Bước đầu nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng enterococus faecium kháng kháng sinh
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.43 MB, 61 trang )
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ THỊ MỸ LINH
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM
BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG
Enterococcus faecium
KHÁNG KHÁNG SINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2020
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ THỊ MỸ LINH
MÃ SINH VIÊN: 1501292
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM
BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG
Enterococcus faecium
KHÁNG KHÁNG SINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Thị Hội
2. PGS.TS. Phùng Thanh Hương
Nơi thực hiện:
1.
Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương
2.
Bộ mơn Hóa sinh Trường ĐH Dược Hà Nội
HÀ NỘI – 2020
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin chân thành cám ơn sự giúp đỡ của PGS.TS. Phùng Thanh
Hương, Bộ mơn Hóa Sinh, Đại học Dược Hà Nội, người cô giáo luôn nhiệt huyết, ở bên
hỗ trợ và định hướng cho tôi rất nhiều kiến thức, phương pháp nghiên cứu và cách trình
bày đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung, Phó giám đốc Bệnh
viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu này.
Tiếp theo, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới TS. Lê Thị Hội, Trưởng phòng Nghiên
cứu phát triển, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, người cũng
giúp đỡ tôi rất nhiều về kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực nghiệm và đồng hành
cùng tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS.BS. Nguyễn Thị Hoa, Khoa
xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương cùng ThS.BS. Doãn Thế Hà, Bác
sỹ Nội trú, Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều và cho tôi những lời khuyên quý
báu trong suốt q trình nghiên cứu tại Bệnh viện.
Tơi xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm-Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương đã hỗ
trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và tiến hành thực nghiệm.
Trân trọng cảm ơn tới các thầy cơ Bộ mơn Hóa sinh, phịng Đào Tạo Trường Đại
học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi trong q trình học tập và
hồn thành khóa luận.
Cuối cùng, tơi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên và luôn
bên cạnh ủng hộ tôi.
Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Vũ Thị Mỹ Linh
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1:
1.1.
TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
Đại cương về vi khuẩn Enterococcus faecium .............................................. 3
1.1.1.
Đặc điểm vi khuẩn học ......................................................................... 3
1.1.2.
Dịch tễ và khả năng gây bệnh ............................................................... 3
1.1.3.
Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Enterococcus faecium .............. 4
1.1.4.
Dịch tễ học vi khuẩn Enterococcus faecium đa kháng........................... 9
1.2.
Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và giải trình tự tồn bộ bộ
gen (WGS) ............................................................................................................. 11
1.2.1.
Khái niệm NGS và WGS .................................................................... 11
1.2.2.
Ứng dụng NGS và WGS trong nghiên cứu vi khuẩn đa kháng ............ 12
1.2.3.
Các công cụ xử lý dữ liệu NGS .......................................................... 12
1.3.
Các nghiên cứu về đặc điểm bộ gen của vi khuẩn Enterococcus faecium.... 14
1.3.1.
Nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 14
1.3.2.
Nghiên cứu tại Việt Nam .................................................................... 16
Chương 2:
2.1.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 17
Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu ............................................................. 17
2.1.1.
Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 17
2.1.2.
Hóa chất, trang thiết bị ....................................................................... 17
2.2.
Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 17
2.2.1.
Quy trình nghiên cứu .......................................................................... 17
2.2.2.
Các chỉ tiêu nghiên cứu ...................................................................... 19
2.3.
Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19
2.3.1.
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ............................................................... 19
2.3.2.
Định danh vi khuẩn ............................................................................ 19
2.3.3.
Đánh giá độ nhạy với kháng sinh ........................................................ 20
2.3.4.
Phương pháp phân tích dữ liệu, số liệu ............................................... 21
2.4.
Vấn đề đạo đức nghiên cứu ........................................................................ 22
Chương 3:
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ..................................................... 23
3.1.
Đặc điểm cấu trúc bộ gen của chủng Enterococcus faecium ....................... 23
3.2.
Kết quả đánh giá độ nhạy với kháng sinh của các chủng Enterococcus
faecium .................................................................................................................. 24
3.3.
Kết quả các gen kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus faecium .... 27
3.4.
Sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình về kháng kháng sinh ...................... 29
Chương 4:
BÀN LUẬN ....................................................................................... 32
4.1.
Đặc điểm cấu trúc bộ gen của chủng Enterococcus faecium ....................... 32
4.2.
Kết quả đánh giá độ nhạy với kháng sinh của các chủng Enterococcus
faecium .................................................................................................................. 33
4.3.
Gen kháng kháng sinh và sự phù hợp kiểu gen kiểu hình về kháng kháng
sinh
.......................................................................................................................34
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 38
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Từ viết đầy đủ
Ký hiệu
Chú giải Tiếng Việt
ADN
Acid deoxyribonucleic
bp
base pair
Cặp base
CC
Clonal complex
Phức hệ dòng
CDC
Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm sốt và Phịng
Prevention
CLSI
ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ
Clinical and Laboratory Standards Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Xét
Institute
nghiệm Hoa Kỳ
Cs
Cộng sự
EU/EEA
European Union (EU) / European Liên minh Châu Âu
Economic Area (EEA)
ICU
Intensive care unit
Khoa hồi sức tích cực
MDRO
MuLti-Drug Resistant Organisms
Vi khuẩn đa kháng thuốc
MIC
Minimum Inhibitory Concentration
Nồng độ ức chế tối thiểu
MLST
Multilocus sequence typing
Giải trình tự đa locus
NGS
Next generation sequencing
Giải trình tự gen thế hệ mới
NST
Nhiễm sắc thể
PCR
Polymerase chain reaction
ST
Sequence type
VRE
Vancomycin resistant Enterococci
Phản ứng khuếch đại chuỗi
Cầu
khuẩn
ruột
kháng
faecium
kháng
Vancomycin
VREfm
Vancomycin resistant Enterocuccus Enterocuccus
faecium
VSE
Vancomycin
Vancomycin
susceptible Cầu khuẩn ruột nhạy Vancomycin
Enterococci
VSEfm
WGS
Vancomycin
susceptible Enterococcus
faecium
Enterococcus faecium
Vancomycin
Whole genome sequencing
Giải trình tự tồn bộ bộ gen
nhạy
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Phân loại kháng kháng sinh nhóm Glycopeptid của họ Enterococci .............. 6
Bảng 1.2 Các cơng cụ xử lý dữ liệu NGS .................................................................. 13
Bảng 3.1 Đặc điểm bộ gen của các chủng E. faecium trong nghiên cứu ..................... 23
Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ nhạy với kháng sinh của các chủng E. faecium trong
nghiên cứu ................................................................................................................. 25
Bảng 3.3 Kết quả các gen kháng kháng sinh của các chủng E. faecium trong nghiên
cứu............................................................................................................................. 28
Bảng 3.4. Sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình về kháng kháng sinh...................... 30
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Cấu trúc của cụm gen vanA, vanB ................................................................. 8
Hình 1.2 Tần suất Enterococci kháng vancomycin (VanA và VanB) theo thời gian và
theo khu vực địa lý, chương trình giám sát kháng sinh SENTRY, 1997-2016 ............ 10
Hình 2.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 18
Hình 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E. faecium trong nghiên cứu ............ 26
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn Enterococcus faecium là một trong những nguyên nhân thường gặp
nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện [9], [30]. Chúng là vi sinh vật cư trú trong đường tiêu
hóa của người, động vật và có thể gây nhiễm khuẩn mô mềm hoặc vết thương, nhiễm
khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc và nhiễm khuẩn đường tiết niệu khi vật chủ gặp các yếu
tố nguy cơ [23]. Kháng sinh vancomycin là một trong những lựa chọn đầu tay để điều
trị nhiễm khuẩn do E. faecium, đặc biệt trong trường hợp E. faecium kháng ampicillin
[43]. Tuy nhiên, sau lần đầu phát hiện tại châu Âu vào cuối những năm 1980, tình trạng
E. faecium kháng vancomycin ngày càng lan rộng trên toàn thế giới [74]. Mỗi năm, tại
Hoa Kỳ, vi khuẩn E. faecium gây ra 10.000 đến 25.000 ca tử vong và E. faecium kháng
vancomycin hiện chiếm tới 80% các chủng E. faecium phân lập ở một số bệnh viện [37].
Bệnh nhân nhiễm khuẩn do Enterococci kháng vancomycin (VRE) tăng tỷ lệ tử vong
gấp 2,5 lần so với nhiễm khuẩn Enterococci nhạy vancomycin (VSE) [17]. Năm 2017,
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công bố danh sách 12 vi khuẩn kháng thuốc cần ưu
tiên có kháng sinh mới và E. faecium kháng vancomycin được xếp vào loại ưu tiên cao
[76].
E. faecium nổi lên do sự phát triển của kháng đa kháng sinh cũng như sự tiến hóa
và đa dạng hóa nhanh chóng của nó [13]. Để kiểm sốt tình trạng kháng kháng sinh,
phát triển các kháng sinh mới hay xác định con đường lây truyền của chủng E. faecium
thì thơng tin về đặc điểm bộ gen của chúng là rất cần thiết [40], [46]. Nhờ ưu điểm về
hiệu suất, công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới đang dần thay thế cho phương pháp
giải trình tự Sanger trong giải trình tự đồng thời nhiều mẫu hoặc nhiều gen mục tiêu,
thậm chí là giải mã tồn bộ bộ gen (WGS) [39]. Với cơng nghệ giải trình tự gen thế hệ
mới, chúng ta có được những thơng tin chi tiết về cấu trúc bộ gen, từ đó tạo điều kiện
cho việc giám sát nhiễm khuẩn cũng như các biện pháp chẩn đoán và kiểm sốt thích
hợp [34].
Hiện nay, chưa có nhiều dữ liệu về E. faecium kháng vancomycin tại các nước
Đông Nam Á nói chung và Việt Nam nói riêng [10], [73]. Cho đến nay, hầu hết các dữ
liệu giải trình tự toàn bộ bộ gen của vi khuẩn liên quan đến tình trạng kháng kháng sinh
tập trung vào vi khuẩn Gram âm, có ít nghiên cứu về vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là
trên E. faecium [56], [68]. Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu dựa trên WGS để xác định
sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình về sự kháng kháng sinh của các chủng E. faecium.
1
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu đặc điểm
bộ gen của một số chủng Enterococcus faecium kháng kháng sinh” với 2 mục tiêu
như sau:
1. Mô tả đặc điểm cấu trúc bộ gen của các chủng Enterococcus faecium kháng
kháng sinh phân lập tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương.
2. Xác định các gen kháng kháng sinh, sự phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình
kháng kháng sinh của các chủng Enterococcus faecium phân lập tại Bệnh viện
Bệnh Nhiệt Đới Trung ương.
2
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1.
Đại cương về vi khuẩn Enterococcus faecium
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn học
Danh pháp
Orla-Jensen (1919) và Schleifer & Kilpper-Bälz (1984) đã đưa ra thang phân loại
chính thức cho Enterococcus faecium như sau:
Giới
Vi khuẩn
Ngành
Firmicutes
Lớp
Bacilli
Bộ
Lactobacillales
Họ
Enterococcaceae
Giống
Enterococcus
Loài
Enterococcus faecium
E. faecium là vi khuẩn gram dương khơng tan huyết hoặc tan huyết nhóm A thuộc
họ vi khuẩn cầu khuẩn ruột (Enterococci). Vi khuẩn có hình bầu dục, có thể đứng đơn
hoặc bắt cặp, chuỗi ngắn hoặc chuỗi rất dài [31]. E. faecium có thể phát triển ngay cả
trong các môi trường tương đối khắc nghiệt như 6,5% NaCl, pH 9,6 và ở nhiệt độ từ
10°C đến 45° C [15]. Về tính chất sinh hóa, E. faecium có khả năng thủy phân esculin
với sự hiện diện của muối mật 40%, tạo ra một leucin minopeptidase và
pyrrolidonylarylamidase (PYR) [15], [43]. Về nguồn gốc, các chủng E. faecium có thể
tìm thấy trong đất nước, thức ăn và trong đường tiêu hóa động vật [15]. Trong mơi
trường bệnh viện, E. faecium là một trong hai loài Entercocci được phân lập nhiều nhất
và là căn nguyên hàng đầu trong nhóm vi khuẩm Gram dương gây nhiễm khuẩn bệnh
viện [43].
1.1.2. Dịch tễ và khả năng gây bệnh
1.1.2.1. Dịch tễ
E. faecium là một vi khuẩn có thể gây nhiễm khuẩn nội sinh và ngoại sinh, cả
trong và ngoài bệnh viện [15]. Trước đây, người ta cho rằng nguồn gây nhiễm khuẩn
Enterococci chủ yếu là do những vi khuẩn cư trú trong hệ đường ruột - nhiễm khuẩn nội
sinh, nhưng sau đó sự gia tăng của các ca nhiễm khuẩn bệnh viện đã cho thấy họ vi
khuẩn này có thế gây nhiễm khuẩn ngoại sinh do sự lây truyền giữa các bệnh nhân cũng
3
như giữa các khoa phòng [21]. Yếu tố nguy cơ của nhiễm khuẩn bệnh viện do E. faecium
gồm bệnh nhân suy giảm miễn dịch, trải qua phẫu thuật ghép tạng, thủ thuật xâm lấn
hoặc bệnh nhân có thời gian nằm viện dài. Tỷ lệ nhiễm khuẩn E. faecium được ghi nhận
cao nhất là tại các khoa hồi sức tích cực, khoa huyết học, khoa sơ sinh hoặc khoa tiết
niệu [15], [47]. Bên cạnh yếu tố nguy cơ thuộc về người bệnh, sự lan truyền nhanh chóng
của E. faecium trong bệnh viện là do E. faecium có thể tồn tại từ 7 ngày đến 2 tháng trên
các bề mặt vật thể, do đó làm tăng khả năng nhiễm khuẩn thơng qua phơi nhiễm với
thiết bị y tế, giường bệnh, với các bệnh nhân nằm gần hoặc các nhân viên chăm sóc y tế
[21].
1.1.2.2. Khả năng gây bệnh
Bệnh cảnh lâm sàng gặp trong nhiễm khuẩn E. faecium gồm: nhiễm khuẩn đường
tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc, nhiễm khuẩn vết thương hoặc nhiễm
khuẩn trong ổ bụng [31], [43]. Trong đó, nhiễm khuẩn huyết là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu còn nhiễm khuẩn tiết niệu là nhiễm khuẩn hay gặp nhất. Tỷ lệ tử vong của
bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết do E. faecium lên tới 42-68% [15]. Còn với nhiễm
khuẩn tiết niệu, trong nghiên cứu của Choe Hyun-Sop và cs (2018) tiến hành trên 6.706
bệnh nhân thuộc 7 nước châu Á (trong đó có Việt Nam) cho thấy: tỷ lệ mắc các bệnh
liên quan đến nhiễm khuẩn tiết niệu là 9,8%, trong đó nguyên nhân liên quan đến
Enterococci chiếm 12,7% (đứng thứ 3, chỉ sau E.coli và Klebsiella spp.) [7].
1.1.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Enterococcus faecium
E. faecium có các cơ chế kháng kháng sinh nội tại và cơ chế kháng thu nhận. Việc
hiểu rõ cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn E. faecium giúp đưa ra các chiến lược
kiểm soát lây lan của vi khuẩn đồng thời thiết lập các phương pháp điều trị mới [45].
1.1.3.1. Cơ chế kháng kháng sinh nội tại
E. faecium có khả năng kháng nội tại với các kháng sinh nhóm beta-lactam và
một số kháng sinh nhóm aminoglycosid. Các kháng sinh nhóm beta-lactam được lựa
chọn để điều trị nhiễm khuẩn do E. faecium chủ yếu thuộc nhóm penicillin như penicillin
G, ampicillin và piperacillin [43]. Hiện nay, sự kháng penicillin trên các vi khuẩn E.
faecium ngày càng gia tăng, với cơ chế kháng chủ yếu do thay đổi cấu dạng cũng như
số lượng protein gắn penicillin (PBP), làm giảm ái lực gắn với penicillin dẫn đến sự
kháng kháng sinh này [45], [51]. Đặc trưng cho khả năng kháng penicillin của các chủng
4
E. faecium là sự tạo ra nhiều PBP5 có ái lực thấp với penicillin, dẫn tới là nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC) của penicillin với E. faecium ở mức cao 8-16 µg/ml [28], [51].
Với nhóm aminoglycosid, do E. faecium có khả năng kháng nội tại với các kháng
sinh kháng sinh aminoglycosid nên trong thực hành lâm sàng, kháng sinh nhóm này chỉ
được dùng kết hợp kháng sinh tác động thành tế bào (như penicillin và vancomycin) tạo
tác dụng hiệp đồng [43]. Sự kháng nội tại này thông qua hai cơ chế: thay đổi tính thấm
màng tế bào với kháng sinh và sinh enzym biến đổi kháng sinh. Cụ thể, E. faecium sinh
enzym biến đổi nhóm hydroxyl và nhóm amin của aminoglycosid làm cản trở không
gian, kháng sinh kém liên kết với đích ribosom [45]. Tuy nhiên, mức độ kháng nội tại
giữa các kháng sinh trong nhóm aminoglycosid là khác nhau. E. faecium có tính kháng
cao với kanamycin, tobramycin và amikacin nhờ một số enzym biến đổi kháng sinh
gồm: aminoglycosid 6-acetyltransferase được mã hóa bởi gen aac(6’)-Ii và
phosphotranferase được mã hóa bởi gen aph (3’)-IIIa [28]. Ngược lại, streptomycin và
gentamicin ít bị ảnh hưởng bởi các enzym nội sinh của E. faecium nên chỉ có hai kháng
sinh này là được sử dụng phổ biến trong phác đồ hiệp đồng kháng sinh trong thực hành
điều trị trên lâm sàng [28], [43], [45].
1.1.3.2. Cơ chế kháng kháng sinh thu nhận
Vi khuẩn E. faecium có thể sử dụng các plasmid, gen nhảy (transposon) và các
trình tự chèn (IS) trong bộ gen của chúng để thu nhận và lan truyền yếu tố kháng thuốc
một cách hiệu quả, tạo điều kiện cho sự lan rộng của gen kháng kháng sinh [45]. Tiêu
biểu cho cơ chế kháng thu nhận này là sự kháng kháng sinh nhóm glycopeptid,
tetracyclin và aminoglycosid.
Kháng sinh nhóm glycopeptid, như vancomycin, teicoplanin là các kháng sinh
quan trọng trong điều trị nhiễm khuẩn E. faecium kháng penicillin, tuy nhiên tình trạng
kháng glycopeptid ngày càng trở nên phổ biến [59]. Dựa vào các yếu tố: kiểu hình
kháng, sự thay đổi đích tác dụng, sự lan truyền kháng, mức độ kháng vancomycin và
teicoplanin, Enterococci kháng vancomycin chia thành 9 nhóm gồm VanA, VanB,
VanC, VanD, VanE, VanG, VanL, VanM, VanN (Bảng 1.1).
5
Bảng 1.1 Phân loại kháng kháng sinh nhóm Glycopeptid của họ Enterococci [6]
Kiểu kháng
VanA
VanB
VanC
VanD
VanE
VanG
VanL
VanM
VanN
64-1000
4-1000
2-32
64-128
8-32
<16
8
>256
8-16
16-512
0,5-1
0,5-1
4-64
0,5
<0,5
<0,5
96
<0,5
Nhiễm sắc
Nhiễm sắc
thể,
thể,
Plasmid
Plasmid
D-Ala-D-
D-Ala-D-
D-Ala-D-
Lac
Lac
Có
Có
Đặc điểm
Vancomycin
MIC (µg /ml)
Teicoplanin
MIC (µg /ml)
Vị trí gen
Thay đổi
Lan truyền
Vi khuẩn
E. faecium E. faecium
E. faecalis
E. faecalis
Nhiễm sắc
thể
Nhiễm
sắc thể,
Nhiễm sắc
Nhiễm sắc Nhiễm sắc
Nhiễm sắc
thể,
Nhiễm sắc
thể
thể
thể
D-Ala-D-
D-Ala-D-
D-Ala-D-
D-Ala-D-
D-Ala-D-
D-Ala-D-
Ser
Lac
Ser
Ser
Ser
Lac
Lac
Khơng
Khơng
Khơng
Có
Khơng
Có
Có
E.
gallinarum
Plasmid
Plasmid
thể
E.
faecium
E.
faecalis
6
E. faecalis
E. faecalis E. faecalis E. faecium E. faecium
Hiện tại, sự kháng kháng sinh glycoppeptid của E. faecium chủ yếu do sự thay
thế pentapeptid ái lực cao với vancomycin (D-Ala-D-Ala) thành pentapeptid ái lực thấp
(D-Ala-D-Lac) [18], [74]. Trong các phân nhóm trên, Enterococci VanA và VanB chiếm
hầu hết các trường hợp VRE ở con người trên khắp thế giới, đặc biệt trên vi khuẩn E.
faecium [25]. Cấu trúc của một cụm gen vanA/vanB gồm: vanS – vanR là 2 thành phần
của hệ thống điều hòa đáp ứng với vancomycin. Sau đó kích hoạt các gen vanH, vanA
hoặc vanB và vanX: vanH là enzym D-hydroxyacid dehydrogenase khử pyruvate thành
D-Lac, vanX là một D, D-dipeptidase phân cắt D-Ala-D-Ala, làm cạn kiệt D-Ala-D-Ala
và cung cấp D-Ala. VanA/B nối D-Ala và D-Lac tạo ra các pentapeptid D-Ala-D-Lac có
ái lực thấp với vancomycin. Ngồi ra, trong cụm gen này cịn có vanY là một Dcarboxypeptidase phân cắt peptid đầu cuối D-Ala để làm cạn kiệt thêm các nhóm
pentapeptid có ái lực cao với vancomycin. Cuối cùng, vanZ chỉ hiện diện trên các chủng
mang gen vanA, thể hiện khả năng kháng teicoplanin của các chủng mang cụm gen này
[8], [17]. Tỷ lệ pentapeptid ái lực cao/pentapeptid ái lực thấp sẽ quyết định mức độ
kháng vancomycin của vi khuẩn [17]. Cấu trúc của cụm gen vanA, vanB được thể hiện
trong Hình 1.1.
7
Hình 1.1 Cấu trúc của cụm gen vanA, vanB [17]
Bên cạnh nhóm kháng sinh glycopeptid, sự đề kháng của E. faecium với kháng
sinh nhóm tetracyclin cũng rất được quan tâm. E. faecium kháng tetracyclin theo hai cơ
chế chính: đó là tạo bơm tống thuốc và che chắn đích tác dụng (ribosom) [45]. Sự kháng
qua cơ chế bơm tống thuốc được quyết định bởi các gen tetK và tetL nằm trên plasmid
mã hóa protein bơm xun màng và tạo ra tính kháng với tetracyclin. Cịn với cơ chế
che chắn đích tác dụng kháng sinh, tetM, tetO và tetS là các gen nằm trên nhiễm sắc thể
mã hóa cho protein làm thay đổi cấu trúc ribosom và thay thế vị trí gắn tetracyclin dẫn
đến tình trạng kháng tetracyclin của các chủng E. faecium [31].
Như đã đề cập trên đây, chỉ có 2 kháng sinh trong nhóm aminoglycosid là
gentamin và streptomycin được sử dụng trong phác đồ phối hợp kháng sinh có tác dụng
hiệp đồng trên E. faecium. Tuy nhiên, tác dụng hiệp đồng này có thể bị mất đi bởi cơ
chế kháng thu nhận của E. faecium [45]. Đối với streptomycin, E. faecium kháng theo 2
cơ chế: sinh enzym phân cắt streptomycin hoặc đột biến điểm đơn lẻ đối với ribosom.
8
Hai gen mã hóa cho enzym adenylyltransferase được mơ tả là ant (6 ′) - Ia và ant (3 ′) Ia, có khả năng làm bất hoạt streptomycin [28], [77]. Trong khi đó, sự đề kháng với
gentamicin chủ yếu là do sự biến đổi kháng sinh của enzym kép được mã hóa bởi gen
aac(6 ′) - Ie / aph (2 ′) - Ia, enzym có cả hoạt động 6′-acetyltransferase và 2′phosphotransferase [12]. Do vậy, việc xác định cơ chế kháng của E. faecium trên 2
kháng sinh này là rất quan trọng trong điều trị nhiễm khuẩn do E. faecium [45].
1.1.4. Dịch tễ học vi khuẩn Enterococcus faecium đa kháng
Trong những thập kỷ vừa qua, VREfm đã nổi lên trên toàn thế giới như là một vi
khuẩn đa kháng thuốc phổ biến trong bệnh viện và trở thành một mối quan tâm hàng
đầu trong lĩnh vực y tế [13].
1.1.4.1. Dịch tễ học trên thế giới
Năm 2019, tổng quan hệ thống của Seyedeh và cs trên 291 nghiên cứu về tỷ lệ
kháng kháng sinh của E. faecium trên thế giới cho thấy E. faecium có tỷ lệ kháng cao
với các kháng sinh: erythromycin là 84% (1661/1977), ampicillin là 78% (2979/3747),
tetracyclin là 59% (651/1194), streptomycin là 50,5% (1336/2377) và gentamicin là
46,5% (2019/4196), có tỷ lệ kháng tương đối thấp với các kháng sinh:
quinupristin/dalfopristin là 8% (225/1972), tigecyclin là 1% (3/492) và linezolid là 0%
(0/172) [30].
Kết quả chương trình giám sát kháng sinh SENTRY về tình hình kháng kháng
sinh của Entercocci theo 4 khu vực địa lý: Bắc Mỹ (North America), Mỹ Latinh (Latin
America), Châu Âu (Europe), Châu Á-Thái Bình Dương (Asia-Pacific) thời gian từ năm
1997 đến năm 2016 cho thấy các chủng E. faecium chiếm đa số trường hợp VRE, thể
hiện trong số 7937 chủng VRE có 6788 phân lập VanA (91% E. faecium), 827 phân lập
VanB (75,3% E. faecium). Tần suất VRE (VanA và VanB) theo thời gian và theo khu
vực địa lý được thể hiện trong Hình 1.2. Trong khoảng thời gian 20 năm của chương
trình SENTRY, tần suất VRE (bao gồm VanA và VanB) có xu hướng tăng dần ở cả 4
khu vực toàn cầu. Trong những năm đầu tiên 1997-2000, VRE chưa phổ biến (0,0%3,3%) ở tất cả các khu vực được giám sát ngoại trừ khu vực Bắc Mỹ (10,3%); Tuy nhiên,
tần suất VRE tăng ở tất cả các khu vực trong năm 2012. Sau đó, giai đoạn 2013-2016,
tại Bắc Mỹ và Châu Âu, nhờ sự quản lý chặt chẽ sử dụng kháng sinh vancomycin và
những nỗ lực trong phòng ngừa lan truyền kháng thuốc, tỷ lệ VRE giảm (giảm 7% ở
9
Bắc Mỹ và khoảng 3% khu vực Châu Âu). Trong khi đó, tại Châu Á-Thái Bình Dương
và Mỹ Latinh tỷ lệ VRE vẫn tiếp tục gia tăng (Hình 1.2) [54].
Hình 1.2 Tần suất Enterococci kháng vancomycin (VanA và VanB) theo thời gian
và theo khu vực địa lý, chương trình giám sát kháng sinh SENTRY, 1997-2016
[54]
Riêng với châu Á, tình hình E.faeium kháng vancomycin ở một số quốc gia cụ
thể như sau: tại Hàn Quốc, theo hệ thống giám sát kháng kháng sinh Hàn Quốc từ năm
2013 đến năm 2015 tỷ lệ VREfm tăng từ 29% lên 31% [33]. Ở Đài Loan, tỷ lệ VREfm
tăng từ 0,3% năm 2004 lên 24,9% năm 2010 [71]. Tỷ lệ VREfm ở Trung Quốc thấp
hơn, tăng từ 0,6% năm 2005 lên 1,9% năm 2016, đạt đỉnh năm 2014 với 4,2% [77].
1.1.4.2. Dịch tễ học tại Việt Nam
Hiện tượng VRE đặc biệt đáng lo ngại ở các nước đang phát triển, như nhiều
quốc gia ở khu vực Đông Nam Á, nơi mà việc quản lý mua bán sử dụng kháng sinh còn
chưa chặt chẽ [10]. Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về E. faecium kháng kháng sinh
ở Việt Nam. Theo nghiên cứu của Antonella Santona và cs (2018) tại Bệnh viện Trung
10
ương Huế, 26 chủng E. faecium kháng ampicillin phân lập được đều là các chủng đa
kháng thuốc. Trong số 26 chủng, 100% kháng với gentamicin, 81% kháng với
streptomycin, 46% kháng với vancomycin và 11% kháng với teicoplanin. Tất cả các
chủng E. faecium trong nghiên cứu đều nhạy với linezolid và quinupristin/dalfopristin
[62]. Khơng chỉ xuất hiện trên người, E. faecium cịn có ở động vật, trong mơi trường
khơng khí và nước [21]. Nghiên cứu của Dang S. T. và cs (2011) khảo sát về sự phát
triển kháng kháng sinh ở vi khuẩn tại các trang trại ở Việt Nam, cho kết quả 100% E.
faecium phân lập được từ phân lợn kháng với tetracyclin, 90% E. faecium phân lập được
kháng với tetracyclin [7].
1.2.
Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và giải trình tự tồn bộ bộ
gen (WGS)
1.2.1. Khái niệm NGS và WGS
Giải trình tự gen thế hệ đầu tiên có 2 phương pháp phổ biến: phương pháp hóa
học (Chemical cleavage sequencing), do Maxam và Gilbert phát triển, công bố vào tháng
2/1977 và phương pháp giải trình tự Sanger (Dideoxy sequencing hay Sanger
sequencing), được Sanger phát triển, công bố vào tháng 12/1977 [41], [61]. Đến tháng
10 năm 2004, tổ chức “The National Human Genome Research Institute” (NHGRI) đã
giới thiệu một loạt các khoản tài trợ “$ 1.000 Genome”, để kích thích những đột phá
trong cơng nghệ giải trình tự, nhằm mục đích giải trình tự bộ gen người với chi phí 1000
đơ la. Điều đó đã dẫn đến sự xuất hiện của những phương pháp mới, được biết đến là
phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới (Next-generation sequencing: NGS). Chúng
được thiết kế để thực hiện hàng loạt các phản ứng song song tạo ra một lượng lớn các
trình tự từ nhiều mẫu với một thông lượng cao [32]. Ngày nay, phương pháp NGS dựa
trên cơ sở Illumina sequencing là hệ thống giải trình tự thành cơng nhất, chiếm hơn 70%
các hệ thống NGS, đặc biệt là với các nền tảng HiSeq và MiSeq [39].
Giải trình tự tồn bộ bộ gen (WGS) vi sinh vật là một công cụ quan trọng để lập
bản đồ bộ gen của các sinh vật mới, hoàn thiện bộ gen của các sinh vật đã biết hoặc so
sánh bộ gen trên nhiều mẫu. Phân tích tồn bộ bộ gen của vi khuẩn gây bệnh thơng qua
WGS rất hữu ích trong việc phân biệt các dòng vi khuẩn liên quan đến các ổ dịch nhiễm
khuẩn trong bệnh viện [57]. Những cải tiến gần đây trong cơng nghệ giải trình tự và các
cơng cụ phân tích làm tăng tốc độ đầu ra cũng như giảm chi phí chung của WGS, giúp
11
WGS trở thành công cụ xác định kiểu gen dễ tiếp cận hơn trong nghiên cứu cũng như
trên lâm sàng [52], [57].
1.2.2. Ứng dụng NGS và WGS trong nghiên cứu vi khuẩn đa kháng
Xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn kháng kháng sinh: theo truyền thống, khi muốn
xác định các mầm bệnh vi khuẩn hay xác định tính mẫn cảm với kháng sinh, ta phải dựa
vào các phương pháp đánh giá kiểu hình. Các phương pháp này chi phí thấp, nhưng mất
nhiều ngày do phải cần thời gian cho vi khuẩn phát triển [67]. Trong bối cảnh đó, cơng
nghệ giải trình tự gen thế hệ mới đóng vai trị quan trọng trong việc chẩn đốn một cách
nhanh chóng các tác nhân gây bệnh. Những nền tảng giải trình tự gen mới có thể phân
tích trình tự tồn bộ bộ gen vi khuẩn, áp dụng với nhiều loại vi khuẩn và chỉ trong thời
gian dưới một ngày [27].
Kiểm soát vụ dịch: Các vi khuẩn đa kháng thuốc thường xuyên được phát hiện ở
các cơ sở y tế, và là căn nguyên gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện [55]. Từ khi công nghệ
giải trình tự gen thế hệ mới ra đời, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới ứng dụng công
nghệ này trong việc xác định nguồn gây bệnh, điều tra dịch tễ học, xác định con đường
lây truyền của các vụ dịch [1], [38]. WGS đã trở thành tiêu chuẩn vàng cho việc điều tra
các vụ dịch nghi ngờ trong bệnh viện [72].
Nghiên cứu sự xuất hiện kháng kháng sinh: WGS được sử dụng để nghiên cứu
sự tiến hóa của vi khuẩn kháng thuốc trong những điều kiện khác nhau [66]. Bên cạnh
đó, WGS cịn giúp đo lường tốc độ xuất hiện kháng thuốc và làm rõ các yếu tố cho phép
lan truyền kháng thuốc [19].
Thử nghiệm lâm sàng, phát triển kháng sinh mới: việc sử dụng WGS để làm sáng
tỏ các cơ chế kháng thuốc có ý nghĩa đối với việc thiết kế các thử nghiệm lâm sàng. Với
các loại kháng sinh mà cơ chế kháng thuốc cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tăng
nhẹ, có thể tăng tần suất sử dụng hoặc tăng liều các kháng sinh đó trong các thử nghiệm
lâm sàng [46]. Ngồi ra, trong thử nghiệm lâm sàng, WGS còn được sử dụng để phân
biệt tái phát nhiễm khuẩn ngoại sinh với tái phát nhiễm khuẩn tiên phát, điều này rất
quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của thuốc [16], [44].
1.2.3. Các công cụ xử lý dữ liệu NGS
Dữ liệu thu được sau khi giải trình tự gen bằng cơng nghệ NGS là các đoạn trình
tự riêng lẻ (reads). Tiếp theo, cần sử dụng các công cụ tin sinh học để kiểm tra chất
12
lượng của các đoạn trình tự, lắp ráp và xác định các đặc điểm bộ gen vi khuẩn. Các công
cụ xử lý dữ liệu NGS được tổng hợp trong bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2 Các công cụ xử lý dữ liệu NGS [5], [14]
Mô tả
Đường dẫn
Kiểm tra chất lượng của các đoạn trình
/>
Tên cơng cụ
Kiểm tra dữ liệu sau giải trình tự
FastQC
andrews/FastQC
tự (reads)
Trimmomatics
Cắt bỏ đoạn thừa và các đoạn chất lượng />immomatic
kém
Lắp ráp bộ gen
Spades
Lắp ráp các đoạn trình tự (reads) thành />trình tự liền kề (contigs)
Velvet
Lắp ráp các đoạn trình tự (reads) thành
trình tự liền kề (contigs)
ades/
/>utorials/modules/velvet/
Chú thích bộ gen
Rast
Prokka
Chú thích bộ gen vi khuẩn, vi rút
Chú thích bộ gen vi khuẩn vi rút
/>
/>prokka
Xác định ST và cơ chế kháng kháng sinh
MLST
Xác định ST, CC của chủng vi khuẩn
/>s/MLST/
Resfinder
Xác định gen kháng từ trình tự gen của
/>s/ ResFinder/
vi khuẩn
ARG-ANNOT So sánh từng cặp của trình tự cần phân
tích với cơ sở dữ liệu ARG-ANNOT
13
Sử dụng các mơ hình phát hiện kháng />
RGI
kháng sinh được thiết lập để dự đoán gen
yze/rgi
kháng nội tại, gen kháng thu nhận và sự
kháng qua đột biến đích tác dụng
ARGs-OAP
Hệ thống phân tích trực tuyến các gen />
(v2)
kháng kháng sinh.
ARIBA
Xác định nhanh kiểu gen kháng kháng
/>
sinh trực tiếp từ dữ liệu đoạn trình tự
pathogens/ariba
args-oap/
(reads), sử dụng cơ sở dữ liệu được công
bố
PointFinder
Xác định kháng kháng sinh dựa dữ liệu
/>
WGS, liên quan đến đột biến nhiễm sắc
s/ResFinder/
thể của vi khuẩn
NCBI-
Xác định các gen kháng thu nhận sử
AMRFinder
dụng cơ sỏ dữ liệu NCBI và HMMs
/pathogens/antimicrobialresistance/AMRFinder/
1.3.
Các nghiên cứu về đặc điểm bộ gen của vi khuẩn Enterococcus faecium
1.3.1. Nghiên cứu trên thế giới
WGS là cơng cụ hữu hiệu trong phân tích đặc điểm bộ gen, sự tiến hóa và lan
truyền của E. faecium. Trong phân tích đặc điểm bộ gen của các chủng E. faecium, WGS
có vai trị quan trọng trong xác định đặc điểm cấu trúc bộ gen, phân loại kiểu gen, xác
định gen kháng kháng sinh và đánh giá sự phù hợp giữa kiểu gen và kiều hình kháng
kháng sinh [68], [77].
Về đặc điểm cấu trúc bộ gen, bộ gen hồn chỉnh của E. faecium lần đầu tiên được
cơng bố vào năm 2012. Đó là chủng E. faecium ST7 được phân lập từ máu của bệnh
nhân tại bệnh viện Melbourn, Úc và kích thước bộ gen là 3Mb [35]. Về cấu trúc bộ gen,
các nghiên cứu chỉ ra cấu trúc nhiễm sắc thể dạng vòng của chủng E. faecium có kích
thước khoảng 2,5-3 Mb, hàm lượng GC khoảng 38% và bộ gen của E. faecium thường
chứa 1 đến 3 plasmid [36], [56]. Đến nay, hệ thống genom của Trung tâm thông tin
Công nghệ sinh học quốc gia (NCBI: National Center for Biotechnology Information,
14
có thơng tin về đặc điểm bộ gen
của khoảng 1900 chủng E. faecium và hệ thống cập nhật liên tục các chủng E. faecium
mới [80].
Với phân loại kiểu gen, vào năm 1998, Maiden và cs đã đưa ra phân loại MLST
(Multilocus sequence typing) để xác định alen dựa trên trình tự các gen chức năng cơ
bản mã hóa protein cần thiết cho các chức năng cơ bản của tế bào. Phân loại MLST cho
E. faecium dựa vào bảy gen chức năng cơ bản khác nhau là atpA, ddl, gdh, purK, gyd,
pstS, adk. Hiện nay, theo nguồn dữ liệu về MLST của E. faecium trên trang web Pubmlst
( có 1700 loại ST (sequence type) đã được công bố [81].
Số lượng ST này sẽ được cập nhật thường xuyên khi có báo cáo về các loại ST mới được
phát hiện trên thế giới. Khi nghiên cứu đặc điểm sinh học của quần thể E. faecium sử
dụng phân loại theo MLST, các dữ liệu đã cho thấy sự tồn tại của 1 tiểu quần thể có cấu
trúc gen đặc biệt liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện, gọi là CC17 (clonal complex).
Đa số các chủng E. faecium phân lập được từ các nghiên cứu lâm sàng và các đợt bùng
phát nhiễm khuẩn E. faecium bệnh viện thuộc 4 loại ST (ST17, ST18, ST78, ST192),
chúng là phân nhóm chính thuộc CC17, hiện đang có xu hướng lan ra tồn cầu [3], [77].
Các nghiên cứu phát hiện gen kháng kháng sinh trên E. faecium rất được quan
tâm. Gregory H. Tyson và cs (2018) nghiên cứu tiến hành phân tích gen kháng và các
đột biến liên quan đến kháng kháng sinh của 197 chủng Enterococci (100 chủng E.
faecium và 97 chủng E.faecalis) phân lập từ thực phẩm và động vật. Kết quả cho thấy
có sự phù hợp giữa kiểu gen với kiểu hình kháng thuốc trong 96,5% trường hợp, với 11
loại kháng sinh [68]. Tại Trung Quốc, nghiên cứu của Jia Yang và cs (2018) tiến hành
xác định đặc tính kiểu hình và kiểu gen của 43 chủng VREfm cho kết quả các chủng
phân lập được đều là các chủng đa kháng và thuộc kiểu hình VanA. Các gen kháng
tet(O), tet(K), acc(6′)-Ie-aph(2′)-Ia và aad(6) là nguyên nhân dẫn tới sự đa kháng kháng
sinh của VREfm do đó cần được quan tâm nhiều hơn [77]. Các gen kháng kháng sinh
được cập nhật trên cơ sở dữ liệu gen kháng như: CARD [McMaster University,
Resfinder [Center for Genomic Epidemiology, DTU,
thuận lợi cho việc nghiên cứu đặc điểm, cơ
chế kháng kháng sinh của vi khuẩn [79], [83].
Hiện nay, hàng loạt các nghiên cứu áp dụng WGS trên E. faecium đang được tiến
hành để xác định đặc đểm bộ gen, cơ chế kháng kháng sinh và xác định đường lây truyền
15
của vi khuẩn, từ đó hướng tới áp dụng các biện pháp ngăn ngừa kiểm sốt tình trạng
nhiễm khuẩn bệnh viện cũng như sự đa kháng kháng sinh của E. faecium một cách hợp
lý.
1.3.2. Nghiên cứu tại Việt Nam
Chưa có nhiều dữ liệu về VRE ở các quốc gia Đông Nam Á nói chung và Việt
Nam nói riêng [10]. Ở Việt Nam, nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm bộ gen của các chủng
E. faecium ở bệnh viện được công bố vào năm 2018, trên 26 chủng E. faecium kháng
ampicillin từ bệnh phẩm của bệnh nhân ở Bệnh viện Trung ương Huế. Nghiên cứu sử
dụng WGS này đã xác định ST, xác định gen kháng kháng sinh, plasmid và các đột biến
trong bộ gen của các vi khuẩn E. faecium kháng ampicillin. Kết quả cho thấy các chủng
E. faecium thuộc 5 ST liên quan đến CC17 (ST17, ST18, ST262, ST78, ST1085), xác
định sự tiến hóa do đột biến tái tạo gen và sự lây truyền của E. faecium đa kháng giữa
các khu vực trong bệnh viện. Trong quần thể ST17 loại vanB2, phát hiện 2 chủng mang
gen kháng bất thường vanA/vanB2. Từ kết quả trên, tác giả rút ra kết luận cần sử dụng
kháng sinh glycopeptid một cách hợp lý và thực hiện các biện pháp giám sát một cách
hiệu quả nhằm giảm sự lây lan VREfm bệnh viện, đồng thời tránh sự gia tăng kiểu gen
VREfm đột biến bất thường [62].
16
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.
Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng E. faecium kháng kháng sinh được phân lập từ bệnh phẩm ngoáy trực
tràng của bệnh nhân nằm tại Khoa ICU, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương từ tháng
6 năm 2017 đến tháng 9 năm 2017.
2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất, mơi trường
-
Mơi trường ni cấy, phân lập: thạch CHROMagar™ VRE (CHROMagar, Paris,
Pháp)
-
Hóa chất chuẩn trong định danh: Bacterial Test Standard (BTS)
-
Hóa chất định danh: HCCA Matrix
-
Hóa chất dung môi Stock Solution: Acetonitril (ACN) 100% và acid
Trifluoracetic 100% (TFA).
-
Card thử độ nhạy kháng sinh: AST-P607
-
Bộ kit định lượng nồng độ DNA: dsADN HS Assay
-
Bộ kit chuẩn bị mẫu giải trình tự: Nextera XT
-
Hóa chất chạy máy Miseq: Miseq Reagent
2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ
-
Tủ ấm Memmert (Đức)
-
Tủ An toàn sinh học cấp II AC2-4E1 (Roche, Thụy Sỹ)
-
Tủ lạnh thường (Panasonic)
-
Hệ thống máy định danh nhanh Maldi biotyper của hãng BRUKER (Đức)
-
Máy Vitek 2 compact (BioMérieux, Marcy l’Etoile, Pháp)
-
Máy lắc Vortex ZX3
-
Lị hấp tiệt trùng sạch, bình cầu, đĩa petri, ống Falcon, ống Eppendorf
-
Que cấy, đèn cồn, pipet, lam kính, đầu côn vàng, đèn cồn, găng tay, khẩu trang
2.2.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Quy trình nghiên cứu
17
