(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh của neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành trong quân đội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

VŨ THỊ XUÂN THU

NGHÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG
SINH CỦA Neisseria meningitidis TẠI CÁC Ổ DỊCH
LƢU HÀNH TRONG QUÂN ĐỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

VŨ THỊ XUÂN THU

NGHÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG
SINH CỦA Neisseria meningitidis TẠI CÁC Ổ DỊCH
LƢU HÀNH TRONG QUÂN ĐỘI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. ĐOÀN TRỌNG TUYÊN
GS. TS. PHẠM VĂN TY

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sinh Học-Trường Đại
Học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội, đã hết lòng tạo điều
kiện để chúng tơi có thể học tập tốt và đạt được những thành quả như ngày
hơm nay.
Đặc biệt, với lịng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy hướng
dẫn TS. Đoàn Trọng Tuyên và GS .TS. Phạm Văn Ty đã tâ ̣n tâm hướng dẫn ,
giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhấ t đế n cán bô ̣ nhân viên của
khoa Vi sinh Vật viê ̣n Y họ c Dự phòng Quân đội và Lañ h đa ̣o chỉ huy viện đã
giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thu thập số liệu , thực hiện nghiên cứu và hoàn
thành luận văn tốt nghiệp.
Xin gửi tới Ban lãnh đạo Bệnh viện Phổi Hà Nội lời cảm ơn sâu sắc đã
tạo điều kiện về thời gian để tơi có thể hồn thành khóa học này.
Một lần nữa, tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cơ, bạn bè và tồn bộ
những người thân trong gia đình đã ln giúp đỡ nhiệt tình và động viên tơi
trong suốt q trình học tập.
Học Viên

Vũ Thị Xuân Thu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3
1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do Neisseria
meningitidis ..................................................................................................... 3
1.1.1. Dịch tễ học của bệnh viêm màng não ............................................... 4
1.1.2. Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng .................... 5
1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis ................................................... 6
1.2.1. Danh pháp và phân loại Não mơ cầu [32] ......................................... 6
1.2.2. Tính chất ni cấy ............................................................................. 7
1.2.3. Sức đề kháng ..................................................................................... 8
1.2.4. Những kháng nguyên quan trọng của Não mô cầu [2], [5], [9], [62]. .... 8
1.3. Các kỹ thuật chẩn đốn phịng thí nghiệm ............................................ 11
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm soi ......................................................................... 11
1.3.2. Kỹ thuật phân lập ............................................................................ 11
1.3.3. Kỹ thuật điện di miễn dịch .............................................................. 12
1.3.4. Kỹ thuật ngưng kết .......................................................................... 12
1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não .. 13
1.4. Đặc điểm gene đích phát hiện N. meningitidis ..................................... 14
1.5. Đặc điểm gene đích (gene đặc hiệu) xác định nhóm huyết thanh của N.
meningitidis ................................................................................................... 16
1.6. Đáp ứng miễn dịch................................................................................. 19
1.7. Điều trị và dự phòng .............................................................................. 21
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ......................................................................................................... 24
2.1. Đối tượng ............................................................................................... 24
2.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................ 24


2.2.1. Thiết bị ............................................................................................ 24
2.2.2. Sinh phẩm ........................................................................................ 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 25

2.3.1. Phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang. ..................................... 25
2.3.2. Phương pháp thực nghiệm trong phịng thí nghiệm........................ 25
2.4. Xử lý số liệu bằng phần mềm Epi–info 3.2 ........................................... 34
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ................................. 35
3.1. Đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của Neisseria
meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội ................. 35
3.1.1. Đặc điểm sinh học của chủng Neisseria meningitidis phân lập tại
các đơn vị tân binh trong quân đội ............................................................ 35
3.1.2. Cơ cấu nhiễm Neisseria meningitidis và các nhóm huyết thanh của
các chủng Neisseria meningitidis phân lập tại các đơn vị tân binh trong
quân đội bằng phương pháp PCR.............................................................. 38
3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học phân tử của các chủng N.meningitidis
phân lập được bằng các cặp mồi đặc hiệu lồi và nhóm N.meningitidis
thơng qua phản ứng PCR .......................................................................... 44
3.2. Đánh giá sự nhậy cảm với kháng sinh của các chủng N. meningitidis
nhóm huyết thanh B và C ............................................................................. 53
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 58
KHUYẾN NGHỊ ................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 60
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 71


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh học của Neisseria meningitidis ....................................... 6
Bảng 1.2 : Dạng nhóm huyết thanh capsule và gene đích cho genotype của N.
meningitidis .............................................................................................................. 18
Bảng 1.3 . Protein màng ngoài của N. meningitidis............................................... 20
Bảng 1.4. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán, điều trị nhiễm N. meningitidis........... 21
Bảng 2. 1. Các hóa chất gắn trong các giếng của thẻ định danh NH.................... 26
Bảng 2.2: Trình tự mồi khảo sát phát hiện gene đích của N. meningitidis và các

nhóm huyết thanh (A; B; C) .................................................................................. 31
Bảng 2.3:Tiêu chuẩn đánh giá MIC theo hướng dẫn của Viện lâm sàng và chuẩn
thức phịng thí nghiệm (CLSI) năm 2013 .............................................................. 33
Bảng 3.1. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis ............................ 35
Bảng 3.2. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis ................................ 36
Bảng 3.3. Đặc điểm chuyển hóa axit amin của N.meningitidis ........................... 37
Bảng 3.4. Đặc điểm chuyển hóa đường của N.meningitidis ................................ 37
Bảng 3.5: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh lưu hành tại 03 đơn
vị giám sát................................................................................................................. 38
Bảng 3.6: Tần suất nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh ......................... 39
theo trung đoàn......................................................................................................... 39
Bảng 3.7: Tỷ lệ nhiễm N. meningitidis và nhóm huyết thanh theo vị trí địa lý ... 41
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra chủng N. meningitidis trên thanh NH và cơ cấu nhóm
huyết thanh bằng kỹ thuật Multiplex-PCR............................................................. 42
Bảng 3.9: Xác định MIC của chủng Neisseria meningitidis, nhóm huyết
thanh B (n=23) ........................................................................................................ 53
Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm N. meningitidis, nhóm
huyết thanh B ........................................................................................................... 55
Bảng 3.11 : Xác định MIC (in vitro) của chủng Neisseria meningitidis, nhóm
huyết thanh C (n=4) ................................................................................................ 55
Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm in vivo trên người nhiễm N. meningitidis, nhóm
huyết thanh C ........................................................................................................... 56


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy......................... 7
Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. ...................................... 8
Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu............................................... 8
Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.................................... 9
Hình 1.5: Hình ảnh ni cấy N. meningitidis trên mơi trường thạch chocolate có

kháng sinh................................................................................................................. 12
Hình1.6: Hình ảnh định danh N. meningitidis trên thanh định danh API NH ....... 12
Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis................ 13
Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng ngun của N. meningitidis .................. 15
Hình 1.9 : Bản đồ gene capsule (CPS) của Nmen (14), ctrABCD operon mã hóa
ATP-protein.............................................................................................................. 19
Hình 2.1 : Thiết kế nghiên cứu đặc điểm sinh học của N. meningitidis ............. 25
Hình 2.2. Thanh E test ............................................................................................. 33
Hình 2.3. Kết quả thử nghiệm MIC bằng E test ...................................................... 33
Hình 3.1: Khảo sát gene CtrA trên 32 chủng N. Meningitidis .............................. 45
Hình 3.2: Khảo sát gene ctrA trên 32 chủng N. Meningitidis ............................... 46
Hình 3.3: Tiếp tục khảo sát sự xuất hiện của gene ctrA trên 32 chủng N.
Meningitidis .............................................................................................................. 47
Hình 3.4: Kết quả khảo sát sự có mặt của gene Por A trên 32 chủng N.
meningitidis phân lập được .................................................................................... 48
Hình 3.5: Khảo sát gene CrgA mã hóa LysR của N. meningitidis trên 32 ........... 49
Hình 3.6: Khảo sát gene SodC trên 32 chủng N. meningitidis .............................. 50
Hình 3.7 : Khảo sát gene sac D phát hiện N. meningitidis nhóm huyết thanh A, 51
Hình 3.8: Khảo sát gene sac Db phát hiện N. meningitidis nhóm B .................... 52
Hình 3.9: Khảo sát gene sia Dc phát hiện N. meningitidis nhóm C ..................... 53


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

NMC:

Não mô cầu

VMN:

Viêm màng não

PS:

Polysaccharide

LOS:

Lipo – oligosaccharide

LPS:

Lipopolysaccharide

OMP:

OuRer membrase protein

PCR:

Polymerase chain reaction

MIC

Minimum inhibition concentration

VSV:

Vi sinh vật

MỞ ĐẦU
Viêm màng não là một bệnh lý nhiễm trùng nghiêm trọng, tỷ lệ tử vong
cao nếu không được nghĩ đến, khơng chẩn đốn và điều trị kịp thời. Sự hiểu
biết về các tác nhân gây bệnh thường gặp, sẽ hỗ trợ cho công tác điều trị và
xây dựng các chương trình phịng chống bệnh tật tại từng Quốc gia. Hầu hết
những dữ liệu về dịch tễ của viêm màng não mủ ở người lớn đều xuất phát từ
những quốc gia đã phát triển, trong đó 4 tác nhân gây bệnh thường gặp nhất
là: Streptococcus pneumoniae (30%-60%), Neisseria meningitidis (13-37%),
Listeria monocytogenes và Haemophilus influenzae. Neisseria meningitidis,
Haemophilus influenzae type b (Hib) và Streptococcus pneumoniae là loại vi
khuẩn có vỏ (polysaccharide-encapsuleated) là nguyên nhân quan trọng gây
bệnh và tử vong trên thế giới [23] Hàng năm có từ 400.000 – 500.000 người
chết do viêm màng não (WHO, 2006).
Trong thời gian cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, đã có sự chuyển đổi
trong việc chẩn đoán các tác nhân sinh học, kết hợp kiểu hình và huyết thanh
học với việc xác định kiểu gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử [39].
Phân tích tính đa dạng về tổ hợp trình tự nhiều vùng gene (MLST) là tiêu
chuẩn vàng cho việc xác định các đặc điểm của vi khuẩn N. meningitidis phục
vụ công tác giám sát dịch tễ học. Sự phát triển của các kỹ thuật phân tử cho
phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não từ mẫu nuôi cấy phân lập và
khơng phân lập để chẩn đốn xác định được ca bệnh và nó trở thành cơng cụ
hữu ích cho nâng cao chất lượng giám sát, phát hiện và tiên lượng dịch, đây là
chiến lược phịng ngừa chính ở các nước Châu âu [7].
Nhằm nâng cao chất lược, hiệu quả của việc phát hiện tác nhân trên cơ
sở xác định đặc điểm về cả kiểu hình và kiểu gene của Neisseria meningitidis
là hết sức quan trọng giúp tiên lượng, dự báo dịch và đề xuất phác đồ dự
phòng, điều trị nhằm hạn chế được tỷ lệ nhiễm N. meningitidis, mắc bệnh
1

trong cộng đồng. Với đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu đặc điểm sinh học và
tính kháng kháng sinh của Neisseria meningitidis tại các ổ dịch lưu hành
trong quân đội. Với mục tiêu:
1. Xác định đặc điểm sinh học và cơ cấu nhóm huyết thanh của
Neisseria meningitidis phân lập tại một số đơn vị tân binh trong quân đội.
2. Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng Neisseria
meningitidis phân lập từ người mang mầm bệnh không triệu chứng

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN
1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh viêm màng não do Neisseria
meningitidis
Năm 1884 Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được
vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tủy. Năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập
được vi khuẩn từ dịch não tủy của bệnh nhân viêm màng não do vi khuẩn và đặt
tên là: Diplococcus intracellularis meningitidis. Sau đó, năm 1901 Albrecht và
Ghon đã đổi thành Neisseria meningitidis để ghi công Albert neisser- nhà khoa
học người Đức.
N. meningitidis cư trú ở đường hô hấp của người, tỷ lệ gây bệnh
chiếm 1/100.000 người và tỷ lệ người mang mầm bệnh là 1/10 người. Não mô
cầu tồn tại trong đường hầu họng nhờ pili gắn vào các thụ thể của người [11].
Bệnh xảy ra chỉ khi não mô cầu vượt qua biểu mô đường hô hấp để vào máu.
Chúng là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết (nhiễm trùng máu) và nếu vi
khuẩn vượt qua hàng rào máu não gây viêm màng não, viêm não. Khi điều trị
bệnh tỷ lệ tử vong do viêm màng não chung là: 11% [28], trong đó viêm màng
não đơn thuần là 5%. Hầu hết các trường hợp chết do viêm màng não có

nguyên nhân từ nhiễm khuẩn huyết. Bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhưng
khơng có hội chứng màng não có tỷ lệ tử vong là 20%, nhưng nếu kèm theo
sốc thì tỷ lệ tử vong chiếm đến 50%.
Trong nhiễm khuẩn não mô cầu 15% thể viêm màng não tiến triển
nhanh từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong. Khởi phát của
viêm màng não kết hợp với đau họng, đau đầu, ngủ lơ mơ, sốt, kích thích,
cứng gáy. Độc tố của vi khuẩn trong dịch não tủy gây viêm và gây hôn mê.
Thể nhiễm khuẩn huyết biểu hiện lâm sàng như: ban xuất huyết ngồi da
và khơng mờ đi khi làm dấu hiệu dây thắt. Theo thống kê có 35% bệnh nhân
3


nhiễm khuẩn huyết có biều hiện nặng như đơng cục máu ở tĩnh mạnh ngoại vi,
ngập hệ tuần hoàn cùng với nội độc tố, sốc và bí niệu. Trong hầu hết các trường
hợp có thể xảy ra xuất huyết não và tuyến thượng thận [13]. N. meningitidis là
vi khuẩn Gram (-), cần phải điều trị tích cực ngay bằng kháng sinh penicillin,
ampicillin hoặc chloramphenicol. Nếu không điều trị tỷ lệ tử vong do bệnh viêm
màng não 100%. Sau giai đoạn cấp của viêm màng não bệnh nhân được điều trị
bằng rifampin để làm sạch vi khuẩn ở hầu họng và người tiếp xúc gần với bệnh
nhân cũng được điều trị dự phòng bằng rifampin [13].
1.1.1.Dịch tễ học của bệnh viêm màng não
Sự lưu hành của bệnh viêm màng não có sự khác nhau trên tồn cầu,
theo mùa khí hậu, và tuổi mắc bệnh, qui mô dịch tễ học của bệnh là ranh giới
của các quốc gia gần nhau thì khơng có sự khác biệt dịch tễ học của bệnh, cho
đến nay xét về lịch sử của bệnh viêm màng não đã có 7 vụ dịch lớn mang tính
chất tồn cầu và ảnh hưởng tới một số nước trong một khoảng thời gian.
Viêm màng não thường xuyên bùng phát ở Cận Saharan – Châu Phi,
lứa tuổi thường mắc là 8-12, tỷ lệ 500 ca bệnh/100.000 dân [67]. Dịch bùng
phát ở các nước phát triển ở đại chiến thế giới lần thứ II, gồm các nước Châu
Âu, Bắc Mỹ. Trong những năm 1970 dịch bùng phát ở Na Uy với cường độ

tấn cơng là 10 ca bệnh/100.000 dân, sau đó lan truyền dọc Châu Âu bao gồm:
Nước Anh và vươn ra các nước xa hơn như: Cuba, Chile và Brazil. Năm 1987
vụ dịch giết chết nhiều người trong các lễ hành hương từ thánh địa HaJ đến
Mecca và lan rộng trên toàn cầu, khi họ quay về đất nước họ [67]. Bệnh viêm
màng não ở các nước phát triển nhìn chung có đặc điểm: xảy ra lác đác,
không thường xuyên cùng với cường độ tấn công 1/100.000 dân [1].
Bệnh dịch bùng phát do ảnh hưởng của việc thay đổi khí hậu: Ở Châu
Phi dịch bùng phát vào mùa khô, trong thời gian khí hậu đặc trưng này biểu
hiện: độ ẩm, bụi, mưa rào và gió thay đổi, dẫn đến thay đổi về hành vi hoạt

4


động của con người, sau các đợt gió khơ, bụi ở vùng cận Saharan là đến mùa
mưa. Ngược với khí hậu này ở Châu Âu và Bắc Mỹ thì tỷ lệ mắc bệnh cao
trong các tháng mùa đông và thấp ở các tháng mùa thu [3]. Rất nhiều các tác
nhân vi khuẩn và nhiễm virus xẩy ra trong cùng mùa, nhưng lứa tuổi là yếu tố
quan trong tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não. Bệnh viêm màng não tác động chủ
yếu đến trẻ dưới 5 tuổi: đỉnh cao ở trẻ 6 tháng tuổi và suy giảm ở nhóm lứa tuổi
cao hơn [3]. Ví dụ: Bệnh viêm màng não ở Mỹ, ở nhóm 1 tuổi chỉ chiếm ½ so
với nhóm 4 tuổi (Centers for Disease Control and Prevention 2000), và tỷ lệ
tử vong lại xảy ra đáng kể ở trẻ vị thành niên ở Mỹ và Anh là tương đương.
1.1.2.Dịch tễ học người mang mầm bệnh không triệu chứng
Người mang mầm bệnh không triệu chứng cao hơn tỷ lệ mắc bệnh. Tỷ
lệ người mang ở Mỹ và Châu Âu khoảng 10% 7],[10], cao gấp 10.000 lần tỷ
lệ mắc bệnh. Tuy nhiên trong nhà khép kín hoặc một cộng đồng sinh hoạt
khép kín thì tỷ lệ mang mầm bệnh cịn cao hơn: các đơn vị quân đội, trường
học, nhà tù thì tỷ lệ người mang mầm bệnh có thể đạt 50% [3]. Mơ hình
người mang mầm bệnh liên quan tới cường độ bệnh, phân vùng địa lý, ảnh
hưởng của khí hậu và lứa tuổi cảm nhiễm. Mùa viêm màng não ở Châu Á và

Châu Phi thường xuất hiện liên quan tới sự thay đổi mùa khí hậu đã được báo
cáo ở Nigeria và India

[2] [5]. Tương tự như vậy, tỷ lệ người mang mầm

bệnh trong vùng khí hậu ơn đới thường khơng xuất hiện theo sự thay đổi mùa
đã được nghiên cứu ở Bỉ và Mỹ [4]; Hà Lan, tỷ lệ người mang mầm bệnh cao
phản ánh nguy cơ dịch lớn, có thể lên tới 70% trong một số bệnh gây dịch.
Tuổi mắc mang mầm bệnh ở Anh, năm 1986[6] có sự khác biệt giữa các
nhóm tuổi : thấp ở lứa tuổi nhỏ và trẻ vị thành niên và cao đến 25% ở lứa
tuổi từ 13-19 tuổi và từ 20-29 tuổi. Sự tương phản đầu tiên quan sát thấy là
tỷ lệ tử vong cao ở trẻ dưới 5 tuổi và thấp hơn là tỷ lệ mang N. lactamica
cao ở tuổi ẵm ngửa [14].

5


1.2. Đặc điểm sinh học của N. meningitidis
1.2.1.Danh pháp và phân loại Não mô cầu [32]
Danh pháp khoa học
Giới (Kingdom): Bacteria

Họ (Family): Neisseriaceae

Ngành (Phylum): Proteobacteria

Chi (Genus): Nesseria

Lớp (Class): Beta Proteobacteria

Loài (Species): N. meningitidis

Bộ (Ordo): Neisseriales

Nhóm huyết thanh: A, B, C, D, 29E,
H, I,L,W135,X,Y,Z

Tên gọi não mô cầu theo danh pháp quốc tế: Neisseria meningitidis.
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh học của Neisseria meningitidis
Chi Lồi đặc trƣng Nhuộm Hình thể Tạo vỏ Sắp
xếp

Gram

Di

Hơ

Mơi

Trong/ ngồi

động

hấp

trƣờng

tế bào

phát
triển
Neiss N. gonorrhoeae Gram (-) Hình hạt
eria N. meningitidis

cà phê,
hai mặt

Tạo vỏ
hoặc

Phế Không Hiếu Thayer-

Gonococcus:

cầu

trong tế bào-

di

không khuẩn động

dẹt đối

khí Martin

N.meningitidis:
ngoại bào

xứng
nhau

Não mơ cầu là cầu khuẩn Gram âm, kích thước thay đổi, có thể thấy ở
dạng đơn độc hoặc song cầu hình hạt cà phê với hai mặt dẹt đối diện nhau và
có thể nằm trong hoặc ngồi bạch cầu đa nhân, khơng lơng, khơng sinh bào
tử, đa số các chủng đều có vỏ.

6


Hình 1.1: Hình ảnh nhuộm Gram N. meningitidis từ dịch não tủy[63].
1.2.2. Tính chất ni cấy
Tính chất ni cấy
Não mơ cầu là vi khuẩn hiếu khí, phát triển ở mơi trường có 5% thạch
máu, thạch Thayer-Martin cải tiến hoặc mơi trường chocolate, ở nhiệt độ 35370C, khí trường 5-7% CO2. Trên thạch máu, khuẩn lạc nhỏ, tròn, mờ đục, lồi,
màu hơi trắng xám, khơng tan máu, đường kính 1- 3 mm. Khi dùng que cấy
đẩy, khuẩn lạc trượt dễ dàng trên mặt thạch.
Phân biệt vi khuẩn não mô cầu thông thường được căn cứ trên hình
dạng, kết quả nhuộm Gram, các thử nghiệm sinh hoá: phản ứng oxidase và
catalase dương tính, lên men đường glucose, maltose nhưng khơng lên men
đường sucrose hay lactose.

7


Hình 1.2:Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch chocolate. [63].

Hình 1.3: Khuẩn lạc N. meningitidis trên thạch máu. [63]
1.2.3. Sức đề kháng

Não mơ cầu có sức đề kháng yếu: chỉ sống được trong bệnh phẩm dịch
não tủy khoảng 3 – 4 giờ sau khi ra khỏi cơ thể. Bị tiêu diệt ngay bởi tia cực
tím, dung dịch Cloramin B 0,5 – 1% hoặc cồn 700. Ở nhiệt độ 550C/30 phút
hoặc ở 600C/10 phút Não mô cầu cũng bị tiêu diệt. Não mơ cầu có sức đề
kháng yếu với điều kiện khơ và ánh sáng, dễ bị tiêu diệt bởi các thuốc sát
trùng thông thường.
1.2.4. Những kháng nguyên quan trọng của Não mô cầu [2], [5],
[9], [62].
8


Màng tế bào chất
Khoảng gian màng
Màng ngoài tế bào

Protein màng tế bào chất
Por A

Lipooligosaccharide
Por B

Pili
Vỏ
Protein màng ngồi
Phospholipid

Hình 1.4: Hình ảnh màng tế bào N. meningitidis cắt ngang.[18]
Lớp polysaccharide (PS) nang: là kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo
kháng thể bảo vệ (ngoại trừ nhóm B). Căn cứ vào tính khơng đồng nhất về
cấu trúc và tính kháng nguyên của PS người ta đã tìm được 13 nhóm huyết

thanh của cầu khuẩn màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135,
X, Y, Z. Nhóm huyết thanh A chứa mannosamine phosphate, trong khi đó
nhóm huyết thanh B, C, Y, W135 chứa acid sialic - chất đóng vai trị quan
trọng trong sự tồn tại và độc tính. Polysaccharide vỏ của nhóm huyết thanh B
và C bao gồm homopolymer của acid N - acetyl - neuraminic liên kết với α 2,8 và α - 2,9. Sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc dẫn đến các đặc tính miễn
dịch khác nhau một cách rõ ràng: trong khi cấu trúc α - 2,9 là kháng nguyên
mạnh đối với cơ thể và sinh ra kháng thể bảo vệ thì α - 2,8 lại có tính kháng
ngun rất yếu.
- Lớp lipo- oligosaccharide (LOS)- Endotoxin

9


Cấu tạo của LOS gồm 1 glycolipid màng ngoài nhưng khác với
lipopolysaccharide (LPS) của Enterobacteriaceae vì thiếu các chuỗi O đặc
trưng và hình thái “xù xì” (ráp) tương tự như của LPS. Nó bao gồm 3 thành
phần chính: oligosaccharide nhân; lipid A kỵ nước (thành phần gây độc); một
chuỗi oligosaccharide nhánh có thể thay đổi (thành phần tạo miễn dịch). gene
glycosytranspherase (lgt) trên nhiễm sắc thể đảm nhiệm việc sinh tổng hợp của
các chuỗi oligosaccharide khác nhau. 4 glycosyltranspherase (lgtA, lgtC, lgtD
và lgtG), sử dụng để phân loại các chủng thành 12 type miễn dịch khác nhau.
Type miến dịch L1 - L8 liên quan chi phối đầu tiên tới não mơ cầu nhóm huyết
thanh B, C, trong khi đó type miễn dịch L9 - L12 liên quan đến các chủng não
mơ cầu nhóm A. Gene truyền ngang của các Neisseria hoại sinh chi phối tính
đa dạng về gene của vị trí lgt.[]
- Màng ngồi chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như polysaccharide của
vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A
- Lớp protein của màng ngoài (PorA và PorB): đặc hiệu type huyết thanh
và phân type huyết thanh Màng ngoài não mơ cầu chứa một số protein màng
ngồi chính (OMPs): chức năng của PorB (tên trước đây là protein lớp 2/3) và

PorA (protein lớp 1) như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi vào. Giống
như hầu hết các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt não mô cầu, độ lớn của
kháng nguyên giữa các chủng là khác nhau, do đó có thể sử dụng chúng để
phân loại não mơ cầu thành các nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh.
Các chủng N. meningitidis được phân chia thành trên 20 nhóm huyết thanh
và phân nhóm huyết thanh khác nhau chủ yếu ở nhóm huyết thanh B, C.
Nhiều chủng phân lập khơng thể phân loại được là nhóm huyết thanh hay
phân nhóm huyết thanh bằng kháng thể đơn dịng hiện tại.
- Cấu trúc kháng nguyên của nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết
thanh thay đổi in vivo một cách nhanh chóng trên một cá thế người và trong
cộng đồng. Các vòng ( mạch) có thể thay đổi trên bề mặt lộ diện của cả hai
10


porins, có thể thay đổi về mặt kháng nguyên bằng cách thêm vào hoặc bớt đi
amino-acid hoặc bằng cách truyền ngang các mảnh phụ của các gene đại diện.
Sự thay đổi này làm cho việc phát triển vắc xin mới là hết sức khó khăn.
- Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu, cầu khuẩn
phổi. Kháng nguyên này được dùng trong một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh.
1.3. Các kỹ thuật chẩn đốn phịng thí nghiệm
1.3.1. Kỹ thuật nhuộm soi
Các thử nghiệm nhanh phất hiện NMC có thể dương tính, là cơ sở cho
liệu pháp sử dụng kháng sinh trước đó. Một số lượng nhỏ mẫu dịch não tủy
gửi đến phịng thí nghiệm càng sớm các tốt để phân tích. Kết quả chẩn đốn
nghi ngờ khi: Nhuộm gram mẫu dịch não tủy ly tâm cho thấy, hình ảnh phế
cầu khuẩn; gram (-), nằm trong hoặc ngồi tế bào bạch cầu, kết quả này xác
định từ 1-2 giờ khi mẫu bệnh phẩm được chuyển đến phịng thí nghiệm
1.3.2.Kỹ thuật phân lập
Tiêu chuẩn vàng để chấn đoán là phân lập N. meningitidis từ dịch tiết vô
trùng của cơ thể như: dịch não tủy, máu. Chẩn đoán xác định khi vi khuẩn

phát triển trên môi trường thạch chocolate. Sự khác biệt với các vi khuẩn
thuộc loài khác là khuẩn lạc được thử nghiệm oxidase, catalase dương tính và
thử nghiệm sinh hóa lên men. Cuối cùng là xác đinh về huyết thanh xác định
dưới nhóm của N. meningitidis, đây là vấn đề quan trọng trong giám sát dịch
tễ học, phần này chỉ có thực hiện tại các phịng thí nghiệm chuyên dụng.
Bệnh phẩm là dịch não tuỷ, máu (lấy trước khi dùng kháng sinh) được
cấy trên môi trường thạch máu, thayer- Martin cải tiến hoặc chocolate và
được ủ ở 370C, 10% khí CO2. Chọn khuẩn lạc, thử các tính chất sinh vật hoá
học và ngưng kết với kháng huyết thanh để xác định nhóm

11


Hình 1.5: Hình ảnh ni cấy N.

Hình1.6: Hình ảnh định danh N.

meningitidis trên môi trường thạch

meningitidis trên thanh định danh API NH

chocolate có kháng sinh
1.3.3.Kỹ thuật điện di miễn dịch: Phát hiện polysaccharide đặc hiệu
của N. meningitidis trong dịch não tuỷ, máu và nước tiểu. Kỹ thuật này có thể
phát hiện được polysaccharide ở mức 0,1µg/ml
1.3.4.Kỹ thuật ngưng kết: Gắn anti-polysaccaride lên hồng cầu hoặc
hạt latex để phát hiện kháng nguyên polysaccaride của N. meningitidis trong
bệnh phẩm máu, dịch não tủy, nước tiểu, độ nhạy giao động từ 2,5 - 62,5
ng/ml (62,5ng/ml đối với N. meningitidis nhóm B) và chỉ dùng trong phát
hiện ca bệnh. Do đó trung tâm kiểm sốt bệnh tật CDC khuyến cáo khơng sử

dụng kỹ thuật này trong thường qui xét nghiệm chẩn đoán nhiễm não mô cầu.

12


Hình 1.7 : Hình ảnh bộ sinh phẩm Pastorex phát hiện N. meningitidis
1.3.5. Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện vi khuẩn gây viêm màng não
Ở các nước phát triển, hầu hết sử dụng chuẩn thức để phát hiện đặc
điểm của tác nhân vi sinh vật gây viêm màng não, bao gồm: nuôi cấy, nhuộm
gram và ngưng kết hạt latex. Thậm chí ni cấy được coi như tiêu chuẩn vàng
để khằng định ca bệnh trong lâm sàng, tỷ lệ dương tính là tương đối thấp do
bảo quản và điều kiện vận chuyển, thực hành kỹ thuật nuôi cấy và tình trạng sử
dụng kháng sinh trước khi thu thập mẫu. Thời gian trong kỹ thuật nhuộm gram
là quan trọng, giá thành rẻ nhưng chỉ cho phép xác định hình thể, tính chất bắt
mầu của tác nhân, khơng xác định được loài. Đọc kết quả của kỹ thuật ngưng
kết hạt latex phụ thuộc vào nhận định chủ quan của người đọc kết quả và có thể
rất khó nhận định, nhất là khi nồng độ vi khuẩn thấp trong máu. Nuôi cấy được
coi như tiêu chuẩn vàng xác định được nguồn gốc các thơng tin về tính nhậy
cảm kháng sinh, định nhóm huyết thanh, biểu hiện kháng nguyên là cơ sở cho
việc sản xuất vắc xin. Mẫu không sử dụng trong phân lập có thể được phân tích
bằng kỹ thuật sinh học phân tử trên cơ sở ứng dụng DNA tách chiết từ mẫu
bệnh phẩm lâm sàng (dịch tiết, máu và dịch não tủy…).
13


Phương pháp PCR không yêu cầu cần thiết vi khuẩn sống trong mẫu
bệnh phẩm và là công cụ tốt cho phát hiện tác nhân vi sinh vật từ mẫu bệnh
phẩm lâm sàng (vi khuẩn chết, hoặc đang bị ly giải do điều kiện bảo quản
hoặc trước khi sử dụng kháng sinh), cho đến nay PCR đã được xử dụng rộng
rãi trong chẩn đoán và giám sát tác nhân vi sinh vật vì có độ nhậy và độ đặc

hiệu cao, là công cụ bổ xung cho các phương pháp xác định kiểu hình khác
như: ni cấy, nhuộm gram, và ngưng kết hạt latex đề nâng cao nhận định
khẳng định kết quả.
1.4. Đặc điểm gene đích phát hiện N. meningitidis
Một vài vùng gene bao gồm: ctrA, porA, crgA và 16 SrRNA đã được
sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm PCR cơ bản [9], [22], [41]. Đặc thù
hơn nữa gene sacB và siaD đã sử dụng từ genogroup cho hầu hết :
A,B,C,W135 và Y [4], [5], [9], [16]. Tuy nhiên chúng ta biết rằng khơng có
phương pháp phân tử nào phân biệt được 12 nhóm huyết thanh của N.
meningitidis mà phát hiện chỉ bằng kháng huyết thanh.
Sự thay đổi vùng gene mã hóa capsule trong choromosome đã tạo ra
CPS khác nhau trong nhóm huyết thanh. Gene mã hóa capsule bao gồm các
vùng A, B, C, D và E:
- Vùng A và C giữa gene galE và tex trong chromosome [38]. Gene A mã
hóa tổng hợp polysaccharide.
- Vùng B là chiều ngược của vùng A hoặc xuôi của vùng C [43], gene trong
vùng B là: LipA và LipB liên quan vận chuyển và biểu hiện bề mặt của capsule.
- Vùng C bao gồm 4 gene (ctrA, -B ,-C và –D), cần thiết cho vận chuyển
capsule tới màng [43].
- Vùng D gồm có một loạt các gene (rmlA, -B, và –C, galE), không liên
quan tới biểu hiện capsule, nhưng chịu trách nhiệm tổng hợp LOS (lipooligosaccharide) [19].
- Vùng E chỉ có 01 gene, tex: điều chỉnh tổng hợp CPS [25].
14


Trình tự gene trong vùng A cho sự khác biệt riêng của từng nhóm huyết
thanh, và vùng B, C, D và E có sự bảo thủ cao giữa Nhóm huyết thanh (A; B;
C; Y; W135; X; Z; 29E) [40].
PorA (lớp 1-OMP)

Polysascharide capsule

Phân nhóm huyết thanh (VR1;VR2;VR3)

Phenotype (B:NT:NT/P1.4/NT)
PCR phát hiện Nm
(CtrA;CrgA).
Nhóm huyết thanh:
- SiaD (B;C;Y;W135)
- mynB (A)

PorB (lớp 2 hoặc 3 OMP)

Dịch tễ học phân tử:

Nhóm huyết thanh

MLST; PorA;fetA

Hình 1.8: Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N. meningitidis
Hai gene đích đặc hiệu cho lồi N. meningitidis (CtrA và sodC) đây là
gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào. Gene CtrA có tính bảo thủ cao và
thường được sử dụng trong các phản ứng PCR [43] nó là gene trong vùng mã
hóa capsule (Hình 2), Tuy nhiên khơng dưới 16% mất CtrA ở người mang
mầm bệnh không triệu chứng [16], [20], [50] Thử nghiệm gene đích khơng
làm biến đổi Cu, Zn và muối Ca, đó là gene SodC, khơng thuộc vùng gene mã
hóa capsule, thử nghiệm SodC trực tiếp phát hiện vỏ của cầu khuẩn
(encapsuleated), nhưng nó hồn tồn được sử dụng cho phát hiện cầu khuẩn
màng não ở người mang mà ở đó khơng có gene CtrA, đó là lý do cần thiết
gene SodC bổ xung trong phát hiện N. meningitidis

15


Gene PorA: N. meningitidis lớp 1- OMP (protein màng) là kháng
nguyên phân biệt phân nhóm huyết thanh (KN dự tuyển vắc xin) [30], [58].
Xác định trình tự nucleotide của các phần trong gene porA có sự thay đổi
vùng (VRs), VR1 và VR2.
1.5. Đặc điểm gene đích (gen đặc hiệu) xác định nhóm huyết thanh
của N. meningitidis
N. meningitidis được phân chia thành 12 nhóm huyết thanh trên cơ sở
cấu trúc hóa học và dạng liên kết của các đơn vị saccharide của
polysaccharide capsule mà nó biểu hiện trên bề mặt vi khuẩn. Các nhóm
huyết thanh là ngun nhân gây bệnh chính bao gồm: A, B, C, Y và W135, có
cấu trúc là poly-α1-6 kết nối N-acetylmannosamine 6- phosphate capsule
[38]. Các vụ dịch N. meningitidis bùng phát do nhóm huyết thanh X, chúng
biểu hiện capsule là poly-α1-4- nối N-acetylglucosamine 1-phosphate [8] đã
được nghiên cứu và thơng báo [3], [26]. Nhóm huyết thanh D là khơng được
sắp xếp vào nhóm huyết thanh của N. meningitidis.
Gene sia tổng hợp sialic axit [22], [29], được gọi là Syn tổng hợp capsule
[27], [61], được sử dụng cho genotype và nhóm huyết thanh B(synD), C (synE),
Y (synF) và w135 (syn G). Gene sacB là gene đích cho nhóm huyết thanh A và
gene xcbA mã hóa capsule polymerase là gene đích cho nhóm huyết thanh X [3],
[43]. Các gene đích được miêu tả trong cấu trúc tổng hợp capsule cho nhóm
huyết thanh A, B, C, Y, w135 và X (Sơ đồ 1). Hầu hết các mồi phù hợp sử dụng
trong giải trình tự, cho xác định nhóm huyết thanh bằng multiplex-PCR, realtime
PCR (bảng 1.2). Các gene biểu hiện capsule được xác định trong 4 operon: 01
trong số đó mã hóa tổng hợp capsule (được gọi là gene syn hoặc sia, phụ thuộc
vào hệ thống danh pháp sử dụng) và 03 trong 4 operon mã hóa capsule vận
chuyển đến protein bề mặt tế bào (ctr). Sản phẩm của gene Ctr tương tự ATP

16


vận chuyển trong ABC lồi [25] và có tính bảo thủ cao trong nhóm huyết thanh
là nguyên nhân gây bệnh. Các thử nghiệm PCR đối với gene đích ctr là gene đầu
tiên trong operon vận chuyển capsule đã được phát triển để phát hiện N.
meningitidis encapsule và 1 số non-encapsule (nongroupable) [18], [43] , mặc dù
vậy thêm 01 gene đặc hiệu và nhậy trong thử nghiệm PCR đó là gene sodC. Sự
khác biệt trong hệ gene mã hóa tổng hợp capsule của N. meningitidis, thì nhóm
huyết thanh là cơ sở dễ ràng xác định các gene đặc hiệu tổng hợp capsule và
xác định genotype của Nm [43].
Hiện nay có một số hệ thống khác nhau đặt tên cho gene mã hóa tổng
hợp capsule cho N. meningitidis. Một số nhóm gọi operon Syn cho tổng hợp
capsule [27], [61] , nhóm khác sử dụng sia đặt tên cho tổng hợp sialic axit
[22], [29], một số khác gọi là nu gene trên cơ sở tương đồng gene E. coli K1
đối với tổng hợp acetylneuraminic axit [27]. Trong khi gene siaD cho nhóm
huyết thanh B, C, w135 và Y đầu tiên có sự tương ứng cao. Gene synD và
synF cho phép phát hiện nhóm huyết thanh B và C, tách biệt và tương ứng mã
hóa capsule, nhưng có sự khác biệt trong sự kết nối của sialic axit (α2 đến 8
kết nối là cho nhóm huyết thanhB và α2 đến 9 kết nối cho nhóm huyết
thanhC). Tuy nhiên gene Y và w135 là gấp 02 lần kích thước của gene cho
B,C trong phân tích giải trình tự gene [17], [60], do đó 02 nhóm huyết thanh
này có tương đồng cao về gene. Hơn nữa Y và w135 kết nối không đồng nhất
trong sialic axit và có cộng thêm glucose hoặc galactose.

17