PHẠM THỊ mát TỔNG hợp và THỬ tác DỤNG SINH học MUỐI NATRI 2 (CURCUMIN o YL)ETHYL HEMISUCCINAT KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ hà nội – 2020

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

PHẠM THỊ MÁT

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC MUỐI NATRI 2(CURCUMIN-O-YL)ETHYL
HEMISUCCINAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

PHẠM THỊ MÁT
MÃ SINH VIÊN: 1501326

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
SINH HỌC MUỐI NATRI 2(CURCUMIN-O-YL)ETHYL
HEMISUCCINAT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hải
2. NCS. Phạm Thị Hiền
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Công nghiệp Dược
2. Viện CNDPQG

HÀ NỘI – 2020


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Văn Hải,
NCS. Phạm Thị Hiền - những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, theo sát, tận tình
truyền đạt, động viên em trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành khóa
luận này.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cơ: GS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS.
Đào Nguyệt Sương Huyền, TS. Nguyễn Văn Giang, NCS. Nguyễn Thị Ngọc và các
anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều
kiện tốt nhất cho em được nghiên cứu tại Bộ môn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, các thầy cô Trường Đại học Dược
Hà Nội đã truyền thụ cho em nhiều kiến thức, kỹ năng quý báu trong khoảng thời gian
em học tập, rèn luyện tại trường.
Trong quá trình thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ
thuộc Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam và Phịng Thử
nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, em xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình¸ các anh chị, các bạn trong
nhóm nghiên cứu – những người luôn bên cạnh, quan tâm, giúp đỡ, tiếp thêm động
lực để em có thể hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Do kiến thức, kỹ năng của bản thân em cịn hạn chế, nên khóa luận khơng tránh
khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự nhận xét, góp ý của các thầy cơ, bạn
bè để khóa luận được hồn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2020
Sinh viên

Phạm Thị Mát

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

3

MỤC LỤC

4

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

8

DANH MỤC CÁC HÌNH

9

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN

1.1. Khái quát chung về curcumin

3
3

1.1.1. Cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của curcumin

3

1.1.2. Vai trị của curcumin đối với sức khỏe

3

1.1.3. Các hạn chế của curcumin

5

1.2. Các phương pháp hóa học trong cải thiện độ tan và sinh khả dụng của curcumin 6
1.3. Lựa chọn phương pháp nghiên cứu tổng hợp và thử sinh học

7

1.3.1. Lựa chọn vị trí biến đổi

7

1.3.2. Lựa chọn nhóm thân nước

8

1.3.3. Lựa chọn phép thử hoạt tính sinh học
CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

13
14

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị, dụng cụ

14

2.2. Nội dung nghiên cứu

15

2.3. Phương pháp nghiên cứu

16

2.3.1. Tổng hợp hóa học

16

2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết

16

2.3.3. Xác định cấu trúc hóa học

16

2.3.4. Thử hoạt tính sinh học

17


CHƯƠNG 3.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Tổng hợp mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1)

23
23

3.1.1. Tổng hợp S-1 theo tài liệu tham khảo

23

3.1.2. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 (Hình 3.2)

25

3.2. Xây dựng quy trình tổng hợp muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat
(S-3)

26

3.2.1. Giai đoạn acyl hóa tạo S-2 từ S-1

26

3.2.2. Giai đoạn tạo muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3)

31

3.2.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-3 (Hình 3.6)

32

3.2.4. Xác định cấu trúc S-3

34

3.3. Thử hoạt tính sinh học

36

3.3.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH

36

3.3.2. Thử hoạt tính ức chế sinh NO

36

3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

37

3.4. Bàn luận

38

3.4.1. Về tổng hợp hóa học

38

3.4.2. Về xác định cấu trúc

40

3.4.3. Về thử hoạt tính sinh học

42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

PHỤ LỤC

1

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon 13 nuclear magnetic
resonance)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-Nuclear Magnetic
Resonance spectroscopy)

AR

Tinh khiết phân tích (Analytical reagent)

CTCT

Công thức cấu tạo

CTPT

Công thức phân tử

DCM

Dicloromethan

DMEM

Môi trường nuôi cấy Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium)

DMF

Dimethyl formamid

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

đvC

Đơn vị carbon

FBS

Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

g

Gam

h

Giờ

Hela

Human cervix carcinoma (Ung thư tử cung ở người)

HepG2

Human hepatocellular carcinoma (Ung thư gan ở người)

HL-60

Human leukemia (Ung thư bạch cầu ở người)

HPLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

IC50

Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at
50%)

IR

Infrared spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

K562

Human myelogenous leukemia (Ung thư bạch cầu cấp ở người)

LD50

Liều chết 50% động vật thí nghiệm

LD100

Liều thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm

L-NMMA

NG-methyl-L-arginin acetat

Log P

Hệ số phân bố dầu nước

LPS

Lipopolysaccharid


MCF7

Human breast carcinoma (Ung thư vú ở người)

MS

Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium

PEG

Polyethylen glycol

Rf

Hệ số lưu giữ (Retention factor)

S-1

mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin

S-2

2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat

S-3

Natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat

SA

Khả năng trung hịa gốc oxy hóa tự do

SC50

Nồng độ trung hịa được 50% gốc tự do (Scavenging concentration
at 50%)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SRB

Sulforhodamin B

RAW 264.7

Dịng đại thực bào chuột 264.7

t°nc

Nhiệt độ nóng chảy

SOD

Chất chống oxy hóa phân giải dây chuyền (superoxid dismutase)

TCA

Trichloracetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số tiền thuốc succinat ..............................................................................8
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu – hóa chất ................................................................14
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ – thiết bị ..................................................................14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng tạo S-2 ................................................27
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol anhydrid succinic : S-1 .............28
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng tạo S-2 .................................................28
Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ khối lượng (CH3OH) của S-3 ...................................34
Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (KBr) của S-3 ........................................34
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của S-3 .................35
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của S-3 ................35
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa ............................................................36
Bảng 3.9. Khả năng ức chế tế bào RAW 264.7 sinh NO ..............................................37
Bảng 3.10. Tác động của mẫu nghiên cứu đến sự sống sót của tế bào RAW 264.7 ....37
Bảng 3.11. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư .............................................37


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của curcumin.....................................................................3
Hình 1.2. Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng .................................5
Hình 1.3. Các vị trí biến đổi cấu trúc của curcumin .......................................................7
Hình 1.4. Tiền thuốc của artemisnin .............................................................................10
Hình 1.5. Tiền thuốc của hydrocortison .......................................................................10
Hình 1.6. Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat ....................................................11
Hình 1.7. Phản ứng tạo dẫn chất succinat của curcumin ..............................................11
Hình 1.8. Phản ứng tạo dẫn chất S-2 ............................................................................12
Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3) ...............12
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp S-3 .......................................................................................16
Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-1 .......................................................................23

Hình 3.2. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-1 ở quy mơ 4 g/mẻ ...........................................25
Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp S-2 .......................................................................................26
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-2 ........................................................................30
Hình 3.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp S-3 .......................................................................31
Hình 3.6. Sơ đồ quy trình tổng hợp S-3 ........................................................................33


ĐẶT VẤN ĐỀ
Curcumin là một polyphenol có trong tinh bột nghệ (Curcuma longa) cùng với hai
dẫn chất của nó là demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin được gọi chung là
curcuminoid - một trong những dược phẩm được sử dụng rộng rãi. Hiện nay, nhiều
nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh curcumin có tác dụng dược lý đa
dạng: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, làm lành vết thương,
làm liền sẹo… [2], [29]. Tuy nhiên để curcumin đạt được lợi ích tiềm năng và ứng dụng
phổ biến trên lâm sàng thì cịn gặp phải một số thách thức: độ tan của curcumin trong
nước ở pH acid và sinh lý rất thấp, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng khi sử
dụng theo đường uống dẫn đến sinh khả dụng của curcumin thấp [31]. Để cải thiện sinh
khả dụng của curcumin người ta có thể sử dụng phương pháp vật lý: hệ thống phân phối
thuốc liposome, micel, tiểu phân nano… hoặc phương pháp hóa học dựa trên khung
curcuminoid có sẵn: biến đổi nhóm OH, khung anken... Kết quả bán tổng hợp các dẫn
chất nhằm tăng độ tan của curcumin cho thấy các dẫn chất trong cấu trúc cịn nhóm –
OH phenol cho hoạt tính sinh học tốt [32]. Gần đây, nhóm nghiên cứu bộ mơn Cơng
nghiệp Dược đã tổng hợp được dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) và
thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH, kháng tế bào ung thư HepG2, kết quả thu được
đều tốt hơn curcumin, tuy nhiên độ tan của chất này so với curcumin tăng không đáng
kể [4]. Xuất phát từ kết quả đó, nhiều nghiên cứu được thực hiện và chỉ ra rằng việc gắn
thêm nhóm thân nước như: phosphat, sulfat...vào dẫn chất S-1 giúp cải thiện độ tan và
tạo ra hợp chất mới có hoạt tính tốt hơn, sinh khả dụng cao hơn curcumin [8].
Trong ngành Dược, một số hoạt chất được sử dụng ở dạng muối natri ester succinat
với ưu điểm: tương đối bền trong mơi trường chuyển hóa, cải thiện đáng kể độ tan, độ

ổn định, sinh khả dụng của thuốc mẹ. Một số ví dụ có thể kể đến là cloramphenicol,
oxazepam, hydroxydion, methylprednisolone…[21] Trong đề tài trước, DS. Đặng Thị
Hải Yến đã tổng hợp và thử in-vitro tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và ức chế tế
bào ung thư của dẫn chất 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2). Kết quả chỉ ra S2 có tác dụng tốt hơn so với curcumin ban đầu [9].
Từ các định hướng trên, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tổng hợp dẫn chất muối natri
2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat và thử in-vitro hoạt tính sinh học dẫn chất tổng
hợp được. Khóa luận thực hiện đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học muối natri 2(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat” với hai mục tiêu chính:
1


1. Xây dựng quy trình tổng hợp muối natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl
hemisuccinat.
2. Thử tác dụng sinh học của dẫn chất tổng hợp được.

2


CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN

1.1. Khái quát chung về curcumin
1.1.1. Cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của curcumin
➢ Cơng thức cấu tạo của curcumin (Hình 1.1):

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của curcumin
➢ Tên khoa học: (1E, 6E)-1,7-bis(4-hydroxyl-3-methoxylphenyl)hepta-1,6dien-3,5-dion.
➢ Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I.
➢ Công thức phân tử: C21H20O6.
➢ Khối lượng phân tử: 368,38 đvC [24].

➢ Dạng thù hình: curcumin tồn tại dưới dạng bột vơ định hình hoặc tinh thể hình
kim màu vàng cam [24].
➢ Nhiệt độ nóng chảy: 183 °C [24].
➢ Tính tan: curcumin hầu như khơng tan trong nước ở mơi trường acid và trung
tính (độ tan < 0,1 µg/mL ở 25 °C) [41]. Curcumin tan được trong môi trường kiềm, tan
trong nhiều dung môi hữu cơ. Curcumin tan được trong một số dung môi như: aceton,
2-butanon, ethyl acetat, methanol, ethanol, 1,2-dichloroethan, 2-propanol; ít tan trong
hexan, cyclohexan; khơng tan trong ether [20].
➢ Về mặt hóa học curcumin chứa các nhóm chức -OH phenol, β-diceton, liên kết
đơi, nhân thơm, vì vậy curcumin có các phản ứng hóa học đặc trưng của các nhóm chức
này: phản ứng hydro hóa [7], imin hóa [3], tạo phức với ion kim loại [6], có tính acid
(giải thích khả năng tan trong kiềm của curcumin), dễ phản ứng với các tác nhân oxy
hóa [1]...
1.1.2. Vai trò của curcumin đối với sức khỏe
Curcumin đã được chứng minh có hoạt tính sinh học rõ ràng, đa dạng. Hiện phân tử
này đang được sử dụng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng để điều trị một
số bệnh: Alzheimer, hen phế quản, viêm loét dạ dày – tá tràng, viêm khớp dạng thấp,
nấm, các bệnh liên quan đến chuyển hóa và ung thư... Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tác
3


dụng chữa bệnh của curcumin nhờ 2 cơ chế chính: chống oxy hóa và chống viêm [17],
[18], [27], [28].
Tác dụng chống oxy hóa: Curcumin có tác dụng chống oxy hóa mạnh ở pH acid và
trung tính thơng qua việc ức chế một số đường tín hiệu tế bào ở nhiều cấp độ, tác động
lên các enzym màng tế bào như enzym cyclooxygenase và glutathion-S-transferase, điều
biến miễn dịch, các tác động trên thành mạch và sự kết dính tế bào – tế bào [31].
Curcumin có khả năng ức chế các gốc oxy hóa tự do gây ra sự peroxy hóa lipid (anion
superoxid (O2-·), hydroperoxid (OH·), gốc ·NO…) do curcumin có thể cho hydro, tham
gia nhận điện tử còn các gốc tự do có xu hướng cho điện tử tự do và lấy hydro của chất

khác. Các nghiên cứu cho thấy hydro của -OH phenol dễ cho đi nhất tạo gốc tự do
phenoxy bền hơn gốc oxy hóa tự do ban đầu do nó có cân bằng cộng hưởng qua cấu trúc
ceton – enol. Điều này giải thích cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh của các sản phẩm
chứa curcumin và các dẫn chất của curcumin cịn nhóm -OH phenol [28]. Mặt khác, các
sản phẩm phân hủy của curcumin trong môi trường kiềm là acid ferulic và vanillin cũng
là những chất chống oxy hóa [25]. Đồng thời, tác dụng chống oxy hóa còn do curcumin
thúc đẩy hoạt động của nhiều enzym chống oxy hóa như catalase, superoxid dismutase
(SOD), glutathion peroxidase (GPx) và hemoxygenase-1 (OH-1),… của cơ thể [29].
Tác dụng chống viêm: Curcumin có đặc tính chống viêm vượt trội và đã được sử
dụng như một loại thuốc tự nhiên để điều trị các bệnh viêm nhiễm. Hoạt tính chống viêm
của curcumin tương đương mà không gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm như các
thuốc chống viêm steroid và không steroid như indomethacin và phenylbutazon [10].
Quá trình oxy hóa kéo dài thường gây ra các phản ứng viêm. Phản ứng viêm gồm nhiều
chuỗi dây chuyền các tín hiệu tạo ra các đáp ứng để điều hịa, nếu q trình này cứ tiếp
diễn, cơ thể không đáp ứng được sẽ gây ra rối loạn, hình thành bệnh tật. Curcumin dọn
dẹp các chất oxy hóa nên hạn chế phản ứng viêm [2], [29]. Mặt khác, các nghiên cứu
chứng minh rằng curcumin có khả năng ức chế một số lượng lớn các phân tử khác nhau
liên quan đến phản ứng viêm bao gồm yếu tố hoại tử khối u (TNF), yếu tố nhân kappa
B (NF-kB), cyclooxygenase 2 (COX-2), các interleukin (IL), gen gây ung thư STAT 3,
enzym cảm ứng sinh nitơ oxid (iNOS), 5-lipoxygenase (5-LOX), protein cảm ứng viêm
(CRP),…[11].

4


1.1.3. Các hạn chế của curcumin
❖ Độ ổn định của curcumin
➢ Ảnh hưởng của ánh sáng:
Curcumin không bền dưới tác dụng của ánh sáng, nhất là trong dung dịch. Sản phẩm
phân hủy chính gồm có vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic và acid ferulic, ngồi ra

cịn có 4-vinylguaiacol và các sản phẩm ngưng tụ (Hình 1.2) [38].

Hình 1.2. Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của ánh sáng
➢ Ảnh hưởng của pH:
Trong mơi trường acid và trung tính, curcumin tương đối ổn định, nhưng trong mơi
trường kiềm lại nhanh chóng bị phân hủy. Trong khoảng pH = 7 – 10, curcumin tồn tại
ở 3 dạng ion H2A-, HA2- và A3-, tương ứng với 3 giá trị pKa, các ion này không bền, ban
đầu phân hủy thành acid ferulic, aldehyd ferulic và các sản phẩm ngưng tụ. Sau đó
aldehyd ferulic nhanh chóng bị chuyển màu (vàng đến vàng nâu) rồi bị phân hủy thành
vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành vinylguaiacol và CO2 [28], [35].
❖ Sinh khả dụng của curcumin
Sinh khả dụng của curcumin đã được nghiên cứu khá đầy đủ cả trên động vật và
người.
Năm 1998, Shoba và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu sử dụng curcumin đường
uống trên chuột với liều 2 g/kg thu được nồng độ đỉnh của curcumin trong máu sau 0,83
h là 1,35 ± 0,23 µg/mL, cùng với liều dùng đó khi sử dụng trên người không phát hiện
được hoặc phát hiện nồng độ curcumin rất nhỏ (0,006 ± 0,005 µg/mL sau 1 h) [33].
Năm 1999, trong q trình nghiên cứu tính chất dược động học của curcumin trên
chuột, Pan và cộng sự đã dùng curcumin với liều 0,1 g/kg. Theo đường uống, nồng độ
curcumin trong huyết tương sau 15 phút là 0,13 µg/mL, sau 1 h nồng độ đạt đỉnh 0,22
5


µg/mL và giảm nhanh trong 6 h. Đường tiêm phúc mạc, kết quả thu được nồng độ
curcumin trong huyết tương sau 15 phút là 2,25 µg/mL, sau 1 h nồng độ trong ruột, lá
lách, gan và thận lần lượt là 177,04; 26,06; 26,90 và 7,51 µg/g, trong khi tại não nồng
độ curcumin chỉ khoảng 0,41 µg/g [26].
Năm 2001, Cheng và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu khác chỉ ra rằng sau khi
uống curcumin với liều 8,00 g thì curcumin sẽ được hấp thu vào máu và đạt đỉnh trong
vòng 1 - 2 h, nồng độ đỉnh là 1,77 - 1,87 µM, nồng độ này nhỏ hơn rất nhiều so với LC50

của curcumin (21 ± 17 µM); đồng thời curcumin cũng chuyển hóa và thải trừ nhanh
chóng ra khỏi cơ thể [16], [18].
Năm 2006, C.D. Lao và cộng sự đã nghiên cứu tính chất dược động học của curcumin
trên người [23]. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi dùng curcumin đường uống với liều
0,50 - 8,00 g thì khơng phát hiện vết curcumin trong huyết tương sau 1, 2, 4 h. Khi tăng
liều lên 10,00 g, nồng độ curcumin trong huyết tương lần lượt là 66, 91, 121 nM sau 1,
2, 4 h. Tương tự với liều 12,00 g, nồng độ curcumin đo được là 81, 156, 139 nM.
Năm 2014, nghiên cứu trên chuột của M. Salem và cộng sự [30] đã chứng minh rằng
khi curcumin được dùng đường uống cho chuột ở liều 500 mg/kg, nồng độ đỉnh được
phát hiện trong huyết tương là 1,8 ng/mL, trong khi curcumin tiêm tĩnh mạch khơng cho
thấy có dấu vết nào của thuốc trong huyết tương trong vòng 1 h.
Các nghiên cứu trên đều đưa ra kết luận curcumin có sinh khả dụng thấp, điều này
giải thích cho việc mặc dù curcumin được khẳng định có nhiều giá trị đối với sức khỏe
con người nhưng đến nay curcumin vẫn chưa có mặt một cách độc lập trong danh mục
dược chất chính thức của y học hiện đại.
1.2. Các phương pháp hóa học trong cải thiện độ tan và sinh khả dụng của
curcumin
Tuy được biết đến với nhiều tác dụng sinh học cùng với có độ an tồn cao nhưng
việc sử dụng curcumin trong lâm sàng gặp nhiều khó khăn do curcumin kém tan trong
nước dẫn đến hấp thu kém, nhanh chóng bị chuyển hóa và đào thải ra khỏi cơ thể. Đó là
nguyên nhân dẫn đến sinh khả dụng đường uống thấp, một số hoạt tính sinh học chưa
có ý nghĩa lâm sàng [36]. Nhiều nghiên cứu đề cập đến các biện pháp cải thiện sinh khả
dụng đường uống của curcumin theo hướng: tăng độ tan và độ hòa tan của curcumin,
tăng tính thấm qua đường tiêu hóa hoặc giảm chuyển hóa, thải trừ của curcumin…. Gần
đây, hướng tạo ra hợp chất mới dựa trên khung curcuminoid có sẵn nhằm cải thiện độ
6


tan, kéo dài thời gian chuyển hóa trong cơ thể từ đó tăng sinh khả dụng, phát huy tác
dụng của curcumin đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Việc biến đổi trong cấu trúc

của curcumin bao gồm sửa đổi chuỗi bên aryl (A), chức diceton (B), các liên kết đôi (C),
thay đổi chức methylen hoạt động (D), tạo phức kim loại – curcumin (E) (Hình 1.3).
Những nghiên cứu này đã đạt được một số thành công nhất định trong việc nâng cao
hoạt tính sinh học hoặc sinh khả dụng của curcumin.

Hình 1.3. Các vị trí biến đổi cấu trúc của curcumin
1.3. Lựa chọn phương pháp nghiên cứu tổng hợp và thử sinh học
1.3.1. Lựa chọn vị trí biến đổi
Nhiều hướng biển đổi cấu trúc curcumin tạo ra hợp chất tan trong nước tốt hơn và
thể hiện hoạt tính đáng mong đợi. Dựa vào cơ chế tác dụng và kết quả thử hoạt tính các
dẫn chất bán tổng hợp của curcumin có thể kết luận rằng nhóm –OH phenol có vai trị
quyết định hoạt tính chống oxy hóa, tác dụng này còn mạnh hơn nếu cấu trúc phân tử
còn hệ liên hợp β-diceton và nhóm methoxy ở vị trí ortho [14], [32]. Vì vậy chúng tơi
hướng tới tác động vào chỉ một nhóm –OH phenol của curcumin.
Năm 2010, Changtam đã alkyl hóa 1 nhóm -OH phenol của curcumin tạo ra dẫn chất
mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) có khả năng chống ký sinh trùng tốt hơn trên
một số loài thuộc chi Trypanosoma và Leishmaina [15]. Gần đây, nhóm nghiên cứu bộ
mơn Cơng Nghiệp Dược cũng đã tổng hợp được dẫn chất này và thử tác dụng chống
oxy hóa hệ DPPH và kháng tế bào ung thư gan HepG2, kết quả thu được đều tốt hơn
curcumin, tuy nhiên độ tan của chất này so với curcumin không tăng nhiều (log P = 2,31
so với log P = 2,56 của curcumin) [4]. Để tiếp tục cải thiện độ tan của dẫn chất monoalkyl
hóa, nhiều nghiên cứu đã thực hiện gắn các nhóm thân nước vào cấu trúc S-1. Năm
2017, tác giả Nơng Thị Bích Vân đã thực hiện gắn thêm nhóm phosphat qua cầu

7


oxyethyl tạo ra sản phẩm 2-(curcumin-O-yl)ethyl dihydrophosphat có độ tan, tính thấm
qua màng tế bào, tác dụng chống viêm tốt hơn S-1 [8].
Trên cơ sở đó, chúng tơi lựa chọn hướng gắn thêm nhóm thân nước vào dẫn chất S1 qua cầu oxyethyl để tạo ra hợp chất mới có độ tan tốt hơn nhằm cải thiện sinh khả

dụng của curcumin.
1.3.2. Lựa chọn nhóm thân nước
❖ Tiền thuốc succinat
Tổng hợp tiền thuốc là một trong những chiến lược sửa đổi phân tử được biết đến
rộng rãi nhằm mục đích tối ưu hóa tính chất hóa lý và dược lý của thuốc để cải thiện độ
tan và các tính năng dược động học cũng như giảm độc tính của thuốc [22]. Các tiền
thuốc tan trong nước hơn, dễ qua màng tế bào hơn và sẽ giải phóng ra thuốc mẹ qua quá
trình biến đổi sinh học nhờ các enzym. Các tiền thuốc hay gặp thường là ester, amid,
carbamat, carbonat, ether, imin, phosphat…[12] Một trong những dạng ester hay được
sử dụng làm tiền thuốc là ester succinat. Ester succinat có ưu điểm là tương đối bền
trong mơi trường chuyển hóa do có pKa thấp, từ 3 – 4. Ở pH sinh lý 7,0 – 7,4, nó bị
deproton hóa mang điện tích âm tương đối bền nhưng có thể hoạt hóa giải phóng thuốc
mẹ dưới tác dụng của các enzym: esterase, amidase,…ở ruột và trong tế bào [21]. Kết
quả của nhiều nghiên cứu cho thấy một số hoạt chất sau khi tạo dạng muối natri ester
succinat có độ tan trong nước tăng đáng kể và thu được kết quả sinh khả dụng đáng
mong đợi, thể hiện hoạt tính sinh học cao hơn so với thuốc mẹ.
Bảng 1.1. Một số tiền thuốc succinat
Tiền thuốc

Thuốc mẹ

TLTK

34
Muối natri cloramphenicol

Cloramphenicol

succinat

8


Tiền thuốc

Thuốc mẹ

TLTK

39, 40

Artemisinin

Artesunat

21

Oxazepam

Muối natri oxazepam succinat

19

Muối natri hydrocortison succinat

Hydrocortison

Ví dụ: Năm 2005, X. Yan và cộng sự đã tiến hành phản ứng tạo muối natri sản phẩm
acid thu được từ q trình acyl hóa dẫn chất của artemisinin. Phản ứng thực hiện ở 0 –
30 °C, trong 5 – 60 phút, sử dụng tác nhân NaOH, NaHCO3 tạo ra sản phẩm muối

artesunat hịa tan tốt trong nước, có thể bào chế cả dạng thuốc tiêm và thuốc viên [40]
(Hình 1.4).

9


Hình 1.4. Tiền thuốc của artemisnin
Muối natri hydrocortison succinat là chế phẩm dược dụng của hydrocortison. Năm
2007, Han S. đã thực hiện phản ứng tạo muối natri sản phẩm acid thu được từ q trình
acyl hóa hydrocortison. Phản ứng được tiến hành trong dung dịch đệm phosphat, sử
dụng các tác nhân NaHCO3, NaOH, Na2CO3 với thời gian, nhiệt độ và pH thích hợp
[19].

Hình 1.5. Tiền thuốc của hydrocortison
Phương pháp 1: Khuấy acid hydrocortison succinat trong dung dịch đệm phosphat
1 h ở 1 – 5 °C, pH~5. Nhỏ từ từ dung dịch NaHCO3 vào hỗn hợp phản ứng đến pH~7,5,
lọc, sấy, thu sản phẩm, hiệu suất phản ứng: 67%.
Phương pháp 2: Khuấy acid hydrocortison succinat trong dung dịch đệm phosphat
4 h ở 75 °C, pH~5, hạ nhiệt độ hỗn hợp xuống dưới 40 °C. Nhỏ từ từ dung dịch Na2CO3
vào hỗn hợp phản ứng đến pH~8,5, lọc, sấy, thu sản phẩm, hiệu suất phản ứng: 86%.
Phương pháp 3: Khuấy acid hydrocortison succinat trong dung dịch đệm phosphat
4 h ở 70 °C, pH~8, hạ nhiệt độ hỗn hợp xuống dưới 40 °C. Nhỏ từ từ dung dịch NaOH
vào hỗn hợp phản ứng, duy trì pH~8, lọc, sấy, thu sản phẩm, hiệu suất phản ứng: 79%.

10


❖ Một số nghiên cứu về dạng ester succinat của curcumin
Năm 2011, W. Wichinithad và các cộng sự đã acyl hóa trực tiếp nhóm -OH phenol
của curcumin bằng tác nhân ethyl-4-cloro-4-oxobutyrat sử dụng xúc tác 4-(N, Ndimethlyamino)pyridin (DMAP) trong dung mơi dicloromethan (DCM) thu được dẫn

chất curcumin diethyl disuccinat (Hình 1.5) thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư biểu
mô đại trực tràng ở người (Caco-2) in-vitro tốt hơn so với curcumin. Đồng thời, dẫn chất
này có độ ổn định hóa học cao hơn curcumin trong dung dịch đệm phosphat 0,1M (pH
= 7,4) ở 37 °C [37]. Tuy nhiên, dẫn chất curcumin diethyl disuccinat khó thủy phân chọn
lọc loại nhóm ethylester để thu được dạng acid dễ tan trong nước hơn.

Hình 1.6. Phản ứng tạo curcumin diethyl disuccinat
Trước đó, năm 2004, Andre Rieks và cộng sự tiến hành tổng hợp dẫn chất succinat
của curcumin sử dụng tác nhân anhydrid succinic trong dung mơi pyridin ở 20○C [13].
(Hình 1.6). Phản ứng đơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên sau phản ứng thu được hỗn hợp
sản phẩm mono và diacyl hóa dễ bị thủy phân, khó tinh chế thu sản phẩm tinh khiết.

Hình 1.7. Phản ứng tạo dẫn chất succinat của curcumin
Năm 2019, tác giả Đặng Thị Hải Yến đã gắn thành cơng nhóm succinat trên dẫn chất
mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1) thơng qua cầu oxyethyl để tạo ra 2(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-2) và tiến hành thử nghiệm ban đầu cho thấy, S2 có tác dụng chống viêm mạnh với IC50 (µM) = 12,97 ± 0,96 thấp hơn gần 1,4 lần so
với curcumin và thấp hơn đối chứng dương L-NMMA 2,9 lần. Đồng thời mẫu S-2 thể
11


hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dịng tế bào thử nghiệm: Hela, HepG2, K562,
MCF7 tốt hơn curcumin trong cùng điều kiện với chất đối chứng dương Ellipticin hoạt
động ổn định [9].

Hình 1.8. Phản ứng tạo dẫn chất S-2
Trên cơ sở phân tích tổng quan, chúng tơi tiếp tục phát triển dẫn chất monoalkyl hóa
của curcumin theo hướng tạo tiền thuốc succinat có độ tan tốt hơn. Đề tài tập trung giải
quyết vấn đề tổng hợp dẫn chất natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat theo sơ đồ:

Hình 1.9. Sơ đồ tổng hợp natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3)
12

1.3.3. Lựa chọn phép thử hoạt tính sinh học
Chúng tơi chọn phép thử chống oxy hóa hệ DPPH (in-vitro), phép thử ức chế sinh
NO (in-vitro) và phép thử gây độc tế bào trên 4 dòng tế bào ung thư: Hela, HepG2, HL60, MCF7 (in-vitro) để đánh giá hoạt tính của dẫn chất tổng hợp được.

13


CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị, dụng cụ
Nguyên liệu ban đầu là curcumin được tinh chế từ hỗn hợp bột curcuminoid chiết
xuất từ cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) tại phịng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược,
Bộ mơn Cơng nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, đạt hàm lượng > 96%.
Các nguyên liệu và hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong
Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu – hóa chất
Tên hóa chất

STT

Tiêu chuẩn, xuất xứ

1

2-Bromoethanol

> 95%, Mỹ

2

Aceton

AR, Trung Quốc

3

Acid hydroclorid

AR, Trung Quốc

4

Anhydrid succinic

99%, Mỹ

5

Dicloromethan

AR, Trung Quốc

6

Dimethylformamid

AR, Trung Quốc

7

Đồng (II) sulfat

AR, Trung Quốc

8

Kali carbonat

AR, Trung Quốc

9

Methanol

AR, Trung Quốc

10

Natri bicarbonat

AR, Trung Quốc

11

Natri sulfat khan

AR, Trung Quốc

12

Nước cất

DĐVN V, Việt Nam

13

Pyridin
AR, Trung Quốc
Các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng trong khóa luận được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh mục các dụng cụ – thiết bị

STT

Thiết bị, dụng cụ

Xuất xứ

1

Bản mỏng silica gel 60 F254

Đức

2

Bình cầu 1 cổ 50 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL

Đức

3

Bình cầu 2 cổ 150 mL, 500 mL, 2000 mL

Đức

4

Bình chiết 100 ml, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

Đức

5

Bình nón 100 mL, 250 mL, 500 mL

Đức

6

Bình sắc ký

Trung Quốc
14


STT

Thiết bị, dụng cụ

Xuất xứ

7

Bộ lọc hút chân không Buchner

Trung Quốc

8

Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S

Thụy Sĩ

9

Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

Đức

10

Đèn soi UV sắc ký CN6

Đức

11

Máy cất quay chân không Buchi R210, R220

12

Máy đo nhiệt động nóng chảy EZ-Melt

Mỹ

13

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 MHz

Mỹ

14

Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700

Nhật

15

Máy đo phổ khối lượng Agilent 1100 LC-MSD Trap

Mỹ

16

Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA

Đức

17

Nhiệt kế

Đức

18

Pipet chia vạch 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL

Đức

19

Sinh hàn hồi lưu

Đức

20

Thiết bị phản ứng có áo nhiệt 5 L

Đức

21

Tủ sấy Memmert

Đức

Thụy Sĩ

2.2. Nội dung nghiên cứu
➢ Nghiên cứu quy trình tổng hợp
− Nâng cấp quy mô tổng hợp dẫn chất mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin (S-1).
− Tổng hợp dẫn chất natri 2-(curcumin-O-yl)ethyl hemisuccinat (S-3) và khảo sát
yếu tố ảnh hưởng.
➢ Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng SKLM với hệ dung mơi thích
hợp, soi bản mỏng dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm và đo nhiệt độ nóng chảy.
➢ Xác định cấu trúc của sản phẩm bán tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại (IR),
phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR).
➢ Thử hoạt tính của dẫn chất đã tổng hợp được:
+ Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư.
+ Thử hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH.
+ Thử hoạt tính ức chế sinh NO.
15


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Bán tổng hợp các dẫn chất của curcumin bằng các phản ứng O-alkyl hóa, acyl hóa,
tạo muối natri theo sơ đồ sau (Hình 2.1):

Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp S-3
➢ Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng silica
gel 60 F254 Merck với hệ dung môi khai triển: dicloromethan : methanol (9,0 : 1,0). Quan
sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại.

➢ Sử dụng phương pháp lọc, cất, chiết lỏng – lỏng, sắc ký cột, kết tinh để thu sản
phẩm.
2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
➢ Sử dụng phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở mục 2.3.1. Dựa
vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm.
➢ Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZMelt. Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản
phẩm.
2.3.3. Xác định cấu trúc hóa học
Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ bao gồm phổ khối
lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 13CNMR).
➢ Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, bằng kỹ thuật tạo mẫu ép viên KBr trong vùng 4000 – 400 cm-1,
16