Tổng hợp hạt PLGA PFOB mang gd3+ và PSS sử dụng trong theo dõi tế bào bằng cộng hưởng từ hạt nhân




NTTU-NCKH-04

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài: Tổng hợp hạt PLGA PFOB mang Gd3+ và PSS sử dụng trong theo dõi tế bào
bằng cộng hưởng từ hạt nhân
Số hợp đồng: 2019.01.10

Chủ nhiệm đề tài: Vũ Quang Hiếu
Đơn vị công tác: Viện Kỹ Thuật Công Nghệ Cao
Thời gian thực hiện: Tháng 01 đến tháng 09/2019

TP. Hồ Chí Minh, ngày 27 tháng 02 năm 2020


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài: Tổng hợp hạt PLGA PFOB mang Gd3+ và PSS sử dụng trong theo dõi tế bào
bằng cộng hưởng từ hạt nhân
Số hợp đồng : 2019.01.10

Chủ nhiệm đề tài: Vũ Quang Hiếu
Đơn vị công tác: Viện Kỹ Thuật Công Nghệ Cao
Thời gian thực hiện: Tháng 01 đến tháng 09/2019


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MRI Magnetic Resonance Imaging
Gd3+ - DTPA - BSA

DTPA-bis(stearylamide) (gadolinium salt)

PLGA

poly(lactic-co-glycolic acid)

PSS

poly(styrene sodium sulphonate)

PVA

poly(vinyl alcohol)

PFOB

Perfluorooctyl bromide

DCM

Dicloromethane

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

TEM

Tranmission Electron Microscope

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Bảng 1: Bảng thể hiện kích thước, điện tích, đơ đồng nhất và hiệu suất tải PFOB của
hạt nano fluorine
Hình1:cấutrúcdự đốn củahạtPSSphủGd3+@NP
Hình2:Hìnhdạngcủahạtmicro@luorine.A,hạt đốichứng,BvàC,hạtmicro
Gd3+@PLGAPFOBởtỷlệW1/10vàW1/20.
Hình3:HìnhảnhTEMcủahạtNPvàPSSphủGd@NP(W1/20)
Hình4:ThờigiangiãnhồiT1củahạtGd3+@NPvớicáctỷlệW1/10,W1/20và1/30
sovớihạtPVAphủNP,PSSphủNPvàPFOBtrongCDCl3trênhaikênh19FMRIvà1H
MRI.
Hình5:ThờigiangiãnhồiT2củahạtGd3+@NPvớicáctỷlệW1/10,W1/20và1/30
sovớihạtPVAphủNP,PSSphủNPvàPFOBtrongCDCl3trênhaikênh19FMRIvà1H
MRI.
Hình6:Thínghiệmvềảnh hưởngsứcsốngcủatế bào đốivớicácloạihạtnanokhác
nhau.N=4
Hình7:CáctếbàohMSCthunhậnhạtPSSphủGd3+@NPthơngquaxâmnhậpnội
bàocaveolae.Hìnhtrênbiểu đồdâytrìnhdiễnsốtếbàonhậnhạtnanovàonộibào.
Biểu đồcộtthểhiệngiátrịtrungbìnhcủa đồthịdây.
Hình8:Hìnhảnh1HMRIvà19FMRIcủatế bào đươc đánh dấuPSSphủNP(A)và
PSSphủGd3+@NP.Sốtế bào đượcsửdụngtrongthínghiệmlà2x106


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đề tài tập trung phát triển hạt PSS phủ Gd3+@NP sử dụng cho việc đánh dấu và theo
dõi tế bào bằng kỹ thuật MRI. Sau nghiên cứu, kết qủa đạt được với 3 nội dung đề ra
Nôị dung 1: Tổng hợp được hạt PSS phủ Gd3+@NP có cấu trúc lõi vỏ, ứng dụng trong
đánh dấu và theo dõi tế bào sử dụng MRI
Nội dung 2: Gd3+ có hiệu ứng làm giảm thời gian T1 của nước trên kênh 1H MRI, do đó

làm tăng tín hiệu của nó. Gd3+ có ảnh hưởng đến thời gian giãn hồi của nước và PFOB
trên cả hai kênh 1H MRI và 19F MRI.
Nội dung 3: Đánh dấu và lấy hình ảnh thành công tế bào hMSC sử dụng hạt PSS phủ
Gd3+@NP.

Sản phẩm thực đạt được
Báo khoa học cấp trường

Sản phẩm đăng ký tại thuyết minh
Báo khoa học cấp trường

Thời gian đăng ký :

từ ngày

Thời gian nộp báo cáo: 


03.2019

đến ngày 12.2019


MỞ ĐẦU
Giới thiệu
Cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) là một trong những phương pháp theo dõi tế bào gốc
hậu cấy ghép hiệu quả nhất nhờ khả năng cung cấp những hình ảnh mơ học nhanh
nhạy và chi tiết. Trong đó, kỹ thuật

19F

MRI có một số ưu điểm nhất định như cung cấp

những hình ảnh chuyên biệt đặc hiệu và số lượng tế bào được đánh dấu.
Mục tiêu
Đề tài nghiên cứu tổng hợp hạt nano polymer có khả năng mang fluorine và chất cảm
từ Gd3+, nhằm tăng hiệu quả đánh dấu và theo dõi tế báo gốc sau khi cấy ghép. Hạt
nano sau đây được gọi là PSS phủ Gd3+@NP.

Nội dung
1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Gd3+ lên hình dạng của hạt nano sau tổng hợp
2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Gd3+ lên tín hiệu MRI
3 So sánh hình ảnh của tế bào gốc sau khi được đánh dấu với các loại hạt nano

Kết quả
1, Khi thêm Gd3+- DPTA -BSA vào hỗn hợp polymer PLGA để tổng hợp hạt. Tỷ lệ khối
lượng giữa Gd3+ và Polymer càng cao thì hình dạng của hạt càng bị biến đổi, so với hạt
đối chứng càng nhiều.
2. Sự xuất hiện của Gd3+ trên vỏ hạt nano làm thời gian giãn hồi T1 và T2 của nước và
Fluorine ngắn hơn, từ đó làm thay đổi tín hiệu MRI và tương phản hình ảnh.


3. Tính hiệu MRI giữa các tế bào gốc được đánh dấu với các loại hạt nano khác nhau.
Tín hiệu MRI của tế bào gốc được đánh dấu với hạt PSS phủ Gd3+@NP cho hình ảnh
rõ hơn trên 2 kênh 19F MRI và 1H MRI.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) là một kỹ thuật chẩn đốn hình ảnh phổ biến trong y
học. Trong đó, tín hiệu của MRI chủ yếu được thu nhận từ sự cộng hưởng tần số của
các phân tử nước có trong cơ thể. Theo nguyên tắc, sau khi tác động một sóng điện từ
(Radio frequency pulse) có tần số cộng hưởng cùng tần số với hạt nhân của nguyên tử

được kích thích ví dụ như hạt nhân của nguyên tử hydro trong phân tử nước, hoặc hạt
nhân nguyên tử fluorine. Sau khi tiếp nhận sóng kích thích hạt nhân ngun tử này sẽ
phát ra sóng phản hồi. Lõi từ của máy MRI sẽ ghi nhận tín hiệu này và chuyển thành
hình ảnh MRI. Vì lượng nước phân bố ở các cơ quan và mô là khác nhau, cho nên tín
hiệu MRI là khác nhau, tạo nên tương phản hình ảnh giữa hai mơ.
Năng lượng phát ra từ các hạt nhân được ghi nhận dưới hai dạng T1 và T2. Trong đó,
T1 là thời gian để vector từ của hạt nhân được kích thích giãn hồi về 2/3 vị trí ban đầu
theo trục dọc và T2 là thời gian để vector từ của hạt nhân giãn hồi đến 1/3 thời gian
trước khi bị de-phase. T1 và T2 là một trong những yêú tố quyết định ảnh hưởng đến
độ tương phản trong hình ảnh MRI. Ví dụ, nếu làm giảm thời gian giãn hồi T1 nó sẽ làm
tăng tín hiệu MRI (hình ảnh sáng lên). Ngược lại, nếu làm giảm thời gian giãn hồi T2,
thì tín hiệu MRI bị giảm (hình ảnh bị tối đi).
Trong chẩn đốn hình ảnh bằng kỹ thuật MRI, Gd3+ và Super paramagnetic iron oxides
nanoparticles (SPION) được sử dụng rộng rãi để tạo tương phản nhằm tăng độ chính
xác trong chẩn đốn bệnh [1]. Gd3+ có khả năng tăng tín hiệu MRI vì chúng có khả
năng làm giảm T1 của hạt nhân được kích thích. Trên hình ảnh, tín hiệu MRI tại vị trí
có sự hiện diện của Gd3+ sẽ sáng hơn so với những vùng cịn lại, từ đó chỉ ra được
vị trí của tế bào được đánh dấu. Ngược lại, do SPION làm giảm thời gian giãn hồi T2


của các hạt nhân, do vậy tín hiệu thu được có xu hướng sậm màu từ đó làm tăng độ
tương phản giữa nhóm tế bào, mơ được đánh dấu so với mơi trường xung quanh.
Tế bào gốc có nhiều ứng dụng quan trọng trong chữa trị y học vì chúng có khả năng
biệt hố thành nhiều loại tế bào chức năng [2]. Tuy nhiên, việc theo dõi tế bào gốc sau
cấy ghép là cần thiết vì chúng sẽ cung cấp nhiều thơng tin cần thiết về q trình sinh
sản và biệt hố của các tế bào này. Có nhiều phương pháp và kỹ thuật để theo dõi tế
bào sau cấy ghép [3]. Tuy nhiên, sử phương pháp theo dõi tế bào bằng cộng hưởng từ
hạt nhân MRI có nhiều thuận lợi [4]. Thứ nhất, MRI là phương pháp chẩn đoán và theo
dõi khơng xâm phạm, do đó tế bào được theo dõi vẫn có thể phát triển bình thường và
khơng bị tổn thương. Thứ hai, có thể theo dõi liên tục tế bào gốc mà không sợ bị phơi

nhiễm tia phóng xạ như trong sử dụng phương pháp cắt lớp. Thứ ba, MRI có khả năng
cung cấp hình ảnh và thơng tin chi tiết về vị trí của mơ hay tế bào được cấy ghép cungc
như mô và tế bào xung quanh .
Trong nghiên cứu, tế bào được đánh dấu với nhiều chất tạo tương phản như
(SPION), hoặc Gadolimium (Gd3+) trước khi cấy ghép nhằm dễ dàng theo dõi và đo
đạc hiệu quả cấy ghép bằng MRI [3-5]. Trong đó, SPION là chất tạo tương phản để
đánh dấu tế bào phổ biến nhất vi nó rất nhạy trong MRI. Tuy nhiên, nhược điểm lớn
nhất của nó là dễ bị lẫn lộn với những mơ, cơ quan khác do có thời gian giãn hồi T2
thấp như máu đông, xương và không khí. Thêm vào đó, tính cảm từ của các hạt
SPION là khá lớn cho nên nó có thể lan rộng ra các vùng xung quanh, gây khó khăn
cho việc xác định chính xác vị trí của các tế bào được đánh dấu [6]. Ngược lại, Gd3+
cho hình ảnh sáng hơn trong MRI, do rút ngắn thời gian giãn hồi T1. Do vậy, hình
ảnh của tế bào được đánh dấu sáng và nổi bật hơn so với các vùng mô xung quanh.
Vì những lý do này, mà Gd3+ được sử dụng rộng rãi trong MRI để tăng cường độ đặc


hiệu trong chẩn đốn hình ảnh [7]. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho rằng, Gd3+
chelate có ảnh hưởng khơng tốt lên thận, và hạn chế sử dụng đối với các bệnh nhân
có tiền sử về bệnh thận. Do vậy, đánh dấu Gd3+ trực tiếp lên tế bào có nhiều rủi ro do
Gd3+ có khả năng rời khỏi tế bào và vào thận. Đồng thời, hiệu quả đánh dấu tế bào
của Gd3+ cũng khơng cao do chúng khơng có chất đánh dấu.
Trong một vài nghiên cứu gần đây, hạt nhân fluorine (19F) được ứng dụng và dùng
để tạo hình ảnh trong MRI do chúng có một số thuận lợi sau. Thứ nhất, hình ảnh
được tạo từ fluorine là hình ảnh chun biệt, nổi bật và khơng xuất hiện tín nền. Thứ
hai, các hợp chất fluorine sử dụng trong tạo hình ảnh là các hợp chất fluorine trơ,
không tương tác với cơ thể như PFOB hay PFCE nên rất an toàn và có thể sử dụng
trực tiếp lên người. Do đó, sử dụng các hợp chất fluorine cho đánh dấu và theo dõi tế
bào có khả năng ứng dụng cao [8-10].
Một số hợp chất fluorine được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hình ảnh MRI là
PFOB và PFCE. Trong đó, PFOB được sử dụng như máu nhân tạo cung cấp oxy cho

mơ tế bào trên người do chúng có độ trơ trong phản ứng hố học và an tồn cao. Vì
có tính trơ cao nên PFOB khơng tan trong nước và các dung mơi hữu cơ, vì vậy
khơng thể sử dụng PFOB trưc tiếp để tiêm truyền vào tĩnh mạch hay đánh dấu tế
bào. Do đó, PFOB thường được bọc trong vi hạt trước khi được sử dụng [8,11,12].
PFOB có thể tồn tại dưới dạng vi huyền phù hoặc bọc trong lớp vỏ polymer
[13,14]. PFOB tồn tại dưới dạng vi huyền phù có hình dạng khơng ổn định, chúng có
thể hoà tan và nhau và tạo ra các thể hạt lớn hơn. Trong các nghiên cứu trước đây,
PFOB được bọc trong lớp vỏ polymer PLGA, có cấu trúc hình cầu ổn định. Đồng
thời, có thể biến đổi và gắn kết các ligand, thuốc lên lớp vỏ PLGA nhằm tăng cường
khả năng điều trị trúng đích. Ví dụ, hạt PLGA PFOB (NP) được gắn kết với ligand


RGD hay Folic acid nhằm tăng cường hiệu quả đến của việc chẩn đốn ung thư
trúng đích trong mơ hình chuột. Gần đây hơn, hạt NP được bao phủ với lớp poly
Styrene Sodium Sulphonate (PSS) để tăng cường hiệu quả đánh dấu tế bào gốc
trong việc theo dõi tế bào gốc sau cấy ghép [10,15]. Nghiên cứu cũng chỉ ra một số
ưu điểm của việc sử dụng hạt NP đánh dấu và theo dõi tế bào gốc sau khi cấy ghép
như hình ảnh theo dõi có độ tinh cậy cao, lâu dài và khơng tác động đến q trình
biệt hố của tế bào cấy ghép. Tuy nhiên, hạt có một số điểm hạn chế như tín hiệu
MRI từ hạt cịn thấp, cần một thời gian dài để scan hình, thơng tin giải phẫu học tại vị
trí cấy ghép cịn thiếu.
Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu phát triển hạt NP mang chất phủ PSS và
Gd3+ nhằm tăng cường hiệu quả chẩn đốn hình ảnh bằng MRI.


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nội dung: Đề tài được chia ra làm ba nội dung chính
Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Gd3+ lên hình dạng của hạt nano sau tổng
hợp

Nội dung nghiên cứu sự ảnh hưởng của Gd3+ - DPTA- DSPE lên hình dạng của NP sau
tổng hợp. Cụ thể Gd3+ - DPTA- DSPE được phối trộn vào PLGA theo tỷ lệ khối lượng
lần lượt là 1/10, 1/20, 1/30. Sau đó, hình dạng của hạt Gd3+@NP sẽ được quan sát
bằng kính hiển vi điện tử huỳnh quang sử dụng tia laser và kinh hiển vi điện tử electron.
Từ đó, rút ra kết luận về tỷ lệ khối lượng của Gd3+ được đưa vào.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ Gd3+ lên tín hiệu MRI
Nghiên cưú ảnh hưởng của Gd3+ hiện diện trên lớp vỏ NP lên thời gian giãn hồi T1 và
T2 của các phân tử nước và PFOB trên hai kênh hình ảnh 1H MRI và

19F

MRI. Từ đó

rút ra kết luận ảnh hưởng của chúng lên hình ảnh MRI.
Nội dung 3: So sánh hình ảnh của tế bào gốc sau khi được đánh dấu với các loại hạt
nano.
Đánh giá ảnh hưởng của hạt PSS phủ Gd3+ @NP lên sức sống của tế bào, hiệu quả
đánh dấu tế bào và khả năng đưa hình ảnh trong MRI. Từ đó rút ra kết luận về khả
năng đánh dấu tế bào của hạt PSS phủ Gd3+ @NP.


Vật liệu và phương pháp thí nghiệm
Nguyên liệu
Các nguyên liệu được mua từ hãng Sigma Aldrich. Các nguyên liệu còn lại sẽ được
nhắc tới trong bài.

Tổng hợp hạt PSS phủ Gd3+@NP
Chuẩn bị
Quy trình tổng hợp hạt PSS phủ Gd3+@NP được phát triển dựa trên phương pháp
được huyền phù một lần và làm theo mô tả trong các nghiên cứu trước với một số biến

đổi nhỏ [10,16].
Pha hữu cơ: PLGA (50 mg) và PFOB (15 µl) được hồ tan trong 2 ml DCM. Sau đó,
DSPE-DPTA-Gd3+ 50 µl methanol với tỷ lệ khối lượng 0/10 (đối chứng), 1/10, 1/20 và
1/30 so với PLGA được thêm vào hỗn hợp trên. Hỗn hợp dung mơi hữu cơ trên sau đó
được khuấy đều cho đến khi trong suốt.
Pha nước: Đồng thời chuẩn bị dung dịch làm giảm sức căng bề mặt Sodium Cholate
(1.5%) trong nước khử ion, giữ lạnh.

Huyền phù tạo hạt micro Gd3+ @NP cho quan sát hình dạng bằng kính hiển vi
điện tử huỳnh quang sử dụng tia laser
Trước khi huyền phù, 2 µl Coumarin 6 (10 mg/ml) trong DCM được cho vào pha hữu
cơ. Coumarin – 6 sẽ phát huỳnh quang trên kính hiển vi điện tử. Cou-6 cũng được sử
dụng để tổng hợp hạt nano phát huỳnh quang cho các thí nghiệm sau.


Hai pha nước (10 ml) và hữu cơ được (2ml) chứa các tỷ lệ khối lượng Gd3+ khác nhau
được trộn chung với nhau trong ống Falcon 50 ml. Sau đó, ống được vortex trong 2
phút với tốc độ 5000 rpm. Huyền phù sau đó được đổ ra cốc Becker 50 ml, khuấy 100
rpm trong tủ hút 6h hoặc cho đến khi pha hữu cơ bay hơi hết. Các hạt này sau đó được
trãi lên lame và chụp hình bằng kính hiển vi điện tử huỳnh quang sử dụng tia laser.

Huyền phù tạo hạt nano PSS phủ Gd3+ @NP
Trộn hỗn hợp hai pha nước và pha hữu cơ vào với nhau trong ống Falcon, rồi vortex
2000 rpm trong một phút. Hỗn hợp huyền phù sau đó được đánh sóng siêu âm với
công suất 50 W trong 2 phút trên nước đá. Sau đó, pha hữu cơ của huyền phù được
khuấy cho bay hơi trong 6h (hoặc cho đến khi DCM bay hơi hoàn toàn).
Tiếp theo, cho 2 ml dung dịch polymer PSS 5% vào dung dịch hạt Gd3+@NP, ủ trong 5
ngày tại 4oC. Hạt được thu bằng ly tâm lạnh ở với tốc độ 2000 rcf trong 30 phút, thu
lắng. Dịch nổi tiếp tục được ly tâm với tốc độ 4000 rcf trong 30 phút, thu lắng. Hạt sau
đó được tái huyền phù (resuspend) trong nước. Lấy 50 µl dung dịch đem đơng khơ để

xác định trọng lượng hạt có trong nước.

Xác định hình định hình dạng hạt micro NP
Hình dạng của hạt micro NP được quan sát bằng máy Confocal laser scanning
microscope, Carl Zeiss, Đức.

Xác định kích thước và điện tích hạt


Kích thước và điện tích hạt được xác định bằng đo máy Malvern Zeta sizer,
Wrochester, Vương Quốc Anh. Lấy 10 µl dung dịch chứa hạt nano NP cho vào 1 ml
nước khử ion. Sau đó, mẫu được đưa vào cuvette và đo 4 lần lập lại.

Xác định kích thước hạt nano bằng chụp kính hiển vi electron

(Transmission

Electron Microscope)
Dung dịch chứa hạt được pha lỗng 100 lần. Tiếp, 10 µl dung dịch hạt load trên lưới
đồng, sau đó được nhuộm với 10 µl uranyl trong 30 giây, rửa lại 10 µl với nước 10 phút
và phơi khô. Các hạt nano được quan sát với máy TEM Tecnai, 120 kV.

Đánh giá tác động của hạt nano lên tế bào gốc rốn (hMSC)
Tế bào hMSC- Tert được nuôi cấy trên dĩa 96 giếng với mật độ 10.000 tế bào / giếng và
được nuôi qua đêm. Tế bào sau đó được ủ với PSS phủ NP, PSS phủ Gd3+@NP,
w1/10, w1/20, w1/30 với nồng độ 1 mg/ml trong 1 ngày. Sức sống của tế bào được
đánh giá bằng kỹ thuật MTT assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5 diphenyltetrazolium
bromide) theo quy trình của nhà sản xuất.

Đánh giá hiệu quả đánh dấu tế bào bằng máy phân loại tế bào

Các tế bào hMSC-TERT sau khi được đánh dấu với hạt PSS phủ Gd3+@NPs chứa
Coumarin 6 ở nồng độ 0.5 mg/mL trong 4h trên dĩa nuôi cấy 12 giếng. Tế bào sau đó
được rửa với PBS 3 lần, thu hoạch và được phân tích bằn máy Gallios Flow cytometer
(Beckman Coulter, CA, USA).


Để đánh giá con đường đánh dấu tế bào thông qua cổng Caveolae, PSS tự do (0.5 mg/
mL) được sử dụng làm chất đánh dấu cạnh tranh với hạt PSS phủ NP và PSS phủ
Gd3+@NP. Kết qủa thí nghiệm được thu thập trên 10.000 tế bào với 4 lần lặp lại.

Đánh giá thời gian giãn hồi T1.
Các thí nghiệm MRI được thực hiện trên máy MRI Bruker, 16.4 Tesla, trục đứng, với lõi
từ 2 kênh 1H/ 19F dual coil (Bruker, Germany).
Trong thí nghiệm, tất cả mẫu được cho vào ống thủy tinh và đặt trong ly chứa nước.
Sau đó, mẫu được đặt vào trung tâm của lõi từ để quét. Muối chelate Gd3+ với nồng độ
0.1 mg/ml và nước được sử dụng làm thông số tham chiếu.
Bản đồ thời gian giãn hồi T1 được lấy bằng chương trình RARE VTR với thời gian nghĩ
giữa 2 xung (TR) từ 320 ms đến 12.000 ms. Các thông số của bản đồ T1 được thực
hiện với độ dày 1 slice 0.5 mm, ma trận ảnh 128 x 128, diện tích ảnh (FOV) 25 x 25
mm2, số lần quét (ns) 20 trên kênh 1H MRI và độ dày slice 15 mm, ma trận 64 x 64, ns
20 lần cho kênh 19F MRI.
Bản đồ B1 về độ đồng nhất của các xung được xác định bằng cách chạy chương trình
MSME với 2 góc tác động 90o – 180o và 45o-90o, thời gian echo (TE) 20 ms, ns 5, ma
trận ảnh 64 x 64. Bản đồ giãn hồi T1 và bản đồ đồng nhất xung được tính tốn bằng
phần mềm Matlab 2019b.

In vitro 19F MRI và 1H MRI
Thí nghiệm được thực hiện để đánh giá hiệu quả đánh dấu tế bào và tác động của hạt
PSS phủ Gd3+@NP lên tế bào gốc hMSCs trên hai kênh hình ảnh 1H MRI và

19F

MRI.

Tế bào hMSCs được cấy ở mật độ 106 tế bào trong bình ni cấy T75 và nuôi qua đêm.


Sau đó, tế bào này được đánh dấu với các hạt PSS phủ Gd3+@NP với nồng độ 1 mg/
mL trong 10 mL dịch ni cấy trong 36 h. Sau đó, các tế bào nuôi cấy được được rửa
ba lần với dung dịch PBS, 20 mL/lần. Sau đó, tế bào được thu hoạch đếm và lưu trữ
trong HCHO 4% qua đêm. Khoảng 2x106 tế bào sau đó được cho vào ống thuỷ tinh
NMR, để lắng và đặt trong cốc nước để scan MRI. Tế bào khơng đánh dấu, và PFOB
3.85 µmol trong CDCl3 được sử dụng làm đối chứng âm và dương.

Hình ảnh 1H MRI được quét bằng chương trình fast low angle shot sequence
(FLASH ) với TR 100 ms, te 4 ms, bề dày slice 0.5 mm, ns 10, ma trận ảnh 64 x 64,
diện tích ảnh 24 x24 mm2.
Hình ảnh

19F

MRI được quét bằng chương trình MSME với TR 5000 ms, TE 7.64 ms,

bề dày slice 20 mm, ns 15, ma trận ảnh 32x32, diện tích ảnh 24x24 mm2. Tần số kích
thích -83 ppm.


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
<Nêu rõ các kết quả thu được trong quá trình thực hiện đề tài>

Trong dự án nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp hạt nano cảm ứng từ có khả năng
tăng cường độ tương phản trong chụp cộng hưởng từ MRI ở hai kênh hydro và
fluorine. Hạt nano sau tổng hợp có ứng dụng đánh dâú và theo dõi tế bào gốc sau cấy
ghép bằng phương pháp không xâm phạm MRI. Hạt nano được thiết kế có cấu trúc lõi
và vỏ như hình 1. Trong đó, lõi của hạt là chất lỏng PFOB, chất cảm từ có khả năng tạo
hình ảnh MRI trên kênh

19F.

Cịn vỏ của hạt được hình thành bởi polymer có thể phân

huỷ sinh học PLGA. Trên lớp vỏ PLGA được bổ sung thêm DPTA-BSA-Gd3+ với mục
đích tạo hình ảnh tương phản trên kênh 1H MRI. Ngồi ra, hạt cịn được phủ một lớp
polymer PSS nhằm tăng cường hiệu quả đánh dấu tế bào gốc qua con đường xâm
nhập nội bào caveolae.

Hình dạng của hạt khi chúng được gắn kết với DTPA-BSA-Gd3+ trên lớp vỏ
Cấu trúc và hình dạng của hạt nano đóng vai trị quan trọng trong hiệu quả tải và vận
chuyển thuốc. Trong quá trình tổng hợp hạt fluorine nano, hình dạng và cấu trúc hạt
chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố bao gồm pha hữu cơ, tỷ lệ giữa các vật liệu và loại
chất làm giảm sức căng bề mặt. Chất làm giảm sức căng bề mặt polymer poly vinyl
alcohol (PVA) sẽ tạo cấu trúc hạt hình quả sồi, trong khi chất làm giảm sức căng bề mặt
sodium cholate lại cho cấu trúc hạt theo hướng lõi –vỏ [13]. Ngoài ra, khi thêm polymer
polylactic acid vào hỗn hợp polymer tạo vỏ, hình dạng của hạt biến đổi từ hình cầu
sang hình trứng [17]. Hạt nano hình cầu có cấu trúc lõi hạt có ưu điểm hơn so với các
cấu trúc cịn lại do chúng có độ đồng nhất về hình dạng cũng như khả năng tải fluorine


hiệu quả. Do vậy, chúng tôi chọn phương pháp được mô tả của Pisani và cộng sự
(2008) để tạo hạt nano [13]. Tuy nhiên, do DTPA-BSA-Gd3+ được thêm vào trong quá

trình tổng hợp hạt. Do vậy, để kiểm tra cấu trúc và hình dạng hạt sau tổng hợp, chúng
tơi sử dụng hai phương pháp. Thứ nhất, tổng hợp hạt fluorine có kích thước micro và
quan sát cấu trúc của chúng sử dụng kính hiển vi huỳnh quang sử dụng tia laser.
Phương pháp thứ hai, tổng hợp hạt nano fluorine và quan sát hình dạng bằng TEM.
Ở phương pháp thứ nhất, hạt micro Gd3+@NP được đánh dấu với chất phát hiện huỳnh
quang Coumarine 6 (Cou-6). Cou – 6 có khả năng hấp phụ trong lớp vỏ PLGA của hạt,
do đó cho phép chúng ta quan sát hình dạng hạt bằng kính hiển vi huỳnh quang (hình
2). Trên khi cho DTPA-BSA-Gd3+ vào hỗn hợp polymer cấu thành lớp của hạt fluorine,
hạt thay đổi cấu trúc từ dạng một lõi vỏ sang dạng nhiều lõi vỏ. Khi tỷ lệ DTPA-BSAGd3+ có trong hỗn hợp càng cao thì tỷ lệ lõi càng nhiều và to. Ở tỷ lệ DTPA-BSA-Gd3+ /
PLGA thấp, cấu trúc của hạt chứa DTPA-BSA-Gd3+ gần như giống với hạt fluorine đối
chứng.
Cấu trúc và hình dạng hạt nano fluorine được tiếp tục kiểm tra bằng TEM. Hình ảnh
TEM cho thấy khơng có sự khác biệt giữa cấu trúc Gd3+@NP at W20 and NP (hình 3),
mặc dù có một vài lõi nhỏ xuất hiện trên hạt nano fluorine. Các lõi nhỏ này có thể là kết
quả của sự hiện diện của DTPA-BSA-Gd3+ trong cấu trúc của hạt Gd3+@NP.

Hiệu quả tải PFOB của hạt nano Gd3+@NP
Thay đổi cấu trúc hạt, cũng làm thay đổi hiệu suất tải PFOB lên hạt. Do đó, hiệu suất tải
PFOB được kiểm tra và trình diễn trong bảng 1. Hiệu suất tải PFOB lên hạt NP vào
khoảng 80%, và kết quả này tương đương với số liệu được báo cáo trong những
nghiên cứu trước [13]. Tuy nhiên, khi có sự xuất hiện của DTPA-BSA-Gd3+ trong lớp vỏ


của hạt nano fluorine, hiệu suất tải PFOB giảm xuống còn 76% , 72% và 64% với các tỷ
lệ lần lượt ở w1/30, w1/20 và w1/10.

Kích thước và điện tích của hạt nano Fluorine
Kích thước, độ đồng nhất và điện tích hạt fluorine đóng vai trị qua trọng trong hiệu quả
đánh dấu tế bào. Hạt nano có kích thước càng nhỏ thì hiệu suất đánh dấu tế bào càng
cao, thơng thường kích thước hạt dưới 200 nm là tốt cho việc đánh dấu. Ngồi ra, điện

tích trên bề mặt hạt cũng ảnh hưởng hiệu quả đánh dấu tế bào. Các nghiên cứu trước
đã sử dụng chitosan để phủ hạt NP để đánh dấu tế bào hMSC [8]. Nghiên cứu báo cáo
hiệu quả cao của việc sử dụng chitosan trong đánh dấu tế bào, tuy nhiên do chitosan
mang điện tích dương nên nó ảnh hưởng đến sức sống của tế bào. Trong nghiên cứu
trước, chúng tôi đã sử dụng polymer PSS mang điện tích âm để đánh dấu hMSC [10].
Kết quả cho thấy PSS không những đạt hiệu quả cao trong đánh dấu tế bào, mà chúng
cịn khơng ảnh hưởng đến sức sống và khả năng biệt hoá của chúng. Do đó, trong thí
nghiệm này, chúng tơi kiểm tra kích thước và điện tích hạt nano fluorine sau khi thêm
DTPA-BSA-Gd3+ và phủ PSS. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tất cả các hạt PSS phủ
Gd3+@NP đều có kích thước nhỏ hơn 200 nm, với độ đồng nhất cao (PDI < 0.2). Điện
tích của tất cả các hạt phủ PSS khoảng -50 mV, trong khi hạt đối chứng PVA phủ NO có
điện tích khoảng -10.4 mV. Điện tích âm của các hạt PSS phủ Gd3+@NP là kết quả của
sự hiện diện của PSS trên bề mặt PLGA. PSS gắn kết lên PLGA thông qua các liên vật
lý giữa các mạch kỵ nước của polymer PSS và các mạch kỵ nước của PLGA. Trong khi
đó, các nhóm styrene sulphonate làm điện tích âm cho hạt fluorine [15].


Thời gian giãn hồi T1 của hạt PSS phủ Gd3+@NP
Như được giới thiệu ở phần trên, Gd3+ là chất cảm từ sử dụng phổ biến trong MRI để
làm giảm thời gian giãn hồi T1 của các vector từ khi chúng tới gần Gd3+. Trong thí
nghiệm này, chúng tơi đánh giá hiệu ứng của Gd3+ lên tín hiệu MRI và thời gian giãn hồi
của các vector từ của hydro trong nước và fluorine trong PFOB. Dựa trên kết quả MRI
(hình 4), thời gian giãn hồi T1 của phân tử nước trong ống PSS phủ NP và PVA phủ NP
là 2.7 giây thấp hơn thời gian giãn hồi T1 của phân tử nước trong ly nước (3 giây). Tuy
nhiên, khi có sự xuất hiện của Gd3+ trên lớp vỏ hạt nano PSS phủ Gd3+@PLGA , thời
gian giãn hồi là 1.5 s, 2.02 s and 2.04 s lần lượt cho tỷ lệ Gd3+ có trên hạt PLGA là 1/10,
1/20, 1/30. Thời gian giãn hồi của các phân tử nước ở hạt Gd3+@NP có tỷ lệ w1/10 là
thấp hơn ở tỷ lệ w1/20 và w1/30, kết quả này cho thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệ Gd3+ có
trên lớp vỏ của hạt nano. Tỷ lệ Gd3+ càng cao thì thời gian giãn hồi T1 của vetor từ của
nước càng nhiều. Kết quả trên có thể được giải thích như sau. Sau khi hấp thu sóng

kích thích, cách vector từ của nước khuyếch tán đến gần phân tử Gd3+ và trao đổi năng
lượng, do đó làm giảm thời gian giãn hồi T1. Vì mật độ Gd3+ có trên bề mặt của hạt
PSS phủ Gd3+@PLGA W1/10 là cao hơn, do đó chúng có hiệu ứng cao và làm giảm
thời gian giãn hồi T1 của các vector từ của nước.
Trái ngược với kết quả về thời gian giãn hồi T1 của nước, thời gian giãn hồi của PFOB
trong tất cả các ống là 1.2 s và không có sự khác biệt rõ ràng giữa các ống. Nguyên
nhân có thể do các vector từ của các nguyên tử fluorine nằm trong lõi hạt nano không
tiếp xúc trực tiếp và trao đổi năng lượng với Gd3+ nằm trên lớp vỏ và mặt ngoài của hạt.
Kết quả của đề tài này có sự khác với các nghiên cứu trước về mối liên hệ giữa Gd3+
và PFOB [18]. Sự khác biệt này có thể liên quan đến thành phần cấu tạo lớp vỏ bên
ngoài của các của các hạt nano fluorine. Trong đề tài của chúng tôi, các hạt nano


fluorine được cấu thành từ polymer PLGA, trong khi nghiên cứu trước thực hiện trên
trên lớp màng phospholid. Sau khi dung môi hữu cơ bay hơi hết, lớp vỏ PLGA trở nên
rắn chắc, do đó Gd3+-DPTA-BSA được cố định trên lớp vỏ PLGA. Ngược lại, nghiên cứu của
nhóm trước sử dụng hạt fluorine dưới dạng huyền phù, cho nên chúng kém ổn định và Gd3+-

DPTA-BSA có thể lật vào bên trong lõi và trao đổi năng lượng với các vector từ fluorine.
Bên cạnh đó, thời gian giãn hồi T1 của PFOB trong ống đối chứng là cao hơn rất nhiều
so với PFOB có trong lõi của hạt nano. Sự khác biệt này có thể bằng mật độ PFOB có
trong ống đối chứng thấp hơn do vậy các vector từ của PFOB rung động tự do tốt hơn
so với PFOB chưa pha loãng trong lõi hạt nano. Kết quả trên cho thấy, khi chọn lựa các
thơng số cho các chương trình quyét MRI, khỏang thời gian TR giữa hai lần lập lại để
đạt được chất lượng tương phản tốt nhất cho thời gian T1 trong hình ảnh 1H MRI là 2
s, và 19F MRI là 5 s.

T2 relaxation time
Ngoài hiệu ứng trên thời gian giãn hồi T1, Gd3+ cịn có một số hiệu ứng nhất định trên
thời gian giãn hồi T2 của các vector từ [19]. Gd3+có khả năng tạo ra từ trường nhỏ bao

quanh nó, và gây rối loạn mơi trường đồng nhất của từ trường chính. Vì tính khơng
đồng nhất của từ trường tại các vị trí có Gd3+, các góc và pha quay của các vetor từ
nhanh chóng bị đồng hố và giảm tín hiệu. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành
kiểm tra thời gian giãn hồi T2 của phân tử nước và PFOB bằng sử dụng chương trình
quyét MSME. Trong hình 5, thời gian giãn hồi T2 của vector phân tử nước lần lượt là
150 ms, 200 ms và 210 ms với các tỷ lệ Gd3+ là W1/10, W1/20 và W1/300. Hiệu ứng
của Gd3+ trên thời gian giãn hồi T2 của hạt fluorine với tỷ lệ W1/10 là cao hơn W1/20,
và W1/30 tỷ lệ thuận với mật độ của Gd3+ có trên hạt PLGA.


Trong thí nghiệm đo lường thời gian giãn hồi T2 của PFOB, thời gian T2 của PFOB
trong NP là 600 ms, tuy nhiên, giá trị này giảm xuống lần lượt là 131 ms, 141 ms và 150
ms với các tỷ lệ W1/10, W1/20 và W1/30.
Nhìn chung, Gd3+ rút ngắn thời gian giãn hồi của T2 của vector từ của phân tử nước và
PFOB, từ đó có khả năng làm giảm tín hiệu MRI của hình ảnh. Tuy nhiên, khi chọn các
thơng số chạy chương trình TE ngắn nhất có thể để tránh làm ảnh hưởng tín hiệu MRI
trên hình ảnh. Trong nghiên cứu của chúng tôi là 4 ms cho cả hai kênh 1H MRI và

19F

MRI.
Độc tính tế bào
Gd3+ bị hạn chế sử dụng cho các bệnh nhân có tiền sử bệnh thận, do độc tính của Gd3+
lên thận. Vì thế, đánh giá độc tính của các hạt mới tổng hợp lên tế bào là cần thiết. Kết
quả từ thí nghiệm MTT (hình 6), tỷ lệ sống của tế bào hMSCs là khoảng hơn 90% so
với đối chứng. Độc tính của hạt nano fluorine lên tế bào trên ở ba nồng độ khác nhau
0.25, 0.5 và 1 mg/ml. Do các hạt nano fluorine khơng có độc ở các nồng độ khác nhau,
nên chúng tôi sử dụng nồng độ cao nhất để đạt hiệu qủa đánh dấu tế bào cao nhất.

Dòng chảy tế bào

Trong những nghiên cứu trước, hạt nano PSS phủ PLGA có khả năng xâm nhập tế bào
thơng qua con đường xâm nhập caveolae nội bào [10,15]. Do vậy, đánh giá quá trình
xâm nhập nội bào của vật liệu bằng dịng chảy tế bào là cần thiết. Trong thí nghiệm
này, chúng tôi thực hiện hai so sánh để chứng minh hạt PSS phủ Gd3+@NP có khả
năng thâm nhập nội bào thông qua con đường caveolae. Đầu tiên, các hạt PSS phủ
Gd3+@NP được so sánh với hai đối đối chứng PSS phủ NP và PVA phủ NP. Như trình
bày trong hình 7, hạt PSS phủ Gd3+@NP có tín hiệu huỳnh quang trung bình tương


đương với hạt đối chứng dương PSS phủ NP và cao hơn rất nhiều lần so với đối chứng
âm PVA phủ NP. Điều này chứng minh rằng sự xuất hiện của Gd3+ - DPTA-BSA khơng
ảnh hưởng đến q trình xâm nhập nội bào của hạt nano fluorine.
Trong thí nghiệm thứ 2, q trình xâm nhập nội bào thơng qua con đường xâm nhập
nội bào caveolae được thể hiện bằng phương pháp thí nghiệm cạnh tranh. Trong thí
nghiệm này, các polymer PSS tự do được sử dụng như là yếu tố cạnh tranh với các hạt
PSS phủ NP và PSS phủ Gd3+@NP. Kết quả đạt được cho thấy, với sự xuất hiện của
các polymer PSS tự do, tín hiệu huỳnh quang của các hạt PSS phủ NP và PSS phủ
Gd3+@NP bị sụt giảm và trở về bằng mức của đối chứng âm, hạt PVA phủ NP. Điều này
là kết của các polymer PSS tự do trong môi trường nuôi cấy đã bám vào các thể
caveolae nhanh hơn, do vậy ức chế quá trình thâm nhập nội bào của các hạt PSS phủ
NP, và làm giảm tín hiệu huỳnh quang trong FACs. Từ kết qủa của hai so sánh trên,
PSS phủ Gd3+@NP chứng minh được tính đặc hiệu và phương phức xâm nhập nội bào
bằng caveolae.

Hình ảnh tế bào được đánh dấu bằng MRI.
Hình ảnh MRI với hai tương phản sẽ mang lại thuận lợi cho quá trình theo dõi tế bào
sau cấy ghép. Vì lý do trên, chúng tơi nghiên cứu hạt nano PSS phủ Gd3+@NP để đánh
dấu và theo dõi tế bào gốc hMSC trên hai kênh

19F

MRI và 1H MRI. Một mặt, Gd3+ có

trên hạt PLGA sẽ làm giảm thời gian giãn hồi T1 của tế bào trên kênh 1H MRI, từ đó làm
tăng tín hiệu MRI, và giúp hình ảnh của các tế bào sẽ sáng và dễ nhận biết hơn trên
kênh này. Mặt khác, hình ảnh chuyên biệt của Fluorine trên kênh 19F MRI giúp định vị vị
trí chính xác của các tế bào cấy ghép và bán định lượng số lượng của chúng. Như
được trình bày trong hình 8, các tế bào được đánh dấu với PSS phủ Gd3+@NP có tín