Các phương pháp định lượng protein

Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Mục lục
LỜI NÓI ĐẦU ...............................................................................................................3
I.

TỔNG QUAN: .......................................................................................................4
1.

CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN:............................................................................ 4
1.1.

Cấu trúc bậc 1: ........................................................................................ 4

1.2.

Cấu trúc bậc 2: ........................................................................................ 5

1.3.

Cấu trúc bậc 3: ........................................................................................ 6

1.4.

Cấu trúc bậc 4: ........................................................................................ 6

II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN ...........................................7
1.

2.

ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL ........................... 7
1.1.

Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl ............................... 7

1.2.

Định lượng nitơ phi Protein: .................................................................. 12

1.3.

Định lượng Protein trong nguyên liệu: .................................................. 13

ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU ...................................... 13
2.1.

Định lượng Protein theo phương pháp Biure. ........................................ 13

2.2.

Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): ............ 16

2.3.

Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant

Blue G - 250): .................................................................................................... 19
3.

ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID

(BCA):................................................................................................................... 22

4.

3.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 22

3.2.

Cách tiến hành: ..................................................................................... 22

3.3.

Tính kết quả: .......................................................................................... 22

3.4.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 22

ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ................................ 23
4.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 23
1

Các phương pháp định lượng protein.

5.

6.

7.

8.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

4.2.

Cách tiến hành: ..................................................................................... 23

4.3.

Tính kết quả: .......................................................................................... 24

4.4.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 24

PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): ........................ 25
5.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 25

5.2.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng: ............................................................ 25

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC............................................................ 25
6.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 25

6.2.

Cách tiến hành: ..................................................................................... 26

6.3.

Tính kết quả: .......................................................................................... 27

6.4.

Khả năng ứng dụng: .............................................................................. 27

PHƯƠNG PHÁP DUMAS: .................................................................................. 27
7.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 28

7.2.

Thiết bị: ................................................................................................. 28

7.3.

Cách tiến hành: ..................................................................................... 29

PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): ................................ 31
8.1.

Nguyên tắc:............................................................................................ 31

8.2.

Dụng cụ: ................................................................................................ 32

8.3.

Tiến hành:.............................................................................................. 32

III. SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN ................33
1.

SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẨM TÍCH ......................................... 33

1.

KẾT LUẬN ...................................................................................................... 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................34

2

Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

LỜI NÓI ĐẦU
Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được
cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp
với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này
trong phân tử Protein như sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%;
S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít
các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê
Ngọc Tú- NXB khoa học và kó thuật HN, trang 94)
Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một
cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống.
Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất
đạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein
(comoniac hoặc muối amonium). Để xác định được chúng hiện nay có nhiều
phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác,
người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp.
Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định lượng Protein, cùng với
một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể.

3


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

I. Tổng quan:

1. Cấu tạo phân tử Protein:
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa một
lượng nhỏ S. Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein
nhö sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các
nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P,
Fe, Zn, Cu, Mn, Ca…
Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật
cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan trọng đối với
tất cả các cơ thể sinh vật.
Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4

1.1.

Cấu trúc bậc 1:

Là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide. Cấu trúc này
được giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trị)

O
+

O
+ +H3N – CH – C

H3N – CH – C
O-

R1

R2

O

O
+

O

H3N – CH – C – NH – CH – C
R1

+ H2O
O–

R2
Liên kết peptide

H

H H

O

H

H

H O

H

– HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C –
R1 O

R2

H R3 O

R4

H

R5

4


Các phương pháp định lượng protein.

1.2.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Cấu trúc bậc 2:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch
polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch
polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành
giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác định.

5


Các phương pháp định lượng protein.

1.3.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Cấu trúc bậc 3:

Tương tác không gian giữa các gốc
acid

amin

ở

xa

nhau

trong

mạch

polypeptide, là dạng cuộn lại trong không
gian của mạch polypeptide (hình dạng
chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều
protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự

tạo thành các liên kết disunfua giữa các
gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide,
làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên
kết tónh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin … đều tham
gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình
tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần
thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.

1.4.

Cấu trúc bậc 4:

Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu,
tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuoãi
6


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

polypeptide gọi là”phần dưới đơn vị ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực
Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vị”.

II. Các phương pháp định lượng protein
1. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Theo nguyên tắc Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng
số và kết quả nhân với 6.25, như thế nghóa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì
trong phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 15 –
17%).

Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ
như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì
vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó
xác định nitơ Protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
 Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein

1.1.

Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc:
Quá trình gồm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte)
nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H2SO4 thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bị
phân hủy và bị oxi hóa đến CO2 và H2O , còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) rồi
kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate
 Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm)
Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH3 ra khỏi dunh dịch bằng NaOH.
(NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O

7


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Lượng NH3 sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một
erlen có chứa một lượng thừa H2SO4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH3 sẽ tác

dụng với H2SO4 chuyển thành (NH4)2SO4 .
NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư
Sau đó đi chuẩn độ lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính
được lượng nitơ có trong mẫu.
NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O
Cách tiến hành:
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:
 Nguyên liệu: các mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô
cần được sấy khô tuyệt đối (105oC, trong 30 phút).
 Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 đặc, H2SO4 0,01N,
H3PO3 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96o, acid tricloacetic (TCA),
thuốc thử đỏ metyl.
 Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger.
(chen hình vào)
Quá trình được thực hiện qua các bước.
 Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO 2,
CO2).
Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn
tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô
đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước
quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK2SO4/CuSO4
(hoặc selen, hay H2O2 30%, hay HCLO4 70%) vaø 10ml H2SO4 đặc.
Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung
dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội.

8


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô
đạm và định mức đến vạch định mức.
 Bước 2: Cất đạm

Sơ đồ máy cất đạm
Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước
vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất
(khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A
sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện
ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước
trong bình B sẽ rút qua G. khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2
cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu
nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi. Khóa van 3 và 2 lại.
Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dịch H2SO4 0,01N
và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu
mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dịch H2SO4 0,01N của erlen E
Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi
bình A, mở van 2 để dung dịch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất
vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng

9


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa

C một lần nữa với thao tác tương tự như trên.
Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy
xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp
tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B.
Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp
2 mà thôi.
Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu
mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của
ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xịt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài
lần như trên rồi chuẩn độ lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,01N.
 Bước 3: chuẩn độ
Lượng H2SO4 còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N. quá
trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt.
Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H2SO4 0,01N và
vài giọt đỏ metyl. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình của 3 lần
chuẩn độ
Tính kết quả:
Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau:
x là tỉ số giữa thể tích H2SO4 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ.
Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH.
Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức:
X=

 v0  v1 * x  *0, 0014*100*100
10* m

Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu
Vo: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3
V1: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H2SO4 thừa
10

Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa
0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N
Nếu là mẫu lỏng:
N/l= 14*  vo  v1 * x  *104 *

1000
vm

Trong đó: Vm là thể tích mẫu
*Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3
Sử dụng hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3 để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và
tránh được những sai số về sự thay đổi nồng độ đương lượng của kiềm hoặc không
khí.
Cách tiến hành:
 Nguyên liệu và hóa chất:
H3BO3 2%, thuốc thử Tarshiro, H2SO4 0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô
cơ hóa mẫu và cất đạm.
Cho vào bình hứng 2ml H3BO3 2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H3BO3
ngập đầu mút của ống sinh hàn. Trong bình hứng, dd H3BO3 tự phân li:
H3BO3  HBO2 + H2O
Khi cất đạm NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH4)2SO4 theo hệ thống sinh hàn vào
bình hứng, phản ứng với HBO2 :
NH4OH + HBO2  NH4+ + BO2- + H2O
BO2- là một bazơ mạnh làm dd của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang

màu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương lượng NH3 bị đẩy ra
trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách độ ngược với H2SO4
0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang
màu tím đỏ.
BO2- + H+  HBO2
Tính kết quả:
Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau:
11


Các phương pháp định lượng protein.
N (%) 

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam
Vt *0,14V *100
Vm * m

Trong đó: Vt – lượng H2SO4 0,01N để chuẩn độ BO2- (ml)
V – số mol dd mẫu pha loãng (100ml).
Vm – số ml dd mẫu cất đạm.
m – trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (mg).
0,14 – số mg N tương đương 1ml H2SO4 0,01N.

1.2.

Định lượng nitơ phi Protein:

Nguyên tắc:
Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein.
Tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các

chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút.
Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng,
acid, thẩm tích đối nước … Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tuûa sau:
TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hổn
hộp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1.
Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch phi Protein. Vô
cơ hóa dung dịch, cất đạm… tương tự định lượng nitơ tổng số.
Cách tiến hành:
Nguyên liệu: các mẫu cần được xác định hàm lượng phi Protein
Hóa chất: cồn 70o và các chất cần cho việc định lượng Protein theo phương
pháp Kjeldahl.
Cân chính xác 5 – 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ
hay thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70o (tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu
tươi và 1:8 nếu mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 – 80
12


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

phút và khuấy liên tục. Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã
vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70 o một lần nữa
theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn
phản ứng với thuốc thử ninhydrin. Dồn tất cả các dịch chiết lại và đem kết tủa
Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa nitơ Protein, còn dịch lọc chứa nitơ phi
Protein. Đem vô cơ hóa dịch lọc và tiến hành xác định hàm lượng ni tơ theo phương
pháp Kjeldahl.

1.3.

Định lượng Protein trong nguyên liệu:

Có thể tiến hành theo 2 cách sau:
cách 1: xác định trực tiếp
Xác định hàm lượng ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết
quả nhân với 6,25.
Protein = Nitơ Protein * 6,25
Cách 2: xác định gián tiếp
Nitơ tổng số = Nitơ Protein + Nitơ phi Protein
Ta xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau
đó tính nitơ Protein.
Nitơ Protein = Nitơ tổng số - Nitô phi Protein
 Protein = Nitô Protein * 6,25

2. Định lượng Protein bằng phương pháp so màu
2.1.

Định lượng Protein theo phương pháp Biure.

Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu2+ trong môi trường kiềm tạo
phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm

13


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Hình : Phản ứng Biure
Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết
peptid trong chuỗi Polypeptid.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1%
Chuẩn bị thuốc thử Biure:
Cân chính xác 1,5g

CuSO4

6g

Tartrat Kilium và Natrium

500ml

nước cất

Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml
Lập đồ thị chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo baûng sau:

14


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Nồng độ
STT

Protein1%(ml)

H2O(ml)

Protein
(mg/ml)

Thuốc thử
Biure (ml)

1

0,0

1,0

0

5

2

0,2

0,8

2

5

3

0,4

0,6

4

5

4

0,6

0,4

6

5

5

0,8

0,2

8

5

6

1,0

0,0

10

5

OD

Bảng 3: lập đồ thị chuẩn nồng độ Protein
Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.
Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc
đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước
sóng 540nm. Ghi nhận mật độ quang.
Tính toán:
Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 26. Trị số mật độ quang của các
ống nghiệm từ 26 bằng mật độ mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 đã
được đo ở trên trừ cho mật độ quang của ống 1. Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến
thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghieäm.

15


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:
Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương
pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein
tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml.

2.2.

Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến):

Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử
dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc
tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại
ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dịnh lượng hàm
lượng Protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein.

Hình : Phản ứng Lowry
Tiến hành
Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
 Dung dịch Protein chuẩn có 10 – 100 µg Protein/1ml
 Dung dịch nghiên cứu có 50 - 300 µg Protein/1ml

16


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

 Dung dịch chuẩn: Albumin 0,1%, thường là huyết thanh bò (BSA –
bovine serum albumin).
Hóa chất : pha
 Dung dịch A : Na2CO3 2% hòa trong NaOH 0,1N
 Dung dịch B : CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dòch natri citrat 1%
 Dung dịch C : hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B với tỉ lệ 49:1
 Dung dịch Folin
Cách pha dung dịch Folin: Pha trong bình cầu có V= 2l
Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na2WO4.2H2O) và 25g natri
molypdate ( Na2MoO4.2H2O). Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto
phosphoric 85% ( H3PO4) .Khuấy cho tan và thêm vào đó 100ml HCl đậm đặc và
tinh khiết rồi tiếp tục khuấy. Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu
trong 10h. Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150g lithium sulfat ( Li2SO4.H2O) tinh
khiết. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 – 10 ml nước Brom khuấy
đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút để đuổi lượng Brom thừa. Dung dịch phải có màu
vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với Brom lần thứ 2 sau khi làm
nguội dung dịch ở nhiệt độ thường. Để vào bình định mức 1l và định mức đến vạch.
Có thể lọc nếu dung dịch không trong. Đựng trong chai thủy tinh nút nhám có màu
nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 – 3 tháng, dung dịch chuyển sang màu xanh thì thêm
vài giọt Brom và đun sôi 15 phút dung dịch lại có màu vàng trở lại. Trước khi dùng
phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng độ 0,5N.
Thiết bị : máy so màu quang điện.
Tiến hành:

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu:
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu ,thêm vào ống nghiệm 4ml dung
dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5ml thuốc
thử Folin, lắc đều và để yên trong 30 – 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từ
17


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

màu vàng sang màu xanh. Sau đó đem đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm và ghi
nhận mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu
Thực hiện tương tự với 1 ống đối chứng bằng cách thay 1ml dung dịch mẫu
bằng 1ml nước cất.
Lập đồ thị chuẩn
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
Protein

Nước cất

0,1% (ml)

(ml)

1

0,0

10

2

0,5

3

ng số

Nồng độ
Protein

Dung dịch Thuốc thử
C (ml)

Folin (ml)

0

2

0,5

9,5

50

2

0,5

1,0

9,0

100

2

0,5

4

1,5

8,5

150

2

0,5

5

2,0

8,0

200

2

0,5

6

2,5

7,5

250

2

0,5

(mg/ml)

OD

Bảng 1: lập đồ thị nồng độ Protein
Trình tự và thao tác tương tự như phần dung dịch thí nghiệm. Sau đó đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 750nm. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn.
Tính toán:
Từ bảng trên khi lập đồá thị thì ta lấy trị số mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ
đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dịch Protein
chuẩn, từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ
Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ quang.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật

độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
18


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch
mẫu chứa vài chục µg Protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 – 2,000mg
Protein. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các Protein không
chứa acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì
tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả.

2.3.

Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie
Brilliant Blue G - 250):

Nguyên tắc:
Dựa phản ứng màu của Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant
Blue G - 250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi
trường axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương
tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein
làm dung dịch có màu xanh. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein trong dung
dịch. Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu.

Phản ứng cho maøu Coomassie

19


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Tiến hành:
Hóa chất: Chuẩn bị dung dịch mẫu Protein cần xác định.
Dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml
Cách pha dung dịch Albumin:
Cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml nước cất lắc đều cho tan hết và
giữ ở 20oC. Khi dùng pha loãng 100 lần để được dung dịch Albumin 0,1mg/ml.
Pha thuốc thử Bradford:
Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue và 4,7g Ethanol 99o và 8,5g Acid
Phosphoric 85%, định mức tới 100ml bằng nước cất. Đựng trong chai có nút đậy
kín.
Thiết bị: máy đo màu quang điện.
Tiến hành:
Lập đồ thị chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
Thuốc thử

Dung dịch Albumin

Nước cất

Nồng độ Albumin

0.1mg/ml (ml)

(ml)

(µg)

1

0

1

0

5

2

0,1

0,9

10

5

3

0,2

0,8

20

5

4

0,3

0,7

30

5

5

0,4

0,6

40

5

6

0,5

0,5

50

5

ng số

Bradford
(ml)

Bảng 2: lập đồ thị chuẩn dung dịch Albumin
Lắc điều và để yên một lúc sau đó đem đo độ hấp thu của các ống ở bước
sóng 595nm. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn.
20


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Chuẩn bị ống thí nghiệm:
Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford
Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford
(Có thể thay nước cất bằng NaCl 0,15M)
Đem đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ
quang phải nằm trong khoảng của đường chuẩn).
Tính toán.
Từ bảng trên thì ống 1 là ống đối chứng ,vì vậy khi lập đồá thị thì ta lấy trị số
mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp

thu thực sự của dung dịch Protein chuẩn,từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên
của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein
và trục tung là mật độ quang.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lượng Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Độ nhạy và khả năng ứng dụng
Phương pháp này dùng cho Protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt
độ phòng. Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và
đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml. đồng thời làm
giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử…Tuy nhiên phương pháp này không
dùng với những chất có chứa surfactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng.
Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu
Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ
quang.

21


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

3. Định lượng Protein bằng phương pháp dùng Bicinchoninic Acid
(BCA):
3.1.

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo

màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 562nm.

Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA)
Đầu tiên Protein sẽ khử Cu2+ thành Cu+ và tạo thành phức có màu xanh trong
môi trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu+ được tạo ra ở trên
cho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm.

3.2.

Cách tiến hành:

Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử
Biure thành thuốc thử BCA.

3.3.

Tính kết quả:

Cách tính kết quả cũng tương tự phương pháp Biure.

3.4.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện
Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg. Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu
22


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ
trong phân tử có các aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cũng bắt
màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả.

4. Định lượng Protein bằng phương pháp quang phổ
4.1.

Nguyên tắc:

Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm của Protein. Các Protein
hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acidamin Tryptophan,
Tyrosin và một phần là Phenylalanin. Sự hấp thu ở bước sóng 280nm của chúng
cũng thay đổi tùy loại Protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi Protein cho phép
tính nồng độ của Protein tinh sạch (hệ số tắc là độ hấp thụ của dd Protein 1% với
đường truyền sóng qua 1cm).

Protein

Hệ số tắt

Protein

Hệ số tắt

Protein

Hệ số tắt

IgG

13,6

Chuỗi γ

13,7

Oncanavalin A

120

IgM

11,8

Chuỗi µ

13,9

IgA

13,2

Chuỗi 

12,3

IgD

15,3

Chuỗi nhẹ

12,3

Lactin Lens
Calinaris
BSA

12.5
6.7

Bảng 3: Hệ số tắt của các loại Protein liên quan với hệ miễn dịch ở bước sóng
280nm

4.2.

Cách tiến hành:

Nguyên liệu: Dung dịch Protein để đo, đệm hòa tan Protein
Thiết bị: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng là 1cm
Quá trình gồm các bước sau:

23


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong thể
huyền phù. Lấy dịch nổi để xác định mật độ quang học.
Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thụ
về 0 với cuvet chứa đệm.
Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu. Nếu giá trị thu được > 2,0 thì
pha loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng truyền ngắn hơn (2mm) cho đến
khi số đọc được nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5.
Bước 4: Lặp lại bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm.
Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm. Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu lớn
hơn 0,6 thì Protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic.

4.3.

Tính kết quả:
Nồng độ Protein =

độ hấp thụ ở 280nm
hệ số tắt ở 280nm

Với một hỗn hợp các Protein hoặc với bất kỳ một loại Protein nào mà không
biết hệ số tắc thì tính như sau:
Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ ở 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ ở 260nm)
Đơn vị: mg/ml
Có thể phỏng đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu ở 280nm/độ hấp
thu ở 260nm).

4.4.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ Protein trong dung dịch.
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ Protein thấp
(dưới 0,05- 0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng vùng cực
tím (ví dụ: đệm, acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi Protein ở trong dung
dịch huyền phù.

24


Các phương pháp định lượng protein.

GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam

So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn,
mẫu dùng lại thường ổn định hóa phần lớn Protein.

5. Phương pháp huỳnh quang O-Phthalaldehyde (OPA):
5.1.

Nguyên tắc:

Dựa vào phản ứng giữa O-Phthalaldehyde (OPA) với các amin có mặt trong
chuỗi polypeptide (từ đầu đến cuối mạch kể cả chính và phụ). Phản ứng xảy ra
nhanh trong sự có mặt của mercaptoethanol tạo sản phẩm huỳnh quang có màu
xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng 340nm -450nm.

5.2.

Độ nhạy và khả năng ứng dụng:

Độ nhạy rất cao đạt tới 50ng/ml. Có thể phát hiện ra đúng đắn peptide thậm
chí nhỏ. Phương pháp này sử dụng cho những chất không chứa các amin khác với
các amin trong chuỗi polypeptide.

6. Phương pháp định lượng amoniac
6.1.

Nguyên tắc:

Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chứa một loại nitơ nằm dưới dạng vô cơ
(muối ammonium hay những amin dễ bay hơi ). Đây là dạng nitơ tạo thành do sự
phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc trong quá trình khử carbonxyl của
amino acid). Những loại nitơ này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng
với MgO thì những loại nitơ nói trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ
được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa axit. Sau đó đem định
phân lượng axit dư, cho phép ta xác định được loại nitơ này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2
2NH3 + H2SO4

2NH3 +

2H20 + Mg2+

(NH4)2SO4

25