khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo cpg thuộc vùng promoter của các nhóm gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC
VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. Hồ Chí Minh, 10/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC
VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài
(ký, họ tên, đóng dấu)

TP. Hồ Chí Minh, 10/2011

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)


Thành viên tham gia: ThS. Lê Thị Trúc Linh
CN. Hồ Bảo Khun
CN. Tơn Nữ Tùng Kim

Đơn vị phối hợp chính: Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á
CN. Hồ Thị Thanh Thủy


MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
I.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG
I.1.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam
I.1.2. Tác nhân gây bệnh
I.2. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA
I.2.1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA
I.2.2. Enzyme xúc tác
I.2.3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư
I.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC GEN DAPK, DNMT3L, RARβ, p16INK4a, DcR1 & 2
I.3.1. Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase)
I.3.1.1. Cấu trúc và chức năng

I.3.1.2. Sự methyl hóa gen DAPK trong ung thư
I.3.2. Gen RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta)
I.3.2.1. Cấu trúc và chức năng
I.3.2.2. Sự methyl hóa gen RARβ2 trong ung thư
I.3.3. Gen DNMT3L (DNA methyltransferase 3-like)
I.3.3.1. Cấu trúc và chức năng
I.3.3.2. Sự methyl hóa gen DNMT3L trong ung thư
I.3.4. Gen p16INK4a
I.3.4.1. Cấu trúc và chức năng
I.3.4.2. Sự methyl hóa gen p16INK4a trong ung thư
I.3.5. Gen DcR1 và DcR2
I.3.5.1. Cấu tạo và chức năng
I.3.5.2. Sự methyl hóa gen DcR1& DcR2 trong ung thư
I.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN
SỰ METHYL HÓA DNA
I.4.1. Phương pháp MSP
I.4.1.1. Nguyên tắc MSP
I.4.1.2. Xử lý DNA bằng sodium bisulfite
I.4.1.3. Đọc kết quả phản ứng MSP
I.4.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR)
I.4.3. Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP)
I.5. TÍNH CẤP THIẾT
I.6. MỤC TIÊU
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
II.1. VẬT LIỆU
II.2. PHƯƠNG PHÁP
II.2.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico
II.2.1.1. Khai thác dữ liệu
II.2.1.2. Khảo sát in silico
II.2.2. Thực nghiệm

II.2.2.1. Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng Q-MSP
II.2.2.2. Thử nghiệm tách chiết DNA
II.2.2.3. Thử nghiệm biến đổi bisulfite DNA bằng phương pháp thủ công
II.2.2.4. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit

1
1
1
3
4
4
5
7
7
7
8
9
9
10
10
11
12
13
13
14
15
15
16
17
18

18
18
19
19
20
20
21
23
23
24
24
25
26
26
27
30
33


II.2.2.5. Phương pháp MSP trên mẫu bệnh phẩm
II.2.2.6. Giải trình tự sản phẩm MSP
II..2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO
III.1.1. Khai thác dữ liệu
III.1.2. Khảo sát in silico
III.1.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG
III.1.2.2. Thiết kế - đánh giá mồi
III.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

34
36
36

III.2.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm Q-MSP sử dụng DNA
chứng
III.2.2. Giải trình tự sản phẩm MSP từ DNA chứng

59

III.2.3. Xây dựng quy trình

72

III.2.3.1. So sánh hiệu quả của hai phương pháp tách chiết: Phenol/Chloroform và
i-genomic kit
III.2.3.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi methyl và unmethyl trên gen
DcR1, sử dụng DNA chưa biến đổi bisulfite
III.2.3.3. Thử nghiệm biến đổi DNA bằng Epitect Bisulfite kit và thực hiện MSP

72

III.2.3.4. Thử nghiệm MSP sử dụng DNA biến đổi bisulfite thủ công

76

III.2.4. Thử nghiệm quy trình trên bệnh phẩm

77

III.2.4.1. Đặc điểm methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen
DAPK, RAR, p16INK4a và DcR1 trong bộ mẫu khảo sát
III.2.4.2. Tương quan giữa đặc điểm kiểu type HPV nhiễm và tần số methyl hóa
của các gen DcR1, DAPK, RAR và p16INK4a
III.2.4.3. Mức độ phủ của các gen có methyl hóa bất thường trong số các mẫu
khảo sát
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

78

IV.1. KẾT LUẬN

89

IV.2. ĐỀ NGHỊ

89

38
38
44
44
45
59

69

73
75

86
86


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ II.1: Tiến trình thực hiện nghiên cứu

24

Sơ đồ II.2: Tiến trình thực nghiệm biến đổi bisulfite DNA thủ công

31

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng II.1: Thành phần phản ứng Q-MSP

26

Bảng II.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP

27

Bảng II.3: Thành phần phản ứng PCR với các cặp mồi WT1, 2

30

Bảng II.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với WT1, 2

30

Bảng II.5: Thành phần phản ứng biến đổi DNA bằng sodium bisulfite

32

Bảng II.6: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite DNA sử dụng EpiTect bisulfite Kit

34

Bảng II.7: Thành phần của phản ứng MSP

35

Bảng II.8: Chu kì nhiệt của phản ứng MSP

35

Bảng II.9: Giá trị nhiệt độ nóng chảy của các mồi

36

Bảng III.1: Phương pháp phân tích và nguồn mẫu sử dụng trong 36 khảo sát

39

Bảng III.2: So sánh số liệu tần số methyl hóa của các nghiên cứu khác nhau dựa
trên yếu tố kỹ thuật và yếu tố nguồn mẫu
Bảng III.3: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen DAPK, RARβ
và p16 trong ung thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường

Bảng III.4: Trình tự và các thơng số IDT của hệ thống mồi thiết kế cho các gen
DcR1, DcR2, DAPK, DNMT3L, RARβ và p16INK4
Bảng III.5: Kết quả kiểm tra trên DNA chứng bằng phương pháp QMSP

40

Bảng III.6: Nồng độ và chất lượng DNA được tách bằng 2 phương pháp igenomic Kit và Phenol/Chloroform
Bảng III.7: Tổng kết đặc nhiễm nhiễm type HPV, đặc điểm loại mẫu bệnh phẩm
và kết quả MSP của DcR1, DcR2, DAPK, RARβ và p16INK4a cho bộ mẫu khảo sát
Bảng III.8: Liên quan giữa nhóm tuổi – nguy cơ bệnh – Tính chất methyl hóa bất
thường
Bảng III.9: Tần số methyl hóa của các gene DcR1, DAPK, RARβ và p16INK4a
trong mơ ung thư cổ tử cung và dịch phết tế bào âm đạo
Bảng III.10: Mối tương quan giữa đặc điểm nhiễm type HPV và tần số methyl
hóa của DcR1, DAPK, RAR, p16INK4a
Bảng III.11: Các mẫu có lần lượt khơng, một, hai, ba, bốn gen bị methyl hóa
trong 31 mẫu bệnh phẩm

71

42
49
59

81
83
84
85
86

DANH MỤC HÌNH
Hình I.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV
Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp
nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)
Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen
Hình I.4: Phương pháp MSP

Trang
3
5
7
18

Hình I.5: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite

19

Hình I.6: Đọc kết quả MSP

19

Hình III.1: Tần số methyl hóa của các gen DAPK, p16 và RARβ trong ung thư cổ
tử cung và trong tế bào bình thường

43

Hình III.2: Sơ đồ cấu trúc vùng gen DAPK, RAR, p16, DNMT3L, DcR1, DcR2
khảo sát, trình tự đảo CpG sau biến đổi bisulfite và vị trí bắt cặp của các cặp mồi
trong phương pháp MSP

52

Hình III.2.1. Gen DAPK
Hình III.2.2. Gen RARβ2
Hình III.2.3. Gen p16
Hình III.2.4. Gen DNMT3L
Hình III.2.5. Gen DcR1
Hình III.2.6. Gen DcR2
Hình III.3: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi RAR-M và RAR-U
Hình III.4: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi p16-M và p16-U
Hình III.5: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi DAPK-M và DAPK-U
Hình III.6: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi DNMT3L
Hình III.7: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi DcR1-M và DcR1-U
Hình III.8: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản
phẩm Q-MSP từ cặp mồi DcR2-M và DcR2-U
Hình III.9: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen DcR1

53
54
55
56
57
58
62

Hình III.10: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP unmethyl của gen DcR1

70

Hình III.11: Kết quả phân tích di trên gel agarose DNA bộ gen tách chiết bằng igenomic kit (ký hiệu A trên hình) và Phenol/Chloroform (ký hiệu B trên hình) từ ba
mẫu sinh thiết mơ 01, 02 và 03
Hình III.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi WT1: giếng 1, 2: tương ứng với mẫu
bệnh phẩm số 1 và thang chuẩn 100 bp
Hình III.13: Kết quả PCR với cặp mồi WT2: giếng 1, 2: tương ứng với mẫu bệnh
phẩm số 1 và thang chuẩn 100 bp
Hình III.14: Kết quả điện di sản phẩm MSP: giếng 1, 3, và 5 tương ứng sản phẩm

72

63
64
65
66
67
69

73
73
74


MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi methyl WT3; Giếng 2, 4, và 6 tương
ứng sản phẩm MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi unmethyl WT4; Giếng 7:
sản phẩm MSP của mẫu số 1, sử dụng mồi WT2

Hình III.15: Kết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi WT3 và WT4 sử dụng
DNA biến đổi thủ công: giếng 1, 2 và 3 tương ứng sản phẩm MSP sử dụng mồi
unmethyl WT4, methyl WT3 và thang chuẩn 100 bp
Hình III.16: Kết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi methyl trên gen DcR2,
trước (A) và sau (B) khắc phục băng ký sinh: ký hiệu mẫu được ghi trên các
giếng, kích thước sản phẩm mong đợi được chỉ ra trên hình; lad: thang chuẩn
100 bp
Hình III.17: Phân tích đặc điểm methyl hóa vùng promoter của các gen DcR1,
DAPK, RARβ và p16INK4a trên các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp MSP
Hình III.18: Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen RARβ

76

77

79

80


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AC
bp
BSP
CDK
COBRA
DAPK
DcR
DNA
DNMT

dNTP
HPV
HSIL
IDT
LSIL
M
MBD
M-F
M-R
MSP
NCBI
PCR
QMSP
RARβ
SCC
Taq
TE
Tm
TNFRSF
TRAIL
U
UV
WT

Adenoma carcinoma
Base pair (cặp base)
Bisulfite Sequencing PCR
Cyclin Dependent Kinase
Combined Bisulfite Restriction Analysis
Death-Associated Protein Kinase

Decoy receptor
Deoxyribonucleic acid
DNA methyltransferase
Deoxynucleoside triphosphate
Human Papilloma virus
High Grade Squamous Intraepithelial Lesions
Integrated DNA Technology
Low Grade Squamous Intraepithelial Lesions
Methylated
Methyl-CpG-binding
Methylated forward primer
Methylated reverse primer
Methylation Specific PCR
National Center for Biotechnology Information
Polymerase chain reaction
Quantitative Methylation Specific PCR
Retinoic Acid Receptor beta
Squamous Cell Carcinoma
Thermus aquaticus
Tris-base EDTA
Melting temperature
Tumor necrosis factor receptor superfamily
TNF-related apoptosis-including ligand
Unmethylated
Ultra violet
Wide type


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
Trường Đại học Mở TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo CpG thuộc vùng
promoter của các nhóm gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của
bệnh ung thư cổ tử cung
- Mã số: B2010.32.10
- Chủ nhiệm: TS. Lê Huyền Ái Thúy
- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Mở TP.HCM
- Thời gian thực hiện: 18 tháng từ tháng 05/2010 đến tháng 11/2011
2. Mục tiêu: Đưa ra một dữ liệu về sự methyl hóa bất thường của một số gen có
liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung ở người
Việt nam.
3. Tính mới và sáng tạo:
- Đây là cơng trình đầu tiên được thực hiện ở Việt nam về tìm hiểu hiện tượng
“Epigenetics” trên nhóm bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Để tìm hiểu thơng tin này,
phương pháp Methylation Specific PCR cũng là lần đầu tiên được xây dựng thành
công, cả trên DNA chứng và trên hai nguồn bệnh phẩm: dịch phết tế bào âm đạo
và sinh thiết mô ung thư cổ tử cung. Chính vì vậy, kết quả của đề tài về thơng tin
sự methyl hóa bất thường trên cụm bốn gen được khảo sát từ 37 bệnh nhân là
thông tin “epigenetic” đầu tiên ở Việt nam được công bố.
- Để đạt được những kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã khai thác hiệu quả thông
tin trên các ngân hàng dữ liệu gen, vận dụng kết hợp các công cụ tin-sinh học mới,
phù hợp để khai thác tốt nhất lượng thông tin di truyền trên từng vùng gen (DNA)
khảo sát. Chính sự kết hợp sáng tạo này đã đưa đến các luận chứng khoa học về
mặt lý thuyết làm tiền đề rất tốt, có đủ độ tin cậy để nhóm nghiên cứu đi tiếp bước
thực nghiệm chứng minh.
4. Kết quả nghiên cứu:
- Đã thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu cho phương pháp MSP và BSP để
kiểm tra mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gen

DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 và p16INK4a
- Đã thử nghiệm thành công để chứng minh tính hợp nhất về lý thuyết cũng như
chứng minh tính đặc hiệu của tất cả các bộ mồi trong thực nghiệm, sử dụng các
nguồn DNA chứng.


- Đã rút ra được các tỉ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các
gen DcR1, DAPK, RARβ và p16INK4a lần lượt là 49%, 58%, 77% và 58% với độ
bao phủ (có ít nhất một trong bốn gen DcR1, DAPK, RAR và p16INK4a bị methyl
hóa) trong bộ mẫu khảo sát là 90%. Trong số đó, mức độ methyl hóa của gen
RARβ và p16INK4a có liên quan chặt chẽ với kiểu gen HPV xâm nhiễm.
5. Sản phẩm:
- 6 bộ mồi cho phản ứng MSP và BSP trên các gen DAPK, DNMT3L, RARβ,
DcR1, DcR2 và p16INK4a
- Quy trình MSP với đầy đủ các thông số
- Tỉ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen DcR1,
DAPK, RARβ và p16INK4a
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp
dụng:
- Ung thư cổ tử cung là một trong những loại ung thư phổ biến và có thể chữa khỏi
nếu được phát hiện kịp thời. Nghiên cứu này nhằm bước đầu xây dựng cơ sở khoa
học về cả lý thuyết lẫn thực nghiệm, nhằm tiến tới xây dựng cơ sở dữ liệu về biến
đổi epigenetics – methyl hóa bất thường của những gen quan trọng, để từng bước
đánh giá khả năng sử dụng dữ liệu này như một dấu chứng sinh học, đặc trưng cho
người bệnh ung thư cổ tử cung ở Việt nam. Kết quả bước đầu rất khả quan hướng
đề nghị của chúng tôi đến việc mở rộng cỡ mẫu khảo sát.

Ngày 20 tháng 10 năm 2011

TRƯỜNG ĐH.MỞ TP.HCM

KT.HIỆU TRƯỞNG
PHÓ HIỆU TRƯỞNG

Nguyễn Thuấn

Chủ nhiệm đề tài


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1. General information:
Project title: Surveying DNA methylation at CpG islands in the promoter
regions of some genes involved in the formation and development of cervical
cancer
Code number: B2010.32.10
Coordinator: Dr. Le Huyen Ai Thuy
Implementing institution: HoChiMinh city Open University
Duration: 18 months from 5/2010 to 11/2011
2. Objective(s): Given an aberrant methylation data of some genes involved in the
formation and development of cervical cancer in Vietnamese people
3. Creativeness and innovativeness:
- This is the first work done in Vietnam to explore of the "Epigenetics"
information of cervical cancer patients in Vietnam. In order to find out this
information, Methylation Specific PCR method was first successfully established,
both on the DNA controls and DNA extracted from two kinds of clinical samples:
vaginal smears and biopsies of cervical cancer tissues. Consequently, the final
results of this research about the aberrant methylation of four gene clusters were
examined from 37 patients first published in Vietnam.
- To achieve the above results, the research group was effective exploitation of
genetic information in the Genbanks, combined use of new bioinformatics tools,

suitable for getting the most of genetic information in each gene (DNA) surveying.
Above creativity combination led to the scientific arguments in theory to be a
good premise, has enough confidence to go forward step experimentally
demonstrated.
4. Research results:
- Successfully designing specific primer pairs for MSP and BSP methods to
surveying the aberrant methylation at CpG islands in the promoter region of the 6
genes including DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 and p16INK4a.
- Successfully demonstrating the consistency of the theory and the experiments,
demonstrating the specific of primer pairs in MSP using DNA controls.
- Giving the frequencies of DNA methylation at CpG islands in the promoter
regions of 4 genes DcR1, DAPK, RARβ and p16INK4a reaching 49%, 58%, 77%
and 58%, respectively, the coverage (methylated at least one of the four genes) is
90%. Especially, the aberrant methylation of p16INK4a and RARβ genes is
associated with HPV genotype infection.
5. Products:
- 6 sets of primers for MSP and BSP at at CpG islands in the promoter regions of 6
genes including DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 and p16INK4a.
- MSP protocols with all of parameters


- The frequency of CpG island methylation in the promoter regions of 4 genes
DcR1, DAPK, RARβ and p16INK4a
6. Effects, transfer alternatives of research results and applicability:
Cervical cancer is one of the most common cancer types and can be cured if
detected in time. This study is the first step to build the scientific basis of both
theory and experiment, to proceed to build the database for epigenetics - aberrant
methylation of important genes in order to get final purpose: use this data as a
biomarker for cervical cancer in Vietnam. Initial results are very positive towards
our proposal to expand the sample size.

MỞ ĐẦU
I.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG:
I.1.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam:
Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế IARC, công bố năm
2008, ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh ung thư thường gặp, có tần suất
thứ hai sau ung thư vú và chiếm 13% trong các bệnh ung thư xảy ra ở phụ nữ trên
thế giới, với tỉ lệ tử vong cao, chiếm 52% trong số người mắc phải căn bệnh này
[65]. Tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính có khoảng 529.828 ca ung tư cổ tử
cung mới và 275.128 ca tử vong trong năm 2008 và khoảng 86% các trường hợp
này xảy ra ở các nước đang phát triển, mà nguyên nhân chủ yếu là do sự thiếu các
chương trình tầm sốt và phát hiện sớm ung thư cổ tử cung đối với các đối tượng ít
được chăm sóc về y tế. Ngồi ra, chất lượng của một số chương trình tầm sốt
bằng tế bào học cổ tử cung thường chưa đạt yêu cầu [65].
Cũng theo IARC, tỉ lệ nhiễm HPV của phụ nữ toàn cầu dao động trong
khoảng 9-13%, nghĩa là cứ 10 phụ nữ có 1 người nhiễm HPV. Ở Việt nam, nếu chỉ
tính riêng ung thư cổ tử cung thì số người chết vì HPV đã cao hơn nhiều so với
HIV. Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung, cao
gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các tổn thương do
HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được phát hiện
kịp thời. Tuy nhiên thực tế ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung
chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời, và hiện nay bệnh
này đang là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ hai ở Việt Nam nói chung và
đứng đầu ở Thành phố Hồ Chí Minh nói riêng. Hiện tại, có khoảng 30,77 triệu phụ
nữ tuổi từ 15 tuổi trở lên có nguy cơ mắc phải ung thư cổ tử cung. Kết quả thống
kê của IARC cho thấy rằng có 2.472 ca tử vong trong số 5.174 trường hợp được
chẩn đoán ung thư cổ tử cung mỗi năm tại Việt Nam [65].
I.1.2. Tác nhân gây bệnh:

1


Các nhà khoa học đã xác định thủ phạm gây ra hầu hết các dạng ung thư cổ tử
cung là Human Papilloma Virus (HPV) – một loại virus gây u nhú ở người, chiếm
khoảng 82% số trường hợp phụ nữ bị ung thư cổ tử cung ở các nước đang phát
triển [46].
HPV là virus có vật liệu di truyền là DNA, thuộc họ Papovaridae. Bởi vì virus
này khơng thể phát triển trong thực nghiệm và khơng có xét nghiệm huyết thanh
nào đáng tin cậy, nên sự nhận diện và định type HPV chỉ căn cứ vào nucleic acid.
Một đặc điểm rất quan trọng nữa của virus này là chúng không phát triển trong
điều kiện ni cấy ở phòng thí nghiệm [46] nên để nghiên cứu, người ta chỉ có thể
dựa vào in vivo trên người hay động vật bị nhiễm.
Tùy thuộc vào khả năng dẫn đến ung thư, người ta chia HPV thành hai nhóm
[46]:
 Nhóm “nguy cơ thấp” (low risk): những type HPV thuộc nhóm này
chỉ gây những mụn cóc hoặc khối u lành tính. Bộ gen của chúng tồn
tại độc lập với tế bào chủ. Các type HPV trong nhóm nguy cơ thấp
thường gặp như L1 (6, 42, 43, 81), L2 (11, 61, 70, 71)


Nhóm “nguy cơ cao” (high risk): bao gồm những type có khả năng

gắn xen DNA của chúng vào bộ gen người, gây ra những rối loạn hình thành các
khối u ác tính. Các type HPV trong nhóm nguy cơ cao thường gặp là H1 (16, 18,
31, 45), H2 (33, 35, 39, 52), H3 (51, 56, 66, 68), H4 (53, 58, 59, 82)
Điều dẫn đến sự khác nhau trong hoạt động của hai type HPV là do vùng gen
E6, E7. Ở nhóm nguy cơ thấp, protein E6, E7 liên kết rất yếu với p53, pRb của
người và khơng có khả năng gắn xen vào DNA tế bào chủ.
Mặc dù có sự khác biệt về tần suất nhiễm các type HPV giữa các vùng địa lý

nhưng type 16,18 thường gây ung thư ở hầu hết các nơi trên thế giới [44, 55].
Hầu hết những trường hợp nhiễm HPV là tạm thời. Nếu bệnh nhân có sức đề
kháng mạnh thì có thể khỏi bệnh. Do cơ chế nào chưa rõ , có khoảng 5-10% phụ
nữ nhiễm HPV nhóm nguy cơ cao sẽ còn tồn tại tình trạng nhiễm HPV này.
Những bệnh nhân ấy có khả năng tiến triển sang các tổn thương tiền ung thư cổ tử
2


cung, nếu không điều trị sẽ tiến đến ung thư. Gần đây, các nhà khoa học đã tìm
thấy sự hiện diện của HPV trong 93-100% các trường hợp carcinom tế bào gai ở
cổ tử cung. Một số týp gây nên những u nhú quanh bộ phận sinh dục, hậu môn
thường gọi là bệnh mào gà (condylomata acuminatum) đó là týp 6, 11 thường xuất
hiện vài tuần hoặc nhiều tháng tế bào nhân to, nhiều thùy nhiều năm sau khi tiếp
xúc. Khảo sát vi thể các tổn thương gây ra do HPV cho thấy lớp tế bào bề mặt có
hình ảnh loạn sừng (dyskeratosis), á sừng (parakeratosis) và những tế bào rỗng
(koilocyte) có nhân to, đa nhân, tăng sắc là đặc trưng của tế bào nhiễm HPV [58].
Loại ung thư cổ tử cung thông thường nhất là ung thư tế bào gai và thường do
HPV 16, 18. Ung thư tế bào tuyến thì ít , chủ yếu có liên quan đến HPV 18 [58].

Sự tiến triển của bệnh
Thời gian

Niêm mạc
bình thường

Nhiều năm

Tháng

Nhiễm HPV;

Tế bào rỗng

CIN I

Tổn thương thượng mô gai mức
độ thấp (LSILs)

CIN II

CIN III

The virus

Thập niên

Carcinoma

Tổn thương thượng mô gai mức
độ cao (HSILs)

Tầm soát
Điều trị

Hình I.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV

I.2. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA:
Epigenetics có thể được định nghĩa là những biến đổi di truyền trong sự
biểu hiện kiểu gen nhưng không đi kèm với những biến đổi trong trình tự DNA
[6]. Trong những năm gần đây, hiện tượng epigenetic đang được nhiều nhà nghiên
cứu trên thế giới quan tâm theo khuynh hướng sử dụng chúng như dấu chứng sinh

3


học (biomarker) và thực tế cho thấy có một sự liên quan hết sức chặt chẽ giữa hiện
tượng epigenetic với nhiều loại ung thư. Một trong những kiểu epigenetic được
chứng minh có tiềm năng trở thành dấu chứng sinh học cao, đó là sự bất hoạt của
các gen đè nén u (tumour suppressor gene) bằng cơ chế methyl hoá quá mức ở các
nucleotide cytosine hiện diện trong đảo CpG, và sự methyl hoá quá mức này
thường được ghi nhận tại vùng promoter hay kéo dài qua đến exon thứ nhất của
các gen nói trên.
Trong những cơng bố của những năm qua và gần đây, các tác giả đã khẳng
định: (1) Ung thư là bệnh của sự methyl hóa bất thường và (2) sự methyl hóa DNA
– là một dấu chứng sinh học tiềm năng lớn có thể dùng để tiên lượng và chẩn đốn
ung thư.
I.2.1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA:
Sự methyl hóa DNA là một biến đổi cộng hóa trị dẫn đến sự bổ sung nhóm CH3 vào vị trí carbone số 5 của Cytosine trong cặp nucleotide CpG nhờ sự xúc tác
của hệ enzyme DNA methyltransferase (DNMTs), enzyme này thúc đẩy phản ứng
chuyển nhóm -CH3 từ S-adenosylmethionine (SAM) đến Cytosine (Hình I.2). Sự
methyl hóa này là biến đổi epigenetics chính trong bộ gen động vật có vú. Khoảng
70% các cặp nucleotide CpG trong bộ gen của động vật có vú đều bị methyl hóa
[34].
I.2.2. Enzyme xúc tác:
Q trình methyl hóa DNA được thực hiện bởi một nhóm enzyme DNMTs
(Hình I.2) đã được biết đến như DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b và
DNMT3L [13]. Trong đó, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành sự methyl
hóa de novo và duy trì sự methyl hóa này là nhờ 3 enzyme DNMT1, DNMT3a,
DNMT3b. DNMT3a và DNMT3b là các de novo DNA methyltransferase có
nhiệm vụ thiết lập DNA methyl hóa đầu tiên bằng cách gắn những gốc methyl mới
vào Cytosine trong cặp CpG mà trước đó khơng bị methyl hóa, DNMT1 là
methyltransferase có nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí Cystosine trên sợi

đơn DNA vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản DNA. Do đó sự methyl hóa
4


DNA được di truyền cho các thế hệ tế bào tiếp theo nhờ vào cơ chế methyl hóa
DNA mạch khn [21]. Các enzyme này cũng góp phần vào sự methyl hóa bất
thường và dẫn đến sự phát triển của ung thư. Sự biểu hiện quá mức của gen
DNMTs ở mức độ mRNA đã được nhận thấy ở một vài bệnh ung thư, và sự biểu
hiện của DNMT1 tăng trong tế bào bình thường thì có thể gây nên sự methyl hóa
de novo bất thường ở đảo CpG. Mức độ mRNA của DNMTs được qui định một
cách khác nhau trong suốt chu trình tế bào, và sự biểu hiện DNMTs khơng phù
hợp có thể góp phần thay đổi sự methyl hóa trong các tế bào ung thư [42].

Cytosine

5 – Methylcytosine

Hình I.2: Sự bở sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp
nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)

I.2.3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư:
Sự methyl hóa có một vai trò quan trọng trong việc kiểm sốt các q trình
của tế bào như: sự phát triển phôi thai, sự phiên mã, ức chế nhiễm sắc thể X (X
chromosomes inactivation), và “in dấu bộ gen” (genome imprinting) [24]. Tuy
nhiên khi sự methyl hóa diễn ra bất thường trên các cặp nucleotide CpG thuộc
vùng promoter của gen đè nén u hay các gen liên quan đến khối u sẽ gây ra những
biến đổi có thể dẫn tới ung thư vì nó ảnh hưởng tới sự giảm hoạt tính của q trình
phiên mã các gen này. Trong một số bệnh ung thư đang được chú ý gần đây thì
người ta nhận thấy có sự gia tăng một số lượng lớn các gen đã bị methyl hóa quá
mức trên đảo CpG ở vùng promoter của gen đó [45]. Điều này củng cố hơn về vai

trò của sự methyl hóa quá mức đảo CpG trong phát sinh ung thư, và là một biểu
5


hiện sớm trong sự phát triển tế bào ung thư. Do đó sự methyl hóa DNA có thể
được sử dụng như một dấu chứng sinh học phân tử hữu ích để tiên đoán ung thư
[45].
Đảo CpG là những vùng thuộc gen có chứa nhiều cặp nucleotide CpG. Trong
bộ gen động vật có vú, đảo CpG có ít nhất khoảng 200bp và có tỷ lệ CG lớn hơn
50%. Đảo CpG thường khơng bị methyl hóa trong tế bào bình thường và được
phân bố ở gần đầu 5’ của gen [34]. Khoảng một nửa tất cả các gen của người đều
chứa đảo CpG [13] và gần đây người ta đã ước tính bộ gen người chứa khoảng
29.000 đảo CpG [45]. Cặp nucleotide CpG phân bố ngẫu nhiên trong bộ gen
nhưng đảo CpG thường nằm trong những vùng nhỏ riêng biệt của gen và khoảng
40% đảo CpG nằm trong và gần vùng promoter. Sự methyl hóa quá mức trên đảo
CpG là một hiện tượng chung trong ung thư. Sự kìm hãm quá trình phiên mã của
gen đè nén khối u bởi hiện tượng methyl hóa quá mức trên đảo CpG ở vùng
promoter của gen có thể sẽ góp phần đến sự phát sinh ung thư [34].
Hai nhóm gen chính mà khi bị đột biến trực tiếp có liên quan đến sự phát
sinh các tế bào ung thư là các gen ung thư (oncogene) và gen đè nén khối u. Trong
đó gen đè nén khối u có vai trò kiểm sốt sự phân chia tế bào và hạn chế tối đa các
đột biến hay tổn thương có thể truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp. Do đó khi hiện
tượng methyl hóa xảy ra quá mức trên đảo CpG thuộc vùng promoter của gen đè
nén khối u sẽ làm giảm sự biểu hiện của gen bằng cách ngăn chặn trực tiếp sự liên
kết với các yếu tố phiên mã hoặc chỉ đạo gen liên kết với các protein kìm hãm. Từ
đó sẽ làm bất hoạt hay làm im lặng gen này, dẫn tới tế bào sẽ phân chia liên tục và
những tổn thương được tích lũy lại dần dần hình thành ung thư (Hình I. 3).

6

Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen
Sự methyl hóa quá mức đảo CpG ở vùng promoter của gen gây ức chế quá trình phiên mã
của gen, làm cho gen im lặng dẫn đến sự phát sinh ung thư

I.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC GEN DAPK, DNMT3L, RARβ, p16INK4a, DcR1 &
2:
I.3.1. Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase):
I.3.1.1. Cấu trúc và chức năng:
Gen DAPK thuộc nhiễm sắc thể số 9 ở vị trí 9q34.1, dài khoảng hơn 210 kb
gồm 24 exon. Gen DAPK mã hóa cho cùng một protein trong khi được điều hòa
bởi hai promoter, trong đó promoter thứ nhất dài 1508 bp hoạt động mạnh hơn từ
40-50% so với promoter thứ hai-exon 1b-intron 1 dài 969 bp. Đồng thời mức độ
biểu hiện của sản phẩm phiên mã từ exon 1 cao gấp 2,4 lần so với exon 1b. Ngoài
ra, trong promoter thứ nhất còn chứa một vùng promoter tối thiểu cần cho hoạt
động đầy đủ của promoter, có chiều dài 332 bp (từ -1357 đến -1025, tính từ vị trí
khởi đầu phiên mã) chứa các vị trí liên kết với yếu tố phiên mã CP2, Sp1, MZF;
do đó khi có sự đột biến tại các vị trí này sẽ ảnh hưởng sự phiên mã của gen. Đột
biến ở vị trí liên kết CP2 (-1184) có một ảnh hưởng mạnh, làm giảm hoạt động của
gen đã được ghi nhận trên 65% trong tất cả các dòng tế bào từ khối u phổi. Ngược
lại, hoạt động của gen chỉ bị giảm khoảng 25% khi đột biến xuất hiện tại vị trí liên
kết Sp1 (-1301) hoặc MZF (-1169) [53].

7


Gia đình DAPK là một phân họ mới của các kinase serine/threonine tiền
chương trình chết (pro-apoptotic), bao gồm ít nhất năm thành viên DAPK, ZIPK
(Dlk), DRP-1, DRAK1 và DRAK2 [57]. Thành viên của gia đình được nghiên cứu
sớm và nhiều nhất là DAPK, một gen đè nén khối u có vai trò kiểm sốt chu trình

chết của tế bào. DAPK tham gia vào nhiều con đường dẫn truyền trung gian trong
chu trình tế bào nhờ các tín hiệu của con đường apoptosis như p53, Interferon-γ,
TNFα, TGF-β…[21] như là một chất điều hòa dương. DAPK cịn có vai trị quan
trọng trong sự bất hoạt chu trình tế bào tại điểm kiểm sốt nhờ vào khả năng hoạt
hóa con đường apoptosis của p53 phụ thuộc p19ARF thơng qua sự phosphoryl hóa
p19ARF. Protein p53 có vai trò ức chế chu kỳ tế bào ở pha G1, cho phép sự tham
gia của những cơ chế sửa sai DNA trước khi bước vào giai đoạn phân chia nhờ
vào sự kích hoạt q trình phiên mã hệ thống enzyme sửa chữa DNA; điều này
nhằm hạn chế tối đa khả năng các sai hỏng này được truyền cho thế hệ tế bào kế
tiếp. Nếu quá trình sửa chữa DNA thất bại thì p53 sẽ cảm ứng cho tế bào đi vào
con đường apoptosis. Protein p19ARF là một protein có vai trò trong sự tiến triển
của chu trình tế bào. Protein này liên quan đến sự hoạt hóa p53 bằng cách ức chế
protein Mdm2 (Murine double minute). Mdm2 liên kết với p53 sẽ ức chế hoạt
động phiên mã của p53, do đó bằng cách ngăn cản Mdm2, p19ARF cho phép hoạt
hóa sự phiên mã của p53 từ đó chu trình tế bào sẽ bị ngừng lại hoặc đi vào con
đường apoptosis nếu có sự sai hỏng DNA. Vì vậy, khi mất đi sự biểu hiện của
DAPK có thể dẫn đến sự bất hoạt con đường apoptosis quan trọng này trong các
khối u nên DAPK được xem như là một gen đè nén khối u liên quan chặt chẽ đến
sự xuất hiện, sự phát triển và xâm lấn của khối u.
I.3.1.2. Sự methyl hóa gen DAPK trong ung thư:
DAPK đóng vai trò quan trọng trong bệnh lí và sự di căn của khối u. Sự mất
chức năng của những gen ức chế khối u có thể xảy ra thơng qua các đột biến điểm,
sự xóa bỏ alen, sự xóa bỏ đồng hợp tử, hoặc do sự methyl hóa bất thường của
vùng promoter. Nhưng sự mất biểu hiện của DAPK thường xảy ra bởi sự methyl
hóa bất thường, mặc dù những cơ chế khác cũng đã được mô tả [60]. Sự im lặng
8


phiên mã của DAPK xảy ra trong nhiều loại ung thư khác nhau thơng qua sự
methyl hóa q mức ở những mức độ khác nhau. Sự methyl hóa quá mức DAPK là

một cơ chế chính cho sự bất hoạt DAPK trong các khối u ở người dẫn đến sự phát
triển các giai đoạn bệnh lí, tăng kích thước khối u và sự hình thành các nút bạch
huyết trong các mẫu khối u [21]. Mất đi sự biểu hiện của DAPK sẽ tạo một sự phát
triển chọn lọc có lợi cho các tế bào ung thư mà nó có thể chuyển sang sự tấn công
và phát triển khối u [53].
DAPK đã được khẳng định có liên quan đến một số bệnh ung thư trong thời
gian gần đây và tỷ lệ methyl hóa gen DAPK trên những loại ung thư đó lần lượt là:
ung thư phổi (34 %) [48], ung thư gan (52%) [68], u tủy nhiều chỗ (52,7%) [11], u
tuyến yên (34%) [59], ung thư bàng quang (48%) [61]… Riêng trong ung thư cổ
tử cung, tỉ lệ methyl hóa ở gen này khoảng 43,3% [42] và tỉ lệ methyl hóa này
trong những giai đoạn khác nhau của ung thư cổ tử cung thì khác nhau như: tổn
thương trong biểu mơ vảy cấp cao HSIL (44,5%) và trong ung thư cổ tử cung xâm
lấn ICC là 40,5% [19], đối với ung thư tế bào biểu mô vảy SCC là 61% và trong
ung thư biểu mô AC là 36% [16], theo như Zambrano và các cộng sự thì tỉ lệ
methyl hóa trên DAPK trong các mẫu khối u lên đến 100% [73]. Đặc biệt, trong tế
bào bình thường gen DAPK khơng bị methyl hóa [16].
I.3.2. Gen RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta):
I.3.2.1. Cấu trúc và chức năng:
Gen RARβ là một gen đè nén khối u mã hóa cho thụ thể RARβ. Gen RARβ
nằm trên nhiễm sắc thể số 3 ở vị trí 3p24 với kích thước khoảng 170 kb, gồm 6
exon. Trên gen RARβ có sự hiện diện của hai vùng promoter P1 và P2 ở đầu 5’ của
gen giúp phiên mã ra bốn loại mRNA khác nhau: mRNA RARβ1, mRNA RARβ2,
mRNA RARβ3, mRNA RARβ4 lần lượt mã hóa cho các thụ thể RARβ1, RARβ2,
RARβ3, RARβ4. Promoter P1 trực tiếp phiên mã cho RARβ1, trong khi đó
promoter P2 thì phiên mã cho RARβ2 và RARβ4. RARβ3 được điều hoà biểu hiện
bởi promoter P1 ở chuột nhưng lại vắng mặt ở người. Retinoids, một tập hợp các
hợp chất hóa học liên quan đến vitamin A, có nhiều vai trò quan trọng trong khắp
9

cơ thể bao gồm khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào biểu mô, tế bào của
xương; giữ vai trò quan trọng trong việc quy định sự phát triển và biệt hóa tế bào,
chức năng miễn dịch và kích hoạt gen đè nén khối u [63, 27]. Những vai trò này
được thực hiện thông qua trung gian là các thụ thể acid retinoic (Retinoid Acid
Receptors-RARs) và các thụ thể retinoid X (Retinoid X receptors-RXRs), mà các
thụ thể này có vai trò kích thích các yếu tố phiên mã trong việc đáp ứng liên kết
của một phối tử acid retinoic bằng cách gắn các yếu tố RAREs lên vùng promoter
của gen đích [63].
Những thụ thể của gia đình RARs được biểu hiện khác nhau trong suốt đời
sống sinh trưởng và phát triển của tế bào, và người ta cho rằng protein RARβ2 hạn
chế sự phát triển của nhiều loại tế bào bằng cách điều chỉnh biểu hiện của gen qua
q trình phiên mã. Trong tế bào biểu mơ bình thường, người ta nhận thấy rằng
khi được xử lí với RA thì sự điều hòa phiên mã của RARβ2 được tăng lên giúp
kiểm sốt q trình phiên mã trong nhân. Ngược lại trong các tế bào ác tính, sự
thiếu hụt RA ở các tế bào biểu mô được thể hiện thông qua sự phân bào tăng liên
tục và mất sự biệt hóa của tế bào [27].
I.3.2.2. Sự methyl hóa gen RARβ2 trong ung thư:
Sự methyl hóa quá mức trong đảo CpG thuộc vùng promoter dẫn đến sự mất
biểu hiện của gen RARβ2 đã được khảo sát trên nhiều bệnh ung thư khác nhau
như: ung thư vú [9], ung thư phổi [1], ung thư dạ dày [38], ung thư tuyến tiền liệt
[38]... Riêng trong ung thư cổ tử cung, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự
methyl hóa có thể là nguyên nhân cho sự giảm biểu hiện của gen RARβ2 trong tế
bào ung thư cổ tử cung. Cụ thể theo nghiên cứu của Ivanova và các cộng sự thì
8/20 mẫu (40%) ung thư tế bào vảy (Squamous Cell Carcinoma-SCC) bị methyl
hóa có sự giảm hoặc mất đi sự biểu hiện của RARβ2. Trong khi đó những mẫu tế
bào cổ tử cung bình thường thì RARβ2 khơng bị methyl hóa và biểu hiện bình
thường [24]. Đối với giai đoạn ung thư cổ tử cung xâm lấn thì mức độ methyl hóa
q mức của RARβ2 dao động từ 33-66% [17].
I.3.3. Gen DNMT3L (DNA methyltransferase 3-like)
10

I.3.3.1. Cấu trúc và chức năng:
Phản ứng gắn nhóm methyl (-CH3) vào vị trí Cacbon 5 của Cytosine trong
cặp nucleotide CpG được xúc tác bởi họ enzyme DNA methyltransferase mà các
enzyme này được mã hóa bởi họ gen DNA (cytosine-5-)-methyltransferase. Các
sản phẩm của họ gen này chịu trách nhiệm phần lớn trong tình trạng methyl hóa
DNA của các tế bào. Thực tế nhiều nghiên cứu đã chứng minh cho thấy có sự
methyl hóa bất thường trên một số gen đè nén khối u và gen gây ung thư dưới xúc
tác của họ enzyme DNA methyltransferase có liên quan chặt chẽ với ung thư nói
chung và ung thư cổ tử cung nói riêng [24, 9, 17] .Vì vậy, những biến đổi bất
thường trên họ gen DNMTs như sự bất hoạt hay hoạt hóa bất thường trên gen
DNMTs sẽ gây nên sự giảm biểu hiện hay sự biểu hiện quá mức của các protein
DNMTs, điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến tình trạng methyl hóa bất thường
của tế bào.
DNA methyltransferase ở Eukaryote được chia thành DNMT1, DNMT2,
DNMT3 (DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L) [6, 12, 41]. Tất cả DNMTs đều có cấu
trúc phân tử tương tự nhau. Miền xúc tác - C chịu trách nhiệm về hoạt động xúc
tác của enzyme, và có mười vùng bảo tồn đặc trưng, sáu trong số này có độ bảo
tồn cao có mặt ở gần như tất cả methyltransferases cytosine từ vi khuẩn đến các
loại nấm, thực vật, động vật có vú [38, 54]. Trong khi đó miền đi –N của
DNMTs có độ bảo tồn thấp [42] chứa các vùng tương tác khác nhau.
Gen DNMT3L nằm trên nhiễm sắc thể số 21, thuộc chuỗi dài ở vị trí 21q22.3,
có kích thước gần 16 kb gồm 12 exon và 11 intron. Vùng promoter của gen này có
chiều dài khoảng 477 nucleotide và vùng 5’ promoter của gen này khơng chứa đảo
CpG. Đặc biệt gen này có vùng promoter thiếu trình tự hộp TATA ở gần vị trí bắt
đầu phiên mã và chứa nhiều vị trí gắn yếu tố phiên mã Sp1. Gen này mã hóa cho
protein DNA methyltransferase 3L. Protein DNMT3L có chiều dài 387 acid amin
chứa các miền chức năng khác nhau như: vùng giàu cystein ATRX (αthalassemia/mental retardation syndrome, X-linked), vùng PHD (polybromo
homology domain), miền -N tương ứng trong DNMT3A và DNMT3B [33], miền 11

C chứa các vùng bảo tồn cao I, IV, VI, VIII. Protein này được biểu hiện cụ thể ở
các tế bào mầm trong thời kỳ hình thành giao tử và giai đoạn phát triển phôi thai
[8].
Protein DNMT3L không được cho là DNA methyltransferase đúng nghĩa bởi
vì trong phân tử của protein này thiếu những acid amin quan trọng cần cho hoạt
động của chính nó [8] nhưng DNMT3L đóng một vai trò quan trọng cho sự điều
chỉnh mức độ epigenetics của tế bào. Chúng cũng có vai trò methyl hóa de novo và
sẽ được hoạt hóa khi tương tác với DNA methyltransferase 3 alpha (DNMT3)/
DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3) [30]. Protein DNMT3L giúp hoat động
de novo methyltransferases bằng cách liên kết với các miền –C của DNMT3A và
DNMT3B và làm tăng mức độ hoạt động của các enzyme này dẫn đến làm tăng
khả năng bám vào DNA của DNMT3A và DNMT3B. DNMT3L có thể được xem
như là một yếu tố trao đổi chất nền cho các chức năng của DNMT3A và
DNMT3B và là một yếu tố kích thích trung gian chung cho tất cả hoạt động
methyl hóa de novo của DNMT3A và DNMT3B. Ngồi ra, protein DNMT3L
cũng có chức năng ngăn chặn sự phiên mã khi nó liên kết với (HDAC1). Các vùng
bảo tồn PHD của DNMT3L tương tác và kích hoạt HDAC1 đã cho thấy rằng
protein này cũng tham gia góp phần cùng với de-acetylation histone, tu bổ chất
nhiễm sắc và ức chế phiên mã [15].
I.3.3.2. Sự methyl hóa gen DNMT3L trong ung thư:
Một số nghiên cứu in vitro cho thấy rằng sự methyl hóa promoter DNMT3L
liên quan đến hoạt động phiên mã của gen [25]. Những biến đổi trên gen DNMT3L
có thể xảy ra như sự giảm hoặc tăng cường sự methyl hóa trên promoter DNMT3L,
có thể làm tăng hay giảm mức độ biểu hiện của gen trong các tế bào bất thường.
Với vai trò của DNMT3L trong việc điều hòa hoạt động methyltransferase,
DNMT3L xứng đáng là gen cần thiết để thành lập một mơ hình methyl hóa trong tế
bào mầm [8]. Sự methyl hóa CpG trong vùng promoter của gen DNMT3L có ý
nghĩa rất quan trọng trong sự phát triển phơi thai, khử hoạt tính nhiễm sắc thể X

[25].
12