Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ ba kích (radix morindae officinalis) của Việt Nam (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VĂN KIỀN

NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU
CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH
(RADIX MORINDAE OFFICINALIS)
CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM VĂN KIỀN

NGHIÊN CỨU NÂNG CẤP TIÊU
CHUẨN DƯỢC LIỆU RỄ BA KÍCH
(RADIX MORINDAE OFFICINALIS)
CỦA VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 62720410
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đoàn Cao Sơn
PGS. TS. Bùi Hồng Cường

HÀ NỘI, NĂM 2021


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận án là trung thực và là một phần của đề tài cấp nhà nước
“Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba kích
Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16- 18, thuộc
Chương trình “Khoa học và cơng nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp
hóa dược đến năm 2020” mà tơi có tham gia và được sự đồng ý của Chủ nhiệm đề
tài.
NCS. PhạmVăn Kiền


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận án này, tơi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình và có hiệu quả
của nhiều cá nhân, tập thể, của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. TS. Đoàn Cao Sơn
– Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS. TS. Bùi Hồng Cường
– Phó trưởng Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội, những
người thầy đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn thành
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng
Đào tạo Sau đại học, GS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, cùng các thầy, cô của Bộ

mơn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, tận
tình giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm để tơi hồn thành luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Bộ Công thương đã cấp kinh phí cho Đề tài cấp nhà
nước “Nghiên cứu thành phần hóa học, tạo chế phẩm có tác dụng sinh học của rễ Ba
kích Việt Nam (Radix Morindae officinalis)”, mã số CNHD.ĐT.075/16-18; PGS. TS.
Trần Việt Hùng – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh, chủ
nhiệm đề tài và các anh, chị, em đồng nghiệp của Khoa Kiểm nghiệm Đông dược
dược liệu, Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương, Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tơi trong q trình thực nghiệm để tơi hồn thành luận án.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cả ơn gia đình tơi và những người bạn, đồng
nghiệp đã ln ủng hộ, động viên khích lệ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2021

NCS. Phạm Văn Kiền


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... i
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ............................................................................ iii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ.................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) .............................................3
1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích ..............................................................................3

1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................3
1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến .................................................................................4
1.1.4. Thành phần hoá học ..........................................................................................4
1.1.5. Tác dụng dược lý ...............................................................................................5
1.1.6. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích .....................................................5
1.2. Monotropein và nystose .......................................................................................6
1.2.1. Monotropein ......................................................................................................6
1.2.2. Nystose ..............................................................................................................8
1.3. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ....................................12
1.3.1. Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein, nystose trên thế giới và tại Việt
Nam ...........................................................................................................................12
1.3.2. Phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ Ba kích ...................................13
1.4. Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh lồi Morinda officinalis
How ...........................................................................................................................15
1.4.1. Quy trình phân tích mã vạch ADN cho thực vật .............................................15
1.4.2. Phương pháp khuếch đại gen (PCR) ..............................................................16
1.4.3. Các trình tự gen thường dùng cho thực vật ....................................................18


1.4.4. Nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Morinda officinalis How ....................22
1.6. Tính cấp thiết của luận án ..................................................................................23
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................25
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................25
2.2. Phương tiện nghiên cứu .....................................................................................25
2.2.1. Chất chuẩn và dược liệu chuẩn.......................................................................25
2.2.2. Hóa chất và thuốc thử .....................................................................................25
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ..............................................................................................26
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................27
2.3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose .......27
2.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích

...................................................................................................................................37
2.3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose .................................................39
2.3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN.....44
2.3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một
số chỉ tiêu định tính, định lượng ...............................................................................48
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................49
3.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ..........49
3.1.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein .........................49
3.1.2. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng nystose .................................54
3.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng ..................................................................................59
3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích60
3.2.1. Chiết xuất cao chiết toàn phần chứa monotropein và nystose .......................60
3.2.2. Phân lập và tinh chế monotropein ..................................................................61
3.2.3. Phân lập và tinh chế nystose ...........................................................................63
3.2.4. Xác định bộ dữ liệu nhận dạng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn...................65


3.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ....................................................67
3.3.1. Thiết lập chất chuẩn monotropein ..................................................................67
3.3.2. Thiết lập chất chuẩn nystose ...........................................................................75
3.3.3. Định tính, định lượng monotropein và nystose trong dược liệu rễ Ba kích....83
3.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN .......85
3.4.1. Chiết tách ADN toàn phần từ dược liệu ..........................................................85
3.4.2. Nhân bản đoạn gen .........................................................................................86
3.4.3. Giải trình tự gen và định danh dược liệu ........................................................87
3.4.4. Phân tích trình tự gen .....................................................................................89
3.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số
chỉ tiêu định tính và định lượng ................................................................................93
3.5.1. Bổ sung các chỉ tiêu định tính, định lượng vào chuyên luận dược liệu rễ Ba

kích trong Dược điển Việt Nam.................................................................................93
3.5.2. Dự thảo chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam VI .....94
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ......................................................................................101
4.1. Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein và nystose ........101
4.1.1. Phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược
liệu rễ Ba kích .........................................................................................................101
4.1.2. Phương pháp định tính, định lượng nystose trong nguyên liệu và dược liệu rễ
Ba kích .....................................................................................................................103
4.1.3. Thẩm định phương pháp định tính nystose trong dược liệu bằng TLC ........105
4.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích
.................................................................................................................................105
4.2.1. Chiết cao toàn phần ......................................................................................105
4.2.2. Phân lập, tinh chế monotropein ....................................................................106
4.2.3. Phân lập, tinh chế nystose .............................................................................107
4.2.4. Xác minh cấu trúc monotropein và nystose tinh chế được ...........................108


4.3. Thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose ..................................................109
4.4. Định danh dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị ADN .....112
4.5. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về một số
chỉ tiêu định tính, định lượng ..................................................................................118
4.5.1. Bổ sung chỉ tiêu định tính..............................................................................118
4.5.2. Bổ sung chỉ tiêu định lượng ..........................................................................120
4.6. Những đóng góp mới của luận án ....................................................................122
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................123
Kết luận ...................................................................................................................123
Kiến nghị .................................................................................................................123
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

: Acid ribonucleic

AFLP

: Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các
đoạn được nhân bản chọn lọc

APG II

: Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng lồi
thực vật hạt kín

ARS

: ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN

CBOL

: Consortium for the Barcode of Life

cpDNA

: Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp

ptDNA

: Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể

DĐVN

: Dược điển Việt Nam

DNA

: Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP

: Deoxynucleoside triphosphate

dATP

: Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

: Deoxycytidine triphosphate

dGTP

: Deoxyguanosine triphosphate

EDTA

: Ethylenediaminetetraacetic acid

ELSD

: Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi

EPRS

: EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu

ETS

: External transcribed spacer – Vùng sao mã ngồi gene

FHH

: Diễn đàn hịa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình
Dương

HPLC-DAD

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector mảng diod

HPLC-ELSD

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi

FOS

: Fructo Oligo Saccharid

ICRS

: Chất chuẩn Dược điển Quốc tế
i


IGS

: Intergenic spacer – vùng chen giữa các gene

IR

: Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR)

ISSR

: Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản giữa

ITS

: Internal transcribed spacer

KNV

: Kiểm nghiệm viên

LDL

: Low density lipoprotein

LSC

: large single copy – vùng đơn gen lớn

matK

: Maturase K

MeOH

: Methanol

mRNA

: Messenger Ribonucleic acid

NCBI

: National Center for Biotechnology Information

PTN

: Phòng thử nghiệm

PCR

: Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen

QTL

: Quantiative Trait loci

RAPD

: Random Amplified Polymorphic DNA

rbcL

: Rubisco large subunit gene

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

SSC

: Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ

TBE

: Tris/Borate/EDTA

TCCL

: Tiêu chuẩn chất lượng

TLC

: Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

TIS

: Transcription start site – Điểm khởi đầu sao chép

TRIS

: Tris(hydroxymethyl)aminomethane

USPRS

: USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ

UV-VIS

: Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến

WHO

: World health organization - Tổ chức Y tế thế giới

ii


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda ................................................................3
Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển ......................5
Bảng 1.3. Chương trình gradient dung mơi định lượng nystose ..............................11
Bảng 1.4. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose ...................13

Bảng 2.1. Danh mục mã hố các mẫu Ba kích .........................................................25
Bảng 2.2. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52]
..........................................................................................................................29
Bảng 2.3. Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52] ....................34
Bảng 2.4. Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điều chế. ...........................38
Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng............................................45
Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast ............46
Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84] .............................46
Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36] .....................46
Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39] ...............47
Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56] .........47
Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48] ..........................47
Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen .....48
Bảng 3.1. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein .....49
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein
..........................................................................................................................50
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein
trong nguyên liệu ..............................................................................................51
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein
trong dược liệu BK5 .........................................................................................52
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong
nguyên liệu ........................................................................................................52
iii


Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong
dược liệu BK5 ...................................................................................................53
Bảng 3.7. Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose.........................54
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose............56
Bảng 3.9. Kết quả độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng nystose trong

nguyên liệu ........................................................................................................57
Bảng 3.10. Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng nystose trong dược
liệu BK5 ............................................................................................................58
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong nguyên
liệu ....................................................................................................................58
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong dược
liệu BK5 ............................................................................................................59
Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo
*
(D2O, 600 MHz) ..............................................................................................66
Bảng 3.14. Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo
*

(D2O, 100 MHz) ..............................................................................................67

Bảng 3.15. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein ........68
Bảng 3.16. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein ....................69
Bảng 3.17. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein........................70
Bảng 3.18. Số lượng lọ chuẩn monotropein .............................................................70
Bảng 3.19. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein .......................71
Bảng 3.20. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein ..........................72
Bảng 3.21. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein .........................................72
Bảng 3.22. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) .......73
Bảng 3.23. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) .........74
Bảng 3.24. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein
(6 tháng) ...........................................................................................................74

iv

Bảng 3.25. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein
(1 năm) ..............................................................................................................74
Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn monotropein sau 1
năm ...................................................................................................................75
Bảng 3.27. Kết quả mất khối lượng do làm khơ của ngun liệu nystose ................76
Bảng 3.28. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn nystose ................................77
Bảng 3.29. Số lượng lọ chất chuẩn nystose ..............................................................78
Bảng 3.30. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn nystose ................................78
Bảng 3.31. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn nystose ...................................79
Bảng 3.32. Kết quả hàm lượng chất chuẩn nystose ..................................................79
Bảng 3.33. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (6 tháng)
..........................................................................................................................80
Bảng 3.34. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm)
..........................................................................................................................81
Bảng 3.35. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm
..........................................................................................................................82
Bảng 3.36. Kết quả định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích ................83
Bảng 3.37. Kết quả định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích. ........................84
Bảng 3.38. Kết quả đo mật độ quang của dịch tách chiết ADN toàn phần ..............86
Bảng 3.39. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự ITS ................................87
Bảng 3.40. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự matK.............................88
Bảng 3.41. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự rbcL ..............................88
Bảng 3.42. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự trnH-pbsA ....................88
Bảng 3.43. Kết quả so sánh độ tương đồng và độ phủ của các mẫu Ba kích so với M.
officinalis KR869730 và M. officinalis AY551330 ...........................................89
Bảng 3.44. Khoảng cách di truyền của các mẫu trên trình tự ITS ...........................90
Bảng 3.45. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự matK .......................91
Bảng 3.46. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự rbcL ........................92
v

Bảng 3.47. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự trnH-psbA ..............93
Bảng 3.48. Tóm tắt các chỉ tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của
Dược điển Việt Nam. ........................................................................................94

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của monotropein [14] ...................................................6
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của nystose [85] ...........................................................8
Hình 1.3. Sơ đồ và các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase [15] ......................17
Hình 1.4. Vị trí các vùng ITS trên cụm đa gen 18S–5.8S–26S rRNA [70] ...............19
Hình 1.5. Vị trí các gen trên cpDNA của Trifolium subterraneum [88] ..................21
Hình 1.6. Vị trí tương đối của matK so với trnK trên cpDNA [75] ..........................22

Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp định tính, định lượng
monotropein ......................................................................................................50
Hình 3.2. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
monotropein ......................................................................................................54
Hình 3.3. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu ............55
Hình 3.4. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích
..........................................................................................................................56
Hình 3.5. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định tính nystose trong dược
liệu rễ Ba kích ...................................................................................................60
Hình 3.6. Quy trình chiết xuất dịch chiết tồn phần .................................................61
Hình 3.7. Sơ đồ phân lập, tinh chế monotropein từ cao chiết MeOH ......................63
Hình 3.8. Sơ đồ phân lập, tinh chế nystose từ cao chiết nước ..................................65
Hình 3.9. Cơng thức cấu tạo của monotropein .........................................................66
Hình 3.10. Cơng thức cấu tạo của nystose................................................................67

Hình 3.11. Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein ..............................................69
Hình 3.12. Chất chuẩn monotropein, SKS: 0119.C005.01 .......................................73
Hình 3.13. Sắc ký đồ SKLM thử tạp chất liên quan nguyên liệu nystose .................76
Hình 3.14. Chất chuẩn nystose, SKS: 0119.C006.01 ................................................80
vii


Hình 3.15. Kết quả thử tạp chất liên quan nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose
..........................................................................................................................82
Hình 3.16. Kết quả điện di tách chiết ADN tồn phần .............................................85
Hình 3.17. Kết quả khuếch đại đoạn ITS với đoạn mồi ITS P5- ITS U4 và ITS4-ITS1
..........................................................................................................................86
Hình 3.18. Kết quả khuếch đại đoạn gen trên chloroplast .......................................87
Hình 3.19. Kết quả gióng hàng trên trình tự ITS ......................................................89
Hình 3.20. Kết quả gióng hàng trên trình tự matK ...................................................90
Hình 3.21. Kết quả gióng hàng trên trình tự rbcL ....................................................91
Hình 3.22. Kết quả gióng hàng trên trình tự trnH-psbA...........................................92

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ba kích (Morinda officinalis) là một cây thuốc quý có giá trị sử dụng trong Y
học cổ truyền, được biết đến với nhiều tác dụng: Bổ thận, tráng dương, mạnh gân cốt,
tăng lực, tăng sức đề kháng, chống viêm [10], [12], [16], [18]… Những năm gần đây,
nhu cầu sử dụng của dược liệu rễ Ba kích và các chế phẩm từ dược liệu rễ Ba kích
ngày một tăng. Thị trường dược liệu rễ Ba kích cũng rất đa dạng, bao gồm các nguồn
cung cấp dược liệu được nhập khẩu từ Trung Quốc, được trồng theo quy hoạch phát
triển vùng trồng dược liệu [13], và nguồn thu hái tự nhiên. Do đa dạng về nguồn cung
cấp nên chất lượng của dược liệu rễ Ba kích chưa được kiểm sốt chặt chẽ.

Hiện nay, dược liệu rễ Ba kích hay bị nhầm lẫn do hình dáng, trong khi việc
định danh dược liệu bằng hình thái học là một cơng tác khó khăn vì sau khi thu hái
và xử lý thì khơng thể thu thập đầy đủ thông tin về đặc điểm thực vật của mẫu dược
liệu. Cần có một phương pháp bổ trợ trong định danh dược liệu để đảm bảo tính đúng
của dược liệu rễ Ba kích, và phương pháp định danh dược liệu bằng giải trình tự ADN
là một phương pháp đáp ứng yêu cầu đặt ra.
Để kiểm soát được chất lượng dược liệu rễ Ba kích, cần xây dựng tiêu chuẩn
dược liệu trong đó kiểm sốt được đầy đủ các chỉ tiêu về hình thái cũng như một số
“marker” (những chất có hoạt tính sinh học hoặc có hàm lượng cao có trong dược
liệu [86]). Đồng thời, phải thiết lập được những chất chuẩn của “marker” này để cung
cấp cho hệ thống kiểm nghiệm nhằm giảm chi phí cũng như thời gian kiểm nghiệm
so với việc phải mua những chất chuẩn này từ nước ngoài.
Về tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích, hiện nay Dược điển Trung Quốc,
Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam có chuyên luận dược
liệu rễ Ba kích. Trong đó, chun luận Ba kích trong Dược điển Việt Nam V mới chỉ
có một số chỉ tiêu cơ bản về mơ tả hình thái, vi phẫu, soi bột, chưa có chỉ tiêu định
lượng thành phần hóa học [3]. Dược điển Trung Quốc và Bộ tiêu chuẩn dược liệu của
Hồng Kơng đã có chỉ tiêu định lượng “marker” - nystose [37], [47].
Về “marker” trong dược liệu rễ Ba kích: Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu
về một số hợp chất trong rễ Ba kích có tác dụng sinh học như: Monotropein có tác
dụng chống viêm [12], [38], oligosaccharid (nystose) có tác dụng chống trầm cảm,
chống tổn thương tế bào thần kinh do corticosteron [59], hay nhóm anthraquinon và
polysaccharid có tác dụng trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu

1


xương [89]. Một số cơng trình khoa học đã cơng bố hàm lượng các chất monotropein
và nystose trong dược liệu rễ Ba kích cũng ở mức tương đối cao (monotropein: 0,046
% [91], nystose:  3,0% [11]). Do vậy, monotropein và nystose đủ điều kiện là

“marker” của dược liệu rễ Ba kích, cần được kiểm sốt hàm lượng và thiết lập chất
chuẩn để phục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng dược liệu rễ Ba kích.
Xuất phát từ những vấn đề cấp thiết ở trên, luận án: “Nghiên cứu nâng cấp tiêu
chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis) của Việt Nam” được thực
hiện với 3 mục tiêu chính:
1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế và thiết lập được 2 chất chuẩn monotropein,
nystose từ dược liệu rễ Ba kích.
2. Định danh được dược liệu rễ Ba kích ở Việt Nam dựa trên một số chỉ thị
ADN.
3. Nâng cấp chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam về
một số chỉ tiêu định tính và định lượng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis)
1.1.1. Vị trí phân loại của Ba kích
Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta,
Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của
Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong
giới thực vật được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda
Phân giới
Ngành
Lớp
Phân lớp
Bộ
Họ
Chi

Cormobionta (Thực vật bậc cao)
Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)
Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)
Lamiidae (Phân lớp Bạc hà)
Gentianales (Bộ Long đởm)
Rubiaceae (Họ Cà phê)
Morinda

Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae.
Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy
(Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây dây leo bằng thân cuốn, dài từ 3 - 5m. Rễ phình to thành củ, hình trụ, mập,
vặn vẹo. Củ thường hơi thắt lại tạo thành các đốt có chiều dài từ 1 - 3 cm, trơng giống
ruột gà. Vỏ ngồi màu hồng nhạt, thịt màu hồng, tím hay trắng, trên mặt vỏ có nhiều
vân dọc, vỏ nạc, giữa có lõi cứng có tỷ lệ so với đường kính củ khác nhau [4].
Thân hình trịn, chia nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt với nhau. Thân non nhẵn,
phủ lông ngắn-cứng hay lông dài, có cạnh, màu xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau
nhẵn, chuyển từ màu xanh sang nâu [1], [2], [5].
Lá đơn, mọc đối. Phiến lá hình mác hoặc bầu dục thn nhọn. Gốc lá hơi lệch,
nhọn, trịn hoặc hơi hình tim; mép phẳng hay lượn sóng, hơi uốn mặt sau; ngọn lá
trịn hay nhọn; mặt trên nhẵn hay phủ lơng dài; mặt dưới nhẵn hay phủ lơng. Lá non
màu tím sau chuyển sang xanh, có thể có hoặc khơng hốc Domatia hốc giữa gân chính
và phụ có phủ lơng. Gân lá hình lơng chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên, nổi mặt dưới, lõm
ở mặt trên. Gân chính có lơng hoặc nhẵn ở mặt dưới. Lá kèm 2, dính nhau, ôm lấy

3

thân, mỏng, mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia làm 2 thùy, dài 2 –
4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ơm sát vào thân, dài 4 mm [4].
Cụm hoa dạng tán, gồm 1-8 tán ở nách lá hay đầu cành, mỗi tán mang 1-14 hoa.
Hoa nhỏ, khi mới nở màu trắng, sau hơi vàng hay tím đen. Đài 3-4, hơi dính nhau ở
dưới, đều hay khơng đều nhau. Tràng 3-4, có phần móng dính nhau tạo thành ống
hình chum hoặc hình trụ, nhẵn hay phủ lơng ở mặt ngồi; phần phiến rời, hình tam
giác, mặt ngồi nhẵn hay phủ lơng, mặt trong có một vịng lơng dày đặc, thẳng, màu
trắng. Quả hình cầu, từ 1-8 quả/1 tán, rời hoặc dính với nhau thành quả kép ở các
mức độ khác nhau. Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển màu cam
khi chín, mang 3 đài cịn lại trên đỉnh quả, có hình dạng và kích thước khơng đều
nhau [8].
1.1.3. Phân bố, thu hái, chế biến
- Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi núi thấp của miền
núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh,
Bắc Giang; một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam, Gia Lai, Kon Tum)
[18].
- Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận
dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10].
- Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10].
- Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi khơng dính
tay, đập nhẹ cho bẹp, phơi đến khơ hoặc sấy nhẹ đến khô [10], [16], [19].
1.1.4. Thành phần hố học
Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm:
- Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%),
asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid
asperulosidic (0,0001%) [91].
- Oligosaccharid: Nystose ( 3,0%) [21], l-borneol-6-o-β-D-apiosyl-β-Dglucosid (0,0001%) [91], 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharid,
heptasaccharid [19], [59], [94].
- Ngồi ra cịn có 6 hợp chất Anthraquinon [58], [89], [91], [93]; 2 hợp chất
sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton

[91], [94], và một số acid amin [16], [19].

4


1.1.5. Tác dụng dược lý
Theo Đơng y, Ba kích là vị thuốc có vị cay ngọt, tính hơi ơn, quy kinh thận. Có
tác dụng ơn thận trợ dương, mạnh gân cốt, khử phong thấp [10].
Dịch chiết Ba kích có một số tác dụng đã được chứng minh như: Chống viêm
(nhóm chất iridoid) [35], chống lỗng xương (nhóm chất iridoid và anthraquinon)
[27], [96], tăng cường miễn dịch hệ tiêu hố (nhóm oligosaccharid) [72], tác dụng
bảo vệ ADN của tinh trùng người (nhóm oligosaccharid) [45], tác dụng chống trầm
cảm (nhóm oligosaccharid) [17]…
1.1.6. Tiêu chuẩn chất lượng dược liệu rễ Ba kích
Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kơng và Dược
điển Việt Nam V có chun luận dược liệu rễ Ba kích. Các chỉ tiêu kiểm tra chất
lượng dược liệu rễ Ba kích trong các Dược điển trên được trình bày tóm tắt trong
Bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển
Stt

Chỉ tiêu

1
2
3
4

6

Mơ tả
Vi phẫu
Bột
Định tính
Hàm
lượng
nước/độ ẩm
Tro tồn phần

7

Chất chiết được

5

8
9
10

Bộ tiêu chuẩn
dược liệu Hồng
Kông [47]
+
+
+
+

Dược điển
Trung Quốc
2015 [37]

+
+
+
+

 13,0%

 15,0%

 12,0%

 5,5%
 50% (chiết lạnh)
 60% (chiết nóng)

 6,0%

 6,0%

 50%

 50%

Dược điển Việt
Nam V [3]

Định
lượng
 2,3 %
 2,0 %

nystose
Tỉ lệ vụn nát
Tạp chất
+
Ghi chú: (+): Có chỉ tiêu; (-): Khơng có chỉ tiêu.

+
+
+
+

 5,0%
+

Theo Dược điển Việt Nam V, chuyên luận dược liệu rễ Ba kích cịn khá đơn
giản và chưa được tiêu chuẩn về mặt hóa học [3]. Trong Dược điển Trung Quốc và
Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kơng kiểm sốt hoạt chất có dược liệu rễ Ba kích
dựa vào hàm lượng nystose [37], [47].

5


Monotropein và nystose là 2 chất có hàm lượng cao nhất của 2 nhóm chất có
tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích là nhóm iridorid và oligosaccharid. Bên
cạnh đó, nystose cũng đã được Trung Quốc và Hồng Kông lựa chọn là “marker” của
dược liệu này. Như vậy, monotropein và nystose là 2 “marker” của dược liệu rễ Ba
kích. Để kiểm sốt chất lượng dược liệu rễ Ba kích cần kiểm sốt hàm lượng 2
“marker” này thơng qua việc bổ sung chỉ tiêu định tính, định lượng 2 “marker”
monotropein và nystose vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt
Nam. Do vậy, nội dung xây dựng phương pháp định tính, định lượng và thiết lập 2

chất chuẩn monotropein và nystose từ dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam là cấp thiết.
1.2. Monotropein và nystose
1.2.1. Monotropein
1.2.1.1. Cơng thức phân tử, tính chất hố lý
- Cơng thức phân tử: C16H22O11 [14].
- Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)-1,4a,7,7atetrahydro-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid.
- Khối lượng phân tử: 390,34.
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 4,14; pKa (môi trường base
mạnh) = -3 [62].
- Thuộc nhóm iridoid, có cơng thức cấu tạo như Hình 1.1.

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của monotropein [14]
- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 273 oC – 275 oC. Tan
tốt trong methanol, ethanol và tan nước (50,2 g/l) [62]. Hấp thụ tia UV, cho cực đại
hấp thụ (trong ethanol) tại bước sóng khoảng 235 nm.

6


1.2.1.2. Tác dụng dược lý
- Tác dụng chống viêm: Các nghiên cứu gần đây cho thấy monotropein có tác
dụng chống viêm [38]. Monotropein được phát hiện ức chế biểu hiện của nitric oxid
18- synthase, cyclooxygenase-2, yếu tố hoại tử u α (TNF-α) và interleukin-1β (IL1β) mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 gây bởi lipopolysaccharide [56]. Việc
xử lý bằng monotropein đã làm giảm tác dụng kết dính yếu tố hạt nhân κB.
Monotropein cũng ngăn chặn sự phosphoryl hóa và suy giảm ức chế κB-α và do đó
hốn vị yếu tố hạt nhân nhân κB. Trong mơ hình viêm ruột kết gây bởi dextran sulfate
sodium, monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh, hoạt động myeloperoxidase
và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông qua ngăn chặn sự hoạt hóa yếu tố
hạt nhân κB ở niêm mạc ruột [35].
- Tác dụng chống loãng xương: Đánh giá tác động của monotropein lên chứng

loãng xương do cắt bỏ buồng trứng ở chuột: Tác dụng bảo vệ xương tốt được chứng
minh bằng sự gia tăng hàm lượng khoáng xương, mật độ khoáng xương và tỷ lệ thể
tích xương, cải thiện cấu trúc xương [96].
Như vậy, monotropein là “marker” của dược liệu rễ Ba kích do monotropein có
hoạt tính tạo nên tác dụng của dược liệu rễ Ba kích.
1.2.1.3. Phương pháp phân tích monotropein
Huang Lin-yun và cộng sự [49] đã tiến hành định lượng monotropein bằng
phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: SinoChrom ODS-BP (250 mm x 4,6 mm, 5 µm)
- Pha động: Hỗn hợp dung mơi MeOH : Acid phosphoric 0,1 % (1 : 99)
- Detector UV tại 235 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 10 µl.
- Nhiệt độ phân tích: 25 oC.
Xu J. và cộng sự [90] đã tiến hành phương pháp định tính, định lượng
monotropein trong Morinda officinalis bằng phương pháp HPLC với điều kiện như
sau:
- Cột sắc ký: Kromasil C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm)

7


- Pha động: Gradient hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,4 % từ (5 :
95) đến (28,8 : 71,2) trong 15 phút.
- Detector UV tại 210 nm
- Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
- Thể tích tiêm: 10 µl.
- Nhiệt độ phân tích: 25 oC.
Như vậy, phương pháp định tính, định lượng monotropein bằng HPLC sử dụng
cột C18 với nhiệt độ cột 25 oC, detector UV, tốc độ dòng 1 ml/phút, hệ pha động bao

gồm MeOH và acid phosphoric 0,1 % - 0,4 %.
1.2.2. Nystose
1.2.2.1. Cơng thức phân tử, tính chất hố lý
- Cơng thức phân tử: C24H42O21 [66].
- Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-2-[[(2R,3S,4S,5R)-2[[(2R,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
- Khối lượng phân tử: 666,58 [66].
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 11,54; pKa (mơi trường base
mạnh) = -3,7 [63].
- Thuộc nhóm oligosaccharid, nystose bao gồm có 3 phân tử fructose liên kết 1
phân tử glucose, có cơng thức cấu tạo như Hình 1.2.

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của nystose [85]

8


- Nhiệt độ nóng chảy: 134 oC -135 oC.
- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước (745
g/l) [63].
Do thành phần oligosaccharid không hấp thụ tia UV, nên detector UV không
phù hợp để phân tích. Để phân tích oligosaccharid một số detector như khúc xạ kế vi
sai, tán xạ bay hơi... [37], [47].
1.2.2.2. Tác dụng dược lý
- Từ các nghiên cứu, thử nghiệm trên người và chuột cho thấy nhóm FOS (bao
gồm chủ yếu là 1-kestose, nystose và fructofuranosyl nystose) có tác dụng kích thích
sự phát triển của các vi sinh vật có lợi như bifidobacteria và giảm số lượng vi khuẩn
gây hại, đặc biệt là Clostridia perfringens. FOS cịn có thể cải thiện sự hấp thu và lưu
giữ khoáng chất, chủ yếu là calci, magnesi ở ruột. FOS giúp tăng cường miễn dịch hệ
tiêu hóa, giảm khả năng viêm ruột và ung thư ruột kết nhờ cải thiện cấu trúc niêm
mạc, làm dày lớp chất nhầy bảo vệ, phát triển hệ bạch huyết và các nang Peyer. FOS

không được cơ thể hấp thu vì khơng hoặc ít bị thủy phân bởi hệ men đường ruột nên
lượng đường trong máu không bị biến động sau khi uống, phù hợp cho bệnh nhân
tiểu đường và người bị bệnh béo phì. Hơn nữa, các nghiên cứu đã chứng minh rằng
FOS làm giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid máu, cholesterol toàn phần và LDL
cholesterol nhờ cơ chế giảm tổng hợp chất béo ở gan bằng cách giảm sự biểu hiện
của các gen mã hóa cho các enzym lipogen. Điều này rất có lợi cho bệnh nhân mắc
bệnh tim mạch [72].
- Theo các nghiên cứu, oligosaccharid trong rễ M. officinalis How cho thấy có
tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người khỏi bị phá hủy bởi H2O2, góp phần trong
điều trị vơ sinh [45]. Oligosaccharid cịn được chứng minh có thể cải thiện khả năng
ghi nhớ trên chuột - được gây mất trí nhớ bằng beta-amyloid, chống trầm cảm, bảo
vệ xương, chống mất xương [92], [97], [98].
- Thành phần oligosaccharid từ Ba kích có tác dụng chống trầm cảm [34], làm
giảm đáng kể các biểu hiện của hành vi trầm cảm gây ra bởi mơ hình stress trường
diễn khơng thể dự đốn (chronic unpredictable stress) trên thử nghiệm lựa chọn
sucrose và thử nghiệm bơi cưỡng bức [95].

9