Nghiên cứu phát hiện và khảo sát chức năng của các vi khuẩn acid lactic có nguồn gốc việt nam lên tế bào ung thư và vi sinh vật gây bệnh

Đại học Quốc gia
Thành Phố Hồ Chí Minh

hí Minh

Ch

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Tên đề tài

Nghiên cứu phát hiện và khảo sát chức năng của
các vi khuẩn acid lactic có nguồn gốc Việt Nam lên
tế bào ung thư và vi sinh vật gây bệnh.

Ngày ... tháng ...... năm ....
Chủ tịch hội đồng nghiệm thu
(Họ tên, chữ ký)

Ngày ... tháng ...... năm ....
Chủ nhiệm
(Họ tên và chữ ký)

Ngày ... tháng ...... năm ....
Cơ quan chủ quản

Ngày ... tháng ...... năm ....
Cơ quan chủ trì
(Họ tên, chữ ký, đóng dấu)

TP.HCM, tháng 03 năm 2015

MỤC LỤC
TÓM TẮT ................................................................................................................................. 1
ABSTRACT .............................................................................................................................. 2
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: LỜI GIỚI THIỆU ............................................................................................ 4
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ................................................................................................... 5
2.1 Probiotic ......................................................................................................................... 5
2.1.1 Đặc tính của probiotic ........................................................................................... 5
2.1.2 Công dụng của Probiotic....................................................................................... 5
2.1.3 Các yều cầu đối với Probiotic ............................................................................... 6
2.2 Lactic acid bacteria (LAB) ........................................................................................... 8
2.2.1. Phân loại và tính chất sinh lý của LAB .............................................................. 8
2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic ........................................ 9
2.2.3 Tác động chống ung thư........................................................................................ 9
2.3 Các sản phẩm probiotic ở Việt nam .......................................................................... 10
CHƯƠNG 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................... 11
3.1 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 11
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 11
3.2.1 Phân lập và xác định vi khuẩn ........................................................................... 11
3.2.1.1 Phân lập vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy ....................................................... 11
3.2.1.2 Định danh....................................................................................................... 12
3.2.1.2.1 Thử nghiệm sinh hoá.............................................................................. 12
3.2.1.2.2 Định danh bằng gen rRNA 16S ............................................................. 12
3.2.2 Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh và xác định sơ bộ thành phần
kháng vi sinh vật .................................................................................................................... 13
i

3.2.2.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB ................................................................ 13
3.2.2.2 Nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh........................................................................ 13
3.2.2.3 Chuẩn bị mẫu để thử kháng vi sinh vật ......................................................... 13
3.2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật .............................................................. 13
3.2.2.5 Khảo sát tính chất của bacteriocin ................................................................. 14
3.2.2.5.1 Tính nhạy cảm với nhiệt độ ................................................................... 14
3.2.2.5.2 Tính nhạy cảm với pH............................................................................ 14
3.2.2.5.3 Tính nhạy cảm với enzyme .................................................................... 14
3.2.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và môi trường pH lên quá trình sản xuất
bacteriocin ................................................................................................................................ 15
3.2.2.6.1 Nhiệt độ ủ ............................................................................................... 15
3.2.2.6.2 Môi trường pH ....................................................................................... 15
3.2.2.7 Tinh sạch bacteriocin ..................................................................................... 15
3.2.2.8 SDS-PAGE .................................................................................................... 16
3.2.2.9 Xác định amino axit đầu N ............................................................................ 16
3.2.2.10 Phát hiện gene liên quan đến bacteriocin ................................................... 16
3.2.2.11 Xác định cyclopeptide ................................................................................. 16
3.2.3 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động
lên tế bào ung thư ................................................................................................................... 17
3.2.3.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB ................................................................ 17
3.2.3.2 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư ............................................................. 17
3.2.3.2.1 Nuôi cấy tế bào ...................................................................................... 17
3.2.3.2.2 Đánh giá hoạt tính chống tế bào ung thư ở chuột (in vivo) ................... 18
3.2.3.3 Xác định sơ bộ các chất kháng ung thư ......................................................... 18
3.2.3.3.1 Polysaccharide ....................................................................................... 18

ii


3.2.3.3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do

DPPH ....................................................................................................................................... 18
3.2.4 Phân tích thống kê số liệu ................................................................................... 19
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 20
4.1 Định danh vi khuẩn ..................................................................................................... 20
4.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật ........................................................................................ 23
4.2.1 Thử kháng khuẩn ................................................................................................ 23
4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng khuẩn ........................................................... 28
4.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ................................................................................. 28
4.2.2.2 Ảnh hưởng của pH ......................................................................................... 31
4.2.2.3 Ảnh hưởng của proteinase K ......................................................................... 35
4.2.3 Xác định bacteriocin............................................................................................ 36
4.2.3.1 Tinh sạch bacteriocin ..................................................................................... 36
4.2.3.2 Xác định chuỗi bacteriocin ............................................................................ 36
4.2.4 Xác định cyclodipeptide ...................................................................................... 37
4.3 Hoạt tính kháng ung thư ............................................................................................ 39
4.3.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư của dịch nổi và exopolysaccharide..... 39
4.3.2 Cơ chế kháng ung thư ......................................................................................... 43
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 48
PHỤ LỤC.................................................................................... Error! Bookmark not defined.

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Hình thái học của vi khuẩn phân lập ................................................................ 20
Bảng 2. Định danh bằng kit API 50 CHL ...................................................................... 20
Bảng 3. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của dịch nổi Lactobacillus plantarum ở các
thời điểm ni cấy khác nhau. ................................................................................................. 23
Bảng 4. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của hoạt tính kháng khuẩn của dich nổi

Lactococcus rhamnosus ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau. ................................................ 25
Bảng 5. Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của hoạt tính kháng khuẩn của dich nổi
Lactococcus lactis ở các thời điểm nuôi cấy khác nhau. ......................................................... 26
Bảng 6. Phần trăm hoạt tính của L. plantarum sau khi xử lý nhiệt................................ 28
Bảng 7. Phần trăm hoạt tính của L. rhamnosus sau khi xử lý nhiệt. .............................. 29
Bảng 8. Phần trăm hoạt tính của L. lactic sau khi xử lý nhiệt. ...................................... 30
Bảng 9. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum. . 32
Bảng 10. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus rhamnosus.
.................................................................................................................................................. 33
Bảng 11. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactococcus lactis. ......... 34
Bảng 12. Hoạt tính ức ché nấm của các phân đoạn chiết cyclodipeptide. ..................... 38
Bảng 13. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. rhamnosus
PN04. ....................................................................................................................................... 40
Bảng 14. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. lactis
NCR112. .................................................................................................................................. 41
Bảng 15. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. plantarum
PN06. ....................................................................................................................................... 42
Bảng 16. Hoạt tính chống oxi hố của dịch nổi và exopolysaccharide L.lactis NCR112.
.................................................................................................................................................. 46

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sơ đồ, cây phát sinh loài của vi khuẩn sinh axit lactic, bao gồm một số vi
khuẩn

gram dương hiếu khí và kỵ khí ngẫu nhiên của phân nhánh G+C thấp, như là các

nhóm Aerococcus, Listeria, Stapphylococcus và Bacillus (màu xám)6. .................................... 8

Hình 2. Nội dung nghiên cứu của đề tài ........................................................................ 11
Hình 3. Phản ứng khử gốc DPPH (gốc tự do) thành DPPH-H ...................................... 19
Hình 4. Các sản phẩm PCR được khuếch đại. Từ trái sang phải: Marker, L1, L2 và L3.
.................................................................................................................................................. 23
Hình 5. Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum ở những thời điểm khác
nhau (24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ). ........................................................ 24
Hình 6. Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus rhamnosus ở những thời điểm khác
nhau (24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ). ........................................................ 26
Hình 7. Hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus lactic ở những thời điểm khác nhau
(24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 120 giờ). ................................................................. 27
Hình 8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng khuẩn của các dịch nổi của L.
plantarum (30oC; 60oC; 80oC; 100oC; 121oC). ........................................................................ 29
Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng khuẩn của các dịch nổi của L.
rhamnosus (30oC; 60oC; 80oC; 100oC; 121oC). ....................................................................... 30
Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng khuẩn của các dịch nổi của L.
lactic (30oC; 60oC; 80oC; 100oC; 121oC)................................................................................. 31
Hình 11. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum.33
Hình 12. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus rhamnosus.
.................................................................................................................................................. 34
Hình 13. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng khuẩn của Lactococcus lactis. ......... 35
Hình 14. Tinh chế các bacteriocin ................................................................................. 36
Hình 15. Sản phẩm PCR của các gene tham gia sinh tổng hộp Nisin của Lactococcus
lactis. Từ trái sang phải: NisA, NisB, NisC, NisI, NisT, NisK tương ứng với các giếng 1,
2,3,5,6,7. Giếng 4: đối chứng âm. ............................................................................................ 37
v


Hình 16. Hoạt tính ức ché nấm của các phân đoạn chiết cyclodipeptide. ..................... 38
Hình 17. Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao. ................................................................ 39
Hình 18. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. rhamnosus

PN04. ....................................................................................................................................... 41
Hình 19. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. lactis NCR112.
.................................................................................................................................................. 42
Hình 20. Tác động độc tế bào của dịch nổi và exopolysaccharide của L. plantarum
PN06. ....................................................................................................................................... 43
Hình 21. Mức độ biểu hiện mRNA của IL-12 sau khi sử dụng EPS ở chuột. ............... 44
Hình 22. Hoạt tính chống oxi hố của dịch nổi và exopolysaccharide của Lactobacillus
rhamnosus PN04. ..................................................................................................................... 45
Hình 23. Hoạt tính chống oxi hoá của dịch nổi và exopolysaccharide L.lactis NCR112.
.................................................................................................................................................. 46

vi


TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này, những chủng vi khuẩn acid lactic (LAB) có tên là Lactococcus
lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và
kháng ung thư. Hoạt tính kháng khuẩn của LAB trên vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng
phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Tất cả những chủng vi khuẩn có khả năng ức chế
Staphylococcus aureus, Pseudomnas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi,
Candida albicans. Riêng chủng Lactobacillus plantarum có khả năng kháng Vibrio
parahemolyticus, Vibrio haryi. Tác động kháng khuẩn là do bacteriocin được sản xuất ra từ
LAB. Các bacteriocin đã được tinh chế bằng phương pháp dựa vào tính bền nhiệt độ, khả
năng kết tủa với ammonium sulfate, lọc gel và kết hợp với ultrafiltration. Độ tinh sạch và
khối lượng phân tử của các bacteriocin được xác định bằng SDS-PAGE. Vì lý do kinh phí
nên một bacteriocin của Lactobacillus plantarum đã được xác định thành phần aminoaxit đầu
N bằng phương pháp Edward degredation. Bằng phương pháp phân tích sự đồng nhất của
chuỗi protein dựa trên Blast search, kết quả bacteriocin xác định này có độ tương đồng với
plantaricin. Nghiên cứu cũng xác định được cyclopeptide có tính kháng nấm Penicillium
citrinum Khả năng kháng tế bào ung thư là Hela, HepG2 và MCF-7 được phát hiện thông qua

phương pháp thử invitro với SRB. Khả năng kháng ung thư trên chuột gây ung thư cũng đã
được thử nghiệm. Tác động chống oxi hoá của EPS cũng được xác định để xem mối liên
quan với tác động kháng ung thư. Tác động này kháng ung thư một phần là do khả năng kích
thích hệ miễn dịch thơng qua việc sản xuất Interleukin-12 của exopolysaccharide của vi
khuẩn được phát hiện được bằng phương pháp realtime RT-PCR.Tuy nhiên, EPS của
Lactobacillus plantarum cho kết quả chống oxi hoá rất yếu. Từ kết quả thu được, nghiên cứu
này đã thành công trong việc phát hiện khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư của những vi
khuẩn LAB được phân lập từ thực vật và đạt mục tiêu đề ra.
Từ khoá: Vi khuẩn sinh axit lactic, hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, bacteriocin,
cyclodipeptide

1


ABSTRACT
In this study, the lactic acid bacteria (LAB) including Lactococcus lactis, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus rhamnosus showed antibacterial activity and anticancer. Their
antibacterial activity on indicator bacteria was determined by agar-well diffusion asssay. All
LAB strains were capable of inhibiting the growth of Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi and Candida albicans. Especially,
Lactobacillus plantarum has expressed its antibacterial activity on Vibrio parahemolyticus
and Vibrio haryi. LAB produced bacteriocin that gave them antibacterial activity. The
bacteriocin was purified by the method based on thermal stability, ability of ammonium
sulfate precipitation, gel filtration and combined with ultrafiltration. Purity and molecular
weight of the bacteriocin was determined by SDS-PAGE. Bacteriocin of Lactobacillus
plantarum was identified amino acid sequence of N-terminal by the Edward degradation
method, however, Lactococcus lactis and Lactobacillus rhamnosus were not identified
because a reason of funding. By homogeneity of protein analysis methods based on NCBI
Blast search, the results indicated that a determined bacteriocin was similar with plantaricin.
The study also detected cyclodipeptide affecting on Penicillium citrinum. Hela, HepG2 and

MCF-7 showed anticancer activities, which were detected in-vitro by SRB. Anticancer
activities were also tested in mouse cancer models. Antioxidant effects of EPS were
determined to investigate the relationship with anticancer effects. This impact was resistant to
anticancer because of enabling to stimulate the immune system through the production of
interleukin-12 by bacterial exopolysaccharide, which was detected by real time RT-PCR.
However, EPS of Lactobacillus plantarum gave a result of very weak antioxidants. As these
results, this study was successful in detecting antibacterial, anticancer of LAB bacteria
isolated from plants according to the proposal aims.
Keywords: Lactic acid bacteria, antibacterial activity, anticancer, bacteriocin,
cyclodipeptide

2


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn Đại học quốc gia đã tài trợ cho đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học của trường Đại học quốc
tế TP.HCM đã tạo điều kiện để thực hiện nghiên cứu này.
Xin chân thành cảm ơn Viện kiểm nghiệm thuốc đã có tạo điều kiện trong việc thực
hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Hiroshima đã có tạo điều kiện trong việc thực
hiện đề tài.

3


CHƯƠNG 1: LỜI GIỚI THIỆU
Vi khuẩn acid lactic (LAB) là vi khuản Gram dương, có các sản phẩm được sử dụng
trong nhiều trong thương mại như các acid vô cơ, acid hữu cơ, bacteriocin và sản xuất
exopolysaccharide1, 2, 3, 6. Những vi khuẩn này ức chế vi khuẩn có hại sống ở thức ăn như thịt,

cá, tơm. Ngồi ra, vi khuẩn được sử dụng trong thức ăn hàng ngày và rau quả lên men một
cách không ý thức. Những năm gần đây, nhu cầu tiêu dùng khơng chỉ có xu hướng tăng cao
về việc sử dụng vi khuẩn phục vụ trong việc tạo mùi hương cho thực phẩm mà còn dựa trên
khía cạnh lợi ích về phục hồi sức khỏe và điều trị bệnh23. Những hoạt tính ức chế của LAB là
do khả năng sản xuất các chất chuyển hoá khác nhau. Những chất này là acid vô cơ như lactic
acid và những chất giống như acetic acid, H2O2, bacteriocin, những chất giống bacteriocin,
diacetyl và CO217. Việc nghiên cứu những chất có nguồn gốc tự nhiên và an tồn cho trong
việc duy trì sức khỏe và để ngăn ngừa bệnh tật là cần thiết. Do đó, phát hiện những chủng vi
khuẩn mới với những đặc tính ưu việt hơn thì ngày càng được quan tâm do tính năng của
những vi khuẩn LAB sống trong đường ruột của người, sữa, nước bọt cịn nhiều yếu điểm
như độ sống sót trong các dạng bào chế thuốc, thực phẩm. Các thành phần như enzyme, các
hợp chất polymer ở LAB chưa được nghiên cứu sâu. Mới đây, có vài nghiên cứu về nhóm
LAB có thể được dùng trong điều chế vaccine, trị cholesterol, trị ung thư. Tuy nhiên, những
nghiên cứu này chỉ mới là bắt đầu.
Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi đã tập trung vào việc phân lập LAB có nguồn
gốc từ thực vật nhằm phát huy những đặc điểm của những chủng vi khuẩn này do sự thích
nghi trong hồn cảnh sống phức tạp của những vi khuẩn này. Để từ đó, tạo ra những probiotic
tốt hơn với những thành phần có khả năng ứng dụng cao hơn cho con người.
MỤC TIÊU:
▪

Phát hiện hoạt tính kháng khuẩn

▪

Phát hiện hoạt tính kháng ung thư

4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 Probiotic
2.1.1 Đặc tính của probiotic
Có nhiều vi sinh vật có lợi được tìm thấy trong ruột người. Những vi khuẩn này tạo nên
nguồn probiotic được sử dụng nhiều trong thực phẩm. Chúng được sử dụng như thuốc bổ
sung hay thay thế (CAM)6. Probiotic có thể đóng vai trị trong miễn dịch, tiêu hố và có ảnh
hưởng lớn đến việc trị những bệnh nhiễm trùng ở trẻ em.
Một nhà khoa học người Nga, Parker đoạt giải Nobel làm việc tại Viện Pasteur đã đề
nghị tính phụ thuộc của vi khuẩn đường ruột trên thức ăn và làm cho nó thay thế nguồn vi
khuẩn hại. Từ "probiotic" khơng được quan tâm mãi đến 196019. Sau đó, Parker đã xác định
probiotic tham gia vào cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột. Tuy nhiên, Fuller đã lọc lại
probiotic là vi khuẩn sống tác động có lợi lên động vật bằng cách cải thiện sự thăng bằng vi
khuẩn đường ruột11,23. Cho đến ngày nay, chế phẩm sinh học (probiotic) được đinh nghĩa như
là các vi sinh vật sống, và nếu được sử dụng với một lượng thích hợp, đều gây ra ảnh hưởng
đến sức khỏe của sinh vật chủ23.
Một số nghiên cứu đã trực tiếp sử dụng các vi khuẩn được phân lập từ hệ tiêu hóa như
các probiotic27. Có nhiều loại vi sinh vật đã được tận dụng làm probiotic không chỉnh những
vi khuẩn sinh axit lactic (Lactobacilli, Streptococci, Enterococci, Lactococci, Bifidobacteria)
mà còn là những dòng Bacillus và nấm (Saccharomyces hay Aspergillus). Hiện nay, một số
loài thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium là được sử dụng nhiều. Những quan tâm về
môi trường đường ruột là cần thiết để có thể hiểu được các ứng dụng của probiotic đến sức
khỏe của con người23, 24.
Probiotic là được sử dụng rất phổ biến nhưng cách tiếp cận này có thể gặp nhiều khó
khăn liên quan đến khả năng sống sót trong hệ sinh thái đường ruột và trong động vật chủ. Để
tồn tại trong điều kiện cơ thể, vi khuẩn phải vượt qua một số rào cản vật lý và hóa học trong
đường tiêu hóa, bao gồm axit dạ dày và các dịch tiết axit mật.
2.1.2 Cơng dụng của Probiotic
Có nhiều ngun nhân con người thích dùng probiotic. Tuy nhiên, LAB được chỉ định
dùng trong:
•

Ngăn ngừa và xử lý tiêu chảy, bao gồm cả tiêu chảy do nhiễm khuẩn.
5


•

Phục hồi môi trường vi khuẩn thân thiện bị phá hủy bởi việc sử dụng thuốc
kháng sinh.

•

Tăng cường tiêu hóa và ngăn chặn vi khuẩn có hại.

•

Ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn có hai trong ruột.

•

Làm giảm sự nhiễm khuẩn âm đạo và đường tiết niệu.

•

Tăng khả năng tiêu hóa, hấp thu lactose ở người khơng có khả năng dung nạp
lactose.

•

Tăng cường khả năng miễn dịch.

•

Làm giảm các bệnh do dị ứng, ví dụ hen suyễn, sốt mùa hè, dị ứng thực phẩm
và bệnh ở da như eczema.

•

Ngăn ngừa ung thư ruột và nhiễm khuẩn Helicobacter pylori, loại vi khuẩn gây
lây lan nhiễm loét.

2.1.3 Các yều cầu đối với Probiotic
Probiotic có thể được sử dụng làm chế phẩm bổ sung để cung cấp vi khuẩn sống cho
quá trình tiêu hóa qua đường uống. Để có được những lợi ích này chúng phải:
•

Được dùng đúng dịng vi khuẩn, có nguồn gốc từ con người, sống trong ruột.

•

Đầy đủ số lượng. Liều lượng dùng thấp nhất mỗi ngày phải từ 108-109 tế bào.

•

Khơng đưa vào cơ thể những vi khuẩn cơ hội gây bệnh như: Samonella typhi,
Escherichia coli… và có khả năng sống sót trong mơi trường ruột, nơi có pH từ
1 đến 4.

•

Có khả năng sống sót ở ruột non, nơi nồng độ muối mật có thể lên đến 2%. Khả
năng dung nạp acid và dịch mật tùy thuộc vào từng chi, họ và lồi. Hầu hết vi
khuẩn có nguồn gốc từ người đều có khả năng tồn tại trong môi trường acid và
dịch mật. L. rhamnosus và L. plantarum là hai loại vi khuẩn có khả năng dung
nạp này tốt nhất; trong khi L. bulgaricus khơng có khả năng sống trong mơi
trường này.

•

Có khả năng kháng lại kháng sinh vì probiotics là những vi khuẩn sống được
dùng làm chế phẩm bổ sung, chúng có thể bị mất đi do việc sử dụng thuốc
6


kháng sinh do tiêu chảy. Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn được dùng làm probiotic
đều không được chuyển gene đề kháng kháng sinh sang vi khuẩn khác, đặc biệt
là những vi khuẩn có hại. Điều này có thể xảy ra giữa những vi khuẩn qua con
đường tự nhiên hay nhân tạo.
Vì vậy, những vi khuẩn probiotic đạt u cầu phải:
•

Đựơc xác định đúng chi, họ, lồi.

•

Đầy đủ số lượng.

•

Có khả năng dung nạp axit và dịch mật.

•

Có khả năng kết dính trong ruột người.

•

Có khả năng đề kháng kháng sinh26.

•

Khơng chuyển gene đề kháng kháng sinh sang vi khuẩn khác.

•

Khơng chứa vi khuẩn cơ hội gây bệnh độc hại.

Mặc dù đã có một số tiêu chuẩn của một probiotic, khơng một probiotic nào có khả
năng sở hữu tất cả các thuộc tính nói trên. Hơn nữa, các thuộc tính của probiotic là đặc trưng
theo dòng vi sinh vật, và các kết quả của dịng probiotic này khơng thể phản ánh tính chất của
dịng khác, thậm chí là đối với dịng liên quan mật thiết. Vi khuẩn được sử dụng như các sản
phẩm của probiotic bao gồm các dòng vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium, vi khuẩn
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcuslactis, Leuconostoc mesenteroides,
Pediococcusacidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Bacillus
cereus, Propionibacterium freudenreichii, Saccharomyces cerevisiae, và Saccharomyces
boulardii. Tuy nhiên, chỉ có Lactobacilli và Bifidobacteria là hai chủng vi khuẩn được sử
dụng phổ biến nhất cho con người.
Mặc dù Lactobacilli được phân loại như là các vi khuẩn thuộc nhóm GRAS, điều quan
trọng là vẫn phải đánh giá độ an toàn của những vi khuẩn này bởi vì tính kháng thuốc nghiêm
trọng của các chủng vi khuẩn này đôi khi đã được báo cáo. Các chủng vi sinh vật làm

probiotic có thể chuyển gen kháng vào các vi khuẩn gây bệnh. Do đó, các tính chất nhạy cảm
với thuốc, đặc biệt là tính nhạy cảm với các kháng sinh của các chủng làm probiotic trên thị
trường cần được kiểm tra mạnh mẽ. Mặc dù chủng Lactobacilli được dùng nhiều trong việc
bảo vệ một cách có hiệu quả sức khỏe con người, vẫn có một bằng chứng rõ ràng cho rằng
Lactobacilli từ các nguồn gốc khác nhau mang các đặc tính của probiotic ở các mức khác
7


nhau. Để tồn tại và nhân giống trong hệ tiêu hóa, vi khuẩn nên thể hiện mức chịu đựng ở cấp
độ cao đối với môi trường axit và dịch mật, và cũng như thể hiện khả năng bám dính bề mặt
thành ruột. Sự kháng kháng sinh của những vi khuẩn gây bệnh đang là một vấn đề y tế ngày
càng gia tăng, và cũng dấy lên những câu hỏi về việc kiểm tra tính nhạy cảm của kháng sinh.
Do đó, chúng ta nên nghiên cứu phát triển các chủng vi sinh vật mới và đánh giá độ an toàn
cùng những thuộc tính của probiotic nhằm tạo những probiotic hứa hẹn.
2.2 Lactic acid bacteria (LAB)
2.2.1. Phân loại và tính chất sinh lý của LAB
LAB là các trực khuẩn và cầu khuẩn gram dương, khơng hình thành bào tử, là các vi
khuẩn yếm khí địi hỏi lên men carbohydrate và chủ yếu sản xuất axit lactic trong suốt quá
trình lên men đường. Mặc dù có sự thay đổi thường xuyên trong sự phân loại LAB, các chi vi
khuẩn vẫn được chấp thuận rộng rãi bao gồm: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,
Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Treptococcus, Tetragenococcus,
Vagocccus và Weissella (Hình 1).

Hình 1. Sơ đồ, cây phát sinh loài của vi khuẩn sinh axit lactic, bao gồm một số vi khuẩn
gram dương hiếu khí và kỵ khí ngẫu nhiên của phân nhánh G+C thấp, như là các nhóm
Aerococcus, Listeria, Stapphylococcus và Bacillus (màu xám)6.

8

Thông thường,vi khuẩn LAB là những vi khuẩn sống trong mơi trường có nhiệt độ vừa
phải, nhưng chúng cũng có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 đến 45C, và có thể sống tốt trong cả
hai mơi trường axit và kiềm. Chúng sản xuất một loạt các sản phẩm, chủ yếu là các axit hữu
cơ, rượu và carbon dioxide, mặc dù chúng thường tạo ra các phân tử thơm, vitamin và peptide
hoạt tính sinh học. Các axit hữu cơ (lactic, axetic và propionic axit) có tác dụng đối kháng
trong đường ruột nhờ sự ức chế của các quá trình vận chuyển tích cực, các phản ứng và việc
sửa đổi điện thế màng của chúng. Sự thiếu enzyme catalase của LAB gây ra sự tích tụ
hydrogen peroxide (H2O2), có khả năng ức chế vi khuẩn và nấm5.
Một số dòng LAB mới có khả năng sản xuất hợp chất protein với tính chất đáng chú ý
trong việc kháng khuẩn, được biết đến như là các bacteriocin.
2.2.2 Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic
Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn sinh axit lactic là gây ra bởi các loại protein kháng
khuẩn (bacteriocin), được sản xuất bởi các vi khuẩn, có khả năng giết chết hay tác động ức
chế khả năng phát triển của vi khuẩn. Các dòng vi khuẩn sản xuất ra một hay nhiều chất
kháng khuẩn, trong đó có dicyclic peptide và bacteriocin. Nhiều vi khuẩn sinh axit lactic
được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cũng sản xuất ra bacteriocin. Thật vậy,
bacteriocin có thể được xem như một hệ thống miễn dịch bẩm sinh có thể giúp thực phẩm để
tự bảo vệ chống lại sự nhiễm khuẩn và/hoặc là kết quả tự nhiên của hệ đường ruột. Mặc dù
bacteriocin được xác định nhiều ở một số chủng như Lactobacoccus lactis, Lactobacillus
rhamnosus, Enterococcus sp, Lactobacillus plantarum, các bacteriocin có thể khác nhau ở
những chủng có nguồn gốc khác nhau. Lợi ích của những bacteriocin này là peptide có kích
thước nhỏ, hoạt động của chúng trực tiếp hướng đến màng tế bào, dễ tiêu hóa trong ruột của
con người, không độc hại và không gây ra bất kỳ dị ứng nào. Vì những tính chất này, các hoạt
tính kháng khuẩn cũng được yêu cầu trong các chế phẩm sinh học16, 28, 36. Một loại peptide có
phân tử lượng nhỏ khác là cyclodipeptide mới đây cũng đã được phát hiện ở vi khuẩn sinh
axit lactic. Các cyclodipeptide này cũng có tính kháng khuẩn, kháng nấm, đặc biệt các
cyclodipeptide có proline tham gia tác động kháng ung thư.
2.2.3 Tác động chống ung thư
Mới đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung những đặc tính kháng ung thư và oxi hố nhằm
ngăn ngừa bệnh cho con người5. Mặc dù những chất tổng hợp có hoạt tính kháng ung thư và

kháng oxi hố19, 41, 47, những chất này khơng những đắt mà tính bền và an tồn vẫn cịn nghi
9


ngờ37. Nhiều báo cáo nói rằng LAB trong sữa có hoạt tính chống ung thư14, 33. Qua thử
nghiệm in vitro, hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư của LAB sau khi diệt bằng nhiệt.
Lactobacillus acidophilus và Lactibacillus casei có tác động trên dòng tế bào ung thư
ruột LS-51337. Cũng có những nghiên cứu sử dụng mơ hình chuột để nghiên cứu LAB trong
tác động kháng ung thư ruột26.
EPS của Bifidobacteria và Lactobacilli tham gia vào việc ngăn ngừa bệnh ung thư, tăng
khả năng miễn dịch và làm giảm những men gây đột biến như β-glucuronidase,
nitroreductase and chologlycine hydrolase42, 46. EPS của LAB cịn cải thiện việc phóng thích
thuốc trị ung thư.
2.3 Các sản phẩm probiotic ở Việt nam
Việc sử dụng các probiotic như các loại thuốc điều trị đã được sử dụng rộng rãi như để
tăng cường sức khỏe cho con người ở Việt Nam38. Mặc dù probiotic đã được biết đến và đã
được sử dụng trên toàn thế giới nhưng những đánh giá về chất lượng ở Mỹ và châu Âu đã chỉ
ra mối tương quan nghèo nàn giữa những nội dung công bố và nội dung thực tế. Vì thành
phần của hệ sinh vật đường ruột vẫn chưa được biết đến hết, sự hiểu biết về các chức năng
probiotic đã bị cản trở.
Ngoài ra, các sản phẩm tinh sạch của probiotic chưa được triển khai. Do đó, nghiên cứu
và khai thác các thành phần của probiotic là cần thiết.

10


CHƯƠNG 3: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG
PHÁP
3.1 Nội dung nghiên cứu
Probiotic được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và ngành Dược. Nghiên cứu các chất

kháng khuẩn và kháng ung thư là cần thiết. Vì vậy, nội dung nghiên cứu như hình 2.
Phân lập và xác định được vi khuẩn axit lactic có
nguồn gốc Việt nam

Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh

Khảo sát tác động lên tế bào ung thư

Khảo sát sơ bộ các thành phần tác động lên tế bào
ung thư và vi sinh vật gây bệnh
Hình 2. Nội dung nghiên cứu của đề tài
3.2 Phương pháp nghiên cứu
Để thực hiện các nội dung nghiên cứu đặt ra, phương pháp nghiên cứu được đặt ra theo thứ tự
như sau:
-

Phân lập và xác định vi khuẩn sinh axit lactic

-

Khảo sát tác động và xác định sơ bộ thành phần tác động lên vi sinh vật gây bệnh

-

Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động lên tế bào
ung thư

3.2.1 Phân lập và xác định vi khuẩn
3.2.1.1 Phân lập vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy
Rau củ và thực phẩm được thu thập ở thành phố Hồ chí minh. Nguồn này được vận

chuyển đến phịng thí nghiệm của trường Đại học quốc tế.
11


Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic theo Schillinger và Rodriguez, sử
dụng môi trường thạch de Man Rogosa Sharpe (MRS) hoặc lỏng (Merck, Darmstadt,
Germany). Cụ thể là, 10g mẫu được trộn với 90 ml NaCl (0.9%) để có tỉ lệ 1/10. Các dung
dịch được lắc trong 10 phút để đồng nhất tất cả các chất khơng hịa tan. Sử dụng 1 ml dung
dịch pha loãng trải đều trên thạch MRS và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 30 °C trong 48 giờ 31
để phân lập. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng tiếp tục cấy truyền trên thạch MRS để làm thuần.
Các khuẩn lạc thuần khiết được kiểm tra bằng kính hiển, phản ứng catalase, khả năng di
động, hình dạng, kích thước và màu sắc, thử hoạt tính kháng khuẩn. Các khuẩn lạc có hoạt
tính kháng khuẩn sẽ được định danh bởi các đặc tính sinh hóa bởi bộ kit API CHL 50
(BIOMERIEUX, Lyon, Pháp) và được giải trình tự gen rRNA 16S.
3.2.1.2 Định danh
3.2.1.2.1 Thử nghiệm sinh hoá
Bộ kit API 50CH (API Laboratory Products Ltd. Biomerieus Saa, France) đã được sử
dụng để xác định quá trình chuyển hố của một số men và carbohydrate. Thí nghiệm được
thực hiện tại 37oC. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đã được xác định sau 24 - 48 giờ theo chỉ
dẫn của bộ kit API 50CH để xác định các chủng vi khuẩn. Các khuẩn lạc được cho vào ống
API 50 CHL của bộ kit cho đến khi độ đục đã được điều chỉnh đến 2,0 McFarland thì dịch
treo này sẽ được cho đầy vào các giếng của bộ kit. Parafin được cho vào từng giếng và ủ ở
30oC. Kết quả đã được quan sát quá trình tạo axit và ghi nhận sau 24h và 48h. Kết quả dương
tính nếu axit tạo được làm cresol đổi màu tím thành màu vàng hoặc xanh tuỳ theo mức độ.
3.2.1.2.2 Định danh bằng gen rRNA 16S
3.2.1.2.2.1 Chuẩn bị DNA
Khuẩn lạc của vi khuẩn cần được phân lập được nuôi trong MRS trong 48 giờ. Sau đó,
tủa vi khuẩn được thu lại để chiết 16S rRNA theo phương pháp hướng dẫn của Takara.
3.2.1.2.1.2 Thực hiện PCR và giải trình tự
Phản ứng PCR được thực hiện bằng phương pháp Newton and Graham trên máy PCR

(Eppendorff). Mỗi ống phản ứng có thể tích 50 µl gồm 1x amplification buffer (50 mM KCl,
10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 và 0.1% Triton X-100, Takara, Co. Ltd.), 200 µmol
dNTP (Takara Co.Ltd.), 20 pmol mồi và Taq polymerase 1U (Takara Co. Ltd.), 200 ng DNA.

12


Phản ứng được thực hiện như sau: 1 cycle/5 phút/95oC, sau đó là 35 cycle và mỗi cycle là 1
phút/95oC, 2 phút/55oC và 2 phút/72oC. Sau chu kỳ 35, phản ứng được để thêm 15 phút/72oC.
Sản phẩm PCR được tinh chế và được giải trình tự ở cơng ty Nam Khoa Biotek. Trình
tự của những chủng cần xác định được so sánh với trình tự của những chủng có nguồn gốc
gần dựa trên dữ liệu trình tự gene trong GenBank.
3.2.2 Khảo sát tác động lên vi sinh vật gây bệnh và xác định sơ bộ thành phần kháng
vi sinh vật
3.2.2.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB
LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics,
Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí (pH 6.5). Đo OD tại bước sóng
600 nm sau mỗi 2 giờ để từ đó xác định giai đoạn tăng trưởng.
3.2.2.2 Nuôi cấy vi sinh vật gây bệnh
Một khuẩn lạc đơn thuần của vi sinh vật gây bệnh được cấy truyền trong 10 ml LB lỏng
ở 37oC trong 24 giờ15. Các chủng chỉ thị được thử nghiệm ở 6 nồng độ pha loãng từ 10-1-10-6.
Theo phương pháp của Deegan et al. (2006), vi khuẩn đối chứng hoặc vi khuẩn chỉ thị được
nuôi cấy trên môi trường NA trên đĩa petri sau đó bổ sung dịch vi khuẩn đối chứng trên một
lỗ thạch đục lỗ (d=5mm), nhằm so sánh với các lỗ thạch chứa dịch khuẩn LAB trong điều
kiện ủ các đĩa ở 37oC trong 24 giờ.
3.2.2.3 Chuẩn bị mẫu để thử kháng vi sinh vật
LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics,
Beauvais, India) và được ủ ở 37oC. Những dịch ni cấy vi khuẩn này sau đó được thu nhận
ở các giai đoạn ủ khác nhau và được ly tâm 10.000 rpm trong 30 phút để tách vi khuẩn và
dịch nuôi. Phần nước trong của dịch sau ly tâm được bổ sung enzyme catalase (Sigma

Chemical Co., Dorset, England) với nồng độ 100U để loại trừ ảnh hưởng của hydrogen
peroxide trước khi thử kháng vi sinh vật. Phần kết tủa được rửa sạch với nước cất vô trùng 3
lần để loại bỏ hoàn toàn phần dịch sau ly tâm. Tiếp theo đó, phần kết tủa này được sử dụng
để kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của LAB.
3.2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật
Đối với phần dịch nổi, tính kháng vi sinh vật được kiểm tra bằng phương pháp khuếch
tán trên thạch17. Nhỏ 20 µl dịch huyền phù vi sinh vật gây bệnh và quét đều trên bề mặt
13


thạch. Lấy 40 µl phần dịch nổi thu được sau ly tâm của LAB để nhỏ vào mỗi giếng của đĩa
thạch.
Đối với phần kết tủa, các đĩa giấy vô trùng (Whatman paper) (đường kính 5 mm) được
ngâm với mỗi kết tủa và rồi được đặt trực tiếp lên đĩa petri đã trải vi sinh vật gây bệnh.
Các đĩa petri sau đó được ủ qua đêm ở 37oC. Sự xuất hiện vịng vơ khuẩn xung quanh
giếng cho thấy dấu hiệu kháng khuẩn.
Vòng tròn kháng khuẩn quanh giếng và đĩa được đo bằng thước đo vịng kháng theo
đơn vị milimet. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.2.2.5 Khảo sát tính chất của bacteriocin
3.2.2.5.1 Tính nhạy cảm với nhiệt độ
Để kiểm tra tính chất này, 1ml dịch nổi của LAB được để tại nhiệt độ phòng, 60°C,
80oC trong 30 phút, và 100oC trong 20 phút, and 121oC trong 15 phút27, 29, 45. Tiến hành kiểm
tra hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch nổi sau khi xử lý qua các nhiệt độ bằng phương
pháp khuếch tán trên giếng thạch. Mỗi thí nghiệm có độ lặp lại 3 lần.
3.2.2.5.2 Tính nhạy cảm với pH
Để kiểm tra tính nhạy cảm với pH, 1ml dịch nổi của LAB được bổ sung với NaOH
0.1N và HCl 0.1N để được các giá trị pH khác nhau (2, 3, 4, 5, 7, 9) 27, 29, 45. Những dịch này
được tiến hành kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
Môi trường MRS lỏng được sử dụng như là mẫu chứng âm. Mỗi thí nghiệm có độ lặp
lại 3 lần.

3.2.2.5.3 Tính nhạy cảm với enzyme
Dịch trong của LAB được bổ sung với enzyme proteinase K (pH 7, Sigma, Singapore)
nồng độ 2 mg/ml, ở 37°C trong 2 giờ và sau đó được xử lý với nhiệt độ 100oC trong 5 phút.
Những dịch này sau khi đã được xử lý này được tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh
vật bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch.
Mẫu không xử lý với enzyme như trên được sử dụng làm mẫu đối chiếu. Mỗi thí
nghiệm được tiến hành 3 lần.

14


3.2.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và môi trường pH lên quá trình sản xuất
bacteriocin
3.2.2.6.1 Nhiệt độ ủ
Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và sản xuất
bacteriocin, các vi khuẩn LAB sinh trưởng đến pha cân bằng trong chu kỳ phát triển của vi
khuẩn LAB với tỷ lệ 1% (v/v, 105 - 106 CFU/ml) trong môi trường MRS lỏng và được ủ ở các
nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng, 37oC, 40oC và 50oC) 13. Phần dịch nổi của LAB đã được
xử lý này sau đó được sử dụng vào q trình kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật. Mỗi thí
nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.2.6.2 Môi trường pH
Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường pH lên sự sinh trưởng và sản xuất
bacteriocin, LAB sinh trưởng đến pha cân bằng trong mơi trường MRS có bổ sung pH (2, 3,
4, 5, 7, 9)

13

. Sau đó, các dịch xử lý pH được kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật. Mỗi thí

nghiệm lặp lại 3 lần.

3.2.2.7 Tinh sạch bacteriocin
Ni cấy LAB trong 1000 ml MRS ở 37C đến pha cân bằng. Thu phần dịch nổi của
dịch nuôi cấy LAB qua ly tâm 10000 rpm trong 15 phút ở 4C, sau đó điều chỉnh độ pH của
những phần nước trong này tới pH3 bằng HCl 0.1N. Dịch trong nuôi cấy được ủ ở 100oC
trong 20 phút. Ammonium persulfate đã được bổ sung từ từ vào dịch vô khuẩn ở trên và được
khuấy liên tục để đạt được 40% độ bão hòa và hỗn hợp được giữ lạnh ở 4C, qua đêm. Hỗn
hợp này được ly tâm ở 10000 rpm trong 30 phút ở 4C, hòa tan lượng kết tủa thu được trong
nước vơ trùng. Phần dịch nổi sau đó đã được bổ sung ammonium persulfate đến mức bão hòa
60 và 80%. Các kết tủa của mỗi trường hợp đã được xử lý này tiếp tục được hòa tan trong
nước được khử trùng như mô tả ở trên sau khi ủ qua đêm ở 4C. Sử dụng 160 µl của những
phần dịch nổi và cả phần dịch nổi để phát hiện hoạt tính kháng vi sinh vật. Phân đoạn có hoạt
tính sẽ được tinh chế qua cột lọc gel Sephadex và ultrafiltration. Các bacteriocin được kiểm
tra độ sạch và xác định khối lượng phân tử bằng SDS-PAGE. Mỗi thử nghiệm được thực hiện
trong ba lần.

15


3.2.2.8 SDS-PAGE
Trọng lượng phân tử của bacteriocin tinh khiết của dòng L. rhamnosus PN04 và L.
lactis PN05, L. plantarum PN06 được xác định bằng cách sử dụng điện di dedocylsulphatepolyacrylamide (SDS-PAGE; 15% discontinuous gel) 43. Trọng lượng phân tử của bacteriocin
được xác định dựa vào protein marker (10 – 200 kDa).
3.2.2.9 Xác định amino axit đầu N
Bacteriocin tinh sạch sẽ được chuyển lên màng PVDF bằng phương pháp Trans-Blot.
Màng PVDF được gửi sang Nhật để xác định amino axit đầu N bằng phương pháp Edward
degradation.
3.2.2.10 Phát hiện gene liên quan đến bacteriocin
Để xác định sơ bộ các bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic phân lập được có
giống với các vi khuẩn lactic cùng chủng loại, các gene này được xác định nhờ phương pháp
PCR, với thiết kế các cặp mồi dựa trên các đoạn gene liên quan đến bacteriocin được xác

định trên NCBI. Đối với Lactococcus lactis, dùng các cặp mồi của NisA, NisB, NisC, NisK,
NisT, NisI. Đối với Lactobacillus rhamnosus và Lactobacillus plantarum, dùng các cặp mồi
ứng cới rhamnosin và plantaricin. Phản ứng PCR được thực hiện bằng phương pháp Newton
and Graham trên máy PCR (Eppendorff). Mỗi ống phản ứng có thể tích 50 µl gồm 1x
amplification buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 và 0.1% Triton
X-100, Takara, Co. Ltd.), 200 µmol dNTP (Takara Co.Ltd.), 20 pmol mồi và Taq polymerase
1U (Takara Co. Ltd.), 200 ng DNA. Phản ứng được thực hiện như sau: 1 cycle/5 phút/95oC,
sau đó là 35 cycle và mỗi cycle là 1 phút/95oC, 2 phút/55oC và 2 phút/72oC. Sau chu kỳ 35,
phản ứng được để thêm 15 phút/72oC. Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng phương pháp
điện di. Sự hiện diện các sản phẩm PCR cho thấy có sự giống nhau hay khác biệt của các
bacteriocin ở chủng phân lập được và các chủng đã có trước đó.
3.2.2.11 Xác định cyclopeptide
Các chủng vi sinh vật được ni cấy trong mơi trường MRS, sau đó, các dịch nổi được
thu lại. Lắc với chloroform theo các tỉ lệ 50:50, 75:25, 25: 75 (dịch nổi:chloroform). Các lớp
chloroform thu lại. Bay hơi chloroform. Hồ cắn với nước. Kiểm tra tính kháng nấm
Penicillium citrinum. Thêm ethylacetate mẫu nước kháng nấm. Tách lấy lớp ethyl acetate.
Bay hơi ethylacetate. Hoà cắn vào nước. Kiểm tra tính kháng nấm. Mẫu nước sẽ được tinh

16


chế bằng HPLC, cột C18, pha động: acetonitrile: nước (95:5), thu được các phân đoạn. Thử
tính kháng nấm. Xác định cyclopeptide của phân đoạn kháng nấm cao nhất.
3.2.3 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư và xác định sơ bộ thành phần tác động lên
tế bào ung thư
3.2.3.1 Khảo sát điều kiện phát triển LAB
LAB được nuôi trong môi trường De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics,
Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí (pH 6.5). Đo OD tại bước sóng
600 nm sau mỗi 2 giờ để từ đó xác định giai đoạn tăng trưởng.
3.2.3.2 Khảo sát tác động lên tế bào ung thư

3.2.3.2.1 Nuôi cấy tế bào
Các tế bào HepG2, HeLa, MCF-7 (Sigma) đã được nuôi trong RPMI 1640 (Invitrogen)
chứa 10% FCS (Sigma), 25 mM HEPES (Sigma) và 2 mM glutamine (Sigma) ủ trong CO2
(5%) khoảng 48 giờ. Mỗi dòng tế bào ung thư được thêm vào trong đĩa 96-giếng (1.0 x 104 tế
bào trong 1 giếng). Sau khi ủ 24 giờ, 5, 10, 15, 20 và 25 mg/ml WSPES được thêm vào mỗi
giếng, đem ủ CO2 (5%) trong 48 giờ tại 37oC. Sau đó, 50 ml TCA (50%) được cho vào từng
giếng có chứa sẵn 200 μl môi trường để đạt được nồng độ cuối là TCA (10%) trong từng
giếng, để yên đĩa mẫu 96-giếng trong 1 giờ ở 4C cho phép tế bào cố định.
Sau 1 giờ ủ, môi trường nuôi cấy trong mỗi giếng được loại bỏ, các giếng sau đó được
rửa sạch nhẹ nhàng với nước 5 lần (200 μl/giếng) và để khơ ở nhiệt độ phịng từ 12-24 tiếng.
Dung dịch SRB (0.2%) được thêm vào mỗi giếng và để tiếp ở nhiệt độ phịng trong 5-20 phút
nữa. Sau đó, rửa sạch 5 lần các đĩa bằng axit axetic (1%) để loại bỏ hồn tồn SRB khơng
liên kết. Để khơ đĩa 96-giếng trong 12-24 giờ trước khi thêm 200 μl Trizma-base (10 mM) để
hòa tan SRB. Cuối cùng, đặt đĩa 96-giếng lên máy lắc ít nhất là 10 phút. Đo độ hấp thu ở
bước sóng 492 nm và 620 nm theo phương pháp ELISA (Molecular Devices, Synnyvale, CA,
USA). DMSO được sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống được tính
theo cơng thức:
% Độc tế bào =

17


3.2.3.2.2 Đánh giá hoạt tính chống tế bào ung thư ở chuột (in vivo)
Để thuận tiện cho việc nghiên cứu sự thay đổi khối u trược và sau khi dùng LAB, chuột
được tiêm một lượng tế bào ung thư vú MCF-7 và đợi cho đến khi thể tích khối u được 30
mm3 thì được chích dịch nổi của LAB. Sử dụng PBS để tiêm chuột nhằm làm mẫu đối chứng.
Theo dõi trong 3 tuần về kích thước khối u và lượng bạch cầu. Cứ sau 2 ngày, huyết thanh và
mô chuột sẽ được sử dụng để chiết RNA. Lượng RNA sẽ được sử dụng để thực hiện phản
ứng realtime RT-PCR nhằm định lượng mRNA của Interleukin-12.
3.2.3.3 Xác định sơ bộ các chất kháng ung thư

3.2.3.3.1 Polysaccharide
3.2.3.3.1.1 Chiết xuất polysaccharide
LAB được nuôi cấy trong De Man-Rogosa- Sharpe (MRS) (Biokar Diagnostics,
Beauvais, India) và được ủ ở 37oC trong điều kiện hiếu khí; thu nhận các dịch trong của LAB
tại các pha tăng trưởng khác nhau sau khi ly tâm 10000 rpm trong 30 phút để tách phần
khuẩn với phần dịch nổi của môi trường nuôi cấy. Phần dịch nổi này được kết tủa bằng cách
thêm 3 lần thể tích ethanol tuyệt đối (EtOH) ở 4oC, và để các mẫu qua đêm. Hôm sau, ly tâm
10000 rpm trong 30 phút. Phần kết tủa này được hoà tan với nước cất và được tiếp tục kết tủa
với 3 lần thể tích EtOH ở 4oC. Dung dịch để qua đêm, và hôm sau tiếp tục được ly tâm thu
tủa, đó chính là các exopolysaccharides (WSPES) tan trong nước. Sản phẩm được sấy khô ở
60oC đến khối lượng không đổi. WSPES được lọc qua màn lọc 0.22 μm (Millipore, Bedford,
Mass.) và được trữ đông ở -80oC đến khi sử dụng.
3.2.3.3.1.2 Đánh giả khả năng kháng tế bào ung thư của EPS
EPS của LAB sau khi phân đoạn, được đem thử tác dụng lên tế bào ung thư. Bằng
phương pháp SRB và thử nghiệm trên chuột theo quy trình như đối với dịch nổi.
3.2.3.3.2 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do
DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH (Sigma-Aldrich) của methanol được xác định theo
phương pháp của Patel với một vài hiệu chỉnh nhỏ39, 41. Phương pháp DPPH dựa trên khả
năng khử gốc DPPH, một dạng gốc tự do bền có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước
sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống oxi hóa, dạng tự do bền sẽ bắt cặp với một hydro (ví
như, một chất chống oxi hóa khử gốc tự do) và bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine
18