: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài

An. maculatus bằng enzym MspI ............................................................... 115
Hình 3.44: Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus bằng enzym XbaI ...................................................................... 115
Hình 3.45: Sản phÈm cđa ph¶n øng RAPD- PCR sư dơng måi A1 ..................... 117
Hình 3.46: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi A5 ..................... 118
Hình 3.47: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F2...................... 119
Hình 3.48: S¶n phÈm cđa ph¶n øng RAPD- PCR sư dơng måi OPL1................. 120
Hình 3.49: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F4...................... 121
Hình 3.50: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR .... 123
Hình 3.51: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR ...................... 125
Hình 3.52: Kết quả định loại các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
bằng ph-ơng pháp PCR đa mồi theo C.Walton .......................................... 127
Hình 3.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 của An. maculatus dạng 5 ...... 128
Hình 3.54: So sánh kết quả giải trình tự với các mẫu đà đ-ợc l-u giữ ở
Genebank .................................................................................................. 129
Hình 3.55: Sự khác biệt kết quả giải trình tự của An. sawadwongporni thu tại
Vân Nam Trung Quốc với các mẫu An. sawadwongporni l-u giữ ở
Genebank .................................................................................................. 130
Hình 3.56: Kết quả t-ơng đồng về trình tự của An. sawadwongporni thu tại
Vân Nam Trung Quốc với các mẫu An. maculatus l-u giữ ở Genebank .... 130
Hình 3. 57: So sánh kết quả giải trình tự của các thành viên đà định tên trong
nhóm loài An. maculatus ........................................................................... 131
Hình 3.58: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu giải trình tự
đoạn ITS2 .................................................................................................. 131


Hình 3.59: So sánh kết quả giải trình tự của các thành viên đà định tên trong

nhóm loài An. maculatus với các trình tự của nhóm loài đ-ợc l-u trên
Genebank .................................................................................................. 132
Hình 3.60: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
đà định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào số liệu giải trình tự
đoạn ITS2 và các số liệu đ-ợc l-u giữ trên Genebank ................................ 133
Hình 3.61: Phân bố của các loài trong nhóm loài An. maculatus........................ 140
Hình 3.62: Kết quả thử nghiệm ELISA xác định thoa trùng P.vivax trong muỗi
An. maculatus tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà ............................ 142
Hình 3.63: Kết quả kiểm tra các mẫu muỗi nhiễm P.falciparum tại Đắc Ơ,
Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc bằng kỹ thuật PCR lồng ..................................... 142


1

Mở đầu

Những nghiên cứu về các côn trùng truyền bệnh, trong đó có muỗi Anopheles,
trung gian truyền bệnh sốt rét ngày càng đ-ợc đẩy mạnh trên mọi ph-ơng diện: phân
loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính và biện pháp phòng chống.
Ngày nay những nghiên cứu về hệ thống học và chủng loại phát sinh đà thâm nhập
sâu vào hầu hết các lĩnh vực của sinh vật học, phân biệt các loài và quá trình phát
triển của sinh giíi. Cïng víi thêi gian, sù ph¸t triĨn c¸c ph-ơng pháp mới, những
kết quả về phân loại và xác định sự phát sinh chủng loại ngày càng phong phú. Từ
những năm 60 của thế kỷ XX trở lại đây, nhiều cuộc cách mạng về khoa học và kỹ
thuật đà xảy ra đặc biệt là những cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Các
ph-ơng pháp mới xác định cấu trúc phân tử của protein, axít nucleic đà sớm đ-ợc
các nhà sinh vật học áp dụng. Nhiều ph-ơng pháp kỹ thuật nghiên cứu mới nhằm
phân loại và xác định nguồn gốc phát sinh của sinh vật đ-ợc ứng dụng rất mạnh. Nổi
bật trong các ph-ơng pháp này là sự phát triển của một kỹ thuật mới đ-ợc phát hiện
vào giữa thập kỷ 80 của thế kỷ tr-ớc gọi là phản ứng chuỗi polymerase (polymerase

chain reaction-PCR). Ph-ơng pháp nhân gen kết hợp với việc thiết kế các loại mồi
khác nhau đà phát hiện một số l-ợng lớn các số liệu về biến đổi trình tự ADN trong
và giữa các loài. Nhân gen cũng đồng thời tạo b-ớc khởi đầu để tiếp cËn víi viƯc
ph©n tÝch dÊu v©n tay ADN (DNA fingerprinting), cũng nh- phân tích các tiểu vệ
tinh (Microsaterllite) (Weber, May, 1989) [210] và đa hình các đoạn ADN nhân bản
ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphism DNA-RAPD) [216]. Cùng với sự
phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử mới chúng ta không nên bỏ qua những
kỹ thuật phân tích sinh học cơ sở th-ờng dùng. Các kỹ thuật điện di hệ enzym
(allozyme) và di truyền tế bào đều là những công cụ rất tốt bổ sung cho việc phân
loại [31, 120, 213] và chúng vẫn là những ph-ơng pháp rất có giá trị trong thực tiễn
nghiên cứu sinh học. Những ph-ơng pháp mới để phân tích ADN nh- PCR, lai
ADN, phân tích đa hình các đoạn giới hạn (Restriction Fragment Length
Polymorphism - RFLP), Microsaterllite, RAPD, ADN fingerprinting...,đà đ-ợc sử
dụng mỗi ph-ơng pháp có điểm mạnh và điểm hạn chế riêng. Nhiều loài muỗi lúc
đầu đ-ợc xác định nh- một loài đơn, nh-ng trong quá trình nghiên cứu sâu về vai trß


2

dịch tễ, đặc tính sinh học và bằng việc sử dơng c¸c kü tht míi, ¸p dơng c¸c dÊu
hiƯu nhËn biết về di truyền, sinh hoá... đà xác định chúng là những phức hợp loài
đồng hình (sibling species complex, cryptic species complex). Một trong những ví
dụ kinh điển là nhóm loài An. macullipenis ở châu Âu đà đ-ợc Mayer [25, 26] dẫn
ra trong sách giáo khoa về phân loại của mình. Càng về sau, ng-ời ta càng phát hiện
ra có nhiều loài đồng hình, đặc biệt ở những loài có vai trò truyền bệnh. Có thể kể ra
hàng loạt các ví dụ khác nh- phức hợp Anopheles gambiae ở Châu Phi, Anopheles
quandrimaculatus ở Châu Mỹ [46, 68], nhóm loài An. hyrcanus, An. leucosphyrus ở
Châu á [35, 36, 55, 70]...
Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát hiện ở Hồng Kông
Trung Quốc vào năm 1901. Sau đó một loạt các loài khác t-ơng tự đ-ợc phát hiện ở

ấn Độ, Đài Loan và đ-ợc coi là các tên đồng vật (synonym) của Anopheles
maculatus [156]
Đây là loài muỗi phân bố rộng rÃi ở vùng Đông ph-ơng [2, 6-10]. Từ năm 1901
đến năm 1925, nhóm loài Anopheles maculatus đà có 8 loài đ-ợc đặt tên [161].
Năm 1986 Rattanarithikul và Green đà phát hiện thêm 2 loài mới ở Thái Lan [156].
Năm 1990 hai loài mới nữa ở Philippin đ-ợc Rattanarithikul và Harbach đặt tên là
An. greeni và An. dispar [157].
Nh- vậy cho đến nay, phức hợp An. maculatus gồm ít nhất 12 loài thành viªn:
An. maculatus Theobald, 1901; An. willmori (James, 1903); An. indicus (Theobald,
1907); An. dudgeonii (Theobald, 1907); An. pseudowillmori (Theobald, 1910); An.
maculosa (James and Liston, 1911); An. dravidicus Christophers, 1924; An.
hanabusai Yamada, 1925; An. sawadwongporni Rattanarithikul and Green , 1986;
An. notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An. greeni Rattanarithikul and
Harbach, 1990 vµ An. dispar Rattanarithikul and Harbach, 1990.
Nhiều thành viên trong nhóm này đà đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh ở
Malaysia [122], Th¸i Lan [89-91], Nepal [151], Trung Qc, Singapore.[122]..
ë ViƯt Nam, tr-ớc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định là một loài
đơn, phân bố rộng rÃi ở vùng rừng núi toàn quốc [2, 6-10]. Những nghiên cứu gần
đây về hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài này gồm ít nhất 6 loài đà đ-ợc định


3

tên và một số dạng ch-a xác định rõ vị trí phân loại [6-10, 22]. Năm 1936,
Toumanoff, đà tiến hành mỉ An. maculatus thÊy chóng cã nhiƠm ký sinh trïng sốt
rét [196]. Đến nay loài An. maculatus vẫn đ-ợc coi là vectơ truyền bệnh thứ yếu ở
n-ớc ta [10, 16, 17, 20-22, 21, 24]. Nh- vËy viƯc nghiªn cøu vỊ muỗi Anopheles
maculatus trên Thế giới và Việt Nam còn khác nhau. Nhiều vấn đề liên quan đến
phân loại, vai trò truyền bệnh...của loài muỗi này ở Việt Nam cần đ-ợc giải quyết.
Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài :Nghiên cứu tính đa hình di

truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles
maculatus ở Việt Nam nhằm mục đích :
1. Xác định thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus ở Việt Nam.
2. Xác định tính đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong nhóm loài.
3. Xác định vai trò truyền bệnh của chúng nhằm góp phần vào việc phòng
chống vectơ sốt rét ở n-ớc ta.


4

Ch-ơng 1 : Tổng quan tài liệu
1.1. Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình

Trong nghiên cứu về côn trùng y học, các loài có vai trò truyền bệnh th-ờng
thể hiện tính đa hình một cách sâu sắc. Việc tồn tại các loài đồng hình và sự gối
nhau về giới hạn biến dị của các loài trong một nhóm loài hay một phức hợp loài là
khá phổ biến.
Việc phân biệt các loài đồng hình, các loài có quan hệ họ hàng gần gũi đôi khi
xuất hiện những biến dị rất khác nhau và giới hạn biến dị của chúng có thể gối lên
nhau nhiều đến mức hình nh- không còn một dấu hiệu nào chuẩn tuyệt đối để phân
biệt.
Việc phát hiện và phân loại các loài đồng hình bằng phân tích hình thái là rất
khó chính xác. Do vậy, ng-ời ta phải kết hợp phân tích hình thái với nhiều ph-ơng
pháp phân tích tính đa hình khác nhau.
Bệnh sốt rét thực sự là một bệnh nghiêm trọng trên toàn cầu, và là một trong
những bệnh do muỗi truyền có phạm vi phân bố rộng rÃi nhất. Muỗi Anopheles đÃ
đ-ợc xác định là vectơ truyền bệnh sốt rét ở ng-ời. Chỉ có một phần nhỏ các loài
muỗi trong giống muỗi này đ-ợc coi là vectơ chính truyền bệnh sốt rét, tuy nhiên

các loài và dạng muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét trên toàn thể giới rất đa đạng và
phong phú) [60, 203]. Những nghiên cứu đầu tiên trên Anopheles maculipennis sau
đó là trên các loài khác bao gồm cả việc nghiên cứu về khả năng giao phối nhân tạo
trong phòng thí nghiệm, các nhà nghiên cứu đà phát hiện ra rằng rất nhiều loài muỗi
Anopheles, là vectơ truyền bệnh sốt rét tồn tại nh- thành viên của các phức hợp loài
trong đó có những loài truyền bệnh và những loài không có vai trò truyền bệnh.
Điều khó khăn chính là, những thành viên của các phức hợp loài này th-ờng có hình
thái rất giống nhau, do đó rất khó cho việc định loại hình thái nhằm chỉ ra vai trò
truyền bệnh của chúng đồng thời gây khó khăn cho việc nỗ lực phòng chống [134,
195, 203]. Việc không chú ý tới sự tồn tại của các phức hợp loài làm cho phân định
các vectơ phức tạp, một loài Anopheles đơn th-ờng tồn tại sự lai không đồng nhất ở
một vùng địa lý rộng lớn [30]. Sự tăng c-ờng tính mềm dẻo về kiểu gen và kiểu hình
này càng gây khó khăn cho việc phân loại các quần thể vectơ và các tác động tới
hiệu quả của các cuộc điều tra cũng nh- các chiến l-ợc phòng chống vectơ [82].
Trong giai đoạn tr-ớc đây, sự thành công trong việc chống lại bệnh sốt rét có sự
đóng góp của việc phòng chống muỗi. Nh-ng trong thời điểm hiện tại chiến l-ợc
này bị thất bại do một loạt các lý do bao gåm sù ph¸t triĨn cđa tÝnh kh¸ng ho¸ chÊt,


5

sự hạn chế về điều kiện kinh tế, và khoảng trống về những hiểu biết về sinh học cơ
bản của các vectơ đồng hình này (Norris, 2002) [141].
Một số nhà khoa học chuyển h-ớng từ nghiên cứu khả năng giao phối sang
nghiên cứu về nhiễm sắc thể khổng lồ, những kết quả đầu tiên đà cung cấp cho nhà
nghiên cứu những bằng chứng di truyền chính xác có thể sử dụng để phân biệt và
nhận biết các loài (trong phức hợp loài đồng hình) và các dạng của nhiễm sắc thể
[58, 194]. Việc phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase đà tạo ra một
ph-ơng tiện mới cho nghiên cứu di truyền phân tử hệ gen và các kỹ thuật mới về sau
tạo điều kiện thuận lợi cho những nghiên cứu về di truyền của từng cá thể cũng nhở mức độ quần thể [45]. Sự đa dạng và phong phú của các chỉ thị phân tử có thể sử

dụng trong nghiên cứu vectơ sốt rét đà đ-ợc công bố liên tục trong vòng 10 năm trở
lại đây. Các chỉ thị phân tử và tế bào từ các công cụ truyền thống như nghiên cứu
tế bào học, nhiễm sắc thĨ khỉng lå, bé NST, c¸c kü tht vỊ miƠn dịch học, lai tạo
và phân tích isozyme [79] tới một loạt các chỉ thị phân tử. Các chỉ thị hiện nay bao
gồm từ cái gọi là các chỉ thị di truyền kinh điển (ADN ty thể và cADN) tới các
ph-ơng pháp sử dụng để phát hiện và phân biệt sự đa hình của từng nucleotide
(SNPs) và cuối cùng là đến những chỉ thị phân tử có tính đa hình cao (RAPD, SSR
và AFLP). Một trong những -u điểm lớn nhất của việc sử dụng một số l-ợng lớn các
chỉ thị di truyền khác nhau là ng-ời nghiên cứu có thể lựa chọn sử dụng, kết hợp các
chỉ thị hay các kỹ thuật để trả lời nhiều câu hỏi có liên quan đến sự lan truyền sốt rét
[189]. Những chỉ thị phân tử này cũng cung cấp công cụ hữu hiệu cho nhiều nghiên
cứu ứng dụng khác bao gồm: phân loại phân tử, hệ thống tiến hoá, di truyền quần
thể, bản đồ di truyền, và một loạt các chẩn đoán phân tử.
Mặc dù một vài năm vừa qua đà phát triển nhiỊu kü tht míi vỊ di trun
häc qn thĨ nh-ng không một kỹ thuật đơn lẻ nào trả lời tốt nhất cho các câu hỏi
đặt ra khi phân loại các loài đồng hình. Sự kết hợp phân tích đa hình độ dài các đoạn
phân cắt, điện di izozym và phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ là một ph-ơng cách tốt
để xác định các loài đồng hình, còn phân tích trật tự ADN là cách tốt nhất cho việc
nghiên cứu phát sinh chủng loại và bộ mẫu dò ADN (DNA probes) là cách tốt nhất
cho việc định loại th-ờng quy các cá thể côn trùng trong các phức hợp loài đà đ-ợc
nhận biết. Cách sử dụng nhiều ph-ơng cách, gồm cả hình thái học và các chỉ thị
phân tử là cần thiết cho việc nghiên cứu các quần thể muỗi.
Hình thái học là nền tảng của phân loại học theo Aristotle cách đây hàng 2000
năm. Nếu hai sinh vật trông giống nhau thì chúng cùng một loài. Nếu trông chúng
khác nhau thì chúng khác loài. Những sự tranh cÃi phân loại học tóm lại là thảo luận
về ngữ nghĩa thế nào là giống nhau được diễn tả theo ngôn ngữ của hình thái học.
Eanst Mayr đà đ-a ra khái niệm loài sinh học, xác định loài là một nhóm sinh vËt


6

mang vốn gen chung. Nh- vậy, ông đà mở rộng nền tảng ổn định của phân loại học.
Sau này, Cockburn đà xây dựng tháp Babel một mô hình mà loài đồng hình đ-ợc đề
xuất dựa trên các kỹ thuật chuyên biệt (hình 1.1). Các quần thể đà đ-ợc xác định là
các loài hình thái đơn có thể thể hiện tập tính phức tạp khác nhau ở những vùng
khác nhau. Ví dụ điển hình nhất là phức hợp loài An. gambiae, trong khi loµi An.
gambiae lµ loµi trun bƯnh chđ u nhất châu Phi thì loài đ-ợc xác định bằng dấu
hiệu hình thái là An. quandrimaculatus thậm chí lại không đốt máu ng-ời.
Sẽ là thuận lợi cho nghiên cứu nếu chúng ta biết sử dụng tổ hợp các kỹ thuật
khác nhau nhằm kết hợp những -u điểm của từng ph-ơng pháp, kỹ thuật trong một
ch-ơng trình nghiên cứu.
Có một điều mâu thuẫn khi tiến hành phân loại các loài đồng hình là các
ph-ơng pháp tiến hành nhanh chóng tiết kiệm thời gian thì những thông tin cung cấp
cho việc phân loại ít, trong khi đó những kết quả của ph-ơng pháp tốn nhiều thời
gian và kinh phí thì lại cung cấp nhiều thông tin có giá trị cho vịêc định loại.

Hình 1.1 Tháp Babel phát hiện các loài đồng hình
(Nguồn Cockburn, 1994 [59])
Mét sè kü tht cã thĨ héi ®đ mäi điều cần thiết để cân bằng giữa tốc độ và
thông tin hàm chứa. Chúng gồm tế bào học nhiễm sắc thể khổng lồ, điện di izozym
và đa hình độ dài các đoạn phân cắt (RFLPs). Cả hai kỹ thuật tế bào học nhiễm sắc
thể khổng lồ và điện di izozym đà đ-ợc sử dụng trong vài thập kỷ qua và đà đóng
góp nhiều kết quả trong việc phát hiện các loài đồng hình. Chỉ thị RFLP bao gồm
ADN ty thể hoặc ADN ribosome đà đ-ợc ứng dụng trong khoảng 10 năm và cũng
có thể so sánh với hai ph-ơng pháp trªn.


7

Hình 1.2: Trình tự hình thái học

(Nguồn Cockburn, 1994 [59])
Giải trình tự ADN (hoặc ARN hoặc protein) là kỹ thuật di truyền tốt nhất thích
hợp với việc phân tích phát sinh chủng loại bởi vì có đủ số l-ợng đặc điểm không
hạn chế (một hệ gen của muỗi có ít nhất 100 triệu đôi bazơ nitơ). Những đặc điểm
giống nhau có thể dễ dàng thu nhận từ mỗi loài bằng cách giải trình tự của các gen
cùng loại. Chủ yếu khi sử dụng các kỹ thuật phân tử để nghiên cứu phát sinh chủng
loại, mỗi một nhà sinh học tiến hoá th-ờng dùng giải trình tự ADN. Sức hấp dẫn cđa
viƯc sư dơng c¸c kü tht di trun kh¸c nhau đối với phát sinh chủng loại cũng rất
mạnh mẽ. Thí dơ, ngay sau khi dÊu hiƯu RFLP cđa mét loµi đồng hình mới đ-ợc tìm
thấy, các kiểu băng này đ-ợc đem so sánh với các loài họ hàng gần gũi và từ đó một
cây chủng loại phát sinh đ-ợc hình thành. Cách làm này đ-ợc sự giúp đỡ của các
ch-ơng trình phần mềm chuyên dụng có thể chuyển các số liệu phân tích di truyền
thành cây chủng loại phát sinh.

Định loại
ADN ty thể
Nhiễm sắc thể
khổng lồ
Izozym

Khẳng định
Hình thái học
Giao phối chéo

Mô tả

Nghiên cứu
Mẫu dò ADN

Sinh thái học

Khả năng truyền bệnh

Hình 1.3: Sơ đồ ph-ơng pháp mô tả đặc điểm loài đồng hình mới
(Nguồn Rutledge và cs, 1996 [170])
Các mẫu dò ADN (DNA probes) là ph-ơng pháp tốt đ-ợc chọn cho việc định
loại th-ờng quy. Nhiều nhóm tác giả đà tách các mẫu dò ADN đặc tr-ng cho từng


8

loài muỗi nhất định nh- An. gambiae [100], An. dirus [143], An. quandrimaculatus
loµi A,B,C [57], An. rangeli vµ An. aquasilis [146].
Nh- vậy rõ ràng để tiến hành phân loại các loài, đặc biệt là các phức hợp loài
đồng hình thì chúng ta phải áp dụng nhiều ph-ơng pháp khác nhau từ đơn giản đến
phức tạp (hình 1.3). Mỗi một ph-ơng pháp phù hợp cho một hoàn cảnh điều kiện cụ
thể.
1.2. Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi

Đa hình di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị trong một loài, một
quần xà hoặc giữa các loài, các quần xÃ. Đây là sự đa dạng về thành phần kiểu gen
của các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau. Tính đa dạng về gen
có thể di truyền đ-ợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể.
Tính đa hình di truyền thực chất là hiện t-ợng biến dị một cách không liên tục
của một kiểu gen. Xét cho cùng, đa hình di truyền là biểu hiện của sự biến đổi của
vật chất di truyền, biến đổi về các cặp bazơnitơ và sự tổ hợp trình tự của các cặp
bazơnitơ.
Tính đa hình di truyền có thể đ-ợc xác định tại mọi mức độ tổ chức bao gồm
từ số l-ợng, cấu trúc của ADN trong mỗi tế bào cũng nh- số l-ợng, cấu trúc của
nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái của mỗi loài trong các điều kiện tự nhiên khác
nhau...

1.2.1. Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở
muỗi
Đa hình enzym cũng chính là một trong các hình thức biểu hiện của đa hình di
truyền. Thuật ngữ izozym xuất hiện để biểu thị các enzym có cùng chức năng
nh-ng do các locut khác nhau quy định. Các biến dạng t-ơng ứng của izozym là
allozym. Allozym là các sản phẩm của những alen khác nhau của cùng một locut.
Hiện t-ợng đa hình izozym trong tự nhiên là kết quả của đột biến gen cấu trúc của
các locut kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm trên. Đột biến có thể xảy ra ở nhiều
mức độ khác nhau. Một số axit amin có thể bị thay thế khi xảy ra đột biến ở một vài
bazơ nitơ trong c¸c bé ba m· hãa cđa gen cÊu tróc. Thậm chí trong các gen cấu trúc
có thể xảy ra hiện t-ợng lặp đoạn, mất đoạn, chuyển đoạn của các nucleotit… [206].


9

Vì vậy, khi sử dụng ph-ơng pháp điện di trên gel tinh bét thủ ph©n, gel agarose hay
gel polyacrilamide cïng với nhuộm hoá tổ chức ta có thể thấy đ-ợc các biến dạng
khác nhau của phân tử enzym [48].
Việc sử dụng dẫn liệu đa hình di truyền của enzym đà mang lại những thuận
lợi cho các phân tích di truyền học: do bản chất di truyền của các enzym là đơn giản
và có thể tiếp cận một cách trực quan do đại đa số các izozym có đặc điểm theo kiểu
đồng trội. Hơn nữa trong nghiên cứu di truyền học quần thể thì số liệu về độ dị hợp
của quần thể nghiên cứu là cực kỳ quan trọng. Số liệu này cho phép đánh giá đ-ợc
động thái di truyền của quần thể tại thời điểm nghiên cứu. Số liệu về độ dị hợp của
quần thể đ-ợc sử dụng để đánh giá khả năng thích nghi của một quần thể. Số liệu
này còn cho phép so sánh động thái di truyền của các quần thể với nhau...
Izozym là một kỹ thuật truyền thống có tính ứng dụng cao. Các hạn chế của
việc phân tích izozym là mẫu vật phải đ-ợc giữ t-ơi sống, hoặc giữ trong lạnh cho
tới khi phân tích và quá trình sử lý mẫu vật yêu cầu một số l-ợng mẫu vật rất lớn

thay cho một vài nanogram mÉu nh- viƯc ph©n tÝch ADN trong kü tht PCR. Tuy
nhiên, izozym cung cấp những số liệu có giá trị làm cơ sở cho những nghiên cứu
hiện đại về Anopheles.
ở muỗi, hiện t-ợng đa hình di truyền izozym lần đầu tiên đ-ợc Bianchi (1969)
đề cập khi so sánh điện di photphatase kiềm của các thành viên phức hợp loài An.
maculipennis. Những số liệu về điện di hệ enzym ở muỗi chỉ ra rằng cũng giống nhcác quần thể sống khác, các quần thể muỗi biểu hiện sự tồn tại đa alen rất cao. ở
một số quần thể muỗi, sự đa hình thể hiện ở chỗ một enzym có thể bao gåm sù biĨu
hiƯn cđa tõ 5-7 alen [52, 54].
Mét trong những nghiên cứu đầu tiên sử dụng ph-ơng pháp sinh hoá nghiên
cứu Anopheles albimanus, đà công bố những số liệu đáng tin cậy về tính đa hình của
các chủng muỗi trong phòng thí nghiệm, những số liệu này sau này còn đ-ợc sử
dụng để nghiên cứu bản đồ liên kết gen [140]. Những nghiên cứu kỹ l-ỡng và việc
sử dụng kỹ thuật này đà phát hiện ra vị trí các locut gen của allozyme trong các
quần thể hoang dại trùng vùng phân bố ở muỗi Anopheles quandrimaculatus A và B
và cho phép sử dụng những ph-ơng pháp này để nghiên cứu di truyền quần thể ở
mức độ rộng hơn [98]. Công cụ này cũng đ-ợc sử dụng để xây dựng khoá định loại


10

nhị phân phân biệt 3 loài trong phức hợp An.quandrimaculatus [140] và đ-ợc sử
dụng để tách biệt 2 loài đồng hình trong phức hợp An. minimus ở Thái Lan [185].
Những dấu hiệu về sự đa hình di truyền đà đ-ợc phát hiện ở hầu hết các loài
Anopheles. Những số liệu này đà chỉ ra sự khác nhau và những biến đổi phức tạp
của các loài đồng hình. Sáu locut ( Est-1, Est-2, Est-3, Est-5, Odh, Xdh) trong số 30
enzym đ-ợc thư nghiƯm chØ ra cã sù kh¸c nhau vỊ c¸c alen điện di có thể dùng để
phân biệt Anopheles gambiae và Anopheles arabiensis (trong phức hợp Anopheles
gambiae) với khoảng cách di truyền là 0,15 [48-49]. Khi phân biệt các loài đồng
hình ng-ời ta cần phân tích khoảng 15 locut gen trở lên. Khoảng cách di truyền và
hệ số t-ơng đồng di truyền của các loài đồng hình thuộc cùng một nhóm loài cũng

nh- các nhóm loài là rất khác nhau.
Năm 1992 A.C Green và V. Baimai đà tiến hành nghiên cứu 8 hệ enzym của
An. dirus và nhận thấy hầu hết chúng đều đa hình.
Trên đối t-ợng Anopheles pseudopunctipennis thuộc 42 quần thể thu thập ở
Trung và Nam Mỹ, Sylvie Manguin et al (1999) [130] nhËn thÊy cã sù kh¸c bịêt về
tần số alen của 3 locut enzym (glycerol dehydrogenase, 6- phosphogluconate
dehydrogenase và phosphoglucomutase) trong tổng số 33 locut phân tích. Dựa vào
những số liệu thu đ-ợc về sự đa hình izozym, các tác giả đà xếp các nhóm quần thể
Anopheles pseudopunctipennis theo 3 vùng địa lý khác nhau: nhóm 1 trải dài từ
miền nam n-ớc Mỹ qua Mexico đến Guatemala. Nhóm 2 phân bố từ Bắc đến Nam
Mỹ qua Trung Mỹ đến Brazil và nhóm 3 có ở Đông Guatemala và Nam Brazil.
Choochote et al, (1998) [54] phân tích 10 hÖ enzym (esterase-EST, aldehyde
oxidase- ALDOX, fumerate hydratase-FUM, glucosephosphate isomerase-GPI, glycerophosphate dehydrogenase--GPDH, hexokinase-HK, lactate dehydrogenaseLDH, malic enzym- ME, xanthine dehydrogenase- XDH, và amylase- MY) ở cả bọ
gậy và muỗi tr-ởng thành của 2 dạng Anopheles sinensis (dạng A và B) ở Thái Lan,
kết quả chỉ ra rằng: phần lớn các izozym đều có sự khác biệt về tần số các alen. ME,
HK, và Fum có các băng đa hình ở bọ gậy và muỗi tr-ởng thành của cả 2 dạng A
và B. Những enzym khác cũng mang các băng đa hình của 2 hay 3 alen trên một
locut. Đi sâu phân tích enzym esterase, các tác giả thấy EST có 5 locut nh-ng chØ cã


11

Est5 dùng để phân biệt dạng A và B. Est5 có 5 alen (96, 100, 101, 105 và 106).
Dạng A cã 4 alen 100, 105, 101 vµ 106 víi alen 100 có tần số bắt gặp cao. Dạng B
có 4 alen 96, 100, 101 vµ 105 víi alen 96 chiÕm -u thế. Nh- vậy dạng B có alen 96
mà dạng A không có và ng-ợc lại dạng A có alen 106 với tần số thấp mà dạng B lại
không có.
Theo những nghiên cứu về izozym trên gel cellulose acetate của phức hợp loài
Anopheles gambiae ở Tây Nam Burkina Faso của Coosemans et al, (1998) [66] thì
tất cả các loài trong phức hợp có thể phân biệt đ-ợc với nhau ở 2 locut ODH và MPI

mặc dù chúng có thể có 1 số alen chung ở 2 locut này. Phân tích đa hình của 13
locut giữa các loài trong phức hợp Anopheles gambiae cho thấy sự khác biệt quan
trọng giữa những mÉu thu thËp ë thµnh phè vµ mÉu thu thËp ở vùng nông thôn về tần
số alen, về tần số kiĨu gen cđa enzym isocitrate dehydrogenase I, malate
dehydrogenase I vµ tần số alen Mpi.
Anopheles sundaicus đ-ợc xác định là vectơ trun bƯnh sèt rÐt chđ u ë
vïng ven biĨn c¸c n-ớc ở Đông ph-ơng [10, 20]. Bằng nghiên cứu di truyền tế bào
các nhà khoa học nhận thấy đây là một phức hợp loài gồm 3 dạng nhiễm sắc thể
khác nhau (dạng A, B, và C) ở Indonesia và Thái Lan. Vào năm 1999, Sukowati et
al, đà tiến hành nghiên cứu izozym của 3 dạng A, B, C này thu thập từ 6 quần thể
địa lý khác nhau ở Indonesia. M-ời hai hệ enzym với tổng số 15 locut đ-ợc nghiên
cứu và kết quả là hầu hết các enzym đều đa hình trong hay giữa các quần thể của
phức hợp An. sundaicus. TÇn sè alen cđa enzym Mpi (Mannose phosphate
isomerase) cho phép phân loại mỗi dạng Anopheles sundaicus khác nhau. Dựa vào
dữ liệu thu nhận đ-ợc từ nghiên cứu trên, các tác giả đà thiết lập mô hình cây chủng
loại phát sinh của 3 dạng này, qua đó thấy dạng A có quan hệ gần gũi hơn với dạng
C, còn dạng B có khoảng cách di truyền xa hơn đối với hai dạng trên, Nh- vậy,
những kết quả này càng củng cố và khẳng định An. sundaicus ở Indonesia là phức
hợp gồm 3 loài đồng hình [186].
Những bằng chứng về sự đa hình di truyền của Anopheles nuneztovari đà đ-ợc
Scarpasa và Tadel công bố dựa vào việc phân tích izozym của các mẫu thu thập ở 6
quần thể khác nhau (4 quần thể rừng Amazon- Brazil và 2 quần thể Colombia). Các
enzym ME và XDH là những enzym đơn locut ở tất cả các quần thể, trong khi đó


12

EST và LAP lại có số locut nhiều hơn. EST cã 5 locut vµ LAP cã 4 locut. IDH cã 3
vùng bắt màu và có sự khác biệt di truyền ở locut Idh I giữa các quần thể ở rừng
Amazon- Brazil. MDH đa hình cao ở tất cả quần thể nghiên cứu. ở quần thể

Sitromela, locut enzym ACON thể hiện có 4 alen còn các quần thể còn lại chỉ có 3
alen. PGM do một locut xác định nh-ng lại có sự đa hình cao ở các quần thể rừng
Amazon... Những enzym này là chỉ thị quan trọng cho thấy sự đa hình trong các
quần thể Anopheles nuneztovari [174].
Khoảng cách di truyền giữa các loài Anopheles rangeli, loài Anopheles
nuneztovari và loài Anopheles dunhami ở rừng Amazon- Brazil đ-ợc tính toán bằng
sử dụng kết quả điện di izozym. Ba loài này thuéc cïng ph©n nhãm Oswaldoi, ph©n
gièng Nyssorhynchus. M-êi ba enzym với tổng số 22 locut của các loài trên đÃ
đ-ợc nghiên cứu và đ-a đến những kết luận: Anopheles nuneztovari và Anopheles
rangeli khác nhau ở các locut Gpi1, Hk1, Me1 đặc biệt rõ rệt ở locut Mdh. Năm
locut (Mdh, Gpi1, Hk1, Gpd và Me) dùng phân biệt hai loài An.rangeli và
An.dunhami trong khi đó chỉ có 1 locut Gpd mới phân biệt đ-ợc An.nuneztovari và
An.dunhami. Khoảng cách di truyền cao nhất giữa An.rangeli và An.dunhami (0,28)
và thấp nhất giữa An.nuneztovari và An.dunhami (0,072). Khoảng cách di truyền
giữa Anopheles nuneztovari và Anopheles rangeli là 0,237. Các tác giả đ-a ra nhận
định rằng An.dunhami và An.nuneztovari là loài chị em có mối quan hệ gần gũi và
có thể đ-ợc tách ra từ một nhánh tổ tiên chung [174].
Bằng cách so sánh phổ điện di 12 hệ enzym của các thành viên trong phức hợp
loài Culex pipiens L ở California và Nam phi, Cornel, Collins (2003) nhËn thÊy ë
Nam phi cã sù kh¸c biệt giữa loài Cx. pipiens và Cx. quinquefaciatus ở các locut
Ao, 6-Pgdh, Mdh2 và Pgm. Ng-ợc lại, tại California, toàn bộ các quần thể Cx.
pipiens đều có sự cân bằng phù hợp với định luật Hardy Weinberg ở tất cả các locut
enzym thử nghiệm. Những kết quả trên đây chỉ ra r»ng ë Nam Phi hai loµi Cx.
pipiens vµ Cx. quinquefaciatus có khoảng cách di truyền khác biệt giữa các quần thể
và có thể chúng là các loài riêng biệt, trong khi đó ở California lại có sự t-ơng đồng
di truyền giữa hai quần thể này, chúng đ-ợc coi nh- loài duy nhất [69].
ở Việt Nam, việc phân tích đa hình izozym ở muỗi cũng đà đ-ợc tiến hành từ
giữa những năm 80 của thế kỷ tr-ớc. Một trong những nhãm loµi trun bƯnh sèt rÐt

13

chính ở Đông Nam á cũng nh- ở Việt Nam đ-ợc nghiên cứu khá rõ là nhóm loài
An. minimus. Những nghiªn cøu vỊ An. minimus ë ViƯt Nam chØ ra rằng izozym
Octanol dehydrogenase (ODH) ở loài muỗi này biểu hiện tính đa hình ở các quần
thể khác nhau. Các quần thể muỗi An. minimus C phân bố chủ yếu ở những sinh
cảnh thích hợp đó là sinh cảnh rừng rậm, rừng nguyên sinh đ-ợc đặc tr-ng bởi
Odh134 và Odh146. Các quần thể An. minimus A phân bố rộng rÃi ở vùng rừng núi
trong toàn quốc chúng mở rộng vùng phân bố tới vùng bán sơn địa có 2 alen đặc
tr-ng là Odh100 và Odh114. Hai dạng muỗi này có tập tính và thời gian sinh sản đặc
tr-ng khác nhau [1, 3, 11, 13].
Năm 2000, các cán bộ của Viện SR- KST- CT TƯ đà phân tích 4 hệ izozym,
đó là: glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD), phosphoglucomutase (PGM),
Isocitrate dehydrogenase (IDH) cña phøc hợp loài An. maculatus ở Việt Nam, các
tác giả nhận thấy có sự đa hình di truyền rõ rệt và thể hiện là các thành viên khác
nhau trong phức hợp loµi. Do vËy cã thĨ sư dơng hƯ izozym nµy để nhận biết các
thành viên trong phức hợp [22].

1.2.2. Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền
Ph-ơng pháp di truyền tế bào là ph-ơng pháp tập trung vào nghiên cứu nhiễm
sắc thể của tế bào: thông th-ờng là nghiên cứu nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene
chromosome) và nghiên cứu hình thể bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa nguyên phân
(karyotype).
Làm tiêu bản nhiễm sắc thể là sử dụng các tác động cơ học và hoá học làm cho
nhiễm sắc thể dàn đều trên bề mặt của lam kính và nhuộm màu. Từ đó, ta có thể
quan sát số l-ợng, hình dạng và các băng đặc tr-ng trên nhiễm sắc thể. Dựa vào
những đặc điểm quan sát đ-ợc ta có thể xác định những nét đặc tr-ng của các loài
cần nghiên cứu, phân tích các chuyển đoạn, đảo đoạn, trình tự sắp xếp của các băng
trên nhiễm sắc thể từ đó có thể xác định mối quan hệ và nguồn gốc phát sinh của
các loài.

Nghiên cứu di truyền tế bào là một h-ớng nghiên cứu cơ bản và quan trọng
nhằm củng cố và tăng c-ờng sự hiểu biết về sinh học loài. Những công trình nghiên
cứu di truyền tế bào các quần thể muỗi thuộc gièng Anopheles gióp chóng ta hiĨu râ


14

hơn về bộ máy di truyền của chúng ở mức độ tế bào và mối quan hệ tiến hoá giữa
các loài trong họ muỗi.
Di truyền tế bào gồm có nghiên cứu kiểu nhân của nhiễm sắc thể khổng lồ, đây
là một trong những công cụ sớm nhất đ-ợc sử dụng để nghiên cứu di truyền ở muỗi
Anopheles. Một trong những nh-ợc điểm của kỹ thuật này ở muỗi Anopheles là
nhiễm sắc thể khổng lồ phải đ-ợc chuẩn bị từ mô tế bào nuôi trứng hoặc ở bọ gậy
tuổi IV. Điều này hạn chế là chúng ta chỉ có thể sử dụng mẫu vật là các muỗi cái no
máu hoặc là giai đoạn cuối của bọ gậy. Thêm vào đó, có rất ít ng-ời có kinh nghiệm
và đ-ợc đào tạo để phân tích kết quả nhiễm sắc thể, đặc điểm này không cung cấp
nhiều, có khi lại rất ít thông tin ở một số loài (Lounibos, Conn, 2000) [124]. Mặc dù
có những hạn chế trên, nh-ng ph-ơng pháp này vẫn tồn tại không thể thiếu cho
những nghiên cứu hiện nay.
Trong những năm gần đây, nghiên cứu di truyền tế bào muỗi sốt rét Anopheles
ngày càng đ-ợc quan tâm và mở rộng đặc biệt trong việc phân biệt các loài đồng
hình trong các phức hợp loài. Các nhà khoa học đà đi sâu nghiên cứu kiểu nhân và
nhiễm sắc thể khổng lồ. Ng-ời tiên phong trong lĩnh vực này là G. Frizzi và
Kitzmiller trên đối t-ợng An. maculipennis (1954). Tiếp đó, năm 1969, Coluzzi đÃ
phát hiện thấy nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào nuôi trứng của muỗi cái Anopheles
tr-ởng thành. Nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào nuôi trứng rất hữu ích trong việc
phân biệt các loài đồng hình trong phức hợp loài An. gambiae [58, 85], An.
culicifacies và An. maculatus [186]
Di truyền tế bào cung cấp những thông tin vô cùng hữu hiệu để phân biệt các
loài cùng vùng phân bố và các dạng nhiễm sắc thể khác nhau. Trên thực tế di truyền

tế bào đ-ợc coi là công cụ duy nhất đáng tin cậy để phân biệt sự khác nhau giữa các
dạng nhiễm sắc thể của An. gambiae s.s. [59] và cho đến tận ngày nay nó cũng là
công cụ đáng tin cậy để phân biệt 9 thành viên của nhóm loài Anopheles funestus
[103]. Sharakhov et al, (2001) [176] đà phát triển một bản đồ nhiễm sắc thể khổng
lồ của An.funestus và so sánh nó với cấu trúc di truyền tế bào của An. gambiae.
Ngoài ra, tần số của những đảo đoạn nhiễm sắc thể có thể sử dụng để nghiên cứu
cấu trúc quần thể và -ớc l-ợng về tác động của kích cỡ quần thể [107, 148, 188].


15

Các đảo đoạn NST cũng có thể đ-ợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá,
tìm ra cấu trúc ban đầu, việc duy trì và đan xen các đảo đoạn NST tồn tại ở nhiều
quần thể và các bậc phân loại trùng vùng phân bố ở nhiều nhóm loài Anopheles
[60]. Những thông tin nh- thế đà đ-ợc sử dụng nh- những bằng chứng về sự tiến
hoá di truyền và những biến đổi để thích nghi của nhiễm sắc thể giữa hai loài đồng
hình, An. gambiae s.s. và An. arabiensis. T-ơng tự, Caccone et al, (1998) [50] và
Powell et al, (1999) đà phát hiện ra các h-ớng tiến hoá thông qua các đảo đoạn
nhiễm sắc thể đ-ợc chia sẻ giữa các thành viên của phức hợp An. gambiae. Cũng
nh- vậy, việc so sánh về sự chia sẻ các băng trên nhiễm sắc thể khổng lồ cũng đ-ợc
tìm thấy ở các loài muỗi Anopheles ở vùng Tân thế giới [147]. Trong cả hai tr-ờng
hợp trên, các nhà nghiên cứu đều phải kiểm tra những dấu hiệu khác để có một kết
luận chính xác về những sự t-ơng đồng này [186].
ở vùng Đông ph-ơng, công trình nghiên cứu đầu tiên trên 6 loài muỗi thuộc 2
phân giống Cellia và Anopheles do Avirachan et al, (1968) [28] tiến hành.Tiếp đó
là công trình của V. Baimai nghiên cứu An. balabacencis và rất nhiều công trình
khác trên các đối t-ợng An. dirus, An. minimus. [35,36]
Theo nhiều tài liệu và kết quả đà đ-ợc công bố, các tác giả đều kết luận rằng
kiểu nhân của tất cả các loài Anopheles đà nghiên cứu đều có số nhiễm sắc thể
l-ỡng bội 2n=6 gồm 3 đôi: hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng, và một đôi nhiễm sắc thể

giới tính (XX ở con cái và XY ở con đực). Hai đôi nhiễm sắc thể th-ờng là tâm cân
hoặc tâm cận giữa, đôi nhiễm sắc thể giới tính có hình thái khác nhau giữa con đực
và con cái và ở các loài khác nhau thì nhiễm sắc thể giới tính khác biệt nhau.
Các kiểu nhân phân biệt với nhau trên cơ sở sự sai khác về hình dạng kích
th-ớc, cũng nh- sự phân bố vùng dị nhiễm sắc trên nhiễm sắc thể th-ờng và nhiễm
sắc thể giới tính. Những nét khác biệt này thấy cả trong cùng một loài và giữa các
loài khác nhau.
Theo những nghiên cứu của V. Baimai (1988) [35], có ít nhất 7 loài đồng hình
trong phức hợp loài An. dirus ở Đông Nam á là A, B, C, D, E, F và An.
takasagoensis. Các loài này đ-ợc phân biệt dựa vào khối dị nhiễm sắc ở tâm động
trên nhiễm sắc thể giới tính trong kiểu nhân nguyên phân.