Xây dựng hệ thống mã vạch dna (dna barcode) để nhận diện phân tử một số loài đăng lan (dendrobium spp ) khu vực tp hồ chí minh báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp cơ sở

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA
(DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ
MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.)
KHU VỰC TP. HỒ CHÍ MINH
Mã số: CS.2015.19.38

Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Như Hoa

---Tp.HCM, 2017---


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG HỆ THỐNG MÃ VẠCH DNA
(DNA BARCODE) ĐỂ NHẬN DIỆN PHÂN TỬ
MỘT SỐ LOÀI ĐĂNG LAN (Dendrobium spp.)
KHU VỰC TP. HỒ CHÍ MINH
Mã số: CS.2015.19.38

Cơ quan chủ trì

Chủ trì đề tài

Trưởng Khoa Sinh học

TS. Phạm Văn Ngọt

|

ThS. Nguyễn Như Hoa


Danh sách những người tham gia thực hiện đề tài và đơn vị phối hợp chính

1. Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Như Hoa, giảng viên Khoa Sinh học Trường ĐH. Sư
phạm Tp.HCM.
2. Cơ quan chủ trì: Khoa Sinh học, Trường ĐH. Sư phạm Tp.HCM.
3. Đơn vị phối hợp chính:. Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM.


MỤC LỤC
Chương 1. TỔNG QUAN................................................................................................5
1.1. Giới thiệu về lan Dendrobium ..............................................................................5
1.1.1. Vị trí phân loại ...............................................................................................5
1.1.2. Sự phân bố .....................................................................................................5
1.1.3. Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium.............................................6
1.1.4. Đặc điểm hình thái lan Dendrobium .............................................................9
1.2. Các lồi Đăng lan trong nghiên cứu ...................................................................12
1.2.1. Hoàng phi hạc (Dendrobium signatum Rchb. f. 1884) ...............................12
1.2.2. Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) ..................................12
1.2.3. Hồng thảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb. ex Lindl.) ............12

1.2.4. Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.) ..................................................13
1.2.5. Giả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba) ........................13
1.2.6. Xương cá (Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb. f.) ......................................13
1.2.7. Thập nhất hoa (Dendrobium aduncum Wall. Ex Lindl.).............................13
1.2.8. Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.) ........................................14
1.2.9. Hoàng thảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb. f.) ...................14
1.2.10. Hồng thảo vơi (Dendrobium cretaceum Lindl.(D. polyanthum Lindl.)) .14
1.3. Mã vạch DNA và ứng dụng trong nhận diện loài ..............................................14
1.3.1. Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA ....................................15
1.3.2. Các cơng trình xây dựng mã vạch DNA cho họ Lan ..................................19
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................................24
2.1. Vật liệu nghiên cứu.............................................................................................24
2.2. Phương pháp .......................................................................................................24
2.2.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu lan................................................24
2.2.2. Phương pháp giải phẫu hình thái .................................................................25
2.2.3. Tách chiết DNA tổng số ..............................................................................28
2.2.4. Kỹ thuật PCR ...............................................................................................28
2.2.5. Phương pháp điện di trên gel agarose .........................................................29
2.2.6. Giải trình tự PCR .........................................................................................30
2.2.7. Hiệu chỉnh trình tự.......................................................................................30
2.2.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loài .............................................................33
i


Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................35
3.1. Kết quả thu mẫu..................................................................................................35
3.2. Kết quả giải phẫu và mơ tả hình thái ..................................................................35
3.3. Kết quả tách chiết DNA tổng số .........................................................................40
3.4. Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp mồi đặc hiệu của phản ứng PCR..................41
3.5. Khuếch đại vùng matK, ITS bằng kỹ thuật PCR ...............................................43

3.6. Kết quả và hiệu chỉnh trình tự trên phần mềm FinchTV và SeaView ...............45
3.7. Kết quả so sánh trình tự của mẫu với cơ sở dữ liệu Genbank nhằm kiểm tra độ
tin cậy của trình tự .....................................................................................................47
3.8. Xây dựng cây phát sinh chủng loài đối với trình tự matK và ITS .....................51

ii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

bp

Base pair

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

CO1

Cytochrome c oxidase 1

cpDNA

Chloroplast DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

ITS

Internal transcribed spacer

kb

Kilo-base pair

matK

Maturase K

PCR

Polymerase Chain Reaction

rbcL

Ribulose - 1,5 – Biphosphate Carboxylase L

rDNA

Ribosomal DNA

RNA

Ribonucleic acid

rpoB

RNA polymerase - β

rRNA

Ribosomal RNA

OD

Optical density

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

Tm

Melting Temperature

UV

Ultraviolet

C.

Cymbidium

D.

Dendrobium

Tp. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

NCBI

National Center for Biotechnology Information

iii


DANH MỤC HÌNH ẢNH và BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Ký hiệu, tên loài và tên khoa học của 10 loài Dendrobium trong nghiên cứu
.......................................................................................................................................24
Bảng 2.2. Cặp mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại trình tự mục tiêu và kích
thước trình tự được khuếch đại .....................................................................................29
Bảng 3.1. Kết quả ghi nhận đặc điểm hình thái của 10 lồi Dendrobium nghiên cứu .35
Bảng 3.2. Kết quả định lượng DNA tổng số của các mẫu Dendrobium trong nghiên
cứu bằng Nano Drop .....................................................................................................40
Bảng 3.3. Nhiệt độ bắt cặp của mồi và kích thước trình tự khuếch đại của các cặp mồi
nghiên cứu .....................................................................................................................41
Bảng 3.4. Tóm tắt kết quả giải trình tự vùng matK (390F- 1326R) và ITS (1F – 4R) sau
hiệu chỉnh của các mẫu Dendrobium trong nghiên cứu ...............................................45

Bảng 3.5. Kết quả BLAST trình tự vùng matK của 27/30 mẫu Dendrobium trong
nghiên cứu với cơ sở dữ liệu Genbank ..........................................................................47
Bảng 3.6. Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của 27/30 mẫu Dendrobium trong nghiên
cứu với cơ sở dữ liệu Genbank ......................................................................................49
Hình 1.1. Hình minh họa các dạng chính của Dendrobium ............................................7
Hình 1.2. Các nhóm Dendrobium....................................................................................8
Hình 1.3. Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, quả và hạt ở chi lan Dendrobium........11
Hình 1.4. Cấu trúc vùng ITS của Dendrobium..............................................................19
Hình 2.1. Hình minh họa q trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi xi trên
SeaView .........................................................................................................................31
Hình 2.2. Hình minh họa quá trình hiệu chỉnh trình tự giải bằng mồi ngược trên
SeaView .........................................................................................................................31
Hình 2.3. Hình minh họa quá trình thống nhất 2 trình tự trên SeaView .......................32
Hình 2.4. Giao diện trang chủ NCBI .............................................................................32
Hình 2.5. Giao diện BLAST .........................................................................................33
Hình 2.6. Hình minh họa kết quả BLAST .....................................................................33
Hình 2.7. Giao diện phần mềm MEGA6.06 ..................................................................34
Hình 3.1. Hình chụp 10 lồi Dendrobium trong nghiên cứu ........................................39
Hình 3.2. Kết quả điện di DNA tổng số của 10 mẫu Dendrobium ...............................41
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng matK của mẫu 2TT ở các ngưỡng
nhiệt độ từ 49oC tới 58oC...............................................................................................42
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng ITS của mẫu 2TT ở các ngưỡng
nhiệt độ từ 49oC tới 58oC...............................................................................................42
iv


Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng matK của 30 mẫu lan Dendrobium ...44
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng ITS của 30 mẫu lan Dendrobium .....44
Hình 3.7. Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng loài của bộ dữ liệu gồm 27
trình tự nghiên cứu đối với vùng matK của Dendrobium .............................................51

Hình 3.8. Mơ hình cây phát sinh lồi vùng matK của nhóm Dendrobium nghiên cứu 52
Hình 3.9. Vùng chọn lựa để phân tích cây phát sinh chủng lồi của bộ dữ liệu gồm 27
trình tự nghiên cứu đối với vùng ITS của Dendrobium ................................................52
Hình 3.10. Mơ hình cây phát sinh lồi vùng ITS của nhóm Dendrobium nghiên cứu .53
Hình 3.11. Mơ hình cây phát sinh lồi từ trình tự vùng matK và ITS của nhóm
Dendrobium nghiên cứu ................................................................................................54

v


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BẰNG TIẾNG VIỆT
Tên đề tài: Xây dựng hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử
một số loài Đăng lan (Dendrobium spp.) khu vực Tp. Hồ Chí Minh
Mã số: CS.2015.19.38
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Như Hoa

Tel: 0902 683 249

E-mail:
Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM
Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :
Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM.
Thời gian thực hiện: 11/2015 – 11/2016
1. Mục tiêu:
Hệ thống hóa các lồi lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban
đầu cho các nghiên cứu về sau.
Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp
nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà
khơng cần có hoa.
2. Nội dung chính:

- Thu thập, hệ thống 10 lồi Đăng lan khu vực tp. HCM.
- Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM.
- Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR.
- Giải và hiệu chỉnh trình tự 2 chiều cho mỗi marker.
- Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng lồi.
3. Kết quả chính đạt được:
- Hệ thống mã vạch DNA cho các loài lan đã thu thập dựa trên trình tự DNA
của 2 marker.
- Các bài báo cáo tại hội nghị và đăng kỉ yếu:
+ Nguyễn Như Hoa, Trần Hoàng Dũng, Dương Hoa Xơ, Huỳnh Hữu Đức
(2016), Phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loài của một số giống lan
Dendrobium dựa trên trình tự vùng ITS, Hội nghị CNSH tồn quốc khu vực
phía Nam – lần thứ IV – năm 2016.


SUMMARY
Project Title: Construction DNA barcode to identify molecular some Dendrobium
species (Dendrobium spp.) in Ho Chi Minh city.
Code number: CS.2015.19.38
Coordinator: MS. Nguyễn Như Hoa
Implementing Institution: Department of Biology, HCM City University of
Pedagogy
Cooperating Institution(s): Biotechnology Center HCM City
Duration: from September -2015 to September -2016
1. Objectives:
- Some orchids codified to preserve and provide materials for future research.
-Two markers sequenced to create barcode system helps identify molecular DNA
samples spread in any department and any stage of development without flowers.
2. Main contents:
- Systems 10 Dendrobium species in HCM city.

- Separation DNA total for 30 Dendrobium samples in HCM city.
- Amplifying the target marker by PCR.
- Sequencing and correction sequence for each marker.
- Analysis and construction of DNA barcodes for each species.
3. Results obtained:
- DNA barcode system for the orchids were collected based on the DNA sequence
of the 2 markers.
- Publish academic reports using data collected from the research:
+ Nguyen Nhu Hoa, Tran Hoang Dung, Duong Hoa Xo, Huynh Huu
Đuc (2016), Analysis phylogenetic relationship of Dendrobium based ITS
region, The 4th national conference on biotechnology of Sothern Vietnam 2016
“Application of biotechnology”.


MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lan Việt Nam với các lồi có hoa đẹp, hương thơm q phái là đối tượng thu hút sự
quan tâm của nhiều nhà khoa học. Hằng năm, Việt Nam thường xuyên phát hiện các
loài mới bổ sung vào danh sách các loài lan phân bố ở Việt Nam. Lan Việt Nam là một
họ phong phú và đặc sắc của hệ thực vật ở nước ta, có giá trị tài nguyên về nhiều mặt
đối với nền kinh tế, đời sống con người.
Nhiều loài lan rừng Việt Nam, đặc biệt là các loài thuộc chi Dendrobium cho hoa
đẹp, kết hợp nhiều màu sắc phong phú, hài hịa; hoa có hương thơm, lâu tàn, nở kéo
dài từ 1 – 2 tháng. Tình trạng thu hái, bn bán lan rừng trái phép phổ biến như hiện
nay có thể dẫn đến nguy cơ làm mất nguồn gen lan rừng. Bên cạnh đó, việc du nhập và
lai tạo ngày càng nhiều giống lan mới cũng làm rất nhiều giống dần dần bị lãng quên.
Từ thực tế đó, rất nhiều cơng trình nghiên cứu được tiến hành nhằm bảo tồn đa dạng
các lồi lan, trong đó có lan Dendrobium.
Cho đến nay, việc nghiên cứu về lan chủ yếu về hệ thống phân loại, ni cấy mơ
một số lồi. Việc nghiên cứu, sưu tập, lai tạo các giống lan đã được thực hiện khá

nhiều ở các trường, viện nghiên cứu, các nghệ nhân... Tuy nhiên, quá trình nhận diện
các giống lan vẫn dựa trên hình thái bên ngồi, đặc biệt là phải có hoa và q trình lai
tạo vẫn mang tính ngẫu nhiên không dựa trên nền tảng di truyền. Do vậy, rất cần một
hệ thống nhận diện nhanh và chính xác các mẫu lan thu thập.
Trong các công cụ sinh học phân tử, mã vạch DNA (DNA barcode) được biết là
công cụ hữu hiệu nhất hiện nay giúp định danh mẫu vật và phân tích tiến hóa sinh học
của lồi vật đó trong tự nhiên, giúp các nhà chọn giống và di truyền học cập nhật
nhanh chóng các thơng tin như tên, thuộc tính sinh học… nhằm đánh giá mối quan hệ
giữa các loài, đồng thời bảo tồn nguồn gen; từ đó có thể quản lý và khai thác tốt hơn
nguồn gen mình đang có. [16,18,19]
Hơn nữa, việc sử dụng trình tự mã vạch DNA để xây dựng cây phát sinh chủng loài
sẽ giúp chỉ ra mối quan hệ di truyền giữa các lồi thu thập được. Từ đó chỉ ra các lồi
có quan hệ xa, quan hệ gần trong cùng chi cùng loài. Cây phát sinh chủng loài sẽ là cơ
sở khoa học quan trọng để xây dựng các tổ hợp lai giữa các mẫu lan (lai cùng chi, giữa

1


hai chi, giữa bốn chi). Các tổ hợp lai sẽ giúp cho cơng tác lai tạo các lồi lan rút ngắn
thời gian, cơng sức nhưng vẫn cho ra các dịng con lai đạt giá trị khoa học và kinh tế
phục vụ nhu cầu nội địa và xuất khẩu, đây là một nhiệm vụ có tầm chiến lược lâu dài.
Hiện nay, những nghiên cứu trong việc xây dựng mã vạch DNA nói chung và cụ thể
với đối tượng phong lan bằng cách sử dụng các mồi đặc hiệu ở Việt Nam mới có một
số nhóm nghiên cứu bắt đầu thực hiện. Có rất nhiều marker tham gia trong phân tích
phân loại như: ITS, rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK, …trải rộng từ bộ cho đến
mức dưới loài. Mỗi đoạn mã vạch DNA có những đặc trưng riêng và có khả năng phân
biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau. Ví dụ, các đoạn DNA như: 18S, 16S, 5,6S có
khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn DNA, như: 26S, rbcL, ndnF,
atpβ có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn DNA, như: ITS, matK, cytb,
5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain).

Tuy nhiên, các nhà khoa học cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn DNA nào được sử
dụng làm mã vạch chung cho tất cả các lồi sinh vật. Vì vậy, việc lựa chọn những
đoạn DNA (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch
DNA là rất cần thiết và đem lại hiệu quả cao. [36, 27, 30]
Trên đối tượng lan Dendrobium, cho đến thời điểm hiện tại, những nghiên cứu trong
việc xây dựng mã vạch DNA cho bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu vẫn chưa hồn
chỉnh. Để góp phần vào việc định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn, khai thác và
sử dụng nguồn gen Dendrobium một cách có hiệu quả, chúng tơi đề xuất “Xây dựng
hệ thống mã vạch DNA (DNA barcode) để nhận diện phân tử một số loài Đăng lan
(Dendrobium spp.) ở khu vực Tp Hồ Chí Minh”.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Hệ thống hóa các lồi lan nhằm mục đích bảo tồn và để làm nguyên liệu ban đầu
cho các nghiên cứu về sau.
Xác định trình tự DNA của các marker để tạo nên hệ thống mã vạch DNA giúp
nhận diện phân tử các mẫu lan ở bộ phận bất kỳ và giai đoạn phát triển bất kỳ mà
không cần có hoa.
3. CÁCH TIẾP CẬN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, PHẠM VI NGHIÊN
CỨU, NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.1 Cách tiếp cận
2


- Tổng hợp các cơng trình nghiên cứu trong và ngoài nước, chú trọng đến
nguồn tài liệu ở những quốc gia có nền khoa học kỹ thuật và đã có những thành tựu
quan trọng trong lĩnh vực bảo tồn nguồn gen để phân tích trên cơ sở lý luận thực tiễn
nhằm định hướng nhanh nhất cho các phương pháp và nội dung nghiên cứu trong đề
tài.
Điều tra, đánh giá một số đặc điểm hình thái lan Dendrobium khu vực tp. HCM; từ đó,
xây dựng báo cáo mơ tả một số đặc điểm hình thái của lan Dendrobium khu vực tp.
HCM.

Kế thừa các kết quả nghiên cứu về lan Dendrobium ở Việt Nam hoặc một số tài liệu,
bài viết có tính tham khảo, chuyên khảo.
Lan Dendrobium thu thập được định danh phân tử bằng cách xây dựng hệ thống DNA
barcode. Hệ thống này sẽ giúp các nhà khoa học, nghệ nhân địa phương dễ dàng tiến
hành xác định nguồn gốc loài và bảo vệ các lồi đang có nguy cơ tuyệt chủng.
3.2 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu mẫu – Giải phẫu hoa.
- Phương pháp tách DNA tổng số, khuếch đại các marker bằng kỹ thuật PCR.
- Phương pháp hiệu chỉnh trình tự
3.3 Phạm vi nghiên cứu
- 30 mẫu lan Dendrobium (10 loài) thu thập tại tp. HCM. Mỗi mẫu sẽ được giải
trình tự 2 marker là ITS và matK để xây dựng DNA barcode.
3.4 Nội dung nghiên cứu
- Thu thập, hệ thống các mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM.
- Xây dựng hệ thống mã vạch DNA cho mẫu vật nghiên cứu.
+ Tách DNA tổng số cho 30 mẫu Đăng lan khu vực tp. HCM.
+ Khuếch đại vùng marker mục tiêu bằng phản ứng PCR.
+ Giải trình tự 2 chiều cho mỗi marker.
+ Hiệu chỉnh trình tự đã giải bằng phần mềm FinchTV, Seaview.
+ Kiểm tra tương đồng trên ngân hàng gen GenBank.
3


+ Phân tích, xây dựng mã vạch DNA cho từng loài.

4


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về lan Dendrobium

1.1.1. Vị trí phân loại
Họ Phong lan (Orchidaceae) có 750 chi và hơn 25.000 loài (Takhtajan, 1987).
Orchidaceae là họ lớn thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae), thuộc ngành Thực vật hạt kín
(Angiospermae) và cũng là họ lớn nhất trong lớp Một lá mầm.
Dendrobium với số lượng lồi lớn, đa dạng về hình dáng, màu sắc, kích thước,
là chi lớn thứ hai trong họ Phong lan, chỉ sau chi lan Lọng (Bulbophyllum).[11]
Giới

Plantae

Ngành

Angiospermae (Magnoliophyta)

Lớp

Monocotylendones (Liliopsida)

Bộ

Asparagales

Họ

Orchidaceae

Họ phụ

Epidendroideae

Tơng

Epidendreae

Chi

Dendrobium

Theo Dương Đức Huyến, 1992, Dendrobium có những đặc điểm khác biệt với
những chi lân cận như luôn mọc cụm và có phân đốt, số lượng khối phấn ln là 4,
khơng có lơng mềm trên lá hay các bộ phận của hoa. Nhóm tác giả này đã dựa trên hệ
thống của Seidenfeden (1985) và Holttum (1964) để sắp xếp 97 lồi Dendrobium ở
Việt Nam thành 15 nhóm (section). [3]
Theo Phong lan Việt Nam của Trần Hợp (1998), ở Việt Nam, Dendrobium có
đến 100 lồi, xếp trong 14 tơng, được phân biệt bằng thân (giả hành), lá và hoa [11].
1.1.2. Sự phân bố
Chi Dendrobium có khoảng 1.600 lồi và hiện đã được lai tạo thêm nhiều loại
mới. Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp, trong đó “Dendro”- có nghĩa là
gỗ, “bio”- có nghĩa là sống. Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên
vỏ cây. Ở Việt Nam, người ta cịn gọi là Hồng lan hay Đăng lan.
Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đơng bán cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt

5


Nam Thái Bình Dương, Philippine, Ấn Độ, một số xuất hiện ở Nhật Bản và xuất hiện
nhiều nhất ở Đông Nam Á. Trong khi các nước Nam Mỹ tự hào về các lồi thuộc chi
Cattleya tuyệt đẹp, các nước Đơng Nam Á cũng hãnh diện vì có chi Dendrobium vơ
cùng phong phú. Theo nghiên cứu của Dressler (1981), châu Á có khoảng 1.400 lồi
thuộc chi Dendrobium. [11]

Điều kiện sinh thái của Dendrobium cũng rất đa dạng, có nhiều lồi chỉ mọc và
ra hoa ở vùng lạnh, có lồi ở vùng nóng, có lồi trung gian, cũng có lồi thích nghi với
bất cứ điều kiện khí hậu nào.
Ở Việt Nam, năm 1932, các nhà thực vật người Pháp (Gagnepsin và
Guillaumin) đã cơng bố 53 lồi Hồng thảo ở Việt Nam, và sau đó đã cơng bố bổ sung
thêm một số lồi (1932 – 1964). 1992, Dương Đức Huyến và cộng sự cũng đã phân
loại và định danh 97 loài Dendrobium ở Việt Nam, trong đó có 48 lồi có giá trị làm
cảnh và 21 loài đặc hữu của Việt Nam [3]. 1998, Trần Hợp mơ tả 93 lồi Dendrobium
trong cuốn Phong lan Việt Nam [11]. Ở miền Nam Việt Nam, tác giả Phạm Hồng Hộ
cũng đã mơ tả 56 lồi Hồng thảo trong Cây cỏ miền Nam Việt Nam 2. [7]
Theo cơng bố “Trích yếu được cập nhật hóa về các loài lan ở Việt Nam, ở Việt
Nam hiện đã biết được 897 loài lan thuộc 152 chi, chúng chiếm khoảng 75-80% trong
tổng số 1.000 - 1.100 lồi ước tính có ở đây. Trong đó, chi Dendrobium có số lượng
lồi cao nhất (107 lồi), tiếp đến là Bulbophyllum, Eria, Liparis… Cơng bố này cung
cấp các thông tin về tên khoa học, khu phân bố, cách sống, độ thường gặp của loài và
tình trạng bị đe dọa tiêu diệt của từng lồi.[1]
1.1.3. Sự đa dạng và phong phú của lan Dendrobium
Dendrobium là chi lan (genus) đơng đảo với hơn 1.000 lồi (species) ngun
thủy được chia thành 40 nhóm (sections) thuộc dịng Dendrobiinae như Phalaenanthe,
Eleutheroglossum, Callista, Ceratobium, Stachyobium…
Do quá đa đạng nên Dendrobium tập trung thành hai dạng chính [5]:
-

Dạng đứng (Dendrobium loại phalaenopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm,

có nhiều hoa. Thành phố Hồ Chí Minh trồng rất nhiều loại này như: Nhất điểm hồng,
Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên, Sonia,….
-

Dạng thịng (Dendrobium loại nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao

như Đà Lạt, Lâm Đồng, …; lá nhạt màu hơn so với dạng thân đứng, lá rụng khi thời
6


tiết lạnh. Có nhiều lồi Dendrobium dạng thịng như Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp
vàng, …
A

B

Hình 1.1. Hình minh họa các dạng chính của Dendrobium
A. Dendrobium anosmum - Dạng thòng [38]
B. Dendrobium cariniferum - Dạng đứng [37]
Theo một cách phân loại khác, lan Dendrobium được chia ra thành 5 nhóm:
-

Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm và hoa thì thường mọc ở gần

ngọn như Dendrobium antennatum, Dendrobium phalaenopsis…
-

Nhóm thứ hai, lá thường rụng vào mùa đông và hoa thường mọc ở gần đốt trên

thân cây như Dendrobium anosmum, Dendrobium wardianum…
-

Nhóm thứ ba hay cịn gọi là nhóm Callista, khi ra hoa thì hoa rủ xuống phía

dưới như Dendrobium chrysotoxum, Dendrobium farmeri…

-

Nhóm thứ tư là nhóm Latoura với chùm hoa mọc thẳng đứng như Dendrobium

atroviolaceum, Dendrobium spectabile…
-

Nhóm thứ năm là nhóm Formosae có đặc điểm là trên thân và lá cây có lơng

màu đen và hoa thường là màu trắng như Dendrobium draconis, Dendrobium
formosum…

7


Nhóm 1

Nhóm 2

D. antennatum – D. phalaenopsis

D. anosmum – D. wardianum

Nhóm 3

Nhóm 4

D. chrysotoxum – D. farmeri

D. atroviolaceum – D. spectabile

Nhóm 5
D. draconis – D. formosum
Hình 1.2. Các nhóm Dendrobium
Phạm Hoàng Hộ (2003) phân loại giống lan Dendrobium gồm 13 nhóm:
Bolbidium, Callista, Apoum, Strongyle, Gastridium, Conostalix, Rhopalanthe,
Formosae, Pedilonum, Dendrobium, Breviflores, Dischophyllum, Stachyobium.
8


- Nhóm Callista gồm có: D. chrysotosum (Kim điệp), D. densiflorum Wall
(Thủy Tiên), D. farmari Paxt (Thủy tiên trắng vàng), D. lindleyi Steudel (Vẩy rồng),
D. thrysiflorum Reichb (Thủy tiên vàng)…
- Nhóm Dendrobium gồm có: D. anosmum Lindl (Giả hạc), D. fimbriatum
Hook.f. (Long nhãn), D. heterocarpumi Lindl (Nhất điểm hoàng), D. primulinum
Lindl (Long tu), D. moschatum (Buch-Ham) (Thái bình) …[8]
Chính vì sự đa dạng về chủng loại mà nhóm lan này có điều kiện sinh thái rất đa
dạng, có lồi hoa chỉ mọc ở vùng lạnh, có lồi lại chỉ sống ở vùng có khơng khí nóng,
cũng có lồi chỉ chịu được nhiệt độ vừa phải, nhưng có một số lồi lại rất dễ chịu là
điều kiện khí hậu nào cũng sống được.
Dendrobium có thể nhân nhanh giống bằng phương pháp chiết nhánh thơng
thường. Vì nó là loại lan đa thân với nhiều giả hành, các giả hành thường mang một
thân với nhiều lá mọc xen kẽ, trên thân có rất nhiều mắt ngủ. Tại những mắt ngủ này
sẽ đâm chồi và cho ra một cây con mới. Hoa của Dendrobium có thể mọc từ thân
thành từng chùm hay chỉ mọc một hoa duy nhất. Có một số lồi Dendrobium trước khi
ra hoa sẽ rụng hết lá. Đặc biệt hơn các giống lan khác, các chồi hoa của lan
Dendrobium không những mọc trên các giả hành mới, tại các giả hành cũ cũng có thể
mọc hoa, vì thế một cây Dendrobium có thể cho ra nhiều cành hoa. Mặt khác, hoa
Dendrobium thường rất lâu tàn, thường là từ 2 đến hơn 3 tháng, có lồi hoa có thể nở
suốt quanh năm như Dendrobium caesar Alba, Dendrobium caesar latin... Tuy nhiên,

có lồi cũng sớm nở tối tàn như Thạch hộc (Dendrobium crulllenatum).
Dendrobium cũng là giống rất đa dạng về màu sắc và kiểu dáng. Chính vì thế,
người Việt Nam dùng những hình tượng khác nhau để tượng trưng cho một số loài
Dendrobium nào đó: một con chim bồ câu trắng (lan Bạch câu), một loài hạc lẻ loi (lan
Giả hạc), hay một đàn bướm vàng bay trong gió (lan Kim điệp) …[11]
1.1.4. Đặc điểm hình thái lan Dendrobium
Dendrobium khơng có một hình dạng chung nhất về hoa và dạng cây do số lượng
quá lớn và phân bố rộng rãi. Các loài thuộc chi Dendrobium đều có bộ phận sinh
dưỡng như rễ, thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, quả. [5]

9


1.1.4.1. Rễ
- Cây có hệ rễ khí sinh, rễ thuộc loại rễ bán gió. Nhóm này thường có rễ nhỏ
nhưng rất nhiều rễ, chủ yếu bám vào giá thể, vào thân cây để hút chất dinh dưỡng.
- Rễ có lớp hút ẩm dày bao quanh gồm những tế bào chết chứa đầy khơng khí
nên rễ ánh lên màu xanh bạc.
- Một số lồi có thân lá kém phát triển, thậm chí tiêu giảm hồn tồn, có hệ rễ
chứa diệp lục tố giúp cây hấp thụ ánh sáng cần thiết cho sự ra hoa và quang hợp. [5]
- Rễ lan Dendrobium không chịu được lạnh, nếu bị lạnh trong thời gian dài, rễ
cây sẽ bị mục nát, cây sẽ chết. [2]
1.1.4.2. Thân
- Dendrobium thuộc nhóm đa thân (nhóm hợp trục) có hệ thống nhánh nằm
ngang bò dài trên giá thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ.
- Ở một số lồi Dendrobium, lá chỉ có ở các mầm non, có giả hành là đoạn thân
phình to giống như củ khơng có lá, là nơi dự trữ năng lượng.
- Gỉả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng
cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới. Cấu tạo giả hành gồm nhiều mơ mềm
chứa đầy dịch nhầy, phía ngồi có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ

để tránh sự mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn
khi cây sống bám trên cao. Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó
cũng làm nhiệm vụ quang hợp. [5]
- Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: hình cầu, thn dài hay
hình trụ xếp chồng lên nhau tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ. [2]
- Một số loài ở xứ lạnh, giả hành chỉ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng nên
khơng có màu xanh nhưng phía trên có mang lá. [2]
1.1.4.3. Lá
- Dendrobium là cây tự dưỡng, nó phát triển đầy đủ hệ thống lá.
- Lá mọc xen kẽ nhau và ơm lấy thân do lá có tận cùng là 1 cuống hay thuôn dài
xuống thành bẹ ôm thân, hình dạng và cấu trúc lá rất đa dạng. [5]
- Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại mọng nước
nạc, dai có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vào vị trí sống của cây. Phiến lá

10


trải rộng hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa
như hình chữ V. Những lá sát dưới gốc đôi khi giảm đi chỉ cịn những bẹ khơng phát
triển hay giảm hẳn thành vảy. Có những lồi trút lá vào mùa khơ hạn, sau đó cây ra
hoa hay sống ẩn để khi gặp mưa thì cho chồi mới. [2]

D. pendulum

D. simondii Gagnep.

D. hercoglossum

Hình 1.3. Đặc điểm rễ, thân, giả hành, lá, hoa, quả và hạt ở chi lan Dendrobium
[32, 33, 34, 39]

1.1.4.4. Hoa
- Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá.
- Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên
ngọn.

11


- Sự biểu hiện trước khi ra hoa khác biệt như có nhiều lồi rụng hết lá trước khi
ra hoa. Thời gian ra hoa là đầu mùa mưa hay đầu tết.
- Khi đủ dinh dưỡng, Dendrobium cho hoa thành chùm, phát hoa dài và thời
gian ra hoa trung bình 1 – 2 tháng. [5]
1.1.4.5. Quả và hạt
- Quả lan thuộc quả nang, nở ra theo 3 - 6 đường nứt dọc. Quả có dạng dài đến
hình trụ ngắn phình ở giữa. Khi chín, quả nở ra và mảnh vỏ cịn dính lại với nhau ở
phía đỉnh và phía gốc. Một số lồi khi quả chin khơng nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi quả
khi quả đã mục nát. [2]
- Hạt rất nhiều, li ti, không chứa chứa chất dinh dưỡng. Hạt chỉ cấu tạo bởi một
lớp chưa phân hoá, trên một mạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy khơng khí. Hạt trưởng
thành sau 2 - 18 tháng, để được nảy mầm cần có nấm cộng sinh hỗ trợ các chất cần
thiết. [2]
1.2. Các loài Đăng lan trong nghiên cứu
1.2.1. Hoàng phi hạc (Dendrobium signatum Rchb. f. 1884)

Phong lan thân cao 50-60 cm, rụng lá vào mùa thu. Hoa to 6-7 cm, mọc 2-3 chiếc ở
các đốt, thơm và lâu tàn. Nở vào mùa xuân-hạ.
Phân bố: Sơn La, Lai Châu, Thừa Thiên-Huế, Tây Nguyên, Lâm Đồng, Nam Cát
Tiên.
1.2.2. Đại Ý Thảo (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)
Phong lan có thân thịng, mảnh, sng, dài đến 90cm. Lá xếp 2 dãy, có phiến thon

nhọn, 5 gân chánh. Phát hoa 1-3, tim tím, hường hay trắng, môi vàng; cánh hoa dài
đến 3,5cm, môi xoan, dài 3cm, giữa có 3 gân màu vàng rất lợt.
Phân bố: Sa Pa, Phú Khánh, Đà Lạt, Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Malaysia.
1.2.3. Hồng thảo Thái Bình (Dendrobium pulchellum Roxb. ex Lindl.)
Phong lan có thân hình trụ dài đến 1-2m; có sọc dọc đỏ. Lá có phiến dài 10-15cm, hẹp
ở hai đầu, rộng 2-3cm ở giữa. Chùm ngoài nách lá, dài 10-20cm; hoa to, rộng 6-8cm,
hường hay vàng vàng, mơi có dạng bầu dục có 2 bớt đỏ, xoan, rìa lơng, đầu lõm, cột
cao 6mm.
Phân bố: Quảng Trị, Nepal, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Lào.

12


1.2.4. Long tu (Dendrobium primulinum Lindl.)
Phong lan có thân mảnh, đứng hay thịng, hình trụ, dài đến 45cm. Lá có phiến thon,
hình giáo, dài 8-10cm, rộng vào 2cm, chẻ 2 ở đầu, dễ rụng. Hoa hường, tim tím dợt,
rộng 6cm; mơi xoan rộng, có 3 thùy, bìa có răng mịn và ria long, gần như trắng, có
đốm vàng và tím ở đáy; cột có nắp tía. Thân khơng lá lúc phát hoa.
Phân bố: Lâm Đồng, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc.
1.2.5. Giả hạc xuân di linh tím (Dendrobium anosmum var alba)
Thân thịng dài đến 1,2m. lá có phiến mỏng, xếp 2 dãy, dài 10-18cm, rộng 2-3cm; bẹ
mau rách. Hoa to, ửng hường, với mơi có tâm có sọc tía, cánh hoa nhọn, cao 3-4 cm,
mơi có long nằm, xoan rộng, đầu tà, cột co 8mm.
Phân bố: Vinh, Đaklak, Lâm Đồng, Srilanca, Ấn Độ, Mianma, Lào, Thái Lan,
Indonesia, Tân Ghi Nê.
1.2.6. Xương cá (Dendrobium aloifolium (Bl.) Rchb. f.)
Phong lan có thân cao đến 40cm, có lá ở phần giữa. Lá trong mặt phẳng, dẹp, hình dao
găm, dài 2,5cm. Phần trên của thân hình chữ chi, có lá teo. Mang hoa trắng, nhỏ, cao
4-5mm, một ô mỗi mắt; cánh hoa và lá đài dảnh, mơi hẹp dài 3,5mm, đầu có 2 thùy
trịn.

Lan sống phụ, mọc bụi nhỏ, cao 40cm, hình trụ ở gốc. Lá ở giữa, dạng tam giác xếp
trên một mặt phẳng, dài 2-3cm, rộng 0,8-1cm. Đỉnh thân gãy khúc mang hoa nhỏ màu
trắng ở mỗi đốt. Cánh mơi ở đỉnh có 2 thùy tròn.
Phân bố: Đà Lạt, Định Quán, Nam Cát Tiên, Tây Ninh, Thái Lan, Mianma, Malaysia,
Indonesia.
1.2.7. Thập nhất hoa (Dendrobium aduncum Wall. Ex Lindl.)
Phong lan có thân thịng dài 60cm, hình trụ sng, hơi chữ chi. Lá có phiến thon hẹp,
dài 7-8cm, rộng đến 2cm. Chùm ở phần không lá, mang ít hoa, hoa tim tím hay hường
lợt, rộng 3,5cm; phiến hoa dài 2 cm. môi cao 1,2cm, 3 thùy, thùy chót nhọn, có một lồi
hình liềm và một sóng giữa.
Lan sống phụ, thân bng xuống, hình trụ gãy khúc, dài 60cm. Lá hình giải nhọn, dài
7-8cm, rộng 1-2cm. Cụm hoa trên thân khơng lá, có 1-5 hoa. Hoa màu hồng hay tím
nhạt, rộng 3,5cm, cánh mơi 3 thùy, thùy giữa nhọn.

13


Phân bố: Đà Lạt, Đồng Nai, Tam Đảo, Gia Lai, Kontum, Bhutan, Ấn Độ, Mianma,
Thái Lan, Trung Quốc.
1.2.8. Kim điệp vàng (Dendrobium capillipes Rchb.f.)
Căn hành bị, thân cao 5-15cm, lóng rộng 10-15mm, có rãnh rọc. Lá 1-2; phiến thon
nhọn, to 4-7x1-1,5cm. Phát hoa thưa, trúc mành; hoa 2-4, vàng; cọng và noãn sào dài
1,5-3cm, lá đài giữa 9x5,5mm; cánh hoa cạnh 12x7mm, mơi bầu dục trịn, to vào
17mm, vàng có bớt vàng đậm, móng (cựa) ngắn.
Phân bố: Bn Mê Thuột, Lâm Đồng, Thuận Hải, Ấn Độ, Mianma, Lào, Thái Lan,
Trung Quốc.
1.2.9. Hoàng thảo Ngọc Thạch (Dendrobium crystallinum Rchb. f.)
Phong lan thành bụi, thân màu vàng tươi lúc khô, dài 30-50cm. Lá hình giải thn có
phiến cứng, dài 7-12cm, rộng 1-1,5cm. Hoa từng cặp trên một u, màu trắng, chót tía
hay hơi hồng; cánh hoa dài 3cm, rộng 1cm; mơi trịn, bìa ngun, có bớt to vàng ở

giữa; cột có nắp hình chùy.
Phân bố: Quảng Trị, Gia Lai Cơng Tum, Bảo Lộc, Đà Lạt, Lào, Mianma, Thái Lan,
Trung Quốc.
1.2.10. Hoàng thảo vơi (Dendrobium cretaceum Lindl. (D. polyanthum Lindl.))
Phong lan có giả hành hình thoi màu nâu tím, có rãnh, trên đó là thân mảnh ít nhánh,
dài 20-40cm. Lá hình giáo, thn ở gốc, nhọn ở đỉnh,có phiến bầu dục, có đốm nâu đỏ,
dài 7-8cm, rộng 1-2cm. Hoa to, trắng, có sọc đỏ; phiến hoa dài 2,5-3cm, mơi có 3 sọc
vàng, thùy 3, cạn.
Phân bố: Định Quán, Biên Hòa, Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan.
1.3. Mã vạch DNA và ứng dụng trong nhận diện lồi
Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng
được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ
và tồn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về đặc điểm
hình thái sinh học giữa hai hay nhiều cá thể. Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất
nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật có đặc điểm giống nhau do cùng thích
nghi với điều kiện mơi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc
phân loại thấp như loài và dưới loài.
Ngày nay, những trở ngại trong việc phân loại này tồn tại ngay trong nhiều nhà
14


hệ thống học, sinh thái học và tiến hóa đa dạng sinh học... Vì vậy, việc nhận diện
chính xác bất cứ mẫu động, thực vật nào một cách nhanh chóng và tin cậy là một vấn
đề thực tế được quan tâm. Đó cũng là lý do chính để phát triển một phương pháp mới
để phát hiện nhanh bất cứ loài nào dựa trên giải trình tự DNA từ mẫu mơ của sinh vật.
Được gọi là “xác định mã vạch DNA” - trình tự của chuỗi DNA được tiêu chuẩn hóa
thành các chuỗi ngắn có kích thước từ 400 – 800 bp. Trên lý thuyết, chúng có thể dễ
dàng tách ra và đặc trưng cho hầu hết các loài trên địa cầu. Bằng cách khai thác những
tiến bộ của di truyền học phân tử, cơng nghệ trình tự nucleotide và tin sinh học. Mã
vạch DNA cho phép nhận diện một cách nhanh chóng và chính xác những giống lồi

đã biết và lấy thông tin từ chúng. Đây cũng là tiềm năng cho việc thúc đẩy sự khám
phá hàng ngàn loài khác. Mã vạch DNA là cơng cụ chính đối với các nhà phân loại
học trong việc lưu trữ và quản lý những dữ liệu về sự phong phú và những biến đổi
trong sinh giới.
Định nghĩa đơn giản nhất của mã vạch DNA là một hoặc nhiều trình tự gen
được lấy từ mẫu gen đã được chuẩn hóa của bộ gen, dùng để xác định loài. Năm 2003,
Paul Herbert và các đồng nghiệp đã đề xuất đầu tiên việc sử dụng những trình tự thu
gọn cho mục đích xác định nhanh chóng và chính xác “vị trí phân loại của lồi” thơng
qua tất cả các dạng sống từ động vật cho đến thực vật…và trên những mẫu mô nhỏ.
Việc phổ biến thông tin về mã vạch DNA được ứng dụng để nhận dạng các loài và
được áp dụng đầu tiên trên động vật. Tuy nhiên, tiêu chuẩn thiết lập mã vạch DNA cho
thực vật không được hội đồng các nhà thực vật học chấp nhận cho đến 6 năm sau khi
tài liệu đầu tiên về mã vạch DNA trên động vật được công bố [16, 18, 27, 25]
1.3.1. Các gen được sử dụng để xây dựng mã vạch DNA
Ở thực vật, DNA nhân, lục lạp và ti thể đều được sử dụng trong phân tích định
danh phân tử. Các gen ti thể có chỉ số đa dạng thấp giữa trình tự các lồi; sự đa dạng
của vùng mã hóa CO1 giữa các họ thực vật đã được ghi nhận là chỉ vài cặp base trên
đoạn trình tự dài khoảng 1.4 kb nên khơng thể sử dụng để làm DNA barcode cho thực
vật.
Nói chung, trong các tế bào, bộ gen ti thể tiến hóa với tốc độ chậm nhất, bộ gen
của lục lạp với tốc độ nhanh hơn và hệ gen nhân với tốc độ nhanh nhất (Wolfe, Li và
cộng sự 1987; Gaut 1998). Vì lý do này, các trình tự gen cpDNA (ví dụ rbcL, atpB,
matK và ndhF) đã được sử dụng rộng rãi ở cấp độ phổ quát (Chase và cộng sự 1993;
15