Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thực vật thuộc chi agrimonia họ hoa hồng (rosaceae)

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học một số loài thực vật thuộc chi
Agrimonia họ hoa hồng (Rosaceae)
Hồ Đắc Hùng
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS. ngành: Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27
Người hướng dẫn: PGS.TS. Phạm Gia Điền
Năm bảo vệ: 2013
Abstract. Tìm hiểu về thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia); một số kết quả
nghiên cứu hóa thực vật của chi Agrimonia; một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính
sinh học của chi Agrimonia; cơng dụng của một số lồi thực vật chi Agrimonia được
sử dụng trong y học dân tộc Việt Nam; những nghiên cứu ở nước ngoài về hoạt tính
sinh học của thực vật chi Agrimonia. Nghiên cứu chiết tách mẫu với các loại dung
môi khác nhau; khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn dịch chiết; phân lập và tinh
chế các hợp chất; xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
Keywords. Hóa hữu cơ; Thực vật có hoa; Thành phần hóa học; Hoạt tính sinh học

Content
MỞ ĐẦU
Thực vật là kho tàng vơ cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trăm nghìn
các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực
của cuộc sống, đặc biệt là trong y học. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp
các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để tổng
hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học
đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao. Các kết thống kê
gần đây cho thấy các hợp chất được đăng ký làm thuốc trên tồn thế giới thì 61% là các hợp
chất thiên nhiên hoặc các chất có liên quan tới chúng. Trong đó có 6% là các hợp chất thiên
nhiên, 27% là các dẫn xuất của các hợp chất thiên nhiên, 5% là các hợp chất tổng hợp có
mang các nguyên liệu đầu bắt nguồn từ các hợp chất thiên nhiên và 23% là các chất tổng hợp
được thiết kế trên cơ sở cấu trúc phân tử thu được từ các hợp chất thiên nhiên (các chất mô
phỏng các hợp chất thiên nhiên). Trong một số các lĩnh vực trị liệu có đến 78% các hoạt chất

dùng làm thuốc kháng sinh và 74% các hoạt chất dùng làm thuốc chữa ung thư là các hợp
chất thiên nhiên hoặc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [*].
Việt nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa là một vùng có tính đa dạng
sinh học cao. Riêng về thực vật, Việt Nam có khoảng 12000 lồi, trong đó có hơn 2300 lồi
thực vật đã được sử dụng làm lương thực, thuốc chữa bệnh… Khoảng 25% các loại thuốc sử
dụng thông thường xuất phát từ các loài thực vật dùng trong y học dân gian.


Cây Long nha thảo có tên khoa học: Agrimonia pilosa Ledeb. thuộc họ Hoa hồng
(Rosaceae) là loại cây thảo sống lâu năm có nguồn gốc ở vùng Hymalaya, bao gồm cả Trung
quốc và Ấn độ và Việt Nam. Trong y học dân gian cây Long nha thảo đã được sử dụng làm
thuốc cầm máu, chữa thổ huyết, khái huyết (ho ra máu), nục huyết (đổ máu cam), đi lỵ phân
lẫn máu, sốt rét và mụn nhọt lở loét ngoài da [1]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy, Long nha
thảo là vị thuốc có phổ tác dụng tương đối rộng, từ chống viêm nhiễm, tăng cường khả năng
miễn dịch của cơ thể, có tác dụng ức chế khối u đến khả năng kháng HIV… do vậy đang
được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, ở Việt Nam mới chỉ được
sử dụng theo kinh nghiệm dân gian và còn chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học. Ngồi ra, Long nha thảo cũng là một trong mười thành phần của vị thuốc
do nhóm lương y thuộc phịng nghiên cứu các cây thuốc, bài thuốc dân tộc thuộc Trung Tâm
Công nghệ Hóa dược và hóa sinh hữu cơ - Viện KH & CNVN sử dụng từ năm 2004 đã điều
trị thành công một số bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS. Trên cơ sở bài thuốc nam đó
chúng tơi chọn cây Long nha thảo làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục đích tìm
hiểu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây với những nội dung chính là:
1. Nghiên cứu phân lập các hợp chất có trong cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa
Ledeb.) họ hoa hồng (Rosaceae), thu hái ở Sapa-Lào Cai.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được.
3. Khảo sát hoạt tính sinh học của các phân đoạn dịch chiết trong cây và các chất phân
lập được.
[*]. David J. Newman, Gordon M. Cragg, and Kenneth M. Snader. (2003), “Natural
products as sources of new drugs over the periode 1981-2002”. J. Nat. prod.. 66,

pp1022-1037.
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về thực vật chi Long nha thảo (Agrimonia)
Chi Long nha thảo (danh pháp khoa học: Agrimonia) là một chi chứa khoảng 12-15
loài. Chi Long nha thảo thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae) có nguồn gốc ở vùng Hymalaya, bao
gồm cả Trung Quốc, Ấn Độ ngồi ra cịn có ở khu vực ơn đới Bắc bán cầu, châu Âu và ở
châu Phi. Theo thống kê các loài thuộc chi Agrimonia phân bố trên thế giới:
- Agrimonia eupatoria (1 loài phân bố Châu Âu, Châu Á, Châu Phi)
- A. coreana, A. nipponica (1 loài phân ở bố Đơng Á)
- Agrimonia pilosa (1 lồi phân bố ở Đơng Âu, Châu Á)
- Agrimonia procera (1 lồi phân bố ở Châu Âu)
- Agrimonia repens (1 loài phân bố ở Nam Á)
- A. rostellata, A. striata, A. gryposepala, A. incisa, A. microcarpa, A. parviflora, A.
pubescens (7 loài phân bố ở Bắc Mỹ).
Ở Việt Nam cây có nhiều ở Lào Cai, Lai Châu, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hịa
Bình, Tam Đảo chủ yếu là lồi A. pilosa [1].
1.2. Một số kết quả nghiên cứu hóa thực vật của chi Agrimonia
Thành phần hóa học của chi Agrimonia đã được nghiên cứu trên thế giới tuy nhiên ở
Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về chi này. Lồi A. pilosa Ledeb mới được sử dụng trong
các bài thuốc dân gian, chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.
Đã có một số cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc trên một số
loài thực vật thuộc chi Agrimonia. Các nghiên cứu về thành phần hóa học từ lồi cây
Agrimonia pilosa đã chỉ ra sự có mặt của các hợp chất flavonoid, tritecpen, saponin và tanin
[2,3,4]. cũng đã có một số nghiên cứu cơng bố các hoạt tính sinh học từ các phần dịch chiết


từ lá và thân loài cây này; đáng chú ý là các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy
hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư và hoạt tính kháng HIV [5,6 ,7].
Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Agrimonia là các tecpenoit,
flavonoit và một số các hợp chất khác.

1.2.1. Các hợp chất flavonoit
Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thực vật thuộc chi
Agrimonia trên thế giới:
Khi nghiên cứu thành phần hóa học lồi A. pilosa Ledeb, các nhà nghiên cứu của
Trung Quốc và Nhật Bản đã phân lập và xác định cấu trúc được các hợp chất như:
Aromadendrin (1), aromadendrin 3-O-β-d-glucopyranosit (2), astragalin (3), afzelin (4),
tilirosit (5), luteolin (6), quercetin (7) , isoquercetrin (8), quercitrin (9), takanechromone C
(10), 5,7-dihydroxy-2-propylchromone 7-O-β-d-glucopyranosit (11), 5,7-dihydroxy-2propylchromone (12), demethylagrimonolit 6-O-β-d-glucopyranosit (13), agrimonolit 6-Oglucosit (14), demethylagrimonolit (15), methylagrimonolit (16), agrimonolit (17) [8, 9].
5'
6'
8

O

R2

8

3'

2

7

5'
6'

1'

4

O

OR1

5
OH

4. R1
5. R1
6. R1
7. R1
8. R1
9. R1

1. R1=H
2. R1=Glc
3. R2=OGlc.

3'
R2

3

6

6
5
OH

2

7

2'

3

O

HO

4' OH

1'

4' OH

4

2'

R1

O

=O-Rha R2=H
=O-6- cumaroyl-Glc R2=H
=H R2=OH
=R2 =OH
=O-Glc R2=OH

=O-Rha R2=OH

4' OR2
8

O

R 2O
7
6

2 R1

1''
R1O 6

3

3
5
OH

1'
2''

O

4

1

8
OH

O

10. R1 =propyl R2=Glc
11. R1 =isopropyl R2=Glc
12. R1 =propyl R2=H

O
13. R1
14. R1
15. R1
16. R1
17. R1

=Glc R2=H
=Glc R2=CH3
= R2=H
= R2=CH3
=H R2=CH3

Glc:-D-glucopyranosyl
Rha: -L-rhamnopyranosyl

1.2.2. Các hợp chất tecpenoit
Các nhà Khoa học Hàn Quốc và Trung Quốc đã phân lập và xác định cấu trúc được
các tritecpenoit như usrolic axít (25), polmolic axít (26), tormentic axít (27), corosolic axít
(28) từ lồi Agrimonia pilosa Ledeb. Các hợp chất trên có các hoạt tính sinh học như hoạt

tính kháng viêm, trừ giun sán và chống chảy máu [2, 3].


30

29

R2
20
19

12
18
25

26

COOH

1

R1

28

3

27

HO

24

23

25. R1 = R2= H
26. R1 = H R2=OH
27. R1 = R2= OH
28. R1 = H R2=OH

1.2.3. Các hợp chất khác
Các lồi thực vật thuộc chi Agrimonia có chứa các chất hypericin, agrimophol,
agrimol A-G, caffeic axit, gallic axit, dầu bay hơi, tannin, axit hữu cơ, vitamin C, K.. .. [1].
O

OH
O

H3C
HO

CH3

HO

OH

CH3

HO

CH3

MeO

CH2

H3C
O

OH

O

O
H3C

OH

CH3

30. Agrimophol

29. Hypericin
OH

OH

OH

R1OC

COR3

OH
HO

HO
OH

MeO
CH3

COR

2

OMe
CH3

Agrimol A: R1=R3=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3
B: R1=R3=CH2CH2CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3
C: R1=R2 =R3=CH2CH2CH3
D: R1=CH(CH3)2, R2=CH(CH3)CH2CH3, R3=CH3
E: R1=R3=CH3, R2=CH(CH3)CH2CH3
F: R1=CH3, R2 =R3=CH2CH2CH3
G: R1=R2 =R3=CH(CH3)2

2. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Agrimonia.
2.1. Cơng dụng của một số lồi thực vật chi Agrimonia đƣợc sử dụng trong y học dân tộc
Việt Nam:

Long nha thảo A. pilosa Ledeb, cây có tác dụng thu liễm chỉ huyết, cầm lỵ, sát trùng.
Điều trị các chứng xuất huyết như khái huyết, thổ huyết, nục huyết, niệu huyết, tiện huyết,
băng lậu, phúc tả, kiết lỵ, sốt rét, viêm âm đạo do trùng roi [1]. Long nha thảo thường được
sử dụng chữa các bệnh như ban xuất huyết do giảm tiểu cầu, ban xuất huyết do dị ứng, bệnh
ưa chảy máu (hemophilia), xuất huyết đường tiêu hóa, xuất huyết đường tiết niệu, xuất huyết
tử cung...
Đặt biệt, kết quả nghiên cứu dược lý gần đây phát hiện Long nha thảo có tác dụng
tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể, các chất quercetin, ursolic acid,... trong Long nha
thảo có tác dụng ức chế khả năng tái sinh của virut HIV [19]. Hiện tại Long nha thảo bắt đầu


được sử dụng trên lâm sàng cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Đã có một số nghiên cứu trong
nước từ nguồn tổng hợp hoặc nguồn gốc tự nhiên để làm thuốc điều trị bệnh nhân nhiễm
HIV/AIDS. Theo đó, cây Long nha thảo đã được sử dụng là một trong 10 vị thuốc mà nhóm
lương y thuộc phịng nghiên cứu các cây thuốc, bài thuốc dân tộc thuộc Trung tâm Cơng nghệ
Hóa dược và hóa sinh hữu cơ - Viện KH & CNVN từ năm 2004 đã điều trị thành công một
bệnh nhân nhiễm HIV chuyển sang AIDS (theo xét nghiệm của bệnh viện Quân y 103 với
biểu hiện người bị lở loét, nhiễm trùng phổi nặng, suy kiệt thể chất. Sau 9 tháng điều trị bằng
thuốc nam, bệnh nhân đã khỏi bệnh, tăng cân, thân thể lành lặn như người bình thường. Trên
cơ sở bài thuốc nam đó, đến năm 2011 những lương y của Trung Tâm đã hoàn thiện bài thuốc
và tiến hành chữa khỏi cho nhiều bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những bệnh nhân này đã
khỏi bệnh, đi làm việc bình thường và khơng phải dùng thuốc nữa.
2.2. Những nghiên cứu ở nƣớc ngồi về hoạt tính sinh học của thực vật chi Agrimonia :
Đã có một số cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học Hàn quốc, Trung quốc trên
một số loài thực vật thuộc chi Agrimonia. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ các phần
dịch chiết từ lá và thân loài cây này đã chỉ ra các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống
oxy hóa, hoạt tính ức chế acetylcholinesterase, chống ung thư và hoạt tính kháng HIV
[2,5,7,19]. Các nghiên cứu hiện đại cho thấy, Long nha thảo là vị thuốc có phổ tác dụng
tương đối rộng. Chất agrimol trong Long nha thảo có tác dụng trừ sán; tannins trong Long
nha thảo có tác dụng chống virut gây bệnh mụn rộp. Cao thuốc chế từ Long nha thảo có tác

dụng làm co mạch ngoại biên, tăng tốc độ đơng máu, có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ
cầu khuẩn vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn coli, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn thương hàn
và trực khuẩn lao. Kết quả nghiên cứu ở Trung Quốc cho thấy Long nha thảo có tác dụng ức
chế mạnh đối với tế bào ung thư mô liên kết S180, ung thư ruột, ung thư gan và một số loại
ung thư khác. Đặt biệt, kết quả nghiên cứu dược lý thập niên gần đây còn phát hiện thêm
Long nha thảo có tác dụng tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể; các chất quercetin,
ursolic axít,... trong Long nha thảo có tác dụng ức chế khả năng tái sinh của virut HIV. Hiện
tại Long nha thảo bắt đầu được sử dụng trên lâm sàng cho các bệnh nhân HIV/AIDS.
CHƢƠNG 2. ĐỒI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, nhiệm vụ nghiên cứu:
Đối tượng là cây thuốc dân gian Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.), được
chúng tôi thu hái cả cây để nghiên cứu. Ở Việt Nam cây có nhiều ở Lào cai, Lai châu, Hà
giang, Cao bằng, Lạng sơn, Hịa bình, Tam đảo[1].
Các nhiệm vụ của luận văn là:
- Chiết tách mẫu với các loại dung môi khác nhau.
- Khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn dịch chiết.
- Phân lập và tinh chế các hợp chất.
- Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất:
Các phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất bao gồm các phương pháp sắc ký
như:
- Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn 60 F254 (Merck).
Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng λ 254 nm và 365 nm; dùng thuốc hiện là
dung dịch H2SO4 10% hoặc dung dịch xeri sunfat.
- Sắc kí cột thường (CC), chất hấp phụ là silica gel Merck cỡ hạt 40-63µm.
- Sắc kí cột nhanh (FC), chất hấp phụ là silicagel Merck cỡ hạt 15-40µm.


- Sắc ký cột gel (sephadex LH-20 ) hoặc nhựa trao đổi ion Diaion HP-20; Sắc ký

ngược pha RP-18 và sắc ký bản mỏng điều chế hoặc kết tinh.
2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất:
Cấu trúc hóa học của các chất sạch được xác định bằng sự kết hợp giữa các phương
pháp vật lý và các phương pháp phổ hiện đại như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EIMS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai
chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H COSY…).
2.2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học:
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử trên 7 chủng vi khuẩn và nấm theo
phương pháp pha loãng nồng độ của Hadacek F. Greger H. Hoạt tính gây độc tế bào được thử
theo phương pháp của Scudiero D. A. và cộng sự trên 2 dòng tế bào ung thư biểu mô (KB),
ung thư vú (MCF7) và đối chiếu với các chất chuẩn. Hoạt tính kháng oxi hóa được thử theo
phương pháp DPPH của Shela G. và cộng sự.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm thực vật của cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.)
Cây Long nha thảo là loại cây thảo sống lâu năm cao khoảng 60-120cm, toàn thân
rậm lông nhung dài màu trắng. Lá do 5-9 lá chét to và lá phụ nhỏ, hình bầu dục hay trái xoan
ngược, mép có răng có lơng nhung như len ở cả hai mặt, có tuyến, lá bắc xoan to, có răng.
Chùm hoa thưa cao 10-30cm, cuống hoa ngắn, đài có thuỳ nhọn; cánh hoa màu vàng, nhị 515, nhụy hai lá nỗn rời. Ðài ở quả có gai móc đứng, rãnh 10, quả bế 2, ra hoa tháng 4-7, quả
tháng 8-10.
Hình 1. Cây Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.)

3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất
3.2.1. Thu hái và xử lý mẫu thực vật:
Chúng tôi chọn thời điểm cây phát triển nhất khi chúng có cả hoa và quả để thu hái.
Mẫu thực vật được chúng tôi thu hái vào tháng 8 tại Sapa - Lào cai - Việt nam. Tên cây được
nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật) thẩm định, tiêu bản
được lưu giữ tại phịng Cơng nghệ các chất có hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viên Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
3.2.2. Sơ đồ phân lập và chiết tách mẫu thực vật

Sơ đồ1: Chiết tách mẫu thực vật
Mẫu thực
vật

Sấy khô
Xay nhỏ
Bột mẫu thực vật
(1,1kg)

1. Chiết siêu âm với EtOH (%)
2. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm
Cặn dịch chiết
(A7)

Chiết phân đoạn lần
lượt với các dung môi

Dm CH2Cl2

Dc CH2Cl2

Dm EtOAc

Dc EtOAc

Dm Butanol

Dc
Butanol

Các dịch
chiết được
cất loại dung
môi dưới áp
suất giảm
Cặn dc CH2Cl2

Cặn dc EtOAc

Cặn dc Butanol

A8 (21 g)

A9 (16 g)

A10 (50 mg)


Sơ đồ 2: Phân lập các hợp chất trong cặn dịch chiết CH2Cl2
Cặn dc CH2Cl2
(21 g)

- SKC chân không VLC
- Hệ dung môi:
aceton/n-hexane (0%-100%)
và MeOH/CH2Cl2 (0%-10%)
F1

F2

F3

F4

F5

Kết tinh lại với hệ
dung môi

F6

F7

SKC nhanh (FC), hệ
dung môi: CH2Cl2MeOH (1:99-9:1)

n-hexane/acetone
Hợp chất 1

Hợp chất 2

(12 mg)

(15 mg)

Sơ đồ 3: Phân lập các hợp chất trong cặn dịch chiết EtOAc
Dc EtOAc
(16 g)

- SKC chân không VLC

- Hệ dung môi aceton/n-hexane
(0%-100%) và MeOH/CH2Cl2
(0%-40%)
Pđ 1

Pđ 2

Pđ 3

Pđ 4

Pđ 5

SKC gel (sephadex LH20),
hệ dung môi: MeOH/CH2Cl2
Hợp chất AP5
(15 mg)

Pđ 6

Pđ 7

Pđ 8

SK bản mỏng điều chế
pha đảo RP-18, hệ
dung môi MeOH/ H2O
(6/4)

Hợp chất AP7

(7 mg)


Sơ đồ 3 (tiếp theo): Phân lập các hợp chất từ phân đoạn 3 của cặn dịch chiết EtOAc
Pđ 3

SKC gel sephadex LH-20,
dung môi MeOH

Pđ 3.1

Pđ 3.2

Pđ 3.3

Pđ 3.4
Tinh chế lại
bằng dung môi
MeOH

Kết tinh lại, hệ
dung môi nHexan/Axeton
Hợp chất AP

Hợp chất AP2

(20 mg)

(7 mg)

Sơ đồ 3 (tiếp theo): Phân lập các hợp chất từ phân đoạn 4 của cặn dịch chiết EtOAc
Pđ 4

SKC silica gel, hệ dung môi
CH2Cl2-MeOH(1:99-8:2)

Pđ 4.1

Pđ 4.2

Tinh chế với hệ
dung môi
CH2Cl2/MeOH

Pđ 4.3

Pđ 4.4

Pđ 4.5

SK cột gel
(sephadex LH-20),
dung môi rửa
MeOH

Hợp chất AP3

Hợp chất AP4

(8 mg)

(16 mg)

3.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất:
*) Chất 1 (ß-sitosterol): phân lập được từ phân đoạn F3 của cặn dịch chiết CH2Cl2, điểm
nóng chảy: 140-142°C, Rf = 0,81 hệ dung mơi CH2Cl2/MeOH (98:2). Phân tích dữ liệu phổ


hồng ngoại IR, MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR có so sánh với tài liệu cho phép
kết luận chất 1 là ß- sitosterol [9] [27].
29
28
21

22

25

24
18

20

26

23

12
17

27

11
13

19

16

1

9

2

14

10

8

15

7

RO

5

3

6

4

1. ß- sitosterol
R=H
2. ß- sitosterol-3-O-ß-D- glucopyranosit R=Glucose
1

H-NMR (CDCl3, 500MHz); δ (ppm): 5,35 (1H, t, H-6); 3,53 (1H, sept, H-3); 2,27
and 1,98 (CH2); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,92 (3H, d, J = 6,4Hz, CH3-21); 0,85 (3H, t, J =
7,6Hz, CH3-29); 0,84 (3H, d, J = 7,0Hz, CH3-26 or 27); 0,82 (3H, d, J = 7,0Hz, CH3-26 or
27); 0,68 (3H, s, CH3-18).
*) Chất 2 (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit) phân lập được từ phân đoạn F5 của
cặn dịch chiết CH2Cl2 bằng sắc ký cột nhanh (FC) chất hấp phụ silica gel với hệ dung môi
CH2Cl2-MeOH (1:99-9:1). Chất thu được ở dạng vơ định hình mầu trắng, điểm nóng chảy:
285-286°C, ESI-MS m/z 575 [M-H]- và sự phù hợp với tài liệu đã công bố [9, 28] cho phép
nhận dạng chất 2 là β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit hay daucosterol.
1
H-NMR (500MHz, DMSO-d6, TMS), δ (ppm): 0,77 (3H, s, CH3-18), 0,81 (3H, d, J =
7,0 Hz, CH3-27); 0,82 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-26); 0,83 (3H, t, J = 7,0 Hz, CH3-29); 0,90
(3H, d, J = 6,0 Hz, CH3-21); 0,96 (3H, s, CH3-19); 3,46 (1H, m, H-3); 5,33 (1H, d, J = 5,0
Hz, H-6); 2,90 (1H, m, H-2′); 3,02 (1H, m, H-4′); 3,07 (1H, m, H-5′); 3,12 (1H, m, H-3′);
3,41 (1H, m, H-6′a); 3,65 (1H, m, H-6′b); 4,22 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1′).
13
C-NMR (125MHz, DMSO-d6, TMS); δ, ppm: 11,7 (CH3-18), 19,0 (CH3-27); 19,7
(CH3-26), 11,73 (CH3-29); 18,6 (CH3-21); 18,90 (CH3-19); 20,6 (C-11); 22,6 (C-28); 23,2
(C-15); 25,4 (C-23); 27,7 (C-16); 28,7 (C-25); 29,2 (C-2); 31,3 (C-7); 31,4 (C-8); 33,3 (C22); 35,4 (C-20); 36,2 (C-10); 36,8 (C-1); 38,3 (C-4); 39,2 (C-12); 41,8 (C-13); 45,1 (C-24);
49,6 (C-9); 55,4 (C-17); 56,1 (C-14); 76,9 (C-3); 121,1 (C-6); 140,4 (C-5); 60,1 (C-6′); 70,1

(C-4′); 73,3 (C-2′); 76,4 (C-3′); 76,7 (C-5′); 100,7 (C-1′).
*) Hợp chất AP (3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone):

5'

8

H3CO

4'

6'

OCH3
O

OCH3

3'
2

1'

7

2'

OCH3

3

H3CO

6
5

4

OCH3 O

OCH3

AP. 3,5,6,7,8,3',4',-heptamethoxy flavon


Hợp chất AP thu được là dạng tinh thể hình kim, màu vàng, điểm nóng chảy 129-130oC,
ESI-MS m/z 432 [M]+ (công thức phân tử: C22H24O9,). Từ dữ liệu thu được, so sánh với tài
liệu [29, 31, 32] xác định được hợp chất AP là 3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone.
1
H-NMR (CDCl3); δ (ppm): 7,84 (dd, J=8, 2Hz, H-6′); 7,82 (d, J=2Hz, H-2′); 7,02 (d,
J= 8Hz, H-5′); 3,99 (3H, s, 3’-OCH3); 3,98 (3H, s, 4’-OC3); 4,01 (3H, s, 8-OCH3); 4,10 (3H,
s, 7-OCH3); 3,96 (3H, s, 6-OCH3); 4,0 (3H, s, 5-OCH3) ; 3,90 (3H, s, 3-OCH3).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3); δ (ppm): 153,0 (C-2); 140,7 (C-3); 175,38 (C-4);
148,2 (C-5); 143,8 (C-6); 151,3 (C-7); 137,85 (C-8); 146,72 (C-9); 115,1 (C-10); 123,50 (C1′); 111,1 (C-2′); 149,95 (C-3′); 153,05 (C-4′); 111,0 (C-5′); 121,9 (C-6′); 62,0 (OCH3-8):
61,7 (OCH3-7); 61,8 (OCH3-6); 62,3 (OCH3-5); 59,9 (OCH3-3); 55,7 (OCH3-4’); 55,7
(OCH3-3’).
*) Hợp chất AP2 (5, 7, 3’- trihydroxy- 6, 4’,5’- trimetoxy flavon)
8

HO

O

2

7
3

H3CO

2'

6

OH

3'

5

4

OH

O

1'
4'
6'

OCH3

5'

OCH3

AP2. 5,7, 3'-trihydroxy-6,,4',5' trimetoxyflavon
Hợp chất AP2 thu được là chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 289-291oC, EI-MS m/z 359
[M-H]- (công thức phân tử C18H16O8). Trên cơ sở dữ liệu thu được, so sánh với tài liệu [34,
35, 36] xác định hợp chất AP2 là 5,7,3’- trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon.
1
H-NMR (MeOD3); δ (ppm): 8,1 (s, H-2); 6,4 (s, H-8); 6,72 (d, J=2Hz, H-2’); 6,70 (d,
J=2Hz, H-6); 3,89 (s, 5’-OCH3); 3,88 (s, 6-OCH3); 3,83 (s, 4’-OCH3).
13
C-NMR (MeOD3); δ 155,5 (C-2), 128,0 (C-3); 182,3 (C-4); 154,9 (C-5); 132,9 (C-6);
158,8 (C-7); 95,0 (C-8); 154,4 (C-9); 106,6 (C-10); 124,1 (C-1’); 106,1 (C-2’), 151,5 (C-3’);
137,9 (C-4’); 154,6 (C-5’); 111,1 (C-6’); 61,0 (OCH3-4’); 59,6 (OCH3-5’); 60,9 (OCH3-6).
*) Hợp chất AP3 (ursolic axit)
30

29
20
19
12

21
22

18

13

25

11

17

26

1

COOH

14
16

9
10

2

8

3

7
4

HO

28

15
27

5
6

24

23

3. Ursolic acid

Chất AP3 được phân lập từ phân đoạn F4.2 của phần dịch chiết EtOAc, ở dạng chất
bột màu trắng, điểm nóng chảy 284-286oC. ESI-MS m/z 456 [M]+ (công thức phân tử


C30H48O3). Kết hợp phân tích các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu cho phép kết luận hợp
chất AP3 là ursolic axít [37, 38].
1
H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 5,12 (1H, t, 3,5 Hz, H-12); 3,07 (1H, dd, 11,5, 4,5 Hz,
H-3); 2,07 (1H, d, 11,5 Hz, H-18); 1,87 (3H, s, H-27); 0,96 (3H, s, H-23); 0,86 (3H, d, 6,5
Hz, H-30); 0,82 (3H, s, H-25); 0,74 (3H, d, 6,25 Hz, H-29); 0,69 (3H, s, H-26); 0,65 (3H, s,
H-24).
13
C-NMR (CD3OD) δ (ppm): 38,5 (C-1); 26,6 (C-2); 78,6 (C-3); 38,7 (C-4); 55,1 (C5); 18,1 (C-6); 32,8 (C-7); 39,3 (C-8); 47,6 (C-9); 36,7 (C-10); 23,3 (C-11); 125,3 (C-12);
138,0 (C-13); 41,9 (C-14); 27,8 (C-15); 24,0 (C-16); 47,6 (C-17); 52,6 (C-18); 39,0 (C-19);
39,0 (C-20); 30,5 (C-21); 36,7 (C-22); 27,8 (C-23); 15,1 (C-24); 15,3 (C-25); 16,6 (C-26);

23,1 (C-27); 180,4 (C-28); 16,7 (C-29); 20,8 (C-30).
*) Hợp chất AP4 (quercetin):
5'
4'

6'
8

3'

O

HO

OH

2

1'

7

OH

2'
3

6

OH

5

4

OH

O

4. Quercetin

Chất AP4 được phân lập từ phân đoạn F4.3 của phần dịch chiết EtOAc là tinh thể
hình kim mầu vàng nhạt. Điểm nóng chảy 314-316oC. ESI-MS m/z 301 [M-H]- (cơng thức
phân tử C15H10O7). Kết hợp phân tích các dữ kiện phổ và so sánh với tài liệu [39, 40] cho
phép kết luận chất AP4 là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-on hay
còn gọi là quercetin.
Phổ 1H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 7,65 (dd, J = 8, 2Hz, H-6′); 7,75 (d, J = 2Hz, H-2′);
6,90 (d, J = 8Hz, H-5′); 6,40 (d, J = 2Hz, H-8); 6,20 (d, J = 2Hz, H-6).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ (ppm): 148,0 (C-2); 137,2 (C-3); 177,3 (C-4); 162,4
(C-5); 99,2 (C-6); 165,5 (C-7); 94,4 (C-8); 158,2 (C-9); 104,5 (C-10); 124,1 (C-1′); 116,0 (C2′); 146,2 (C-3′); 148,7 (C-4′); 116,2 (C-5′); 121,7 (C-6′).
*) Hợp chất AP5 (catechin)
5'
4'

6'
8

HO

O

OH

3'
2

1'

7

2'

OH

3

6
4

5

OH

OH

5. Catechin

Chất AP5 được phân lập từ phân đoạn F5 của phần dịch chiết EtOAc, dạng chất rắn màu nâu
nhạt, điểm nóng chảy 178oC. Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion tại m/z 289 [M-H]- tương

ứng công thức phân tử C15H14O6. Từ phân tích dữ liệu thu được, so sánh với tài liệu [41,42]


xác định hợp chất AP5 là flavanol có tên gọi là 2R, 3S-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro2H-chromene-3,5,7-triol hoặc catechin.
1
H-NMR (CDCl3); δ (ppm): 6,64 (dd, J = 8,0Hz, 2Hz, H-6′); 6,74 (d, J = 2Hz , H-2′);
6,67 (d, J = 8,0Hz, H-5′); 5,84 (d, J = 1,5Hz, H-8); 5,81 (d, J =1,5Hz, H-6); 2,8 (dd, J =
16Hz, 6Hz, H-4); 2,4 (dd, J = 16Hz, 6Hz, H-4); 3,9 (ddd, J = 8, 8, 5,5Hz, H-3); 4,4 (d, J =
8Hz, H-2).
13
C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ, ppm: 81,2 (C-2); 67,4 (C-3); 27,1 (C-4); 155,6 (C-5); 95,3
(C-6); 155,2 (C-7); 94,5 (C-8); 155,8 (C-9); 99,7 (C-10); 130,2 (C-1′); 114,0 (C-2′); 144,4
(C-3′); 144,6 (C-4′); 115,0 (C-5′); 119,0 (C-6′).
*) Hợp chất AP7 (quercitrin)
5'
4'

6'
8

HO

O

OH

3'
2

1'

7

2'

OH

3

6
5

4

OH

OR

O

AP7. Quercitrin, R=Rham.
(Quercetin 3-O--L-rhamnopyranosit)
Hợp chất AP7 là chất rắn màu vàng, phân lập được từ phân đoạn 6 của cặn dịch chiết
EtOAc. điểm nóng chảy 314-316oC. Kết quả phân tích số liệu phổ 1H-và 13C-NMR có so
sánh với tài liệu [46, 47, 48] đã xác định được cấu trúc của hợp chất AP7 là quercitrin
(quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosit).
1
H-NMR (CD3OD); δ (ppm): 7,31 (1H, dd, 8Hz, 2Hz, H-6′); 7,34 (1H, d, 2Hz, H-2′);
6,90 (1H, d, 8Hz, H-5′); 6,37 (1H, d, 2Hz, H-8); 6,20 (1H, d, 2Hz, H-6); 5,3 (1H, d, 1Hz, H1-rha), 0,9 (1H, d, 1Hz, H-6-rha).
13

C-NMR (125 MHz, CD3OD); δ (ppm): 158,5 (C-2); 136,20 (C-3); 179,6 (C-4);
163,1 (C-5); 99,8 (C-6); 165,8 (C-7); 91,7 (C-8); 159,3 (C-9); 105,9 (C-10); 122,8 (C-1′);
116,3 (C-2′); 146,3 (C-3′); 149,7 (C-4′); 116,9 (C-5′); 123,0 (C-6′); 103,5 (C-1-rha); 72,0 (C2-rha); 72,1 (C-3-rha); 73,2 (C-4-rha); 71,9 (C-5-rha); 17,6 (C-6-rha).
3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn dịch chiết từ cây Long nha thảo:
Thử hoạt tính sinh học được tiến tại phịng Thử hoạt tính sinh học -Viện Hóa học Viện khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Các cặn dịch chiết diclometan (A8), EtOAc (A9), BuOH (A10) và cặn tổng (cặn
EtOH-A7) được tiến hành thử hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính
độc tế bào, và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định theo các phương pháp đã nêu ở mục
2.2.4.
3.4.1. Hoạt tính chống oxi hóa (antioxidant activity)
Sự sản sinh q mức các gốc tự do trong cơ thể là nguyên nhân tổn hại tế bào, sai lệch
nhiễm sắc thể, đột biến AND… dẫn đến các bệnh tim mạch, suy nhược thần kinh, lão hóa,
ung thư và hàng loạt các bệnh khác. Tác dụng chống oxy hóa của một sản phẩm sinh học có ý
nghĩa bao trùm lên việc chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau. Phép thử xác định hoạt tính
chống oxy hóa nhằm tìm kiếm các chất có khả năng bắt hoặc trung hòa các gốc tự do, làm
giảm sự sản sinh gốc tự do hoặc gia tăng tốc độ phản ứng phân hủy peroxit… có tác dụng
phịng chống và ngăn ngừa bệnh tật cho cơ thể.


Bảng 3: Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của các cặn dịch chiết
Stt
1
2
3
4

Tên mẫu
A7 (Cặn EtOH)
A8 (Cặn CH2Cl2)
A9 (cặn EtOAc)

A10 (cặn BuOH)
Resveratrol

EC50 (μg/ml)
82,34
>128
36,17
37,34
8,5

Kết quả thử nghiệm cho thấy:
Chất đối chứng là resveratrol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa ở liều EC50 (μg/ml) = 8,5.
Các cặn EtOH (A7), EtOAc (A9) và cặn BuOH (A10) có hoạt tính chống oxy hóa ở liều EC50
(μg/ml) lần lượt là : 82,34; 36,17 và 37,34. Cặn dịch chiết diclometan (A8) khơng có hoạt
tính chống oxi hóa.
3.4.2. Hoạt tính độc tế bào (Cytotoxic activity)
Các tế bào ung thư là những tế bào kém biệt hóa do sự phân chia quá nhanh chóng và
diễn ra liên tục. Chúng có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch của cơ thể và
tăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận. Những chất có khả năng phịng chống và
điều trị ung thư là những chất có khả năng ngăn ngừa sự hoạt động và bắt giữ các tác nhân
gây ung thư, ức chế q trình tiến triển bệnh thơng qua sự ức chế hoạt động một số enzyme
hay tác động gây biệt hóa tế bào. Phép thử sinh học để sàng lọc và tìm kiếm các hoạt chất
chữa trị bệnh ung thư sử dụng chính tế bào ung thư làm đối tượng nghiên cứu.
Trong nghiên cứu này, dịch chiết tổng và các dịch chiết phân đoạn của cây Long nha
thảo được khảo sát hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư thông qua phép thử gây độc
tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư KB (ung thư biểu mô) và MCF2 (ung thư vú). Kết quả cho
thấy:
- Chất dối chứng dương Elipticin thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả 2 dòng tế bào ung thư
với giá trị IC50 là 0,29 và 0,51 μg/ml.
- Cặn dịch chiết tổng (A7) và các cặn dịch chiết thành phần (A8, A9) đều có khả năng gây

độc tế bào ung thư biểu mô (KB) với giá trị IC50 lần lượt là 41,05; 10,5 và 38,69 μg/ml tương
ứng; khả năng gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) với giá trị IC50 lần lượt là 116,21; 31,07 và
90,53 μg/ml tương ứng. Cặn dịch chiết BuOH (A10) có khả năng gây độc tế bào ung thư biểu
mô (KB) với giá trị IC50 là 20,98 μg/ml nhưng khơng có hoạt tính gây độc trên dòng tế bào
ung thư vú (MCF-7). (Xem kết quả thử hoạt tính ở bảng 4).

Stt
1
2
3
4

Tên mẫu
A7 (Cặn EtOH)
A8 (Cặn CH2Cl2)
A9 (cặn EtOAc)
A10 (cặn BuOH)
Elipticin

Bảng 4: Kết quả thử hoạt tính độc tế bào
IC50 (μg/ml)
KB
MCF-7
41,05
10,5
38,69
20,98
0,29

116,21

31,07
90,53
>128
0,51

3.4.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity)
Nhiễm trùng (infection) là biểu thị sự xâm nhập và nhân lên các vi sinh vật trong các mô
cơ thể, gây rối loạn các cơ chế điều hịa, mất đi sự cân bằng nội mơi. Nhiễm trùng cấp tính có
thể chỉ tồn tại trong thời gian ngắn, nhưng trong một số trường hợp bệnh cấp tính chuyển
thành bệnh mãn tính với các triệu chứng kéo dài có thể là nguyên nhân dẫn đến ung thư.


Hàng ngày, hàng giờ sinh vật thay đổi cấu trúc tế bào khi tiếp xúc với các chất kháng sinh
dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc. Do vậy việc phát hiện những hoạt chất có khả năng đặc hiệu
một loại vi sinh vật nào đó có ý nghĩa rất quan trọng. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm
định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn của các mẫu thử thông qua giá trị IC50
(nồng dộ ức chế 50% sự phát triển vi sinh vật).
Kết quả cho thấy cặn chiết tổng (A7) chỉ có hoạt tính kháng 2 chủng vi sinh vật kiểm
định gram (+) là chủng S. aureus và B. subtilis với giá trị IC50 là 87,49 và 90,11 μg/ml, không
kháng các chủng vi khuẩn gram (-) và nấm. Cặn dịch chiết diclometan (A8) có hoạt tính khá
tốt, kháng cả 3 chủng vi khuẩn gram (+) là chủng S. aureus, B. subtilis và L. fermentum với
giá trị IC50 là 5,05; 2,35 và 6,55 μg/ml nhưng không kháng các chủng vi khuẩn gram (-) và
nấm. Cặn dịch chiết A9 và A10 thì khơng có hoạt tính kháng khuẩn hoặc kháng nấm. (xem
bảng 5)

St
t

Tên
mẫu

Bảng 5: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật và nấm kiểm định – IC50
((μg/ml))
Gram (+)
Gram (-)
Stapyloco
ccus
aureus

Bacillu
s
subtilis

Lactobacill
us
fermantum

Salmonel
la
enterica

Escherich Pseudomon
ia
as
enterica
aeruginosa

1

A7

87,49

90,11

> 128

> 128

> 128

> 128

Candi
da
albica
n
> 128

2
3
4

A8
A9
A10

5,05
> 128

> 128

2,35
> 128
> 128

6,55
89,04
> 128

> 128
> 128
> 128

> 128
> 128
> 128

> 128
> 128
> 128

> 128
> 128
> 128

CHƢƠNG 4. THỰC NGHIỆM
4.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu:
- Điểm nóng chảy đo trên máy Mikroskopheiztisch PHMK-50, Germany.
- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy IMPACT-410FT-IR spectrometer (CARL ZEISS

JENA).
- Phæ khèi ion hoá bụi electron (ESI-MS) đ-ợc đo trên máy LC-MSD-Trap-SL.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-135, DEPT90 được ghi
trên máy Bruck Avance 500 (Germany).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng silica gel 60 F245 (Merk). Sắc ký cột (CC) sử dụng
silica gel 60 (Merk, 40-63μm).
4.2. Dung mơi hóa chất:
- Các dung mơi sử dụng là dung môi tinh khiết hoặc cất lại: Etanol, n-hexan,
diclometan, etylaxetat, metanol và butanol.
- Thuốc hiện dùng trong sắc ký lớp mỏng là dung dịch Ce(SO4)2 hoặc dung dịch
H2SO4 10% trong EtOH.
4.3. Nguyên liệu thực vật:
4,5 kg mẫu cây Long nha thảo (A. pilosa Ledeb.) được chúng tôi thu hái vào tháng 8
tại Sapa - Lào Cai - Việt Nam. Tên cây được nhà thực vật học Nguyễn Kim Đào (Viện sinh


thái và tài nguyên sinh vật) định tên, tiêu bản được lưu giữ tại phịng Cơng nghệ các chất có
hoạt tính sinh học, Viện Hóa học, Viện KH & CNVN.
4.4. Chiết xuất và phân lập:
4.4.1. Xử lý mẫu và phƣơng pháp chiết tách:
4.5 kg mẫu cả cây (rễ, thân, lá, cành, hoa và quả) Long nha thảo (Agrimonia pilosa
Ledbe) được làm sạch, phơi khơ rồi thái nhỏ. Tiếp đó mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45oC và
đem xay nhỏ. Nguyên liệu khô ở dạng bột (1,1 kg) được ngâm chiết bằng siêu âm 45 phút với
dung môi EtOH ở 45oC (chiết 5 lần, mỗi lần 45 phút). Các dịch chiết được gom lại, lọc và cất
loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết tổng kí hiệu A7. Cặn chiết tổng được
chiết phân bố lần lượt với các loại dung mơi có độ phân cực tăng dần (diclometan, etylaxetat
và cuối cùng là butanol, mỗi loại dung môi được chiết 4 lần). Gom các phần dịch chiết, cất
loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC, thu được các cặn dịch chiết tương ứng:
diclometan (21 g) kí hiệu A8, etylaxetat (16 g) kí hiệu A9 và cuối cùng là butanol (50 g) kí
hiệu A10 (xem sơ đồ 1 mục 3.2). Các cặn phân đoạn dịch chiết được tiếp tục sử dụng để phân

lập các hợp chất.
Các cặn phân đoạn dịch chiết bước đầu được chúng tôi tiến hành thử sơ bộ một số
hoạt tính sinh học như: hoạt tính độc tế bào, hoạt tính chống oxi hóa và hoạt tính kháng sinh.
4.4.2. Phân lập các hợp chất:
Phân lập các chất trong dịch chiết CH2Cl2
Cặn dịch chiết CH2Cl2 (21 g) được tách phân đoạn bằng sắc ký cột chân không VLC
(vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi
giải hấp aceton/n-hexane (0% -100%) và MeOH/CH2Cl2 (0% - 10%) thu được 7 phân đoạn
(kí hiệu từ F1 - F7).
Từ phân đoạn F3 (hệ dung môi n-hexane/aceton) thu được chất kết tủa mầu trắng. Sau
khi gạn dịch và rửa, chất kết tủa này được kết tinh lại với hệ dung môi n-hexane/acetone thu
được hợp chất 1 dạng tinh thể hình kim (12 mg). Phân đoạn F5 được đưa lên cột sắc ký silica
gel cỡ hạt 0,015- 0,043 mm với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH(1:99-9:1) thu được chất rắn, tinh
chế lại bằng hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH được hợp chất 2 (15mg). (Xem sơ đồ 2, mục
3.2)
Phân lập các chất trong dịch chiết etylaxetat
Cặn dịch chiết EtOAc (16g) được tách phân đoạn sử dụng sắc ký cột chân không VLC
(vacuum liquid chromatography), chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,04-0,063 mm, dung môi
giải hấp: aceton/n-hexane (0%-100%) và MeOH/CH2Cl2 (0%-40%) thu được 8 phân đoạn.
Từ phân đoạn 3 được phân tách tiếp bằng cột sephadex LH-20, dung môi rửa giải là
MeOH thu được 4 phân đoạn từ F3.1-F3.4. Ở phân đoạn F3.2 thu được 1 chất rắn màu vàng,
kết tinh lại bằng dung môi n-hexan/acetone thu được 20mg chất sạch dạng tinh thể (kí hiệu:
AP), ở phân đoạn F3.3 cũng thu được chất rắn màu vàng, tinh chế lại bằng dung môi MeOH
thu được 7mg chất sạch (kí hiệu: AP2).
Ở phân đoạn 4 tiếp tục sử dụng sắc ký cột nhanh, chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 0,0150,043 mm, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-MeOH(1:99-8:2) thu được 5 phân đoạn từ F4.1-F
4.5. Ở phân đoạn F4.2 thu được một chất rắn màu trắng, kết tinh lại bằng dung môi
CH2Cl2/MeOH thu được 8 mg hợp chất kí hiệu AP3. Phân đoạn F4.3 được đưa lên cột
sephadex LH-20 với dung môi rửa là MeOH thu được một chất rắn, tinh chế lại trong MeOH
thu được 16 mg chất sạch ở dạng tinh thể hình kim mầu vàng nhạt (kí hiệu AP4).
Từ phân đoạn 5 tiến hành chạy cột sephadex với hệ dung môi rửa MeOH/CH2Cl2 thu

được 15 mg hợp chất ở dạng bột mầu nâu nhạt (kí hiệu AP5).
Ở phân đoạn 6, thu được chất rắn màu vàng, bằng sắc kí bản mỏng điều chế pha đảo
RP-18, dung môi giải hấp MeOH/H2O (6/4) thu được 7mg chất sạch (kí hiệu AP7) (Xem sơ
đồ 3, mục 3.2).
Phân lập cặn dịch chiết butanol


Cặn dịch chiết BuOH (50g) được đưa qua cột diaion, hệ dung môi rửa H2O/MeOH
(100%, 10%, 30%, 50%, 80% và 100%) và sau cùng là acetone 100%. Các phân đoạn
MeOH 30% (13g), 50% (15g) và 80% (5g) được cô lại dưới áp suất giảm đến khô kiệt, cặn
thu được kiểm tra trên bản mỏng pha đảo RP-18 thấy hiện rất nhiều vệt chất rõ ràng, sẽ được
tiếp tục nghiên cứu thành phần các chất tiếp theo.

KẾT LUẬN
1. Lần đầu tiên đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi
Long nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb.) họ Hoa hồng (Rosaceae) mọc ở Việt Nam.
2. Từ cặn dịch chiết EtOAc đã phân lập và xác định được cấu trúc 6 chất sạch, trong
đó có 1 hợp chất là tritecpen và 5 hợp chất flavonoit đó là: ursolic axít (AP3), 3,5,6,7,8,3',4'heptamethoxyflavone (AP), 5,7,3’- trihydroxy - 6, 4’,5’- trimetoxy flavon (AP2), quercetin
(AP4), catechin (AP5), quercitrin (AP7). Trong đó hai hợp chất AP và AP2 lần đầu tiên
được phân lập từ loài Long nha thảo.
3. Đã phân lập và xác định được cấu trúc hai hợp chất ß-sitosterol, ß-sitosterol-3-O-ßD-glucopyranosit từ cặn dịch chiết CH2Cl2 của cây Long nha thảo.
4. Cặn dịch chiết tổng (EtOH-A7) và các cặn dịch chiết phân đoạn (cặn dịch chiết
CH2Cl2-A8, cặn dịch chiết EtOAc-A9, cặn dịch chiết BuOH-A10) từ cây Long nha thảo đã
được thử hoạt tính kháng sinh, chống oxi hóa và độc tế bào cho kết quả tốt. Cặn dịch chiết
EtOAc-A9 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50 (g/ml) là 36,17g/ml; thể hiện
hoạt tính độc tế bào ở cả 2 dòng thử với giá trị IC50 (μg/ml) là 38,69 (dòng ung thư biểu mơKB) và 90,53 μg/ml (dịng ung thư vú-MCF7). Đặc biệt, cặn dịch chiết CH2Cl2 kháng 3
chủng vi sinh vật (S. aureus, B. subtilis và L. fermentum) với giá trị IC50 (μg/ml) lần lượt là
5,05; 2,35; 6,55 (μg/ml) và hoạt tính độc tế bào rất tốt ở cả 2 dòng thử với giá trị IC50 (μg/ml)
là 10,5 (dòng ung thư biểu mơ-KB) và 31,07 (dịng ung thư vú-MCF7). Cặn dịch chiết
BuOH-A10 có hoạt tính chống oxi hóa với giá trị EC50 (g/ml) là 37,34g/ml và hoạt tính

độc tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 (μg/ml) là 20,98.
5. Như vậy, kết hợp với các kết quả nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính các chất
thành phần từ cây Long nha thảo cho thấy loài này có giá trị trong dược liệu, do đó cần tiếp
tục nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất trong
cây Long nha thảo.

References
Tiếng Việt:
1. Võ Văn Chi, Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học. Hà nội, 1999, tr.676.
Tiếng Anh:
2. Murayama T et al. Agrimoniin, an antitumour tannin of Agrimonia pilosa Ledeb., induces
interleukin-1. Anticancer Res, 12, 1471-1474 (1992).
3. Ren-Bo An, Hyun-Chul Kim, Gil-Saeng Jeong, Seung-Hwan Oh, Hyuncheol Oh, and
Youn-Chul Kim. Constituents of the aerial parts of Agrimonia pilosa. Natural Product
Sciences, 11(4), 196-198 (2005).
4. Zhe-Xiong Jin, Bao-Qing Wang and Zhi-Jie Chen. Microwave-assisted extraction of
tannins from Chinese herb Agrimonia pilosa Ledeb. Journal of Medicinnal plants
research, 4 (21), 2229-2234 (2010).


5. Hea Jung Yang, Yune Suk Jung, Ki Suk Kim, Eun- Kyeong Choi, Dong Jin Lim, Kwang
Seok Ahn, Hee-Jae Jung, Sung-Ki Jung & Hyeung-Jin Jang. Global transcriptome
analysis of the E.coli O157 response to Agrimonia pilosa extract. Mol Cell Toxicol, 7,
299-310 (2011).
6. Malkil Jung and Moonsoo Park. Acetylcholinesterase inhibition by flavonoids from
Agrimonia pilosa. Molecules, 12, 2130-2139 (2007).
7. Kyoung Jin Nho, Jin Mi Chun, Ho Kyoung Kim. Agrimonia pilosa ethanol extract induces
apoptotic cell death in HepG2 cells. Journal of Ethnopharmacology, 138 (2), 358-363
(2011).
8. Hiroyoshi Kato, Wei Li , Michihiko Koike, Yinghua Wang, Kazuo Koike. Phenolic

glycosides from Agrimonia pilosa. Phytochemistry, 71 (16), 1925-1929 (2010).
9. Isao Kouno, Naosuke Baba, Yumiko Ohni, Nobusuke Kawano. Triterpenoids from
Agrimonia pilosa. Phytochemistry, 27 (1), 297-299 (1988).
10. A.R. Bilia, E. Palme, A. Marsili, L. Pistelli, I. Morelli. A flavonol glycoside from
Agrimonia eupatoria. Phytochemistry, 32 (4), 1078-1079 (1993).
11. Craig T.M Tomlinson, Lutfun Nahar, Alison Copland,Yashodharan Kumarasamy, Namik
F Mir-Babayev, Moira Middleton, Raymond G Reid, Satyajit D Sarker. Flavonol
glycosides from the seeds of Agrimonia eupatoria (Rosaceae). Biochemical Systematics
and Ecology, 31( 4), pp. 439–441(2003).
12. Jae-Jin Kim, Jun Jiang, Do-Wan Shim, Sang-Chul Kwon, Tack-Joong Kim, Sang-Kyu
Ye, Myong-Ki Kim, Yong-Kook Shin, Sushruta Koppula, Tae-Bong Kang, Dong-Kug
Choi, Kwang-Ho Lee . Anti-inflammatory and anti-allergic effects of Agrimonia pilosa
Ledeb extract on murine cell lines and OVA-induced airway inflammation. Journal of
Ethonopharmacology, 140 (2), 213-221 (2012).
13. Junsei Taira, Wakana Ohmine, Takayuki Ogi, Hitoshi Nanbu, Katsuhiro Ueda.
Suppression of nitric oxide production on LPS/IFN-γ-stimulated RAW264.7 macrophages
by a novel catechin, pilosanol N, from Agrimonia pilosa Ledeb. Bioorganic and
Medicinal Chemistry Letters., 22 (4), 1766-1769 (2012).
14. Junsei Taira, Hitoshi Nanbu, Katsuhiro Ueda. Nitric oxide-scavenging compounds in
Agrimonia pilosa Ledeb on LPS-induced RAW 264.7 macrophages. Food Chemistry., 115
(4), 1221–1227 (2009).
15. Kasai S,Watanabe S,Kawabata J,et al. Antimicrobial catechin derivatives of A. pilosa.
Phytochemistry, 31(3):787-789 9 (1992).
16. Savi L. A., Barardi C. R., simoes C. M. Evaluation of antiherpertic activity and genotoxic
effects of catechin derivatives. J. Agric. Food. Chem., 54(7), 2552-2527 (2006).
17. Li G., Min B. S., Zheng C., Lee J., Oh S. R., Ahn K. S., Lee H. K. Neuroprotective and
free radical scavenging activities of phenonlic compounds from Hovenia dulcis. Arch
Pharm. Res., 28(7), 804-809 (2005).
18. Ono K., Yamada M. Antioxidant compounds have potent anti-fibrillo genic ang fibrildestabilizing effects for alpha-synuclein fibrils in vitro. J. Neurochem., 97(1), 105-115
(2006).

19. M. M. Adeyemi, D. A. Adebote, J. O. Amupitan, A. O. Oyewale and A. S. Agbaji Aust, J.
Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010).
20. Kyoung Jin Nho, Jin Mi Chun, Ho Kyoung Kim. Agrimonia pilosa ethanol extract
induces apoptotic cell death in HepG2 cells. Journal of Ethnopharmacology, 138 (2),
358-363 (2011).
21. Seong-Jin Yoon, Eun-Ji Koh, Chang-Soo Kim, Ok-Pyo Zee, Jong-Hwan Kwak, Won-Jin
Jeong, Jee-Hyun Kim, Sun-Mee Lee. Agrimonia eupatoria protects against chronic
ethanol-induced liver injury in rats. Food and Chemical Toxicology, 50 (7), 2331-2341
(2012).


22. Frances Watkins, Barbara Pendry, Alberto Sanchez-Medina, Olivia Corcoran.
Antimicrobial assays of three native British plants used in Anglo-Saxon medicine for
wound healing formulations in 10th century England. Journal of Ethonopharmacology.,
144 (2), 408-415 (2012).
23. Park, C. H., Kim. S.H., Choi. W., Lee, Y. J., Kim, J. S., Kang, S. S., Suh, Y. H. Novel
Antichlolinesterase and antiamnestic activities of dehydrovodiamine, a constituent of
Evodia rutaecarpa. Planta Med., 62, 405-409 (1996).
24. R. Tundis, B. Deguin, F. Menichini and F. Tillequin, Biochem. Syst. Ecol., 30, 689-691
(2002).
25. Y. Kumarasamy, M. Fergusson, L. Nahar, S.D. Sarker. Pharm Biol., 40 (4), 307 (2002).
26. T. Takao, F. Kitatani, N. Watanabe, A. Yagi, K.A. Sakata. Biosci Biotech Biochem., 58
(10), 1780 (1994).
27. Park, C. H., Kim. S.H., Choi. W., Lee, Y. J., Kim, J. S., Kang, S. S., Suh, Y. H. Novel
Antichlolinesterase and antiamnestic activities of dehydrovodiamine, a constituent of
Evodia rutaecarpa. Planta Med., 62, 405-409 (1996).
28. G. Ushbayeva, A. Kabieva, T. Ryakhovskaya, R. Mustaphina. Study of antitumor activity
of phenolic complex of agrimonia asiatica. European Journal of Cancer., 35 (4), 295
(1999).
29. H.Y. Kuo, M.H. Yeh, J. Chin. Chem. Soc., 44, 379-383 (1997).

30. L. Voutquenne, C. Lavaud, G. Massiot, T. Sevenet, Hamid A. Hadi, Phytochem., 50, 6369 (1999).
31. Dalia Hamdan, Mahmoud Zaki El-Readi , Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Dorothea
Kaufmann, Nawal Farrag, Assem El-Shazly, Michael Wink. Food Chemistry., 127, 394–
403 (2001).
32. Xiao Wang, Fuwei Li, Hongxia Zhang, Yanling Geng, Jingpeng Yuan, Ting Jiang .
Journal of Chromatography A., 1090, 188–192 (2005).
33. Yukiko Iwasea, Yuko Takemuraa, Motoharu Ju-ichia,*, Masamichi Yanob, Chihiro Itoc,
Hiroshi Furukawac, Teruo Mukainakad, Masashi Kuchided, Harukuni Tokudad, Hoyoku
Nishino. Cancer Letters., 163 7-9 (2001).
34. Hideyuki Ito, Satomi Onoue, and Takashi Yoshida. Isoflavonoids from Belamcanda
chinensis. Chem. Pharm. Bull., 49 (9) 1229-1231 (2001).
35. Sabrin R. M. Ibrahim 1, Gamal A. Mohamed 2 and Nawal M. Al-Musayeib. New
Constituents from the Rhizomes of Egyptian Iris germanica L. Molecules 17, 2587-2598,
(2012).
36. Eckhard Wollenweter, Jan Frederik Stevens, Karin Klimo, Jutta Knauft, Nobert Frank,
Clarisa Gehauser. Planta Med., 69, 15-20 (2003).
37. R. Tundis, B. Deguin, F. Menichini and F. Tillequin, Biochem. Syst. Ecol., 30, 689-691
(2002).
38. Dae Sik Jang, Jong Min Kim, Ga Young Lee, Joo-Hwan Kim and Jin Sook Kim.
Ursane-type triterpenoids from the aerial parts of Potentilla discolor. Agric. Chem.
Biotechnol. 49(2), 48-50 (2006)
39. M. M. Adeyemi, D. A. Adebote, J. O. Amupitan, A. O. Oyewale and A. S. Agbaji Aust, J.
Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010).
40. P.K. Agrawa. Carbon-13 NMR of Flavonoids", Elsevier Science, New York, (1989).
41. M.A. Hye, M. A. Taher, M. Y. Ali, M. U. Ali and Shahed Zaman. Isolation of (+)catechin from Acacia catechu (Cutch tree) by convernient method. J. Sci. Res. I (2), 300305 (2009).
42. Savi L. A., Barardi C. R., simoes C. M. Evaluation of antiherpertic activity and genotoxic
effects of catechin derivatives. J. Agric. Food. Chem., 54(7), 2552-2527 (2006).


43. Li G., Min B. S., Zheng C., Lee J., Oh S. R., Ahn K. S., Lee H. K. Neuroprotective and

free radical scavenging activities of phenonlic compounds from Hovenia dulcis. Arch
Pharm. Res., 28(7), 804-809 (2005).
44. M. M. Adeyemi, D. A. Adebote, J. O. Amupitan, A. O. Oyewale and A. S. Agbaji Aust, J.
Basic and App’Sci., 3342-3346 (2010).
45. Ono K., Yamada M. Antioxidant compounds have potent anti-fibrillo genic ang fibrildestabilizing effects for alpha-synuclein fibrils in vitro. J. Neurochem., 97(1), 105-115
(2006).
46. Kim YK, Kim YS, Choi SU, Ryu SY., Isolation of flavonol rhamnosides from Loranthus
tanakae and cytotoxic effect of them on human tumor cell lines. Arch. Pharm. Res. 27(1),
44-7 (2004).
47. A. P. de Almeida, M. M. F. S. Miranda , I.C. Simoni , M.D. Wigg , M.H.C. Lagrota, S.S.
Costa, Flavonol monoglycosides isolated from the antiviral fractions of Persea
americana (Lauraceae) leaf infusion. Phytotherapy Research, 12 (8), 562 - 567 (1998).
48. Shanmugakumar S.D., Amerjothy S., Balakrishna K and Soo-un Kim, Isolation,
characterization and in-vitro evaluation of kaemprol-3-O-a-L-rhamnopyranoside from
Pithecellobium dulce benth, against Mycobacterium tuberculosis and its associated
secondary infections. Phcog Mag., 4 (15), 59-64 (2008).