Bước đầu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo báo cáo tổng kết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
---------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ
BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO
MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TS. Trần Thanh Thúy

TP. HỒ CHÍ MINH - 2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SỬ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA SINH HỌC
---------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐỀ TÀI :
BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ

BỆNH ĐƢỜNG RUỘT CHO HEO
MÃ SỐ CS. 2005. 23. 92

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI
TS. Trần Thanh Thúy

TP. HỒ CHÍ MINH - 2006


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về probiotic ....................................................................................................... 3
1.1.1. Lƣợc sử nghiên cứu probiotic .......................................................................................... 3
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng trong probiotic ................................. 3
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic.......................................................................................... 5
1.1.4. Vai trò của probiotic ........................................................................................................ 8
1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN .......................................... 11
1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic ........................................................................................ 13
A. Vi khuẩn lactic .................................................................................................................... 13
1.2.1.
Đặc điểm hình thái ......................................................................................... 14
1.2.2.
Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................................ 14
1.2.3. Quá trình lên men lactic ................................................................................................. 16
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình ............................................................................................ 16
1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình ............................................................................................... 17
1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của vi khuẩn lactic ..................... 17
1.2.4.1. Nguồn cacbon ............................................................................................................. 17
1.2.4.2. Nguồn nitơ .................................................................................................................. 18

1.2.4.3. Các muối vô cơ ........................................................................................................... 18
1.2.4.4. Các chất sinh trƣởng ................................................................................................... 18
1.2.4.5. Oxy.............................................................................................................................. 19
1.2.4.6. Nhiệt độ ....................................................................................................................... 19
1.2.4.7. pH................................................................................................................................ 20
1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sình học phục vụ đời sống 20
B. Nấm men ............................................................................................................................. 21
1.3. Tổng quan về heo .............................................................................................................. 24
1.3.1.
Vị trí phân loại của heo .................................................................................. 24
1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con .............................................................................. 24
1.3.2.1. Đặc điểm bộ máy tiêu hóa .......................................................................................... 24
1.3.2.2. Thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột ........................................................................ 25
1.3.3. Các bệnh đƣờng ruột ở heo con ..................................................................................... 25
1.3.3.1. Bệnh tiêu chảy ở heo con do E. coli ........................................................................... 25
1.3.3.2. Tiêu chảy do Saimonella (Phó thƣơng hàn)................................................................ 26
1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị .................................................................................... 26
1.3.4.1. Phòng bệnh.................................................................................................................. 26
1.3.4.2. Điều trị ........................................................................................................................ 27


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 29
2.1. Vật liệu .............................................................................................................................. 29
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................................... 29
2.1.2. Môi trƣờng (xem Phần phụ lục) ..................................................................................... 29
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................................. 29
2.2.1. Phân lập vi khuẩn lactic theo phƣơng pháp Koch [13] .................................................. 29
2.2.2. Xác định khả năng sinh axit tổng bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm [12], [13], [25],
[36], [37] .................................................................................................................................. 29
2.2.3.

Định lƣợng axit lactic bằng phƣơng pháp chuẩn độ Therner [12], [13], [25],
[36], [37]
30
2.2.4.
Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .................................... 30
2.2.5. Xác định hoạt tính ức chế vỉ khuẩn kiểm định bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch [12],
[13], [25], [36], [37]. ................................................................................................................ 32
2.2.6. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của vi khuẩn lactic ................................... 33
2.2.7. Phƣơng pháp bảo quản giống VK lactic bằng phƣớng pháp đông khô ......................... 34
2.2.8. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi
trƣờng thạch [12], [13], [36], [37] ........................................................................................... 35
2.2.9. Khảo sát sự sinh trƣởng và và các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của vi
khuẩn lactic bằng phƣơng pháp đo mật độ quang [12], [13] ................................................... 35
2.2.10.
Khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng tạo sinh
khối của tế bào nấm men bằng phƣơng pháp cân sinh khối tƣơi ............................................. 38
2.2.11.
Phƣơng pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic [12], [13], [36], [37] ............... 38
2.2.12. Tạo chế phẩm probiotic ............................................................................................... 39
2.2.13. Phƣơng pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa ..................................... 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN............................................................................. 42
3.1. Phân lập tuyển chọn các chủng VSV có các đặc tính phù hợp với u cầu tạo chế phẩm
probiotic ................................................................................................................................... 42
3.1.1.
Phân lập và sơ bộ tuyển chọn Vklactic .......................................................... 42
3.1.2.Tuyển chọn các chủng VK lactic - probiotic .................................................................. 42
3.1.2.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng ..................................................................... 43
3.1.2.2. Khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định........................................................ 44
3.1.2.3. Khảo sát hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh ................................................. 46
3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn lactic tuyển

chọn .......................................................................................................................................... 48
3.2.1.
Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 .................................................. 48
3.2.2. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của 3 chủng B, N4, L2................................................... 48
3.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm men ......................................................... 52
3.3.1. Khả năng đề kháng các kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae.................... 52
3.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng với các vi khuẩn kiểm định ............................................ 53
3.3.3. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng nấm men ......................... 54
3.4. Ảnh hƣởng một số điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối các chủng nghiên
cứu............................................................................................................................................ 55
A. Vi khuẩn lactic .................................................................................................................... 55


3.4.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................. 55
3.4.2. Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi
khuẩn lactic .............................................................................................................................. 57
3.4.2.1. Nhiệt độ nuôi cấy ........................................................................................................ 57
3.4.2.2. pH ban đầu .................................................................................................................. 59
3.4.2.3. Nguồn thức ăn nitơ ..................................................................................................... 60
3.4.2.4. Nồng độ cao nấm men ................................................................................................ 62
3.4.2.5. Nguồn thức ăn cacbon ................................................................................................ 63
3.4.2.6. Nồng độ saccharose .................................................................................................... 64
3.4.3. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện
tối ƣu ........................................................................................................................................ 65
B. Nấm men ............................................................................................................................. 66
3.5. Tạo chế phẩm probiotic .................................................................................................... 68
3.5.1. Đông khô các chủng VSV.............................................................................................. 68
3.5.2.
Xác định tỷ lệ phối trộn các chủng trong các chế phẩm ................................ 68
3.5.3. Đóng gói tạo chế phẩm probiotic ................................................................................... 71

3.6. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm .......................................................................................... 72
3.6.1. Khả năng sống sót của các chủng vsv sau q trình đơng khơ ...................................... 72
3.6.2. Khả năng đối kháng với các VK kiểm định của các chủng trong chế phẩm ................. 73
3.7. Xây dựng quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm probiotic .................................................... 75
3.8. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm P-SP-01 trên heo con sau cai sữa .................................. 76
3.8.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa ............................................................................ 76
3.8.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa ................................................................................... 78
3.8.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn .................................................................................................... 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................................................... 82
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC .......................................................... 84
PHỤ LỤC.................................................................................................................................... i


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CNSH

Công nghệ sinh học

ĐHNN

Đại học Nông nghiệp

ĐHQG

Đại học Quốc gia

ĐHSP

Đại học Sƣ phạm

MT

Mơi trƣờng

PTN

Phịng thí nghiệm

SHPT

Sinh học phân tử

TB

Tế bào

TBC

Tế bào chất

TG

Thế giới

VK

Vi khuẩn

VN

Việt Nam

VSV

Vi sinh vật


Mẫu 1.10

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CỞ SỞ
Tên đề tài: Bước đầu nghiên cứu sử dụng Vi sình vật để sản xuất chế phẩm
probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo.
Mã số: CS.2005.23.92
Chủ nhiệm đề tài: Trần Thanh Thủy

Tel:0908 402 475

Email:
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Sư phạm Tp.HCM
Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện :
1. TS. Nguyễn Thị Hoài Hà, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. TS. Võ Thị Hạnh, Phòng Vi sinh, Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.
Thời gian thực hiện: 1 năm.
1. Mục tiêu: Sử dụng một số chủng VSV có lợi (Vi khuẩn lactỉc, nấm men) tạo chế
phẩm có khả năng phịng và trị bệnh tiêu chảy cho heo cỏ hiệu quả.
2. Nội dung chính:
- Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có hoạt tính cần thiết của
chủng probiotic.
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV đã

tuyển chọn.
- Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.
- Tạo chế phẩm probiotic.
- Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.
- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.
3. Thành quả chính đạt đƣợc (khoa học, ứng dụng, đào tạo, kinh tế - xã hội):
- Đã có 2 bài báo :
"Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02", Tạp chí Khoa
học Trƣờng ĐHSP TP.HCM năm 2006.
" Đặc điểm các chủng vi khuẩn lactic dùng trong chế phẩm probiotic phòng và trị
bệnh tiêu chảy cho heo," Hội nghị khoa học lần thứ 20 Trƣờng ĐHBK Hà Nội, năm 2006).
- Hoàn thành 1 luận văn Thạc Sĩ Sinh học, 2 cử nhân Sinh học.


Mẫu 1.10

SUMMARY
Project Title:
Onfirst study on utilliation microorganisms stains to produce the preparation
probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs
Code number: CS.2005.23.92
Coordinator:

Dr. Trần Thanh Thủy

Tel: 0908 402 475

Implementing Institution : Hồ Chí Minh city University of Pedagogy
Cooperating Institution(s):
Dr. Nguyễn Thị Hoài Hà - Center of Biotechnology Việt Nam national University, Hà

Nội
Dr. Võ Thị Hạnh - Institute of Tropical Biology, National center for Science and
Technology of Việt Nam.
Duration:

from...6/ 2005 to ...6/2006

Objectives:
On first study on utilization microorganisms stains to produce the preparation
probiotic for preventing and treating the digestive disorder in pigs
Main contents:
- Isolation and selection of some acid lactic bacteria, yeast strains with high probiotic
activity.
- Studies biological characteristisct of the yast and acid lactic bacteria strains.
- Studies the optimal conditions for their receiving biomass .
- Research on technology to produce probiotic.
- To appraise the quality of products.
- On first test probiotic on weaned piglings, we find good resuls.
Results obtained :
+ " Lactic acid bacteria characteristics in probiotic for preventing and treatirtg the
digestive disorder of pigs ", proceeding of the 20th scientfic conference Ha Noi University of
Technology, 10/2006.
+ "Studying some biological characteristisct of the strain Saccharomyces sp.02,
Journal of science Ho Chi Minh city University of Pedagogy, 7/2006.
+

Finish 1 dissertation of Biology master, 2 dỉssertation Biology bachelors.


1

MỞ ĐẦU
Đã từ lâu, VK lactic và nấm men vốn nổi tiếng với vai trò quan trọng trong các thực
phẩm lên men đem lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con ngƣời. Những năm gần đây, nhóm
VSV này đƣợc biết đến nhiều hơn với chức năng "VK probiotic" nhằm ngăn ngừa, hạn chế
dịch bệnh cho ngƣời và vật nuôi. Probiotic là chế phẩm có bổ sung các vi sinh vật sống có lợi
giúp cải thiện sự cân bằng hệ VSV tự nhiên nơi đƣờng ruột, có khả năng cạnh tranh và đối
kháng với mầm bệnh, tiết các chất trung hịa các độc tố, tăng cƣờng chuyển hóa thức ăn, bổ
sung các dƣỡng chất (protein, khống, vitamin), kích thích miễn dịch trên cơ thể ngƣời cũng
nhƣ vật nuôi.
Trong chăn nuôi heo, bệnh tiêu chảy là căn bệnh khá phổ biến, gây thiệt hại không
nhỏ đến năng suất và chất lƣợng sản phẩm nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh này
thƣờng dẫn đến hiện tƣợng loạn khuẩn khiến tiêu chảy kéo dài cùng với những hậu quả
nghiêm trọng cho sức khỏe con ngƣời cũng nhƣ môi trƣờng sinh thái. Phƣơng pháp hữu hiệu
nhất khắc phục tình trạng này là tái lập cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột bằng cách bổ sung
một hệ vi khuẩn có lợi mới dƣới dạng các chế phẩm probiotic.
Phòng bệnh bằng chế phẩm tiền sinh học hay còn gọi là probiotic nhằm tăng cƣờng
khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu bền và an tồn sinh học.
Trên thị trƣờng hiện đang lƣu hành nhiều loại chế phẩm probiotic ngoại nhập nhƣ Bye (Mỹ),
Neo-Perk-Porcine (Anh), Lacfeed 66G (Nhật),... cho kết quả tốt nhƣng không ổn định và giá
thành còn cao.


2

Do đó, việc nghiên cứu sử dụng các VSV có lợi để tạo chế phẩm probiotic nhằm khắc
phục tình trạng trên là việc làm hết sức cần thiết trong điều kiện hiện nay. Đó cũng chính là
lý do khiến chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu : "Bước đầu nghiên cứu sử dụng các vi sinh
vật tạo chế phẩm Probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo"
Mục tiêu của đề tài:

Sử dụng một số chủng VSV có lợi (VK lactic, nấm men) nhằm tạo chế phẩm có khả
năng phịng và trị bệnh đƣờng ruột cho heo con hiệu quả.
Nhiệm vụ của đề tài:
1. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic, nấm men có các hoạt tính cần thiết
của một chủng probiotic.
2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại các chủng VSV
đã tuyển chọn.
3. Nghiên cứu các điều kiện tối ƣu cho sự tạo sinh khối các chủng.
4. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống và tạo chế phẩm probiotic.
5. Kiểm tra chất lƣợng chế phẩm.
6. Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa.
7. Xây dựng quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm probiotic quy mơ PTN.
Đề tài được thực hiện tại:
- Phịng thí nghiệm Sinh lí - Sinh hóa - Vi sinh Trƣờng ĐHSP Tp.HCM
- Phịng thí nghiệm Vi sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới Tp.HCM.
- Phịng thí nghiệm CNSH và SHPT thuộc Trung tâm bảo tàng giống chuẩn ĐHQG
Hà Nội.
- Bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm tại trại chăn nuôi heo xã Đại Hải, huyện Kế Sách,
tỉnh Sóc Trăng.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về probiotic
1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic
Khái niệm probiotic đầu tiên đƣợc mô tả nhƣ là hệ VSV trong thức ăn bổ sung cho
ngƣời và vật nuôi.
Năm 1925, Beach là ngƣời đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có
chứa các VK "Lactobacillus acidophiỉus" [46].

Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mơ
tả những VSV có khả năng kích thích sinh trƣởng của một số vật nuôi.
Năm 1968, King đã nghiên cứu thành cơng trong việc kích thích sự tăng trƣởng của
heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46].
Năm 1989, Fuller (Anh), cùng nhiều nhà khoa học khác nhƣ Lee (Singapore),
Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) đều thống nhất trong định nghĩa
: "Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hưởng tốt
cho sức khỏe của vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột" [41], [42],
[46].
1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic
Hiện biết có khoảng gần 20 loài VK đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotic. Các VK
lactic có lợi giữ vai trị chính đƣợc sử dụng nhƣ L. acidophỉlus, Lactobacillus delbrueckii
subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve,Enterococcus
faecium , ...


4

Chúng có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của VSV gây bệnh.
Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đƣờng ruột, tạo mơi trƣờng khơng thuận lợi cho
VSV có hại phát triển. Ngồi ra, chúng cịn sản xuất chất kháng sinh, sinh H202, sản xuất các
enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B1, B2, B6, B12), khử độc
tố trong đƣờng ruột [1], [42], [46].
Tham gia vào thành phần VSV probiotic cịn có nấm men nhƣ Saccharomyces
cerevisiae và Sac. bouiardij. Nấm men ngoài khả năng làm cân bằng hệ VSV trong đƣờng
ruột cịn có vai trị tạo ra sinh khối nhanh, sinh khối giàu axit amin, các vitamin (nhóm B, D),
tiết các chất có khả năng hấp thu độc tố và bài thải ra ngồi. Chúng lên men chuyển hóa
glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi khác trong đƣờng ruột hoạt động và
sinh sản. Nấm men cịn tiết các enzym tiêu hóa nhƣ amylase, protease,... và cịn có khả năng
đề kháng lại với tất cả các kháng sinh (trừ kháng sinh nấm). Chính vì vậy, chúng có thể tồn

tại ở bất cứ nơi nào trong đƣờng ruột của vật ni mà hồn tồn khơng bị kháng sinh tiêu diệt
[1], [11], [42], [46].
Có thể tóm tắt đặc điểm chung của VSV probiotic là :
- Có khả năng gắn vào tế bào.
- Loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại.
- Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh.
- Tạo ra các chất chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh.
- Không lan truyền rộng, không gây ung thƣ và không gây bệnh.


5

Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56]

Sản phẩm, nhà sản
xuất, xuất xứ
LC1, Nestlé (Mỹ, Pháp,
Ý, Anh, Đức)
PAIGEN TWINU,
Cp-Meiji (Thái Lan)
Lactinex, Hynson (Mỹ)

Chủng VK lactic
sử dụng
L. bulgaricus
L. johnsonii
L. bulgaricus
L. acidophilus
L. bulgaricus
L. acidophilus

Chức năng

Dạng sản phẩm

Kích thích hệ thống
miễn dịch

Sữa lên men

Tăng cƣờng sức khỏe

Sữa lên men

Tăng cƣờng sức khỏe

Thuốc bột

Phịng chống các rối
loạn tiêu hóa, giảm
tiêu hao thức ăn cho
heo
Organic Green, Han
Phòng chống bệnh
L. acidophilus
Poong (Nam Triều Tiên)
tiêu chảy cho heo
Phịng chống rối loại
Saccharomyces
Ultra levure

tiêu hóa, tăng cƣờng
(Pháp)
boulardii
sức khỏe
Chữa chứng tiêu chảy,
Emitan
(Trƣờng ĐHNN I Hà
Endomycosis CG2 tăng chuyển hóa thức
Nội)
ăn
1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic

BioI, Viện Sinh học
nhiệt đới TP. HCM (Việt
Nam)

L. acidophilus
Saccharomyces
sp.

Bột mịn

Bột mịn
Viên viên nhộng
Chế phẩm dạng bột
mịn

- Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh
Khi cung cấp thƣờng xuyên các VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đơng
khơ cho ngƣời và động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ngày), chúng sẽ

phát triển, chiếm ƣu thế và cạnh tranh với các VSV có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh
dƣỡng, về khối lƣợng các chất sinh ra bởi VSV [15], [41], [42], [46].


6

- Sản xuất các chất kháng khuẩn
Tác nhân ức chế VK gây bệnh của VK lactic không chỉ là axit lactic mà còn bởi
những chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ axit hữu cơ, ethanol, H2O2, diacetyl,... [11], [46], [48].
Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh axit lactic thì nhóm VK
lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác nhƣ axit acetic, axit formic, axit
propionic,... Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trƣờng và khi pH đạt đến một mức
nào đó sẽ đủ để loại trừ những VSV gây hại trong đƣờng ruột. Chẳng hạn nhƣ các VSV gây
thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các VSV gây
bệnh nhƣ E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium,
Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn). Một số loài nhƣ Lactococcus lactis,
Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H202 khi chuyển từ mơi trƣờng kị khí sang hiếu khí.
H2O2 có khả năng ức chế Staphylococus aureus một loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn.
[1], [11]. Hoạt tính ức chế của Diacetyl tăng lên trong môi trƣờng axit, ức chế mạnh hơn đối
với VK G- và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao).
- Kháng khuẩn do sinh bacteriocin
Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein có khả năng ức chế các VK có quan
hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đó. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
một số bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G+ và G-.


7

Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt nhƣ sau : bacteriocin đƣợc hút bám
trên màng tế bào VSV nhạy cảm với nó, làm giảm thế năng của màng, gây những thƣơng tổn

không thể khắc phục đƣợc. Sau đó, chúng dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội
bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thốt các axit
amin tích tụ và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngồi mơi trƣờng qua các lỗ thủng
trên màng. Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lƣợng [41], [42], [46], [48].
Zymocin là một loại kháng sinh do một số chủng nấm men tiết ra nhằm chống lại sự
cạnh tranh giữa các chủng cùng loài hoặc chủng thuộc họ gần. Chúng có bản chất là
polipeptit hay glucoprotein. Do tính chọn lọc cao nên zymocin cịn có tiềm năng chống lại
một số bệnh nan y. Theo Nguyễn Kim Minh Tâm (2001), Saccharomyces boulardii có khả
năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficili (gây viêm ruột kết màng giả),
trung hòa nội độc tố của E. coli, Vibrio cholerae nên đƣợc dùng trị tiêu chảy cấp tính cho
ngƣời.
- Cân bằng hệ vi khuẩn trong đƣờng ruột
Đã có nhiều bằng chứng cho thấy khả năng phục hồi và duy trì sự cân bằng hệ VSV
đƣờng ruột nhờ chế phẩm probiotic có VK lactic hoặc có nấm men. Khi cho bệnh nhân bị
chứng rối loạn dạ dày hay đƣờng ruột sử dụng L. acidophilus, B. biỷidum và B. breve sẽ làm
gia tăng số lƣợng của Lactobacillus và giảm số lƣợng của E. coli trong ruột. Bệnh nhân sử
dụng thuốc trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số VSV có lợi trong đƣờng ruột


8

nên ngƣời ta thƣờng dùng chế phẩm có Bifidobacterium sp. và L. acidophilus để phục hồi hệ
VK đƣờng ruột cho những bệnh nhân này [46].
1.1.4. Vai trò của probiotic
a. Với con ngƣời
- Phòng và trị bệnh tiêu chảy, bệnh nhiễm khuẩn ở dạ dày, đường ruột.
Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophilus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2
số trẻ bị tiêu chảy do Rotavirus và giúp tăng cƣờng hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể,...
[11], [41], [46]. Khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus dƣới dạng sữa lên men hoặc dạng đơng
khơ cho trẻ em thì khoảng 95% trẻ em sẽ giảm thời gian tiêu chảy ngay sau ngày đầu tiên và

ít nơn mửa, khơng tiêu ra máu ngay sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46].
- Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa
Khi cơ thể thiếu enzym B-galactosidase, đƣờng lactose sẽ không đƣợc tiêu hóa thành
glucose và galactose và bị chuyển ngay xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi
những VK đƣờng ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi
cho việc tiêu hóa sữa. Nhƣng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lƣợng lactose sẽ giảm đi, đồng
thời enzym B-galactosidase đƣợc tăng cƣờng nhờ VK lactic sẽ có tác dụng làm giảm đi
những triệu chứng của bệnh này.
- Phòng và trị một số bệnh khác
Việc sử dụng các chế phẩm Probiotic hay sữa chua với liều lƣợng thích hợp sẽ có khả
năng chữa khỏi trên 50% số ngƣời bị táo bón, làm giảm lƣợng cholesterol, cải thiện tình trạng
bệnh nhân bị bệnh gan mãn


9

tính [41], [46]. Những bệnh nhân nhiễm trùng đƣờng hơ hấp và đƣờng niệu có hàm lƣợng
Candida ở trong phân (10 5 tế bào/g phân) rất cao. Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, hàm
lƣợng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46].
Các VK lactic trong chế phẩm probiotic cịn có khả năng làm giảm các enzym
Nitroreductase, Azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thƣ thành chất gây
ung thƣ [11], [46]. Chúng có khả năng làm thối hóa khối u hạn chế sự giảm bạch cầu trong
điều trị phóng xạ, kéo dài sự sống cho bệnh nhân ung thƣ cổ tử cung và ung thƣ bàng quang
[46], [48].
Bên cạnh đó, nấm men trong chế phẩm probiotic cịn có khả năng cung cấp các
vitamin thuộc nhóm B đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, protein giúp tăng cƣờng
sức đề kháng cho ngƣời bệnh, cho những ngƣời ăn kiêng.
b. Với vật nuôi
- Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn
Sử dụng probiotic trong chăn ni gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho

ngƣời sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK lactic có
chức năng cải thiện khu hệ VSV đƣờng ruột, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, tận dụng thức
ăn,...
Nghiên cứu trên heo con 4 tuần tuổi và heo trƣởng thành với 4 lơ thí nghiệm. Kết quả
thu đƣợc cho thấy, khi sử dụng L. acidophilus với liều lƣợng 750mg/kg thức ăn đối với heo 4
tuần tuổi, đã làm cho heo tăng trọng bình quân mỗi ngày là 0,159 kg và tăng khả năng chuyển
hóa thức ăn. Axit


10

lactic giúp heo con gia tăng khối lƣợng cơ thể nhƣng nó khơng có tác dụng trên heo trƣởng
thành [15], [42], [42], [46].
Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên
heo con và heo trưởng thành [46]

Chỉ tiêu

Đối chứng

Lactobacillus

S. faecium

Axit lactic

Lƣợng chế phẩm lấy
vào

0

750mg/kg
thức ăn

1250mg/kg
thức ăn

220mg/kg
thức ăn

Heo con :
Tăng trọng trung bình
mỗi ngày (kg)

0,145

0,159

0,134

0,145

Hệ số tiêu tốn thức ăn

3,09

2,43

2,82

2,61

Heo trƣởng thành :
Tăng trọng trung bình
mỗi ngày (kg)

0,84

0,83

0,83

-

Hệ số tiêu tốn thức ăn

3,17

3,20

3,20

-

Bổ sung chế phẩm Saccharomyces cerevisiae cho heo con đang bú có khả năng làm
giảm tỷ lệ tiêu chảy 4,8%, làm tăng trọng lƣợng heo con sau cai sữa từ 2-3% so với đối chứng
và làm giảm hệ số tiêu tốn thức ăn trong 17ngày [ll], [42], [46]. - cải thiện sự đề kháng bệnh
Khảo sát trên 312 heo con mới sinh, chia 2 lơ thí nghiệm. Ở lơ có sử dụng chế phẩm
probiotic - VBP (B. pseudolongum preparation), cịn lơ đối chứng khơng sử dụng chế phẩm.
Khi sử dụng chế phẩm VBP cho heo ngay sau khi sinh với liều lƣợng 0,5g/ ngày, liên tục

trong 10 ngày và tiến hành theo dõi bệnh tiêu chảy trong 3 tuần. Kết quả là hiếm thấy bệnh
tiêu chảy ở nhóm cho ăn VBP trong suốt tuần đầu heo mới sinh. Trong khi đối chứng có hơn
60% mắc bệnh tiêu chảy. Hơn thế, các độc tố đƣờng ruột do các


11

VK gây bệnh sinh ra có thể đƣợc trung hịa bởi probiotic. Từ đó làm giảm tỷ lệ tiêu chảy và
giảm tỷ lệ chết trên heo con do tiêu chảy.
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi [46]

Vật nuôi

Probiotic

Liều sử dụng

Ảnh hƣởng

Bò đực cai sữa

B. pseudolongum

l g/ngày

Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy

Heo còn bú

B. pseudolongum

0,5 g/ngày

Giảm sự xuất hiện bệnh
tiêu chảy, sức khỏe tốt hơn

Heo cai sữa

L. bulgaricus

500 ml/1l
36 g/1l

Tỷ lệ % E. coli thấp ở trực
tràng, giảm tỷ lệ chết ỡ heo

1.1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên TG và VN
a. Những nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc
Ở Việt Nam hiện nay, có thể kể đến các cơng trình nghiên cứu về lĩnh vực này của
Viện Thú y quốc gia :
+ Yaourt và canh trùng Subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của heo con
(Đào Trọng Đạt, Vũ Đình Hƣng, 1962).
+ Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột của gia súc (Lê
Thị Tài và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm VSV (Saccharomyces boulardi) với bệnh phân trắng heo con (Phan
Thanh Phƣợng và cộng sự, 1968 - 1978).
+ Chế phẩm Biolactyl để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Phan Thanh Phƣợng và
cộng sự, 1979 - 1984).
+ Chế phẩm BioI để phòng trị bệnh đƣờng ruột của heo (Viện Sinh học nhiệt đới TP.

HCM, 2003).


12

Các nghiên cứu trên khẳng định việc sử dụng chế phẩm probiotic đều cho kết quả tốt
trong phòng, trị bệnh đƣờng ruột cũng nhƣ khả năng điều hịa và kích thích sự sinh trƣởng
của heo.
Năm 2002, Tạ Thị Vịnh và cộng sự đã sử dụng chế phẩm VITOM.l và VITOM.3 của
Nga trong phịng trị bệnh đƣờng tiêu hóa trên heo và gà. Kết quả thu đƣợc là trọng lƣợng heo
tăng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% và khơng có tái phát
(VITOM.3).
Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (2002), nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chế phẩm
EM1 trên heo con đã cho thấy chế phẩm này có tác dụng ức chế đối với E. coli, Salmonella,
Klebsiella, Shigella, Proteus, Staphylococcus, Sreptococccus, Clostridium, Sarcina lutea. Kết
quả số lƣợng VK E. coli trong phân giảm, tỷ lệ tiêu chảy giảm và heo tăng trọng nhanh.
b. Những nghiên cứu và ứng dụng ở ngoài nƣớc
Theo Lema và cộng sự (2001), để kiểm tra sự bài thải của VK E. coli Q157, ông đã
trộn các VK probiotic với liều 6 x 106 CFU/ kg thức ăn liên tục trong 7 tuần. Kết quả cho
thấy lơ 4 có sự bài thải VK E. coli trong phân thấp hơn các lơ khác. Khác biệt này hồn tồn
có ý nghĩa so với lô đối chứng không dùng probiotic.
Kyriakis và cộng sự (1999), nghiên cứu ảnh hƣởng của probiotic LSP 122 đến việc
phòng ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con giai đoạn 28 ngày tuổi. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên
4 lô : lô 1 không dùng probiotic, lô 2 sử dụng VK B. toyoi với liều 106 tế bào/kg thức ăn và lô
4 sử dụng B. licheniformis với liều 106 và 107 tế bào/kg thức ăn. Kết quả thí nghiệm


13

giữa các lơ khác biệt hồn tồn và có ý nghĩa so với lơ đối chứng (P< 0,05). Ngồi ra, tăng

trọng/ngày, tiêu tốn thức ăn ở lơ thí nghiệm cũng cải thiện hơn so với đối chứng. Trong đó, lơ
sử dụng 107 tế bào B. licheniformis cho kết quả tốt nhất. Theo Tuomola và cộng sự (1999),
làm thí nghiệm dùng các VK probiotic cho thấy Lactobacillus, L. johnsonii và L. rhamnosus
làm giảm sự bám dính của E. coli từ 90 - 91% ; riêng S. typhimurium bị giảm khả năng bám
dính đến 77% bởi L. johsonii và 83% bởi L. casei.
Mặc dù, các cơng trình nghiên cứu những khía cạnh khác nhau, sử dụng các chế phẩm
có thành phần vi khuẩn probiotic khác nhau nhƣng đều có chung kết luận là probitic đã ảnh
hƣởng có lợi trên nhiều mặt với cơ thể vật nuôi.

1.2. Sơ lƣợc về vi sinh vật probiotic
A. Vi khuẩn lactic
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Scheele lần đầu tiên đã tách đƣợc axit lactic từ sữa
bị lên men chua.
Năm 1847, Blondeau đã cơng nhận axit lactic là sản phẩm cuối cùng của chuỗi phản
ứng lên men.
Năm 1857, Louis Pasteur (Pháp) chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt
động của một nhóm VK đặc biệt gọi là VK lactic.
Năm 1873, Lister phân lập thành công VK lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium
lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactis). Từ đó đến nay các nhà khoa học đã phân lập
đƣợc nhiều loại VK lactic khác nhau và


14

công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic đã đƣợc hình thành từ năm 1881.
Trong tự nhiên, VK lactic có mặt ở nhiều nơi : trong phân, rác, niêm mạc ruột,... Đặc
biệt có nhiều trong sản phẩm lên men chua. VK lactic ngày càng đƣợc ứng dụng trên qui mơ
lớn, đặc biệt những chủng có hoạt tính sinh học cao thuộc chi Lactobacillus, Streptococcus,...
[1], [11], [14], [47], [50].
1.2.1. Đặc điểm hình thái

VK lactic là tên gọi của một nhóm VK thu nhận năng lƣợng nhờ phân giải
cacbonhydrat và sinh ra axit lactic. Chúng đƣợc xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Mặc
dù nhóm VK này khơng đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả dạng que ngắn, que dài và cả
VK hình cầu), song về mặt sinh lí chúng lại tƣơng đối thống nhất với nhau trong các đặc
điểm sau :
+ Đều là VK Gram dƣơng (G+).
+ Không tạo thành bào tử.
+ Hầu hết khơng di động.
+ Là VSV hiếu khí tùy ý hoặc kỵ khí khơng bắt buộc.
+ Đều thuộc loại đa khuyết dƣỡng.
1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic
VK lactic bao gồm các chi : Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacter, Enterococcus,
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus,
Vagococcus và Bifìdobacteriwn. Những VSV đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp thực
phẩm thuộc về các chi


15

nhƣ Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Trong đó Lactobacillus chiếm
vị trí quan trọng nhất [11], [14], [47], [50].
* Streptococcus
Tế bào hình cầu hay oval, đƣờng kính nhỏ hơn 2 m, dạng đơi hay chuỗi ngắn hoặc
dài, ƣa ấm, nhiệt độ thích hợp khoảng 370C. Có khả năng phân giải nhiều loại đƣờng nhƣ
glucose, mantose, lactose. Chúng đóng góp vào việc tạo hƣơng vị cho sản phẩm, nhất là chất
lƣợng sữa.
* Lactobacillus
Tế bào hình que dài hoặc ngắn, thƣờng dạng chuỗi, kích thƣớc dao động trong khoảng
0.5-1.2 X 1 - 10 m. Tế bào không di động; gram dƣơng; không sinh bào tử. Chúng là dạng
kỵ khí khơng bắt buộc, có thể tăng trƣởng ở nhiệt độ từ 50 C- 530 C nhƣng nhiệt độ tăng

trƣởng tối thích từ 300 C - 400 C. Chúng có thể sống ở pH < 5. Một số chủng thuộc loại kỵ khí
nghiêm ngặt.
Lactobacillus gồm 25 lồi, chia thành 3 nhóm đồng hình bắt buộc, dị hình bắt buộc, dị
hình tùy ý. Các nhóm VK lactic này đều tạo ra axit lactic nhƣng axit do từng nhóm tạo ra
khác nhau về cấu hình đồng phân của axit lactic. Lacctobacillus đƣợc sử dụng nhiều trong
công nghiệp chế biến và bảo quản sữa, phomat, thịt cũng nhƣ trong việc tạo các chế phẩm
probiotic.
* Leuconostoc
Tế bào hình oval xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn hoặc chuỗi dài. Chúng có nhu
cầu cao về mặt dinh dƣỡng. Lên men dị hình tạo axit lactic và các sản phẩm phụ nhƣ axit
acetic, etanol, CO2; Có khả năng tạo hƣơng


16

thơm cho bơ, sữa chua do tạo thành các chất nhƣ acetylmetyl carbinol hay acetonin [ll], [14],
[47], [50].
* Bifidiobacterium
Là những trực khuẩn kị khí ; lên men lactic dị hình ; sản phẩm chính là là axit lactic
và axit acetic (tỷ lệ 3:1) cùng với một lƣợng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic ; khác biệt
với các VK lên men lactic dị hình khác là khơng sinh CO2. Chúng thuộc loại ƣa ấm, nhiệt độ
sinh trƣởng tối thích từ 310 C - 410 C [11], [14], [47], [50].
1.2.3. Quá trình lên men lactic
Lên men lactic là q trình chuyển hóa kỵ khí đƣờng với sự tích lũy axit lactic trong
mơi trƣờng. Có thể tóm tắt theo phƣơng trình sau:

Các lồi VK lactic khác nhau về cơ chế lên men glucose. Một vài loài VK lactic lên
men đƣờng tạo axit lactic, nhóm này gọi là lên men đồng hình. Một số nhóm khác ngồi axit
lactic cịn tạo rƣợu và CO2, nhóm này gọi là lên men dị hình [11], [14], [47], [50].
1.2.3.1. Lên men lactic đồng hình

Các VK lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (Embden Meyerhof - Parnas) và cho ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90-98%). Mức độ tạo thành các
sản phẩm phụ thuộc sự có mặt của oxi.


17

Phƣơng trình tóm tắt:
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi

2CH3CHOHCOOH + 2ATP

glucose

axit lactic

Một số VK lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis, Lactobacillus
acidophilus, L.casei,

L. cremoris, L.helveticus, L. delbrueckii, Streptococcus lactis, S.

thermophilus, p. cerevisiae [47], [50].
1.2.3.2. Lên men Lactic dị hình
Sản phẩm của q trình lên men lactic dị hình ngồi axit lactic (40%), cịn có các sản
phẩm khác nhƣ axit succinic, rƣợu etylic (20%), axit acetic (10%), các chất khí cịn lại (20%)
[14], [47], [50].
Phƣơng trình tóm tắt:
C6H12O6
glucose

CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + x Kcal

axit lactic

etanol

Một số VK lactic lên men dị hình thƣờng gặp là Leuconostoc mensenteroides,
Leuconostoc cremoris, L. brevis, L. fermentum,... [11], [14], [47].
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic
1.2.4.1. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon quan trọng nhất cho VK lactic là monosaccarit và disaccarit. Các
nguồn cacbon này đƣợc dùng để cung cấp năng lƣợng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra
các axit hữu cơ nhƣ axit malic, axit pyruvic,... Tùy từng loại VK lactic khác nhau mà ta chọn
nguồn thức ăn cacbon cho phù hợp.