Nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính ức chế α glucosidase lá chân chim không cuống quả họ nhân sâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

--------------------------------------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH
ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE LÁ CHÂN CHIM KHÔNG CUỐNG QUẢ HỌ
NHÂN SÂM
Mã số: CS. 2015.19.19

Cơ quan chủ trì:
Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Việt Hoa

TP. Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

--------------------------------------------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ THĂM DỊ HOẠT TÍNH
ỨC CHẾ -GLUCOSIDASE LÁ CHÂN CHIM KHÔNG CUỐNG QUẢ HỌ
NHÂN SÂM
Mã số: CS. 2015.19.19

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài

Chủ nhiệm đề tài

Lê Thị Việt Hoa

TP. Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2016


DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
VÀ CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
 Các thành viên tham gia thực hiện đề tài:
1. Lê Thị Việt Hoa_Chủ nhiệm đề tài.
2. Nguyễn Tấn Phát_Viện Cơng nghệ Hóa học.
 Các đơn vị phối hợp chính:
1. Khoa Hóa học, Trường ĐHSP Tp. HCM;
2. Viện Cơng nghệ Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐH SƢ PHẠM TP. HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 09 năm 2016

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thơng tin chung:
* Tên đề tài:

“Nghi n cứu th nh hần hóa học v th
h ạt tính ức chế -glucosidase của
lá Chân chim không cuống quả họ Nhân sâm”
* Mã số đề tài: CS.2015.19.19
* Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Việt Hoa
* Cơ quan chủ trì: Khoa H trƣờng Đại học Sƣ hạm Tp. Hồ Chí Minh
* Thời gian thực hiện: 09/2015 đến 09/2016
2. Mục tiêu củ đề tài:
“Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc, thử hoạt tính ức chế -glucosidase
trên cao và các chất có trong cao methanol của lá Chân chim khơng cuống quả họ
Nhân sâm”
3. Tính mới và sáng tạo:
Đã phân lập được 5 chất có trong lá chân chim không cuống quả, xác định cấu
trúc và thử hoạt tính ức chế -glucosidase trên các cao và chất đã phân lập.
4. Kết quả nghiên cứu:
- Biện luận cấu trúc của 5 hợp chất được cô lập từ cao methanol của lá Chân
chim không cuống quả.
- Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase cho cao ethanol, nhexane, ethyl acetate, methanol, và các hợp chất đã phân lập.
5. Sản phẩm:
– 1 bài báo khoa học;
6. Hiệu quả hƣơng thức chuyển giao kết qủa nghiên cứu và khả n ng á ụng:
Kết quả của bài báo khoa học sẽ được sử dụng cho các cơng trình nghiên cứu
khoa học tiếp theo của khoa Hóa.
Cơ qu n chủ trì
(Kí tên)

Chủ nhiệ

đề tài

Lê Thị Việt Hoa


THE INFORMATION OF RESEARCH RESULTS

1. General information:
* Project title: “Stu y f structure c

nents and prove the -glucosidase

inhibitor activities from the leaves of Schefflera sessiliflora De. P. V”.
* Code number: CS.2015.19.19
* Coordinator: Le Thi Viet Hoa.
* Implementing institution: Ho Chi Minh City Pedagogical University,
Chemical faculty
* Duration: From September 2015 to September 2016
2. Objective:
“Isolation, structure elucidation of new components from the methanol extraction,
and prove the -glucosidase inhibitor activities from the leaves of Schefflera
sessiliflora De. P. V”.
3. Creativeness and innovativeness:
-

Isolated 5 components from the methanol extraction.

-

Test the -glucosidase inhibitor activities on extractions and components.

4. Research results:

- Report structure elucidation of five new compounds.
- Result of the -glucosidase inhibitor activities on ethanol, n-hexane, ethyl
acetate, methanol extractions and some new components.
5. Products:
- Scientific papers: 1
6. Efficient, method of transferring research results and the ability to apply
Research results will be used for the next research of Chemistry faculty.

Implementing institution

Coordinator

Le Thi Viet Hoa



MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. iii
DANH MỤC SƠ ĐỒ .......................................................................................... iii
LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI ....................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Phân loại khoa học ....................................................................................... 2
1.2 Mô tả thực vật .............................................................................................. 2
1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học......................................................... 2
1.4 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý ............................................................. 5
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị .................................................................... 6
2.1.1 Hóa chất .................................................................................................... 6

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 6
2.2 Nguyên liệu .................................................................................................. 7
2.3 Chiết tách và phân lập ................................................................................ 7
2.3.1 Q trình trích ly các cao chiết ................................................................. 7
2.3.2 Quá trình sắc ký phân lập các hợp chất .................................................... 9
2.4 Th

dị hoạt tính ức chế -glucosidase ............................................... 13

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế -glucosidase .................................... 13
2.4.2 Q trình thử hoạt tính ức chế -glucosidase .......................................... 13
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 Nhận danh cấu trúc các chất đã phân lập .................................................... 14
3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase .......................... 14
KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ................................................................................. 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
BÀI BÁO

Trang ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
H-NMR
: Proton Nuclear Magnetic Resonance
13
C-NMR : Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance
brs
: broad (NMR)
CC

: Column chromatography
CHCl3
: Chloroform
C-M
: Chloroform-Methanol
COSY
: Correlation SpectroscopY
d
: doublet
dd
: doublet of doublet
DEPT
: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
E-M
: Ethyl acetate – Methanol
EtOH
: Ethanol
EtOAc
: Ethyl acetate
HMBC
: Heteronuclear Multiple Bond Coherence
HR-ESI-MS : High Resolution Electrospray Ionisation Mass Spectrometry
HSQC
: Heteronuclear Single Quantum Correlation
H2SO4
: Acid sulfuric
IR
: Infrared
IC50
: Inhibitory Concentration 50%

1

J
L
LD50
m
MeOH
mp
ppm
q
Rf
s
t
TLC
UV

L
m

: Coupling constant (hằng số ghép spin)
: lít
: Lethal Dose 50%
: multiplet (NMR)
: Methanol
: melting point
: par per million
: quartet
: Retention factor
: singlet (NMR)
: triplet (NMR)

: Thin Layer Chromatography
: Ultraviolet
: chemical shift
: microliter
: micrometer

Trang iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Kết quả cột thường phân đoạn V
Bảng 2.2: Kết quả cột thường phân đoạn V.2
Bảng 2.3: Kết quả cột thường phân đoạn IV
Bảng 2.4: Kết quả cột thường phân đoạn IV.1
Bảng 2.5: Kết quả cột thường phân đoạn IV.2
Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của SSL01 và so sánh với tài liệu
Bảng 3.2: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của SSL02 và so sánh với tài liệu
Bảng 3.3: Dữ liệu phổ 13C–NMR, HMBC của SSL03 và so sánh với tài liệu
Bảng 3.4: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của SSL04 và so sánh với tài liệu
Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, COSY, HMBC của SSL05 và so sánh với tài
liệu
Bảng 3.6: Kết quả phần trăm ức chế và IC50 của các cao so với acarbose
Bảng 3.7: Kết quả phần trăm ức chế và IC50 của các chất so với acarbose

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ trích ly các loại cao chiết
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ rửa giải cao Methanol
Sơ đồ 2.3: Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn V
Sơ đồ 2.4: Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn IV

Trang iv


LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa nên có nguồn thực vật vơ cùng đa dạng và
phong phú. Từ xa xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nhiều cây cỏ và các bộ phận của cây
để chữa bệnh một cách hiệu quả, nhưng việc sử dụng chỉ dựa vào kinh nghiệm dân
gian. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học-kỹ thuật nói chung và ngành HóaThực vật nói riêng địi hỏi chúng ta khơng chỉ sử dụng hiệu quả mà cịn phải tìm hiểu
thành phần hóa học của các cây thuốc để có thể tìm ra những hợp chất có hoạt tính
sinh học cao cũng như tìm ra những hoạt tính mới giúp nâng cao giá trị cây thuốc Việt
Nam.
Xu hướng hiện nay các nhà khoa học không chỉ quan tâm tới những cây thuốc
ngồi khả năng chữa bệnh mà cịn có khả năng bồi bổ cơ thể, tăng lực, ngăn lão hóa tế
bào, phịng chống ung thư... như họ Nhân sâm (Araliaceae) tiêu biểu là sâm Triều Tiên
(Panax ginseng C.A. Mey.), sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), sâm
nam (Schefflera octophylla (Lour.) Harms)…
Năm 2004, nhóm tác giả Trần Cơng Luận đã phát hiện ra một loài mới thuộc họ
Nhân sâm là chân chim không cuống quả và đặt tên là Schefflera sessiliflora De P. V.
Với mong muốn tìm kiếm các hoạt chất quý cũng như các hoạt chất có hoạt tính sinh
học cao làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng dược liệu hoặc phát hiện ra những chất
mới có hoạt tính, chúng tơi tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dị
hoạt tính ức chế -glucosidase cao methanol của lá chân chim không cuống quả
thuộc họ Nhân sâm”. Qua đó, có thể đưa ra khuyến cáo chung khi sử dụng loại dược
liệu này về liều lượng dùng, cách dùng… góp phần nâng cao giá trị loại dược liệu này
tại Việt Nam.

Trang 1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Phân loại khoa học
Chân chim không cuống quả (Schefflera sessiliflora)
Năm 2004, Trần Công Luận và cộng sự đã phát hiện Schefflera sp3 là một loài mới
và được đặt tên là Schefflera sessiliflora[1].
Chân chim không cuống quả có tên khoa học là Schefflera sessiliflora, thuộc họ
Nhân sâm (Araliaceae).
1.2 Mô tả thực vật
Đặc điểm của cây là không cuống, thường mọc chùm 3-7 quả hay riêng lẻ, hình
cầu (5 x 4 mm), khi chín màu cam có 5 cạnh[2].
1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học
Hiện chưa có bất kỳ nghiên cứu nào về thành phần hóa học của loài Schefflera
sessiliflora trên thế giới.
Ở Việt Nam, loài Schefflera sessiliflora cũng có 2 cơng trình nghiên cứu, tuy nhiên
cũng chỉ dừng lại là khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học, định lượng saponin tổng và
cơ lập 2 sapogenin là acid oleanolic và hederagenin từ saponin tổng[3]. Do đó, chúng
tơi đã tìm hiểu thành phần hóa học của một vài loài khác thuộc chi Schefflera.
1.3.1 Schefflera abyssinica
Năm 2006, Léon Azefack Tapondjou và các cộng sự đã cô lập 13 hợp chất từ lá:
acid oleanolic (1), hederagenin (2), caulosid A (3), copterosid B (4), fatsiasid C1 (5),
guaianin N (6), collinsonidin (7), ciwujianosid C3 (8), caulosid D (9),
chikusetsusaponin V (10), ciwujianosid A1 (11), caulosid G (12) và hederagenin 3-O[β-D-glucopyranosyl-(13)]-α-L-arabinopyranosid

28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-

(14)-β-D-glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid (13)[4].
1.3.2 Schefflera arboricola
Năm 2003, Meleka F. R. và các cộng sự đã cô lập 9 triterpenoid từ thân và lá: acid
oleanolic

3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid

(14),

acid

echinocystic 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid (15), acid
oleanolic

3-O-[β-D-apiofuranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid

glucopyranosid

(16),

acid

oleanolic

28-O-β-D-

3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(12),

α-L-

ramnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid (17), acid oleanolic 3-O-[α-Larabinopyranosyl-(12), α-L-rhamnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid 28Trang 2


O-β-D-glucopyranosid (18), acid oleanolic 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(12), α-Lrhamnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid (19), acid oleanolic 3-O-[β-Dgalactopyranosyl-(12), α-l-rhamnopyranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid 28O-β-D-glucopyranosid (20), acid oleanolic 3-O-[α-l-arabinopyranosyl-(12), β-Dapiofuranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid

(21),

acid

oleanolic

3-O-[α-L-

arabinopyranosyl-(12), β-D-apiofuranosyl-(14)]-β-D-glucuronopyranosid 28-O-βD-glucopyranosid (22)[5].
Năm 2006, Guo Fu-Jiang và cộng sự đã cô lập 4 triterpenoid từ thân: scheffarbosid
A (23), scheffarbosid B (24), scheffarbosid C (25), scheffarbosid D (26)[6].
Cơng thức hóa học của các chất đã cô lập từ chi Schefflera

R1

R2

R3

(1)

H

H

H

(2)

H

OH

H

(3)

Ara

OH

H

(4)

GlcA

OH

H

(5)

Glc-(12)-Ara

H

H

(6)

Glc-(13)-Ara

H

H

(7)

Glc-(13)-Ara

OH

H

(8)

Ara

H

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

(9)

Ara

OH

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

Trang 3


(10)

Glc-(12)-GlcA

H

Glc

(11)

Glc-(12)-Ara

H

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

(12)

Glc-(13)-Ara

OH

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

(13)

Glc-(12)-Ara

OH

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

(14)

Rha-(14)-Glc

H

H

(16)

Apiofuran-(14)-GlcA

H

Glc

(17)

Ara-(12)-Rha-(14)-Glc

H

H

(18)

Ara-(12)-Rha-(14)-Glc

H

Glc

(19)

Gal-(12)-Rha-(14)-Glc

H

H

(20)

Gal-(12)-Rha-(14)-Glc

H

Glc

(23)

GlcA-(13)-Rha-(12)-Ara

H

H

(24)

Ara-(14)-Ara-(13)-Rha-(12)-Ara H

H

(25)

Ara-(14)-Ara-(13)-Rha-(12)-Ara OH

H

(26)

Ara-(14)-Ara-(13)-Rha-(12)-Ara H

Rha-(14)-Glc-(16)-Glc

R1

R2

(16)

H

Glc

(21)

Ara

H

(22)

Ara

Glc

Trang 4


(15)
1.4 Các nghiên cứu về tác dụng ƣợc lý
Năm 2001, Trần Công Luận và cộng sự đã thử tác dụng tăng lực trên cả 3 bộ phận
lá, thân, vỏ thân. Đối với lá và vỏ thân liều 1 g/kg cho tác dụng rõ, đạt ý nghĩa thống
kê với độ tin cây 99%; đã thử khả năng chịu đựng stress nóng mạnh ở liều 200 mg/kg
đối với mẫu cao thân[20].
Năm 2004, Trần Công Luận và cộng sự đã thử khả năng tăng lực khi phối hợp cao
thân với cao hồng sâm tỉ lệ 1:1 ở liều 400 mg/kg thời gian sống trung bình của chuột
dài hơn cả lơ sử dụng hồng sâm[21,22]; đã thử độ độc tính cấp đường uống cao thân với
LD50 = 1255 g/kg (đối với dược liệu) và LD50 = 277,92 g/kg (khi phối hợp với hồng
sâm)[21].
Năm 2008, Võ Duy Huấn, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận, Huỳnh Thị
Cẩm Hồng đã thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết và các genin
bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); đã thử khả năng ức chế
peroxy hóa lipid bằng phương pháp MDA (malonyl dialdehyd)[23].
Năm 2012, Trần Mỹ Tiên, Đặng Thị Thanh Nhàn, Trần Công Luận, Nguyễn Thị

Thu Hương đã thử tác dụng kiểu androgen trên chuột đực giảm năng sinh dục của cao
lá và cao thân[24].

Trang 5


CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.1.1 Hóa chất
- Silica gel 230-400 mesh (Merck).
- Silica gel pha đảo C18 (Merck).
- Hạt nhựa Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co).
- n-hexane, Trung Quốc.
- Chloroform, Chemsol, Việt Nam.
- Ethyl acetate, Trung Quốc.
- Methanol, Trung Quốc.
- H2SO4 10%/EtOH.
- Acarbose Merck.
2.1.2 Dụng cụ, thiết bị
+ Thiết bị dùng để phân lập và tinh chế các chất
- Bản nhôm silica gel Merck–GF60F254 tráng sẵn, kích thước 20×20 m, độ
dày lớp hấp phụ 0,2 mm (Merck, Germany).
- Bình sắc ký có nắp đậy và các ống vi quản.
- Cột sắc ký thủy tinh đường kính từ 2-5,5 cm.
- Máy cơ quay chân khơng Buchi EYELA OIL BATH OSB-2000.
- Bếp điện Blacker®.
- Máy siêu âm (Elma S 100 H, Elmasonic, USA).
- Cân phân tích AND HR-200.
+ Thiết bị dùng để xác định cấu trúc các chất
- Phổ hồng ngoại IR đo trên máy Bruker Tensor 27 FT-IR, Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
- Phổ UV-VIS được đo trên hệ máy HPLC-UV Aglilent 1260, Viện Cơng
nghệ Hóa học.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker AM500 FTNMR, Viện Hóa học.
- Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) đo trên máy
Bruker MicrOTOF-QII, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
+ Thiết bị dùng để thử hoạt tính ức chế -glucosidase
Trang 6


- Máy đo mật độ quang Shimadzu UV 1800.
2.2 Nguyên liệu
Nguyên liệu là lá chân chim không cuống quả Schefflera sessiliflora De P. V. được
cung cấp bởi Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt, số 18 Hoàng Văn Thụ,
Thành phố Đà Lạt. Định danh bởi cố TS. Phan Văn Đệ, Bộ môn Tài nguyên Dược
liệu, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, tiêu bản được lưu giữ tại Viện Cơng nghệ
hóa học. Phần lá thu được, rửa sạch, phơi khơ.
2.3 Chiết tách và phân lập
2.3.1 Q trình trích ly các cao chiết
Lá chân chim khơng cuống quả (5 kg) được trích kiệt bằng phương pháp ngâm dầm
và chiết siêu âm với 75 L ethanol 96%, lọc bã, dịch chiết đem cô quay áp suất thấp loại
dung môi thu được 890 g cao thô EtOH.
Cao thô ethanol được thêm nước, chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi nhexane, ethyl acetate, methanol.
Dịch chiết n-hexane thu được đem cô quay loại dung môi thu được 300 g cao nhexane, tương tự tiếp tục chiết lỏng – lỏng phần cắn với ethyl acetate, cô quay áp suất
thấp thu hồi dung môi thu được 15 g cao ethyl acetate. Dịch nước còn lại là cao
methanol tiếp tục đem đi sắc ký.
Cao methanol thu được cho qua cột Dianion HP-20 rửa giải với nước, MeOH 25%,
MeOH 50%, MeOH 75%, MeOH 100%, thu được 5 phân đoạn chính đánh số từ I-V
tương ứng.

Trang 7


Sơ đồ 2.1: Sơ đồ trích ly các loại cao chiết

Mẫu khô
5 kg
Chiết siêu âm với ethanol 96%

Phần bã

Dịch chiết Ethanol
Cô quay thu hồi ethanol

Cao Ethanol
890 g
Chiết lỏng-lỏng với n-hexane

Dịch chiết
n-hexane

Không tan
Chiết siêu âm với ethyl acetate

Cô quay
thu hồi
n-hexane

Dịch chiết
Ethyl acetate

Cơ quay
thu hồi
EtOAc

Cao n-hexane
300 g

Phần
cịn lại

Cao
Methanol

Cao Ethyl acetate
15 g

Trang 8


Sơ đồ 2.2: Sơ đồ rửa giải cao Methanol
Cao Methanol
Cột diaion HP-20
Nước-MeOH
75:25

Nước
100%
Phân đoạn
I

Phân đoạn
II
(67 g)

Nước-MeOH
50:50

Phân đoạn
III
(72 g)

Nước-MeOH
25:75

Phân đoạn
IV
(80 g)

MeOH
100%

Phân đoạn
V
(85 g)

2.3.2 Quá trình sắc ký phân lập các hợp chất
Kiểm tra sơ bộ các phân đoạn thu được từ cột diaion bằng sắc ký bản mỏng TLC
trước khi tiến hành sắc ký cột, các phân đoạn của các vết có Rf như nhau được gom
chung lại.
- Từ hân đ ạn V (85 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung môi

tăng dần độ phân cực n-hexane-EtOAc và EtOAc-MeOH thu được 6 phân đoạn đánh
số tương ứng từ V.1-V.6.
Quá trình sắc ký cột phân đoạn V thu được 6 phân đoạn được tóm tắt như sau:
Bảng 2.1: Kết quả cột thường phân đoạn V
Phân đ ạn

Hệ dung môi

Khối lƣợng

V.1

n-hexane –EtOAc (1 : 1)

10 g

V.2

EtOAc 100%

24 g

V.3

EtOAc-MeOH (10 : 1)

20 g

V.4

EtOAc-MeOH (5 :1)

15 g

V.5

EtOAc-MeOH (3 : 1)

7g

V.6

EtOAc-MeOH (1 : 1)

4g

Tại phân đoạn V.2 (24 g) tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi
tăng dần CHCl3-MeOH thu được 4 phân đoạn đánh số tương ứng từ V.2.1-V.2.4
Tại phân đoạn V.2.1 (8 g) tiếp tục tiến hành sắc ký cột nhiều lần pha thường với
dung môi CHCl3 100% thu được SSL01 (8 mg).

Trang 9


Bảng 2.2: Kết quả cột thường phân đoạn V.2
Phân đ ạn

Hệ dung môi

Khối lƣợng

V.2.1

CHCl3 100%

8g

V.2.2

CHCl3-MeOH (10 : 1)

7g

V.2.3

CHCl3-MeOH (7 : 1)

4g

V.2.4

CHCl3-MeOH (5 :1)

3g

Sơ đồ 2.3: Quy trình phân lập các chất từ hân đ ạn V cao Methanol

V.2.1
8g

V.2.2
7g

V.2.3
4g

Phân đoạn V.6
4g

Phân đoạn V.5
7g

Phân đoạn V.4
15 g

Phân đoạn V.3
20 g

Phân đoạn V.2
24 g

Phân đoạn V.1
10 g

Phân đoạn V
85 g

V.2.4
3g

SSL01
8 mg
- Từ hân đ ạn IV (80 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung
môi tăng dần độ phân cực EtOAc-MeOH: 0-100% thu được 7 phân đoạn đánh số
tương ứng từ IV.1-IV.7.
Quá trình sắc ký cột phân đoạn IV thu được 7 phân đoạn được tóm tắt như sau:

Trang 10


Bảng 2.3: Kết quả cột thường phân đoạn IV
Phân đ ạn

Hệ dung môi

Khối lƣợng

IV.1

EtOAc-MeOH (10 : 1)

15 g

IV.2

EtOAc-MeOH (5 : 1)

15 g

IV.3

EtOAc-MeOH (3 : 1)

20 g

IV.4

EtOAc-MeOH (1 : 1)

8g

IV.5

EtOAc-MeOH (1 : 2)

6g

IV.6

EtOAc-MeOH (1 : 3)

5g

IV.7

MeOH 100%

3g

Tại hân đ ạn IV.1 (15 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung

môi tăng dần CHCl3-MeOH-nước (90:10:0,1 - 80:20:0,2) thu được 4 phân đoạn đánh
số tương ứng IV.1.1-IV.1.4.
Bảng 2.4: Kết quả cột thường phân đoạn IV.1
Phân đ ạn

Hệ dung môi

Khối lƣợng

IV.1.1

CHCl3-MeOH-nước (90:10:0,1)

2g

IV.1.2

CHCl3-MeOH-nước (85:15:0,1)

5g

IV.1.3

CHCl3-MeOH-nƣớc (85:15:0,2)

5g

IV.1.4

CHCl3-MeOH-nước (80:20:0,2)

1g

Phân đoạn IV.1.3 (5 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột pha thường
nhiều lần rửa giải với hệ dung môi CHCl3-MeOH-nước (90:10:0,1), sau đó tiếp tục
cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (6:1) thu được 13 mg
SSL02.
Tại hân đ ạn IV.2 (15 g) tiến hành sắc ký cột pha thường rửa giải với hệ dung
môi tăng dần CHCl3-MeOH-nước (85:15:0,1 - 75:25:0,3) thu được 4 phân đoạn đánh
số tương ứng IV.2.1-IV.2.4.

Trang 11


Bảng 2.5: Kết quả cột thường phân đoạn IV.2
Phân đ ạn

Hệ dung môi

Khối lƣợng

IV.2.1

CHCl3-MeOH-nƣớc (85:15:0,1)

3g

IV.2.2

CHCl3-MeOH-nƣớc (80:20:0,2)

4g

IV.2.3

CHCl3-MeOH-nƣớc (75:25:0,2)

4g

IV.2.4

CHCl3-MeOH-nước (75:25:0,3)

1g

Phân đoạn IV.2.1 (3 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột pha thường
nhiều lần rửa giải với hệ dung mơi CHCl3-MeOH-nước (90:10:0,1), sau đó tiếp tục
cho qua sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (5:1) thu được 8 mg SSL04.
Phân đoạn IV.2.2 (4 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột thường nhiều
lần rửa giải với hệ dung môi CHCl3-MeOH-nước (85:15:0,1), sau đó tiếp tục cho qua
sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (4:1) thu được 9 mg SSL05.
Phân đoạn IV.2.3 (4 g) có vết hồng đậm tiếp tục đem đi sắc ký cột thường nhiều
lần rửa giải với hệ dung mơi CHCl3-MeOH-nước (75:25:0,1), sau đó tiếp tục cho qua
sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi nước-MeOH (3:1) thu được 15 mg SSL03.
Sơ đồ 2.4: Quy trình phân lập các chất từ hân đ ạn IV

IV.1.3
5g

IV.2.1

3g

SSL02
13 mg

SSL04
8 mg

IV.2.2
4g

SSL05
9 mg

IV.2.3
4g

SSL03
15 mg

Trang 12

Phân đoạn
IV.7 3 g

Phân đoạn
IV.6 5 g

Phân đoạn
IV.5 6 g

Phân đoạn
IV.4 8 g

Phân đoạn
IV.3 20 g

Phân đoạn
IV.2 15 g

Phân đoạn
IV.1 15 g

Phân đoạn IV
80 g


2.4 Th

dị hoạt tính ức chế -glucosidase

2.4.1 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế -glucosidase[28]
Phương pháp nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase trong điều trị
bệnh đái tháo đường loại II dựa trên nguyên tắc:
- Enzyme -glucosidase khi gặp nối -D-glucose sẽ cắt đứt liên kết để giải phóng
đường D-glucose.
- Sử dụng chất nền có liên kết  với đường D-glucose như p-nitrophenyl--Dglucopyranoside, dưới tác dụng của enzyme -glucosidase sẽ bị thuỷ phân cho ra
đường D-glucose và p-nitrophenol.
- p-nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được nên tiến hành đo độ hấp thu
A ở bước sóng = 405nm. Từ đó xác định lượng D-glucose sinh ra.

- p-nitrophenyl--D-glucopyranoside  -D-glucopyranoside + p-nitrophenol.

Theo phản ứng lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p-nitrophenol. Vì vậy có thể đo độ
hấp thu A của p-nitrophenol khi đọc trên máy đo mật độ quang ở bước sóng 405nm để
xác định lượng glucose sinh ra. So sánh hàm lượng glucose sinh ra giữa mẫu ức chế và
không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ
chất ức chế để xác định chỉ số IC50.
2.4.2 Q trình thử hoạt tính ức chế -glucosidase
Pha các dung dịch mẫu thử ở các nồng độ 0, 10, 25, 50, 100, 250 µg/ml (625 L).
Thêm 0,2 U/mL enzyme -glucosidase (25 L) trong 0,01M đệm photphate (pH =
7), lắc đều ủ ở 37oC trong 5 phút.
Thêm 3 mM dung dịch chất nền p-nitrophenyl--D-glucopyranoside (25 L), lắc
đều ủ ở 37oC trong 30 phút.
Dừng phản ứng bằng cách thêm Na2CO3 0,1M (375 L).
Sau đó, đem đo mật độ quang ở bước sóng  = 405 nm.

Trang 13


CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1 Nhận danh cấu trúc các chất đã hân lập
3.1.1 Biện luận cấu trúc SSL01
Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (phụ lục 1.1) cho mũi ion phân tử
giả với m/z: [M-H]- = 455,3512 ứng với C30H47O3 (so với lý thuyết 455,3525), cho
phép xác định công thức phân tử của SSL01 là C30H48O3.
Phổ 13C NMR (125 MHz, pyridine-d5,  ppm) (phụ lục 1.2) kết hợp với phổ
DEPT90, DEPT135 (phụ lục 1.3) cho thấy SSL01 có 30 carbon: 1 carbon carbonyl
>C=O ở C 180,4 (C28); carbon tứ cấp >C= ở δC 144,3 và carbon methine –CH= ở δC
122,1 đặc trưng cho 2 carbon olefin C13, C12; 1 carbon methine kề oxy –CH–O– ở δC
77,9 (C3); 6 carbon tứ cấp >C< ở δC 46,3 (C17), 41,6 (C14), 39,2 (C8), 38,7 (C4), 36,8

(C10), 30,4 (C20); 3 carbon methine >CH– ở δC 55,3 (C5), 47,571 (C9), 41,4 (C18);
10 carbon methylene –CH2– ở δC 46,0 (C19), 38,4 (C1), 33,6 (C21), 32,7 (C7), 32,6
(C22), 27,7 (C15), 26,9 (C2), 23,1 (C16, C11), 18,1 (C6); và 7 carbon methyl bậc bốn
–CH3 ở δC 32,8 (C29), 28,2 (C23), 25,7 (C27), 23,3 (C30), 16,9 (C26), 16,0 (C24),
15,0 (C25).
Sự hiện diện của: 7 carbon methyl bậc bốn cùng với 2 carbon olefin đặc trưng
cho khung olean kết hợp với nhóm carbonyl và carbon oxymethine, từ đó nhận định sơ
bộ SSL01 là acid oleanolic.
Phổ 1H NMR (500 MHz, pyridine-d5,  ppm) (phụ lục 1.4) cho các tín hiệu:
1 proton olefin ở δH 5,57 (1H, brs, H12); 1 proton oxymethine ở δH 3,53 (1H, dd, J =
6,0 và 10,0, H3); 1 proton methine ở δH 3,33 (1H, dd, J = 4,0 và 14,0, H18); và các
proton methylene vùng δH 1,48 - 2,21; cùng các proton nhóm methyl bậc bốn δH 0,93 1,34.
Phổ HMBC (phụ lục 1.6) cho thấy có các tương tác: Proton olefin ở δH 5,57
(1H, brs, H12) cho tương tác với carbon methine ở δC 47,6 (C9) và carbon bậc bốn ở
δC 41,6 (C14).
Proton methine ở δH 3,33 (1H, dd, J = 4,0 và 14,0, H18) tương tác với carbon tứ
cấp ở δC 122,1 (C12), 46,0 (C19).
Bên cạnh đó proton ở δH 5,57 (1H, brs, H12) cũng có tương tác với carbon
methine ở δC 41,4 (C18), chứng minh nối đơi ở vị trí C12 và C13 thuộc một phần
khung sườn olean.
Trang 14


Proton methyl ở δH 1,05 (3H, s, H29) lại có tương tác với carbon ở ở δC 46,0
(C19), ở δC 30,4 (C20), ở δC 33,6 (C21), ở δC 23,3 (C30) và ngược lại proton ở δH 1,09
(3H, s, H30) cũng có tương tác với carbon methyl ở δC 32,8 (C29).

29

30

H

H

12

1

17

26
9

2

14
8

10

3

20

18

13

11

25

19

16

21
22
28
COOH

15
27

4
HO

24

5

7
6

23

Proton methyl ở δH 1,05 (3H, s, H26) có tương tác với carbon methine ở δC 47,6
(C9) carbon tứ cấp ở δC 39,2 (C8) carbon methylene ở δC 32,7 (C7) và proton methine
1,70 (3H, t, J = 9,H9) cũng có tương tác với carbon methyl ở δC 16,9 (C26).
Proton methyl ở δH 1,34 (3H, s, H27) có tương tác với carbon methine ở δC 41,6

(C14) carbon methylene ở δC 27,7 (C15).
Proron methyl ở δH 0,93 (3H, s, H25) có tương tác với carbon methine ở δC 55,3
(C5) δC 47,6 (C9) carbon tứ cấp ở δC 36,8 (C10) carbon methylene ở δC 38,4 (C1) và
proton methine ở δH 1,70 (3H, t, J = 9, H9) cũng có tương tác với carbon methyl ở δC
15,0 (C25).
Proton oxymethine ở δH 3,53 (1H, dd, J = 6,0 và 10,0, H3) tương tác với 2
carbon methyl ở δC 28,2 (C23), 16,0 (C24) và ngược lại proton của 2 nhóm methyl này
ở δH 1,29 (3H, s, H23), 1,09 (3H, s, H24) tương tác với caron oxymethine ở δC 77,9
(C3) và carbon methine ở δC 55,3 (C5), chứng minh nhóm hydroxy gắn ở vị trí C3.

Trang 15


Proton methylene ở δH 2,21 (1H, m, H16a) tương tác với carbon carbonyl ở C
180,4 (C28) chứng minh nhóm carbonyl gắn vào vị trí C28 của khung olean

29

30

20

19
18

12
25

HO

16

14

Hb

27

5

28
COOH
Ha

15

8

10

3

17

26
9

1

2

22

13

11

21

7

4
H

6
24

23

1

13

Tóm lại từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, H-NMR, C-NMR, kết hợp với phổ
DEPT, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu[29]; chúng tôi khẳng định SSL01 là
acid oleanolic.

Trang 16