Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU HEAT SHOCK PROTEIN LÊN CÁC
THÔNG SỐ MIỄN DỊCH CỦA TÔM SÚ
Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Hồng Lộc1, Nguyễn Thị Hiền1, Võ Hồng Phượng1
TÓM TẮT
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly
trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được
kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng
492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR. DnaK được ly trích từ chủng vi khuẩn E. coli có khả
năng biểu hiện DnaK gắn với hexahistidine sau đó được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt
từ Dynabead. Lượng DnaK ly trích được kiểm tra bằng phương pháp Bradford. DnaK sau đó được trộn
với dung dịch đệm nạp mẫu và điện di trên bản gel 10% SDS-PAGE. Gel sau khi điện di được nhuộm
với Bio-safe Coomassie stain (phản ứng SDS-PAGE) hoặc chuyển qua màng lai cho phản ứng với kháng
thể đặc hiệu cho DnaK (phản ứng Western Blot). Tơm sú có trọng lượng trung bình 10-12g được tiêm
với các liều khác nhau của DnaK (2, 4, 6, 8, 10 hoặc 15µg/tơm), máu tơm được thu ở các thời điểm 2, 4,
7 và 10 giờ sau khi tiêm DnaK. Biểu hiện của gen prophenoloxidase được kiểm tra bằng phản ứng định
lượng real-time PCR. Tôm được tiêm với 8 hoặc 10 µg DnaK làm tăng biểu hiện của Prophenoloxidase
(proPO) tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi tiêm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức
khác (p < 0,05). Kết quả này cho phép kết luận DnaK có khả năng điều khiển đáp ứng miễn dịch trên
tơm sú.

Từ khóa: DnaK, tôm sú, HSP70, prophenoloxidase.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Heat shock protein (Protein sốc nhiệt hay
Hsp) là loại protein được sinh trong quá trình
sốc do nhiệt hoặc do các yếu tố khác như thay
đổi đột ngột các yếu tố môi trường sống (pH,
độ mặn,...). Hsp được Ritossa khám phá đầu
tiên vào năm 1962 trên ruồi dấm Drosophila

melanogaster. Tuy nhiên, mãi đến năm 1974 thì
mới có tên gọi chính thức là Hsp. Theo Lindquist
và Craig (1988), HSP được tìm thấy trên hầu hết
các cơ thể sinh vật. Hsp chiếm từ 5-10% trên
tổng protein của tế bào bình thường và có thể
tăng lên gấp 2-3 lần khi gặp phải các yếu tố gây
sốc như nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ôxy
hoặc là nhiễm bệnh (Pockley, 2003). Căn cứ trên
trọng lượng phân tử, HSP được phân làm nhiều
nhóm như Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90,...Một
trong những nhóm Hsp được nghiên cứu nhiều
là Hsp70.

Nghiên cứu gần đây cho thấy nhiệt độ gây
sốc khơng gây chết kích thích sinh ra lượng HSP
làm tăng khả năng đáp ứng với hiện tượng nhiễm
khuẩn của động vật không xương sống (Singh và
Aballay, 2006). Theo Campisi và ctv., (2003), khi
tiếp xúc với các yếu tố gây sốc mạnh sẽ làm tăng
cường Hsp72 ở chuột. Đây được xem là một dấu
hiệu báo động kích thích các phân tử NO hoạt
động để chống lại vi khuẩn và làm tăng cường
khả năng phục hồi từ nhiễm khuẩn.
Nghiên cứu trên cá hồi, Sergio và ctv.,
(2007) tìm thấy tiềm năng của Hsp như là kháng
nguyên kích thích sinh miễn dịch. Kết quả kiểm
tra bằng phản ứng ELISA cho thấy kháng thể
trong huyết thanh của cá nhiễm Piscirickettsia
salmonis cho phản ứng dương tính với Hsp được
trích từ lồi vi khuẩn này. Do đó nhóm nghiên

cứu này cho rằng Hsp có thể được sử dụng như
là vaccine để kích thích sinh kháng thể.

Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2
*Email:

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

25


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Hsp đã được nghiên cứu ở lĩnh vực bệnh
trên đối tượng thủy sản thông qua việc sử dụng
ấu trùng Artemia franciscana nuôi trong điều
kiện vơ trùng như là một mơ hình mẫu để gây
bệnh thực nghiệm với vi khuẩn. Quy trình sốc
nhiệt khơng gây chết nhưng có tác dụng kích
thích sản sinh Hsp70 ở Artemia đã được tối ưu
hóa. Cụ thể là ấu trùng Artemia nuôi ở 28°C
khi được gây sốc ở 37°C trong 30 phút sau đó
là 6 giờ cho khoảng thời gian hồi phục rồi kiểm
tra khả năng đề kháng của Artemia đã được gây
sốc với Vibrio campbellii. Kết quả cho thấy quy
trình này tăng cường khả năng kháng Vibrios
gây bệnh trên ấu trùng Artemia được gây sốc
nhiệt. Tỷ lệ sống tăng gấp đơi ở nhóm được gây
sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ rằng
Hsp70 có vai trị bảo vệ Artemia đối với tác
nhân gây bệnh (Yeong và ctv., 2007, 2008).

Ảnh hưởng của Hsp70 lên khả năng bảo
hộ của Artemia đối với Vibrio được thực hiện
thông qua việc khảo sát hàm lượng và hoạt động
của phenoloxidase (Baruah và ctv., 2010). Kết
quả cho thấy PO sinh ra sau khi cho Artemia
ăn E. coli siêu tổng hợp Artemia-Hsp70 thấp
và tương đương với nhóm chỉ cho tiếp xúc với
Vibrio. Tuy nhiên, việc kết hợp cả 2 yếu tố dẫn
đến việc tăng cường hoạt động PO, kết quả
tương thích với lượng RNA thơng tin (bằng kỹ
thuật RT-PCR). Từ các kết quả này cho thấy hệ
thống miễn dịch có thể trước tiên được hoạt hố
bằng Hsp70, sau đó được kích thích tối đa tại
thời điểm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Điều
này cho thấy khả năng đạt được tình trạng hoạt
hóa của hệ miễn dịch có thể tồn tại và là một đặc
điểm quan trọng ở vật ni thủy sản. Quy trình
hoạt hóa hệ thống miễn dịch lần đầu tiên được
thực hiện trên động vật nuôi thủy sản cụ thể là
tôm sú, nếu thành cơng sẽ có khả năng ứng dụng
cho chương trình chọn giống tơm sú dựa vào
tính trạng kháng bệnh.
Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra
ảnh hưởng của protein sốc nhiệt ly trích từ vi
26

khuẩn (DnaK) lên khả năng đáp ứng miễn dịch
của tôm sú
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Ly trích và tinh sạch DnaK
DnaK được ly trích và tinh sạch từ chủng
vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK
gắn với hexahistidine. Bước đầu tiên của ly
trích DnaK là cấy E. coli từ ống giữ giống lên
đĩa thạch Luria-Bertani (LB) và ủ ở 37°C trong
24 giờ sau đó chọn khuẩn lạc và cấy tăng sinh
trên môi trường lỏng LB đến pha log (mật độ
quang OD600 nm = 0,4 - 0,6). Việc kích thích sinh
DnaK protein được thực hiện bằng cách thêm
đường L-arabinose (0,5 mg/ml) sau đó tiếp tục
ủ ở 37°C trong 4 giờ. Tồn bộ vi khuẩn tăng
sinh được chuyển qua ống falcon vô trùng ly
tâm ở 2.200g trong 15 phút, thu cặn hòa vào
dung dịch đệm Phosphate-Buffered Saline 1X
(PBS, pH = 7,2, Sigma-Aldrich). Vi khuẩn bị
làm vỡ tế bào và đồng nhất bằng dập mẫu mini
beadsbeater (Biospec, USA) rồi ly tâm ở 2.200
g trong 1 phút ở 4°C, thu dịch nổi để tinh sạch
DnaK bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt từ
Dynabeads (Dynabeadsđ His-Tag Isolation v1àl

DND/RNA free water

8,5àl

cDNA mu

2

Chu trỡnh nhit:
50oC/ 2 phút
95oC/10 phút
95oC/15 giây
60oC/1 phút
95 C/5 phút
o

35 chu kỳ

Tăng nhiệt độ từ 55oC lên 95oC trong 80
bước, mỗi bước tăng 0,5oC trong 10 giây.
Tính giá trị ∆CT gen đích = CT mẫu thử CT mẫu đối chứng (CT là số chu kỳ mà tại đó
tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua giá trị
threshold). Nếu quy trình qPCR có lặp lại thì
tính giá trị trung bình ∆CT gen đích. Thực hiện
tương tự để được giá trị trung bình ∆CT gen
tham chiếu.
Tính giá trị ∆∆CT = trung bình ∆CTgen
đích - trung bình ∆CT gen tham chiếu
Tỉ lệ biểu hiện gen (R) = 2-∆∆CT

28

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.6. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm có 7 nghiệm thức gồm một

nghiệm thức đối chứng và 6 nghiệm thức tiêm
với 6 nồng độ Hsp70 (2, 4, 6, 8, 10, 15 µg/0,2
ml/tơm). Mỗi nghiệm thức gồm 5 tơm có trọng
lượng trung bình 10-12 g ở mỗi thời điểm thu
mẫu. Thu máu tại 4 thời điểm 2, 4, 7 và 10
giờ sau khi tiêm DnaK. Thực hiện phản ứng
phenoloxidase đọc bằng quang phổ kế theo
phương pháp trình bày ở phần trên. Ngồi ra

Hình 1. Tinh sạch DnaK bằng các hạt từ
trong eppendroff
Xác định hàm lượng protein của DnaK được
tinh sạch dựa theo quy trình Quick StartTM
Bradford Protein Assay (BIO-RAD). Việc định
lượng protein trong DnaK được tinh sạch dùng

Hình 3. Chuyển bản gel sau khi điện di SDSPAGE lên màng lai để thực hiện phản ứng
Western Blot

cịn thực hiện phản ứng định lượng RT-PCR từ
máu tơm thu được.
III. KẾT QUẢ
3.1. Ly trích DnaK
DnaK được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác
dụng của các hạt từ Dynabeads (Dynabeads®
His-Tag Isolation & Pull down, Invitrogen)
được mơ tả cụ thể trong phần phương pháp.

Hình 2. Bước cuối cùng của tinh sạch
(qua lọc và ly tâm)

làm cơ sở cho phản ứng SDS-PAGE và Western
Blot. Kết quả ly trích và tinh sạch thu được
lượng DnaK với nồng độ thơng thường từ 1-2
µg/µl.

Hình 4. Bản gel sau khi ghép với màng lai
được vào bồn điện di để thực hiện phản ứng
Western Blot

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

29


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2

Hình 5. Kết quả điện di SDS-PAGE của DnaK được sản sinh từ E. coli (1µg DnaK tinh sạch được
điện di và nhuộm với Commassie Biosafe; M = thang protein) (hình trái). DnaK được xác định
sau khi thực hiện phản ứng Western Blot (hình phải)
3.2. Ảnh hưởng của các liều DnaK lên
đáp ứng miễn dịch của tôm sú
3.2.1. Kết quả phản ứng PO assay khi
tiêm tôm sú với các liều DnaK khác nhau

với quy trình của Baruah và ctv., (2011) với quy

Kiểm tra phản ứng phenoloxidase bằng
phản ứng tạo màu đo bằng quang phổ kế ở bước
sóng 492nm. Máu tơm sau khi thu được chứa
trong eppendroff và giữ lạnh (Hình 6) sau đó

tiến hành ly tâm thu cặn tế bào và thực hiện các
bước làm vỡ tế bào như mô tả ở phần phương
pháp. Cuối cùng thực hiện phản ứng PO assay
trong cuvet (Hình 7). Trong nghiên cứu này,

Các tác giả này khi thực hiện PO assay đo OD

PO assay được tham khảo có bổ sung và so sánh

Hình 6. Máu tơm được thu và chứa trong dung
dịch kháng đơng, giữ lạnh
30

trình tương tự nhưng trên đối tượng là Artemia.
bằng máy đọc ELISA. Tuy nhiên cũng có tác
giả thực hiện phản ứng trên cuvet đơn và đo OD
bằng máy quang phổ (Sritunyalucksana và ctv.,
1999; Sung và ctv., 1998) nghiên cứu trên tôm
sú và tôm càng xanh. Về cơ bản PO assay được
thực hiện nhờ L-DOPA và dung dịch đệm (có
thể là đệm citrate hoặc Tris saline buffer).

Hình 7. Phản ứng PO assay được thực hiện
trong cuvet

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Ở thời điểm 2 giờ sau khi tiêm DnaK có

sự tăng nhẹ của phenoloxidase ở nghiệm thức
tiêm 8, 10 và 15µg protein, các liều tiêm cịn
lại có phenoloxidase tăng rất ít và khơng khác
nhiều so với đối chứng (Đồ thị 1). Khuynh
hướng này cũng được ghi nhận ở lần thí
nghiệm thứ 2 (Đồ thị 2). Ở các thời điểm 7 và
10 giờ sau khi tiêm DnaK, hầu hết các nghiệm
thức tiêm DnaK có biến động phenoloxidase
gần bằng với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm

thức tiêm 10µg DnaK có phenoloxidase tăng ở
cả 2 thời điểm thu mẫu 2 và 4 giờ. Tuy nhiên,
việc tăng giảm phenoloxidase ở các nghiệm
thức chưa có sự khác biệt rõ rệt. Chính vì vậy,
phản ứng định lượng bằng realtime PCR cần
được thực hiện để xem biến động về mặt định
lượng ở các nghiệm thức theo các thời gian
thu mẫu khác nhau như thế nào (Kết quả được
trình bày ở phần sau).

Đồ thị 1. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tơm
(thí nghiệm 1)

Đồ thị 2. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tơm
(thí nghiệm 2)

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

31

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
3.2.2. Kết quả định lượng phenoloxidase
bằng RT-PCR trên máu tôm thu sau khi tiêm
với các liều khác nhau của DnaK
Kết quả ở Đồ thị 3 cho thấy ở thời điểm 2
giờ sau khi tiêm DnaK có sự gia tăng đáng kể
(gấp 4 lần so với đối chứng) của PO ở nghiệm

thức tiêm 8 và 10 µg DnaK. Sự khác biệt này
cịn được tìm thấy ở thời điểm 4 giờ. Tuy nhiên
ở các thời điểm 7 và 10 giờ khơng tìm thấy sự
khác biệt về tỷ lệ biểu hiện mRNA ProPO ở các
nghiệm thức. Ở lần thí nghiệm thứ hai cũng cho
khuynh hướng tương tự (Đồ thị 4)

Đồ thị 3. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của
DnaK (thí nghiệm 1)

Đồ thị 4. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của
DnaK (thí nghiệm 2)

32

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
IV. THẢO LUẬN
Hsp70 là một loại protein được nhận định là

thường hiện hữu trong hầu hết các loại tế bào,
tăng mạnh khi đáp ứng với các điều kiện stress
hay yếu tố lạ và tôm sú cũng không phải là điều
ngoại lệ. Ở liều tiêm 8 và 10 μg DnaK đã kích
thích biểu hiện PO cao gấp 4 lần ở thời điểm
2 giờ sau khi tiêm. Lượng PO vẫn còn cao ở
nghiệm thức này tại thời điểm 4 giờ nhưng sau
đó giảm đáng kể ở các thời điểm thu mẫu cịn
lại. Có thể là do bản chất DnaK hay đáp ứng
miễn dịch của tôm chỉ biểu hiện và kéo dài trong
một khoảng thời gian ngắn. Ở các thời điểm sau
4 giờ có thể là do sự bình ổn của hệ miễn dịch
nên khơng thấy tăng giảm PO đáng kể.
Đã có rất nhiều nghiên cứu cho rằng HSP70
đóng vai trị như yếu tố hoạt hóa hệ miễn dịch
tự nhiên (Pockley, 2003; Tsan, 2004) cụ thể là
kích thích hoạt động của các tế bào trong hệ
miễn dịch. Nghiên cứu đầu tiên về ứng dụng
HSP70 tái tổ hợp cho thấy HSP70 có khả năng
kích thích sự sản sinh cytokines như IL-1 hay
TNF-α từ bạch cầu đơn nhân lớn ở người hay
đại thực bào ở chuột trong điều kiện in vitro
(Basu và ctv., 2002; Galdiero và ctv., 1997).
Prophenoloxidase đóng vai trị quan trọng trong
đáp ứng miễn dịch ở giáp xác. Các nghiên cứu
cho thấy ProPO có vai trị quan trọng trong cơ
chế miễn dịch chống lại các bệnh nhiễm khuẩn
hay ký sinh trùng (Cerenius và Söderhäll, 2004).
Hiện tại chưa thấy công bố nghiên cứu về
ảnh hưởng của tiêm Hsp70 lên PO trên tôm sú.

Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp của Hsp70 và vi
khuẩn Vibrio campbellii lên PO trên Artemia
đã được Baruah và ctv., (2011) nghiên cứu.
Theo nhóm tác giả này khi cho Artemia nuôi
trong điều kiện vô trùng ăn Hsp70 từ Artemia
hoặc Hsp70 được kích thích sinh ra từ E. coli
tiếp theo đó là gây nhiễm bằng V. campbellii cho
thấy tăng cường hệ thống ProPO được chứng
minh bằng mRNA và ở mức độ protein. Nghiên

cứu này cho thấy rằng Hsp70 có nguồn gốc từ
prokaryotic hay eukaryotic đều là nguồn khơi
dậy tác dụng bảo hộ miễn dịch ở Artemia chống
lại tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ
thống ProPO. Đây là một trong những nghiên
cứu đầu tiên về hoạt động hoạt hóa của Hsp70 ở
động vật khơng xương sống.
Theo Ryckaert và ctv., (2010) thì Hsp70
tái tổ hợp khi tiêm vào playfish (Xiphophorus
maculates) có vai trị kích thích miễn dịch
kháng lại tác nhân gây bệnh Yersinia ruckeri.
Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ vẫn chưa so sánh
được với vaccine.
Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức
tiêm Hsp70 liều 2, 4, 6 µg DnaK hầu như khơng
có sự khác biệt lớn về phenoloxidase so với
nhóm đối chứng ở các thời điểm thu mẫu. Theo
các nghiên cứu trước đây thì lượng PO sinh ra
có liên quan đến chu kỳ lột xác của tơm. Liu và
ctv., (2004) nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng

8,0–14,4 g ở các giai đoạn lột xác khác nhau
cho thấy tổng số tế bào máu cao nhất ở giai
đoạn sau lột xác lớp vỏ đã cứng (intermoult)
nhưng thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột xác.
Hoạt động phenoloxidase cao nhất ở giai đoạn
intermoult và thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột
xác. Hoạt động thực bào của tôm với Vibrio
alginolyticus giảm một cách đáng kể ở giai
đoạn vừa sau lột xác và giai đoạn tiền lột xác.
Trong một thí nghiệm khác, khi tiêm tôm thẻ
chân trắng ở các giai đoạn lột xác khác nhau
với 105 CFU V. alginolyticus cho thấy sau 10
giờ tiêm cho thấy tỷ lệ chết ở nhóm vừa sau
lột xác cao hơn và có ý nghĩa so với nhóm ở
giai đoạn intermoult. Sau 48-120 giờ theo dõi
cho thấy nhóm tơm ở giai đoạn vừa sau lột
xác có tỷ lệ chết cao nhất và nhóm intermoult
cho tỷ lệ chết thấp nhất. Vì vậy để loại trừ khả
năng ảnh hưởng của các giai đoạn lột xác đến
phenoloxidase sau khi tiêm với các liều khác
nhau của DnaK, trong nghiên cứu này chúng

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

33


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
tơi đã chọn lựa tôm đồng đều về giai đoạn lột
xác trước khi tiến hành thí nghiệm.

Theo Sung (2014) khi cho ấu trùng tơm thẻ
chân trắng ăn E. coli YS 2 có khả năng sản sinh
DnaK khi kích thích bằng Arabinose làm tăng
cường khả năng đề kháng khi gây nhiễm với
V. harveyi. Bằng phương pháp Realtime PCR
nhóm tác giả này tìm thấy ở nhóm cho ăn E. coli
tăng crustin mRNA gấp 7 lần so với nhóm đối
chứng. Tuy nhiên nhóm tác giả này khơng tìm
thấy sự khác biệt so với nhóm đối chứng về các
chỉ tiêu miễn dịch khác như ProPO, penaeidin,
hemocyanin và peroxinectin.
Theo kết quả nghiên cứu của Hu và ctv.,
(2014) cho thấy DnaK có khả năng kích thích
hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng.
Sau khi tiêm tôm thẻ chân trắng với DnaK
tinh sạch liều 5 µg/tơm nhóm tác giả này tìm
thấy có sự tăng có ý nghĩa thống kê đối với chỉ
tiêu transglutaminases và prophenoloxidases ở
tôm thẻ chân trắng tại thời điểm 3 giờ sau khi
tiêm DnaK. Ngoài sự tăng PO cịn có sự tăng
giảm của các gen liên quan đến miễn dịch
trên tôm thẻ chân trắng như Penaeidin (PEN),
Transgluminase (TGase-1), endogenous HSP70

34

(lvHSP70) (lv = left ventricular). Tuy nhiên,
không phải tất cả các gen điều hòa miễn dịch
đều tăng sau khi tiêm DnaK và chỉ giới hạn ở
một số và ở các điểm thời gian nhất định.

V. KẾT LUẬN
Tiêm tơm với 8, 10 µg DnaK làm tăng biểu
hiện của proPO tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi
tiêm, điều này được xác định bằng phản ứng
định lượng RT-PCR.
Kết quả kiểm tra hoạt tính của phenoloxidase
bằng phản ứng Phenoloxidase được thực hiện
trên cuvet chưa thấy sự khác biệt lớn về hoạt tính
phenoloxidase khi tiêm tơm với DnaK. Tuy nhiên
với kết quả định lượng cho thấy sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê ở một số thời điểm thu mẫu.
LỜI CÁM ƠN
Nghiên cứu này được thực hiện trong nội
dung chương trình nghiên cứu song phương
Việt Bỉ với kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa
học và Cơng nghệ Quốc gia. Nhóm tác giả
chân thành cảm ơn sự tài trợ của Quỹ cũng như
sự giúp đỡ của các giáo sư thuộc Laboratory
of Aquaculture & Artemia Reference Center
(Gent, Belgium).

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Basu, N., Todgham, A.E., Ackerman, P.A., Bibeau,
M.R., Nakano, K., Schulte, P.M., Iwama, G.K.,
2002. Heat shock protein genes and their functional

significance in fish. Gene 295: 173–183.
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P.,
2010. Efficacy of heterologous and homologous
heat shock protein 70s as protective agents to
Artemia franciscana challenged with Vibrio
campbellii. Fish & Shellfish Immunology 29:
733-739
Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., Macrae, T.H. and
Bossier, P., 2011. Primming the prophenoloxidase
system of Artemia Franciscana by heat shock
proteins protects against Vibrio campbellii
challenge. Fish & Shellfish Immunology
31(1):134-41
Cerenius, L., Soderhall, K., 2004. The prophenoloxidaseactivating system in invertebrates. Immunology
Review 198: 116–126.
Galdiero, M., de l’Ero, G.C., Marcatili, A., 1997.
Cytokine and adhesion molecule expression in
human monocytes and endothelial cells stimulated
with bacterial heat shock proteins. Infecion and
Immunity 65 (2): 699-707
Hu, B., Phuoc, L.H., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2014.
Bacterial HSP70 (DnaK) is an efficient immune
stimulator in Litopenaeus vannamei. Aquaculture,
418–419, 87–93.
Ji, P-F., Yao, C-L., Wang, Z-Y., 2009. Immune response
and gene expression in shrimp (Litopenaeus
vannamei) hemocytes and hepatopancreas against
some pathogen-associated molecular patterns.
Fish & Shellfish Immunology 27: 563-570
Lindquist, S., and Craig, E. A., 1988. The heat shock

proteins. Annual Review Genetic 22: 631-637.
Liu, C-H., Yeh, S-T., Cheng, S-Y., and Chen, J-C.,
2004. The immune response of the white shrimp
Litopenaeus vannamei and its susceptibility to
Vibrio infection in relation with the moult cycle.
Fish & Shellfish Immunology 16: 151–161
Liu, C.H., Yeh, S.P., Kuo, C.M., Cheng, W., Chou,
C.H., 2006. The effect of sodium alginate on
the immune response of tiger shrimp via dietary
administration: activity and gene transcription.
Fish & Shellfish Immunology 21:442-253.
Pockley, A. G., 2003. Heat shock proteins as regulators
of the immune response. The Lancet 362: 469476.
Pockley, A.G., 2005. Heat shock proteins as regulators
of the immune response. The Lancet 362: 469–476.

Ryckaert, J., Pasmans, F., Tobback, E., Duchateau, L.,
Decostere, A., Haesebrouck, F., 2010. Heat shock
proteins protect platyfish (Xiphophorus maculatus)
from Yersinia ruckeri induced mortality. Fish &
Shellfish Immunology 28: 228–231.
Sergio, H. M., Pablo, C., Marcela, Z., Jorge, O.,
Fernando, G., Patricio, C., and Vitalia, H., 2007.
Immunological characterization of a bacterial
protein isolated from salmonid fish naturally
infected with Piscirickettsia salmonis. Vaccine
25: 2095–2102.
Singh, V., and Aballay, A., 2006. Heat-shock
transcription factor (HSF)-1 pathway required for
Caenorhabditis elegans immunity. Proceedings

of the National Academy of Sciences USA 103:
13092-13097.
Sritunyalucksana, K., sithisarn, P., withayachumnarnkul,
B., and flegel, T.W., 1999. Activation of
prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial
activity in haemolymph of the black tiger prawn,
Penaeus monodon, by immunostimulants. Fish &
Shellfish Immunology 9: 21–30.
Sung, H.H., Chang, H.J., Her, C.H., Chang, J.C.,
Song, Y.L., 1998. Phenoloxidase activity of
hemocytes derived from Penaeus monodon
and Macrobrachium rosenbergii. Journal of
Invertebrate Pathology 71(1): 26-33.
Sung, Y.Y., 2014. Heat Shock Proteins: An Alternative
to Control Disease in Aquatic Organism. Journal
of Marine Science: Research & Development
4:e126. doi: 10.4172/2155-9910.1000e126.
Tsan, M.F., 2004. Cytokine function of heat-shock
proteins. AJP: Cell Physiology, 286, 739-744.
Yeong, Y.S., Van Damme, E. J.M., Sorgeloos, P., and
Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect
gnotobiotic Artemia franciscana larvae against
virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology
22: 318-326.
Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos,
P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic
Artemia franciscana larvae to abiotic stress
promotes heat shock protein 70 synthesis
and enhances resistance to pathogenic Vibrio
campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66.

Yeong, Y.S, Ashame, M.S., Chen, S., MacRae, T.H.,
Sorgeloos, P. and Bossier, P., 2009. Feeding
Artemia franciscana (Kellogg) larvae with
bacterial heat shock protein, protects from Vibrio
campbellii infection. Journal of Fish Diseases 32
(8): 675-685.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016

35


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

EFFECT OF DIFFERENT DOSE OF HEAT SHOCK PROTEINS ON IMMUNE
PARAMETERS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon)
Le Hong Phuoc1*, Nguyen Hong Loc1, Nguyen Thi Hien1, Vo Hong Phuong1
ABSTRACT
This study was conducted to evaluate the effect of different doses of bacterial heat shock protein
(DnaK) on immune response of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Shrimp’s immune
response was tested by carrying out phenoloxidase reaction in cuvet, then measuring OD492nm
by photospectrometer and quantification of mRNA by Real-time PCR. DnaK was extracted from
E. coli strain overexpressing DnaK with a hexahistidine-tag. After extraction DnaK was purified
by Dynabead manegtic beads. The concentration of purified recombinant DnaK was determined
by Bradford assay. DnaK sample was then combined with loading buffer and electrophoresed in
10% SDS-PAGE gels. Gels were either stained with Bio-safe Coomassie stain (SDS-PAGE) or
transferred to polyvinylidene fluoride membranes for antibody probing (Western Blot). The juvenile
P. monodon shrimp (mean body weight = 10-12g) were injected with DnaK at a dose of 2, 4, 6, 8, 10
or 15 µg shrimp-1. Haemolymph were collected at 2, 4, 7, and 10 hours post DnaK injection. The
expression of prophenoloxidases gene was monitored via quantitative RT-PCR. Shrimps injected

with 8 or 10 µg DnaK resulted in significantly increase in PO at 2 and 4 hours post injection
compared to other treatments (p < 0.05). This result suggests that DnaK is able to modulate immune
responses in P. monodon.
Keywords: DnaK, shrimp, prophenoloxidase, HSP70.

Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày nhận bài: 18/11/2015
Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015
Ngày duyệt đăng: 25/12/2015

1. Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2.
* Email:

36

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016