(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

BÙI THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ
GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU

Chuyên ngành : Hố Phân Tích
Mã số

: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội – Năm 2015


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN!

Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tơi đã hồn thành luận văn cao học
của mình với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số glycoside tim
trong dược phẩm và dược liệu” dƣới sự hƣớng dẫn, chỉ bảo của PGS.TS Nguyễn
Văn Ri và các thầy cô, anh chị em, các bạn trong bộ mơn Hóa phân tích.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Văn Ri, ngƣời đã giao đề tài và tận tình chỉ dẫn tơi trong q trình hồn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quý Thầy Cơ trong bộ mơn hóa Phân tích
và khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt q trình làm luận văn.
Tơi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Cơng Tuấn –
phịng máy HPLC đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình hồn thành luận văn.
Cuối cùng tơi cũng xin chân thành cảm ơn tồn thể các anh chị, các bạn
trong phịng thí nghiệm Hố phân tích, các bạn cao học K23 đã giúp đỡ tôi trong
thời gian thực hiện đề tài.


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN! ............................................................................................................1
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim. ..............................................3
1.1.1. Cấu tạo, tên gọi. .................................................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng của các hợp chất glycoside tim ...................................................... 9
1.1.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng ............................................................... 9
1.1.4. Tính chất của glycoside tim.............................................................................10
1.1.5. Phân bố trong tự nhiên ......................................................................................12
1.1.6. Một số loại thuốc chứa glycoside tim. ..........................................................13
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin ..................................................................13
1.2.1. Digoxin .................................................................................................................14
1.2.2. Digitoxin ...............................................................................................................15
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim ......................................................15
1.3.1. Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim ................................................15
1.3.2. Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim ..................................................17
1.3.3. Phƣơng pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực .........20
1.3.4. Phƣơng pháp định tính và định lƣợng. .........................................................21
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................................23
2.1. Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu ................................................................23
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu ..........................................................................................23
2.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................................23
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị .........................................................................24
2.2.1. Chất chuẩn............................................................................................................24
2.2.2. Hoá chất ................................................................................................................24
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................24

2.3. Phƣơng pháp phân tích ...................................................................................25
2.3.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu....................................................................................25


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

2.3.2. Phƣơng pháp phân tích. ....................................................................................26
2.4. Thực nghiệm...................................................................................................26
2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ƣu .................................................................................26
2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn.....................................................................................27
2.4.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng. .................................................27
2.4.4. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................................................................29
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................30
3.1. Tối ƣu hoá các điều kiện chạy sắc ký.............................................................30
3.1.1. Van bơm mẫu ......................................................................................................30
3.1.2. Cột tách .................................................................................................................30
3.1.3. Detector .................................................................................................................31
3.1.4. Bƣớc sóng hấp thụ cực đại của các glycoside tim .....................................31
1.1.5. Khảo sát và chọn thành phần pha động và tốc độ dòng...........................32
3.1.6. Khảo sát độ lặp lại của thiết bị .......................................................................39
3.1.7. Điều kiện tối ƣu cho q trình phân tích các glycoside tim ...................40
3.2. Đƣờng chuẩn các glycoside tim ....................................................................42
3.2.1. Khảo sát sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất .............................42
3.2.2. Dựng đƣờng chuẩn..............................................................................................43
3.2.3 . Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ..................................................45
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích ..................................................................46
3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích .........................................46
3.3.2. Đánh giá hiệu suất thu hồi của phƣơng pháp ............................................47

3.4. Phân tích mẫu thực tế .....................................................................................48
KẾT LUẬN ...............................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................52
Tiếng Việt:.................................................................................................................53
Tiếng Anh:.................................................................................................................53


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 3.1: Phổ UV của 2 glycoside tim .....................................................................32
Hình 3.2: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau ......37
Hình 3.3: Sắc đồ tách các glycoside tim ở các tốc độ dòng pha động khác nhau.....38
Hình 3.4: sắc đồ của digoxin ở điều kiện tối ƣu. ......................................................40
Hình 3.5: Sắc đồ của digitoxin ở điều kiện tối ƣu. ...................................................41
Hình 3.6: Sắc đồ tách các chất glycoside tim ở ở điều kiện tối ƣu. ..........................42
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn của 02 glycoside tim nghiên cứu trong luận văn................45
Hình 3.9: Sắc đồ của mẫu thực .................................................................................51


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21] .........................6

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn glycoside tim ............................................24
Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động của digoxin .........................................................34
Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động của digoxin......................................................34
Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động của digitoxin .......................................................35
Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động của digitoxin ...................................................35
Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu của các Glycoside tim. .......................................39
Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc của các Glycoside tim .........................................40
Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn .....................................................................44
Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc của các glycoside tim .........................44
Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của các Glycoside tim ..........45
Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp ................46
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi của các glycoside tim .................................................48
Bảng 3.13: Kết quả thu đƣợc của mẫu 1 ...................................................................49
Bảng 3.14: Kết quả thu đƣợc của mẫu 2 ...................................................................49
Bảng 3.15: Kết quả thu đƣợc của mẫu 3 ...................................................................49


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ACN: Acetonitrin
DD: dung dịch
HPLC: High performance liquid chromatography
LC-MS: liquid chromatography – spectrometry
LOD: Limit of detection
LOQ: Limit of quantity
RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography

RSD: Relative standard deviation
PDA: Photo-diode – array
SD: Standard deviation
UV: Ultraviolet
UV- VIS: Ultraviolet visible


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

MỞ ĐẦU
Ra đời từ rất sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào
cuối thế kỉ 20. Vào những năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh và đã đạt đƣợc
những thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc các hỗn hợp các chất cực kì giống nhau nhƣ
các nguyên tố đất hiếm, các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu.
Ngày nay rất nhiều cải tiến đã đƣợc thực hiện để nâng cao độ nhạy của
phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao. HPLC (sắc kí
lỏng hiệu năng cao) là một kỹ thuật không thể thiếu trong phân tích để quản lí một
mảng các chất phân tích mà phƣơng pháp khác không thể đáp ứng đƣợc. Với việc
áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ khơng phân cực nhƣ: các
chất thơm PAHs, các axit béo, các dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), các
mẫu sinh học trong phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline,..) đến phân cực
nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí
lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có
độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao và hiệu quả tách cao, pic cân đối. Thêm vào đó pha
động thƣờng là hỗn hợp của nƣớc và các dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế.
Đây là một phƣơng pháp rất thành công [6,7].
Glycoside tim là một nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng trong y học bởi bác sĩ
ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, và hiện nay glycoside tim có một vị trí quan

trọng trong thuốc điều trị bệnh tim. Trong số rất nhiều loại glycoside tim có trong tự
nhiên thì digoxin và digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị suy tim sung
huyết, loạn nhịp tim và đƣợc nghiên cứu nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên các các
chất glycoside tim thƣờng rất độc, nếu sử dụng quá hàm lƣợng cho phép dẫn đến
ngộ độc, thậm chí dẫn tử vong cho con ngƣời [18]. Chính vì thế cần xác định chính
xác hàm lƣợng của các glycoside tim trong các loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt
hiệu quả cao không sử dụng quá liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đang
rất đƣợc chú trọng.

1


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yêu cầu đặt ra là phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng các glycoside tim
trong dƣợc liệu, dƣợc phẩm một cách nhanh chóng và chính xác nhất. Việc ứng
dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc và dƣợc phẩm đã đƣợc làm nhiều trên
thế giới nhƣng ở Việt Nam vẫn còn tƣơng đối mới mẻ và chƣa có nhiều cơng trình
về lĩnh vực này.
Chính vì lí do trên chúng tơi xin lựa chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu
phương pháp định lượng một số glycoside tim trong dược phẩm và dược liệu”.
Trong đề tài này tôi sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép
nối detector PDA để định lƣợng một số glycoside tim trong dƣợc phẩm và dƣợc liệu.

2


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Khái quát chung về các hợp chất glycoside tim.
1.1.1.

Cấu tạo, tên gọi.

Glycoiside tim cũng nhƣ các glycosid khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần:
aglycon và phần đƣờng [9].
a) Phần aglycon: có thể chia làm 2 phần:
Nhân hydrocarbon và mạch nhánh (vịng lacton).
* Nhân hydrocarbon
Nhân hydrocarbon có cấu trúc steran: 10, 13-dimethyl cyclopentanoper
hydrophenanthren. Đính vào nhân này có các nhóm chức oxy.

1
2
3

19

9

10

A
4

11

5

B

12

18

13

C

8

17

D
14

16
15

7

6

Ở C-3 ln ln có đính nhóm OH, hầu hết các chất có trong cây đều hƣớng β,
trừ một vài chất ví dụ carpogenin, carpogenol, epidigitoxigenin có OH C-3 hƣớng α.

Ở C-14 của hầu hết các glycosid tim có tác dụng sinh học đều có nhóm OH
hƣớng β. Một vài chất khơng có nhóm OH này do trong q trình thủy phân hoặc
do sắc ký cột có xẩy ra sự dehydrat hóa tạo thành nối đơi ở C 14-15. Tuy nhiên, có

3


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

một số chất do bản chất tự nhiên khơng có nhóm OH này nhƣ các chất diffugenin,
strophanthilin A, β-anhydro-uzarigenin.
Sự oxy hóa (gắn nhóm OH hoặc carbonyl) cịn có thể xảy ra thêm ở các vị trí
nhƣ 1, 5, 11, 12, 16, 19. Mức độ oxy hóa ở C-19 có thể là CH2OH, CHO, COOH.
Các chất có mức độ oxy hóa khác nhau này thƣờng cùng tồn tại trong cùng một cây.
Chất G-strophanthidin có đến 6 OH trong phần aglycon. Nhóm OH có thể bị acyl
hóa ví dụ oleandrigenin, gitalixigenin. Có trƣờng hợp các nhóm OH gần nhau
tƣơng tác với nhau để tạo nhóm chức epoxy, ví dụ adynerin. Nhóm OH ở C-11 có
thể tác dụng với COOH ở C-19 để tạo thành vịng lacton ví dụ chất sarmentosigenin
E có trong Strophanthus sarmentosus.
* Vịng lacton
Phần glycon của glycosid tim ngồi khung hydrocarbon nói trên, đặc biệt cịn
có một vịng lacton nối vào vị trí C-17 của khung. Vòng lacton này đƣợc coi là
mạch nhánh.

Hầu hết các chất có tác dụng sinh học đều có vịng lacton ở hƣớng β. Một số
ít ở hƣớng α do enzym epimerase có mặt trong cây chuyển hóa mà thành. Có hai
loại vịng lacton: loại thứ nhất có 4 carbon với một nối đơi ở vị trí α-β, những
aglycon nào có vịng lacton này thì có 23 carbon và đƣợc xếp vào nhóm

4


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

“cardenolid”. Loại thứ hai có 5 carbon có 2 nối đơi (vịng γ-pyron hay coumalin),
những aglycon nào có vịng lacton này thì có 24 carbon và đƣợc xếp vào nhóm
“bufadienolid” (do chữ bufo = cóc, dien = 2 nối đơi. Trong nhựa cóc có các chất có
cấu trúc hồn tồn giống nhƣ aglycon của nhóm này, ví dụ bufotalin).
Các glycosid tim trong thiên nhiên thƣờng là loại cardenolid; một số ít thuộc
loại bufadienolid nhƣ scillaren A có trong Hành biển (Urginea martima L.) hellebrin
có trong cây Helleborus niger L.
b) Phần đƣờng
Phần đƣờng trong glycosid tim nối vào OH ở C-3 của aglycon. Cho đến nay
ngƣời ta biết khoảng 40 loại đƣờng monosaccharid khác nhau trong các glycosid
tim. Ngồi những đƣờng thơng thƣờng nhƣ D-glucose. L-rhamnose, D-xylose, Dfucose có gặp trong những nhóm glycosid khác, cịn lại là những đƣờng đặc biệt của
glycosid tim. Trong các đƣờng này, đáng chú ý là các đƣờng 2,6-desoxy. Dƣới đây
là một số đƣờng 2,6-desoxy làm ví dụ.

Các đƣờng 2,6-desoxy có những đặc tính sau: dễ bị thủy phân, cho phản ứng
màu với thuốc thử Keller-Kiliani và thuốc thử xanthydrol.
Mạch đƣờng có thể là monosaccharid hoặc oligosaccharid. Gitoxin
cellobiosid trong Digitalis tía có mạch đƣờng với 5 đơn vị đƣờng đơn:
Gitoxincellobiosid = Gitoxigenin + (digitoxose)3 + (glucose)2

5

Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Ngƣời ta nhận thấy rằng ở glycosid tim glucose bao giờ cũng ở cuối mạch
(xa aglycon) [9].
Dƣới đây là tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim.
Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo của một số glycoside tim [21]
TT

Tên gọi

1

G -strophathin

Công thức cấu tạo

M
(g/mol)

584

2

872

Kstrophanthoside

550
3

Convallatoxin

4

K- trophanthin-

405

6


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

5

Oleandrin

576

6

Cymarin

548

7

Digoxin

780

8

Digitoxin

9

Lanatoside A

969

985
10

Lanatoside B

7


Luận văn thạc sĩ

11

Lanatoside C

12

Gitoxin

Bùi Thị Tâm

985

780

806
13

Acetyldigitoxin

823
14

Acetyldigoxin

15

Neriantin
873

8


Luận văn thạc sĩ

1.1.2.

Bùi Thị Tâm

Tác dụng của các hợp chất glycoside tim

Glycosid tim là những glycosid steroid có tác dụng đặc biệt lên tim, đặc biệt là
digoxin và digitoxin. Ở liều điều trị có tác dụng cƣờng tim, làm chậm nhịp tim và điều
hòa nhịp tim. Các tác dụng trên đƣợc gọi là tác dụng theo quy tắc 3R của Potair:
Renforcer

= cƣờng.

Ralentir

= chậm .

Regulariser = điều hoà.
Nếu quá liều sẽ gây nôn làm chảy nƣớc bọt, mờ mắt, tiêu chảy, yếu các cơ,
loạn nhịp tim, và có thể gây tử vong. [9, 21].
Glycoside tim còn đƣợc gọi là glycoisid digital vì glyciside của lá cây
Digitalis đƣợc dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim [9].
1.1.3.

Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng

Phần quyết định tác dụng lên tim của glycosid tim là phần aglycon bao gồm
nhân steroid và vòng lacton chƣa bão hòa. Cả hai phần đều quan trọng:
- Nếu vẫn giữ vòng lacton nhƣng thay nhân steroid bằng nhân benzen,
naphtalen… tác dụng lên tim sẽ mất.

- Nếu vẫn giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton nhƣ: bão hịa nối
đơi, mở vịng, thay vịng lacton bằng vịng lactam thì tác dụng mất hoặc giảm đi rất
nhiều.
Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng, ruột, phụ thuộc vào số lƣợng nhóm OH của
phần aglycon, nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó. Digitoxin dễ hấp
thu qua đƣờng tiêu hóa, tái hấp thu qua thận, gan và có tính tích lũy trong cơ thể vì
aglycon (digitoxigenin) chỉ có 2 nhóm OH. Ouabain có nhiều nhóm OH tự do trong
phần aglycon nên khó hấp thu qua đƣờng tiêu hóa (nên phải dùng qua đƣờng tiêm
tĩnh mạch) và thải trừ nhanh.

9


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Nhóm OH ở C-14 rất quan trọng, thiếu nhóm này tác dụng trên tim sẽ giảm
đi rất nhiều.
Nhóm OH ở C-3 hƣớng α cũng làm giảm tác dụng. Qua q trình chuyển hóa
trong cơ thể, β-OH ở vị trí C-3 bị epimer hóa sang α-OH để thải ra ngồi.
Thí nghiệm trên súc vật cho thấy một số cardenolid khi đƣa vào cơ thể sẽ
đƣợc gắn thêm OH ở C-12 chuyển thành chất có tính phân cực hơn để dễ thải ra
ngồi.
Dung hợp giữa các vịng của nhân steroid cũng ảnh hƣởng đến tác dụng của
glycosid tim: C/D cấu hình cis có tác dụng quyết định lên tim. A/B trans giảm tác
dụng 10 lần so với dẫn chất cis tƣơng ứng.
Vòng lacton hƣớng α cũng giảm tác dụng lên tim.
Ở dạng aglycon, hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất
cardenolid tƣơng ứng. Trong hai nhóm cardenolid và bufadienolid thì nhóm đầu

đƣợc sử dụng nhiều hơn. Nhóm bufadienolid hay gây tác dụng phụ.
Phần đƣờng ít có ảnh hƣởng đến tác dụng của glycosid tim, chủ yếu là ảnh
hƣởng đến độ hòa tan, hấp thu và thải trừ của glycosid tim [9,21].
1.1.4.

Tính chất của glycoside tim

* Tính chất vật lí
Glycosid tim là những chất kết tinh đƣợc, một số ở dạng vơ định hình hoặc
lỏng sánh. Đa số khơng mầu, một số có màu (anthraglycosid đỏ, da cam flavonoid
glycosid màu vàng). Chúng có vị đắng, có năng suất quay cực.
Độ tan: Phụ thuộc vào mạch đƣờng dài hay ngắn và các nhóm ái nƣớc trong
phần aglycon. Glycosid thƣờng tan trong nƣớc, ROH, hỗn hợp cồn – nƣớc,..Tan ít
trong Clorofom,…không tan trong dung môi hữu cơ phân cực kém nhƣ :ether,
benzen,…
* Tính chất hố học

10


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Glycosid tim có đƣờng 2-desoxy sẽ rất dễ bị thủy phân khi đun với acid vô
cơ 0,05N trong methanol 30 phút, trong khi những glycosid khác trong điều kiện đó
khó bị thủy phân.
Glycosid tim dễ bị thủy phân bởi các enzym. Các enzym, thƣờng có sẵn
trong cây, có khả năng cắt các đơn vị đƣờng cuối mạch (xa aglycon) thƣờng là
glucose để chuyển thành các glycosid thứ cấp nhƣ enzym digilanidase trong

lá Digitalis lanata, digipurpidase trong lá Digitalis purpurea, strophanthobiase trong
hạt Strophanthus courmontii, scillarenase trong Urginea maritima.
Vòng lacton 5 cạnh hay 6 cạnh dễ bị mở bởi tác dụng của kiềm rồi tạo thành
dẫn xuất iso không tác dụng. Dƣới đây là cơ chế tạo thành dẫn xuất iso của nhóm
cardenolid [9].

Vịng lacton 5 cạnh còn phản ƣ́ng với các dẫn chấ t nitro (thơm), tạo các sản
phẩ m màu dùng để đinh
̣ tiń h, Glycosid tim + nitro (thơm) (OH‾) màu. Ví dụ:
- Phản ứng Raymond – Marthoud:
NO2

Glycosid tim +

NaOH
NO2

11

Tím khơng bền → xanh dƣơng


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

- Phản ứng Kedde:

NO2
Glycosid tim +

COOH

NaOH

Màu đỏ tía

NO2
- Phản ứng Baljet:
NO2

Glycosid tim +

OH

NO2

NaOH

màu cam

NO2

- Phản ứng Legal:

Glycosid tim + Na2{Fe(CN)5}NO
1.1.5.

NaOH

Màu đỏ

Phân bố trong tự nhiên

Ngƣời ta tìm thấy glycosid tim trong các họ thực vật: Apocynaceae,
Asclepiadaceae, Celastraceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, Leguminosae, Liliaceae,
Meliaceae, Moraceae, Ranuculaceae, Scrophulariaceae, Sterculiaceae và Tiliaceae.
Glycosid tim có thể gặp trong mọi bộ phận của cây: lá, hoa, vỏ thân, rễ, thân rễ, dò,
nhựa mủ.
Ngƣời ta cịn phát hiện thấy glycosid tim có mặt trong một số côn trùng nhƣ
bƣớm và sâu bƣớm nữ hoàng thƣờng sống trên cây Asclepias syriaca; hoặc
rệp Aphis nerii sống trên cây Asclepias curassavica. Chúng thu nhận cardenolid từ
cây để làm chất bảo vệ chống kẻ thù ăn thịt. Tuy nhiên gần đây ngƣời ta phát hiện
các loài bọ cánh cứng Chrysolina spp. thu nhận các sterol từ thức ăn thực vật rồi
tổng hợp thành glycosid tim. Ngƣời ta phát hiện 14 glycosid mới có các đƣờng
hiếm nhƣ lyxose, allose, ribose và một aglycon mới trong loại bọ nói trên [9].

12


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Digoxin và digitoxin là hai glycoside tim đƣợc chiết xuất từ cây mao địa
hoàng (D. purpurea và D. lanata), đây là lồi cây có xuất xứ từ miền Tây châu Âu.
Trong lịch sử dƣợc, cây mao địa hoàng nổi tiếng là khám phá của William
Withering, một bác sĩ ngƣời Anh ở thế kỷ XVIII. Ngày nay cây mao địa hồng có
nhiều lơng tơ (D. lanata) là nguồn cung cấp glycosides tim.
Trong một số tài liệu [9, 19] và rất nhiều tài liệu khác cho biết trong cây trúc

anh đào cũng chứa một số glycoside tim. Đây là loại cây đƣợc trồng hoặc mọc
hoang rất nhiều ở nƣớc ta.
1.1.6.

Một số loại thuốc chứa glycoside tim.

Hiện chỉ còn digoxin và digitoxin đƣợc dùng ở lâm sàng trong điều trị bệnh
tim. Vì vậy chỉ cịn một số loại thuốc chứa hoạt chất Digitoxin và digitoxin còn lƣu
hành trên thị trƣờng. Các thuốc loại này đều có 3 đặc điểm chung:
Tất cả đều có nguồn gốc từ thực vật: các lồi Digitalis, Strophantus. Có cấu trúc hố
học gần giống nhau: đều có nhân steroid nối với vịng lacton khơng bão hòa ở C17,
gọi là aglycon hoặc genin, và đều có tác dụng chống suy tim. Vị trí C3 nối với một
hoặc nhiều phân tử đƣờng(ose), khơng có tác dụng dƣợc lý nhƣng ảnh hƣởng đến
dƣợc động học của thuốc [9].
1.2. Khái quát về digoxin và digitoxin
Trong số rất nhiều loại glycoside tim có tác dụng mạnh lên tim thì digoxin và
digitoxin là hai hoạt chất hiện nay đƣợc dùng phổ biến nhất trong điều trị bệnh tim
(suy tim sung huyết và loạn nhịp tim), chúng đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣợc
sử dụng rộng rãi nhất trong các loại glicoside. Nếu không điều chỉnh phù hợp đƣợc
liều lƣợng sử dụng có thể dẫn đến tử vong. Đối với digoxin liều lƣợng điều trị cho
phép từ 0,5 đến 3,0 ng/lit và thời gian bán thải từ 20 đến 60 giờ [18].
Đây cũng là hai chất mà chúng tơi phân tích, nghiên cứu trong bản luận văn
này.

13


Luận văn thạc sĩ

1.2.1.

Bùi Thị Tâm

Digoxin

Cơng thức: C41H64O14 (780,95)

Tính chất vật lý:
-

Là chất kết tinh không màu

-

Tan trong cồn, pyridin, hay hỗn hợp chloroform – alcolhol, tan nhiều
trong cồn nóng 80%,..

-

Độ tan trong nƣớc 64,8 mg/L ở 25 °C và điểm nóng chảy ở 249 °C.

-

Khơng tan trong ete, axeton….

Dƣợc tính:
- Là chất độc bảng A
- Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hồng (Digitalis). Nó
đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị các tình trạng tim khác nhau, và có hai tác động
riêng biệt lên tim.

+ Digoxin ức chế bơm Na+-K+ ATPase ở màng tế bào cơ tim (myocyte).
Điều này làm tăng nồng độ ion natri trong tế bào cơ tim và dẫn đến tăng nồng
ion canxi. Nồng độ canxi tăng làm tăng tính co bóp của cơ tim.
+ Digoxin làm tăng sức bóp cơ tim và giảm tính dẫn truyền xung điện
qua nút nhĩ thất,do đó thƣờng dùng trong điều trị suy tim, kiểm soát nhịp tim trong
rung nhĩ, cuồng động nhĩ, nhịp nhanh kịch phát trên thất[1,2].

14


Luận văn thạc sĩ

1.2.2.

Bùi Thị Tâm

Digitoxin

Cơng thức: C41H64O13 (764,95)

Tính chất vật lý:
- Digitoxin là chất kết tinh không màu,
- Tan tốt trong cồn, chloroform, …
- Tan ít trong nƣớc (1gam/100 lít ở 20oC)
- Khơng tan trong dung mơi hữu cơ benzen, ether….
Dƣợc tính:
Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hoàng (Digitalis).
- Là chất độc bảng A
- Có cấu trúc và hiệu ứng tƣơng tự nhƣ digoxin.
1.3. Các phƣơng pháp xác định glycoside tim

1.3.1.

Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim

Phƣơng pháp sắc kí để nghiên cứu các glycoside tim rất đƣợc quan tâm, vì:
thứ nhất các glycoside tim là các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng ngày
càng gia tăng trong thuốc, thứ hai, chúng còn đƣợc nghiên cứu về cấu trúc và thể
tích lƣu trong sắc kí. Hơn nữa điều kiện tối ƣu tách các glycoside cũng đƣợc quan tâm.
F.erni và R.W.Frei đã đƣa ra quy trình tách các glycoside tim trong thuốc
bởi sắc kí pha ngƣợc, với điều kiện: cột pha ngƣợc C18, kích cỡ hạt 10m, dài 30
cm, ID 3,5mm, pha động là 37% acetonitrin trong nƣớc, tốc độ dòng pha động 1,4
ml/phút, thể tích vịng mẫu 25l, detector đặt ở bƣớc sóng 220nm. Thời gian phân
tích là 25 phút [14]. Youichi fujii, Hitomi fukuda, Yumiko Saito và Mitsuru

15


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

Yamazaki đƣa ra quy trình tách và định lƣợng các glycoside tim trong thuốc bằng
phƣơng pháp micro – HPLC với điều kiện: Cột Jasco SC-01 (165x0,5mm I.D), pha
động acetonitrin – methanol – nƣớc bằng 1:1:1, tốc độ dòng 4 l/phút, detector UV
đặt ở 220 nm, thể tích vịng mẫu 0,1l. Thứ tự ra khỏi cột là: digoxin, lanatoside B,
gitoxin, lanatoside A, digitoxin, thời gian tách thay đổi trong khoảng 30 đến 45 phút
[22]. Nhóm tác giả Youichi fujii, Hitomi fukuda, Yumiko Saito và Mitsuru
Yamazaki cũng đƣa ra quy trình xác định glycoside trong lá cây digitalis purpurea.
Trong bài báo này, các glicoside đƣợc tách bằng phƣơng pháp HPLC với điều kiện:
cột 5-C8-U, pha động acetonitrin – methanol – nƣớc (4:4:5), tốc độ dòng

0,5ml/phút, detector UV đặt ở bƣớc sóng 220 nm, thể tích vồn mẫu 10 l., Thứ tự
ra khỏi cột là: gitoxin, gitatoxin, digitoxin… thời gian phân tích mẫu 30 phút [23].
Belachew desta, E.Kwong và K.M.McErlane cũng đề cập đến việc xác định và tách
các glycoside tim. Trong bài báo này, 9 glycoside tim đựơc tách bởi phƣơng pháp
HPLC với điều kiện: cột C18, dung môi pha động nƣớc – methanol – isopropanol –
diclomethane (47:40:9:4), tốc độ dịng 1,2ml/phút, đặt ở bƣớc sóng 220nm. Thời
gian phân tích mẫu 27 phút. Thứ tự ra khỏi cột là:

digoxigenin; digoxigenin

monodigitoxoside;

digoxin;

digoxigenin

bisdigitoxoside;

digitoxigenin;

digitoxigenin monodigitoxoside; gitoxin; digitoxigenin bisdigitoxoside; digitoxin
[11]. Digoxin và digitoxin cũng đựơc nhóm tác giả Federica Pellati, Renato Bruni,
Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti phân tích xác định và
tách trong lá cây mao địa hoàng với phƣơng pháp HPLC trên cột LiChrospher RP18 (125 mm × 4.0 mm I.D.), Zorbax SB-C18 (150 mm × 4.6 mm I.D.); SB-Aq (150
mm × 4.6 mm I.D.,); Symmetry C 18 (75 mm × 4.6 mm I.D., For the Symmetry
C18 trong điều kiện dung môi pha động là hỗn hợp acetonitrin và nƣớc, chạy
gradient từ 0- 35phút với tỉ lệ H2O/ACN là 80:20, từ phút 35 đến 40 tỉ lệ H2O/ACN
là 70:30 và tỉ lệ H2O/CAN bằng 60:40 đựơc giữ trong 3 phút, nhiệt độ cột đặt ở
20oC, thể tích bơm mẫu 10l, tốc độ dịng là 1ml/phút, detector đặt ở bƣớc sóng
220nm. Tổng thời gian phân tích mẫu là 48 phút, thứ tự ra khỏi cột: digoxigenin;

2,deacetyllanatoside C; 3,digoxigenin-bis-digitoxoside; 4,gitoxigenin; 5, digoxin; 6,

16


Luận văn thạc sĩ

Bùi Thị Tâm

lanatoside C; 7, digitoxigenin; 8, -acetyldigoxin; 9, -acetyldigoxin; 10, lanatoside
B; 11, gitoxin; 12, lanatoside A; 13, digitoxin [12]. Phƣơng pháp RP – HPLC sử dụng
detector PDA có độ nhạy và chọn lọc hơn đƣợc nhóm tác giả Kevin L. Kelly, Bruce A.
Kimball, John J. Johnston sử dụng để xác định digoxin, digitoxin và chuyển hoá của
chúng bằng, dung môi pha động H2O/ACN chạy gradien (67: 33, 77:23, 90:10, 55:45),
tốc độ dòng 1,3ml/phút, tổng thời gian phân tích mẫu là 14 phút, phát hiện chất ở bƣớc
sóng 220nm. Trong nghiên cứu này đã tách đƣợc 8 glycoside tim là
digoxigenin(1),digoxigenin monodigitoxoside (2),

digoxigeninbisdigitoxoside(3),

digoxin(4), digitoxigenin (5), digitoxigenin monodigitoxoside(6), digitoxigenin
bisdigitoxoside(7), and digitoxin (8) [15]. Theo bài báo của nhóm tác giả A.
Jedlicka, T. Grafnetterova´, V. Miller đã sử dụng phƣơng pháp HPLC với detector
UV để xác định digoxin có trong thuốc. Digoxin sau khi đƣợc chiết pha rắn đƣợc
đƣa vào phân tích với điều kiện: cột C18 (RP-18e, 5m, 125x4,0mm), pha động là
nƣớc và acetonitrin với tỉ lệ H2O/ACN = 72:28, phát hiện chất ở bƣớc sóng 118nm,
thể tích bơm mẫu là 100l, nhiệt độ cột 50oC, tốc độ dòng 1,1ml/phút [10]. Một
phƣơng pháp LC-MS/MS đƣợc dùng bởi nhóm tác giả Ralf Dieter Josephs, Adeline
Daireaux, Steven Westwood, Robert Ian Wielgosz để xác định một số glycoside
trong thuốc. Một số glycoside đƣợc xác định đồng thời

digoxin, digitoxin,

digoxigenin, desacetyl-lanatosid C, digitoxigenin, digoxigenin-tetra-digitoxoside,
gitoxigenin, lanatosid C, purpureaglycoside A, purpureaglycoside B, acetyldigoxin
and gitoxin trên cột pha ngƣợc ODS (150 mm × 2.1 mm) [17].
1.3.2.

Phương pháp khác xác định glycoside tim

1.3.2.1. Quang phổ
Trong vùng tử ngoại, nhóm cardenolid có đỉnh hấp thu cực đại 215-218 nm
và log ε khoảng 4,1; nếu trong phân tử có thêm nhóm carbonyl (ví dụ
strophanthidin) thì có đỉnh hoặc vai ở 272 -305 nm, cịn các dẫn chất bufadienolid
có đỉnh hấp thu cực đại ở khoảng 300 nm log ε khoảng 3,7.

17