Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn vị thuốc ba kích và khảo sát thành phần hóa học của dịch chiết ethanol ba kích

B Y T
I HC HÀ NI



TRNH TH NGA

NGHIÊN CU NÂNG CP
TIÊU CHUN V THUC BA KÍCH VÀ
KHO SÁT THÀNH PHN HÓA HC
CA DCH CHIT ETHANOL
BA KÍCH

KHÓA LUN TT NGHI





HÀ NI - 2013



B Y T
I HC HÀ NI


TRNH TH NGA

NGHIÊN CU NÂNG CP TIÊU
CHUN V THUC BA KÍCH VÀ
KHO SÁT THÀNH PHN HÓA HC
CA DCH CHIT ETHANOL
BA KÍCH

KHÓA LUN TT NGHI

ng dn:
TS. Trn Vit Hùng
DS. Ph
c hin:
Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

HÀ NI  2013


LI C
Tôi xin bày t lòng bic ti:
TS. Trần Việt Hùng  Phó ving, Vin kim nghim thu
ng d và to mu kin thun li trong sut quá trình
hc tp và nghiên c hoàn thành khóa lun.
DS. Phạm Thái Hà Văn, TS. Bùi Hồng Cường, Các thy cô giáo và cán
b k thut viên B môn c hc c truyn - i hc Hà Ni;
TS. Nguyễn Quốc Huy  B môn thc v i h c Hà Ni và
DS. Trịnh Thị Hồng Thảo cùng các anh ch khoa V   ng - Vin kim
nghim thu   n tình ch b   và tu kin tt nht
trong quá trình thc hi tài khóa lun.
 i li c     tôi

trong sut quá trình hc tp ca mình.

Hà N
Sinh viên

Trnh Th Nga












Trang
Danh m


 1
NG QUAN 2
1.1. Ba kích 2
1.1.1. Tên khoa hc 2
1.1.2. Mô t cây 2
1.1.3. Cây d nhm ln. 3
1.1.4. Phân b, thu hái và ch bin 3
1.1.5. Thành phn hóa hc 3

1.1.6. Tác dc lý 4
1.1.7. Công dng và liu dùng 6
1.1.8. Bài thuc có Ba kích 7
1.1.9. Mt s n bit Ba kích 8
1.2. Sc kí lng hi 11
1.2.1. Khái nim 11
1.2.2. Detector dùng trong HPLC 12
1.2.3. Các thông s a HPLC 12
1.3. Monotropein 14
 16
 16
2.1.1. Nguyên liu 16
2.1.2. Thit b, dng c và hóa cht 16
 17
t xut 17


nh hiu sut chit 17
nh tính mt s nhóm cht hng phn ng hóa hc 18
2.2.4. Sc kí lng hi 19
2.2.5. Thnh  20
 lý s liu 21
 22
3.1. Kt qu thc nghim và nhn xét 22
3.1.1. Bào ch nh hiu sut 22
nh tính mt s nhóm cht hng phn ng hóa hc 23
3.1.3. Xây dng Monotropein bng
HPLC 24
3.1.3.1. Quy trình chy sc kí 24
3.1.3.2. Th 25

3.2. Bàn lu
3.2.1. V ng nghiên cu 30
3.2.2. V u 31
t xut 31
HPLC 31
3.2.2.3. Khu kin sc kí 32
3.2.2.4. Th.33
 34
Kt lun 34
Kin ngh 35








DANH MC CÁC KÍ HIU, CÁC CH VIT TT
HPLC

DAD

MeOH
EtOAc
SKLM

BK



TT
VKNTTW
KL
HA
dd
RSD











Sc ký lng hiu 
(High Performance Liquid Chromatography)
Detector mng diot
(Diod array detector)
Methanol
Ethylacetat
Sc kí lp mng
Phn ng
Ba kích
n Vit Nam IV
n Trung Quc
Thuc th
Vin kim nghim thu

Khng
Hàm m
Dung dch
 lch chui
(relative standard deviation)



DANH MC BNG
Bng
Tên bng
Trang
Bng 1.1

10
Bng 3.1

23
Bng 3.2

24
Bng 3.3

25
Bng 3.4

27
Bng 3.5

28

Bng 3.6

29
Bng 3.7

30





















DANH MC HÌNH V TH
Hình
Tên hình

Trang
Hình 1.1
Cây Ba kích (Morinda officinalis How)
2
Hình 1.2

9
Hình 1.3

9
Hình 1.4

9
Hình 1.5

11
Hình 1.6

14
Hình 2.1
Máy HPLC Agilient Technologies 1200
16
Hình 2.2

22
Hình 3.1

26
Hình 3.2



28














1



T V
Tiêu chun hóa và kim tra cht ch ngun nguyên liu là yu t
s m bo hiu lc và tác dng ca thuc tho mc. Vì vy công tác
kim nghic li nh rõ ngun gc, tránh nhm ln, gi mo là ht
sc quan trng.     ng phát trin c  c và là mt
trong nhng gii pháp nhm hii hóa nn y-c hc c truyn Vit Nam.
Ba kích là mt cây thuc quý có giá tr s dc. Trên th
giiên cu v mt s hp cht trong r Ba kích có ng du tr
Monotropein có tác dng chng viêm [26], Oligosaccharid có tác dng chng
trm cm, chng t   bào thn kinh do corticosteron [19], hay nhóm

Anthraquinon và Polysaccharid có tác du tr bnh liên
n s ]. Hin nay, chuyên lun Ba kích trong n Vit
n Trung Quc  tiêu thành phn hóa hc.
Vì nh tài u nâng cp tiêu chun v thuc Ba
kích và kho sát thành phn hóa hc ca dch chi c tin
hành vi mc tiêu:
1.      trong      
- HPLC.
2. 







2



NG QUAN
1.1. BA KÍCH
1.1.1. 
Morinda officinalis How.Rubiaceae.
Tên gi khác: Ba kích thiên, dây rut gà, chu phóng xì (Hi Ninh), thau tày cáy
(Tày), chi hoàng kim, sáy cày (Thái), chày kiang dòi (Dao), liên châu ba kích,
Medicinal indian mulberry (Anh) [5], [11], [13].
1.1.2. 

, hình mác

--
  

Hoa -

hàn  
háng 5-6.
-10 [5], [11].
Trong thi 
Morinda -



Hình 1.1. Cây Ba kích (Morinda officinalis How.)

3



1.1.3. 

- 
+ Ba kích lông - Morinda cochinchinensis Lour
chín 
- Morinda villosa 
 Morinda sp.)
    - Zygostelma benthami Baillon var. lineare    
Asclepiadaceae
Zygostelma benthami
Baillon var. lineare Asclepiadaceae) 

 
- 
  dùng   Bacopa monnieri (L.) Pennell. (Herpestis
monnieri thyme- leaved gratiola (Anh), h
chó Scrophulariaceae    Clematis chinensis Osbeck(C.minor L.),
hRanunculaceae [11],[13].
1.1.4. 
: Cây   
Tây,
              
-

Bộ phận dùng: Radix Morindae).
Chế biến: 
 ], [11], [13].
1.1.5. 
M
4



- Anthraquinone: 1,6-dihydroxy-2,4-dimethoxyanthraquinone, 1,6-dihydroxy-
2-methoxyanthraquinone, methylisoalizarin, methylisoalizarin-1-methyl ether, 1-
hydroxy-2-methoxyanthraquinone, 1-hydroxy-2-methylanthraquinone, physcion, 1-
hydroxy-anthraquinone, 2-methylanthraquinone, lucidin--methyl ether, 2-
hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone, rubiadin và rubiadin-1-methyl ether,
tectoquinon, alizarin-1-methylether, 1-hydroxy-2,3dimethylanthraquinon, 1-
hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinon [25].
- Iridoid: monotropein, morindolid, morofficinalosid, asperulosid, acid
asperulosidic, acid desacetyl asperulosidic [13],[25].

- Glucoside: nystose, 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharide
and heptasaccharide, l-borneol-6-o--D-apiosyl- -D-glucosid [13].
-  -
ursan: acid rotungenic. -5-hydroxyhexan-4-olid. 24-
ethylcholesterol, 1 ceton (officinalisin), 1 vài acid amin [11], [13].
- [5], [11].
1.1.6. 
a) Tác dụng tăng lực.
٭ -

٭           
4
Cl) trên
-
4
Cl.

a

b) Tác dụng chống viêm.
٭ 
chân ch
a kích có
[5], [10].
5



c) Nghiên cứu một số tác dụng nội tiết.
٭ 

tác              



٭ 
[5], [10].
d) Hạ đường huyết và giảm stress.

 
TM3
].
Oligosaccharid: có tác dng chng trm cm, chng t bào thn
kinh do corticosteron, có rt nhiu th nghim lâm sàng chng minh viên nang
oligosaccharid t Ba kích có th cha tr chng trm cm m nh và va, hiu
qu cha tr i fluoxetin hydrochlorid, phn ng ph rt ít và nh, có
th áp dng trong cha tr chng trm cm m nh và va [15], [19], [21].
        : acid succinic, nystose, 1-F-
fructose-
e) Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ.
- i

 
].
f) Tác dụng trên xương.
Anthraquinon và Polysaccharid  n vi u ch  
ng s  bào tin vivo, và có tác dng
u tr bn s 
6

tác dng bo v, chng mht tính ca
các enzyme chng oxy hóa c  , làm gi ng MDA (Malodialdehyd)
trong chut cng th nghim. So sánh vi chu c ki   ng,
 xut hin c-2, Cbfal, Rrankl, rOPG,
     u tr b     u
 ng trong s phát trii cht c  n [15],
[31].
 

Anthraquinon:  c báo cáo có tác dng gi  ng viêm, kháng
khun, chng oxy hóa, chng HIV [17], [31].
Ba hp cht anthraquinon: 1, 3, 8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinone, 2-
hydroxy-1-methoxy-c chng minh là có tác dng bo
v chng li s c hin ct b bung trng  chut.  n 0,1
- 10µmol/l chúng làm gim các l u tr lic lp,
làm ging t bào hc ch tartrate resistant acid phosphates
(TRAP), enzim cathepsin K, th th calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CA
II) là nhng thành phc hiu cho hong ca t bào h
hp cht này còn có tác dng chn s báo hiu cho t bào hca NK-
(nuclear factor kappa B ) và JNK (c-Jun N-ng thu chnh t
l OPG/RANKL (Osteopro-tegerin / receptor activator of NF-a t bào
t], [31].
g) Độc tính cấp.
LD
50
a Ba kích là 193g/kg.

1.1.7. 


 ],[10], [11], [13].
7



* a
 

 


*              


 hi dùng
B
a kích và vitamin B
* Trong nhân dân, Ba kích là mt v thuc b trí não và tinh khí, dùng cha
các bnh li, sm xut tinh, di mng tinh, ph n kinh nguyu
phong thc khí, gân ct yu mi.
            -12g/ngày

* Kiêng kị: 
1.1.8. 
* Huyết áp cao: 


* Lưng gối đau mỏi, mặt trắng nhợt nhạt, chân tay lạnh: Ba kích

* Thận hư, dương ủy, di tinh: 


* Dùng chữa người già yếu, chân gối tê mỏi: 10g,
 
[4],[5],[11], [13].
8



1.1.9. 
1.1.9.1. 

 
]. (Hình 1.2)
1.1.9.2. 
Vi phẫu rễ: -




   
]. (Hình 1.4)
Soi bột:Bt có màu nâu nht, v u. Soi kính hin vi thy:
Mnh bn gm các t bào hình ch nht, mnh mô mm cu to bi các t bào hình
nhiu cnh thành mng, mt s t bào cha bó tinh th calci oxalat hình kim, dài
kho n gãy ca chúng. Ri rác có các ht tinh bt và nhiu
mm [2]. (Hình 1.3)



9

Hình 1.2. Rễ Ba kích (Radix Morindae)

Hình 1.3. Một số đặc điểm bột Ba kích.
1. Mnh bn; 2. Mnh mô mm;
3,7. Mnh mch; 4. T bào cng;
5. Tinh th calci oxalat; 6. Ht tinh bt.

Hình 1.4. Vi phẫu rễ.

10



1.1.9.3. 

- Ly 0,2g bc liu, ti c tinh th màu vàng.
Khi thêm dung dch kim s ng  tím [2].
- c liu vi 1ml dung dch natri hydroxyd 10% (TT) và
c, ri ln phn 
ether ethylic (TT), lc. Lp dung dch ammoniac s nhu bn vng [2].
* Định tính bằng SKLM:
Bảng 1.1. Một số phương pháp SKLM định tính Ba kích.
ng

u kin khác
Kt qu
e
0

40
0
C)- EtOAc -CH
3
COOH


Bn mng silicagel G
Th tích chm mu: 10µl
TT hin màu: dd kali
hydroxyd 10% trong ethanol
n 3 vt màu
 [2].
-EtOAc-HCOOH
(75:25:1)

Các vt phát
quang/UV [14].
-EtOAc-HCOOH
(75:25:1)
TT: KOH 5%/EtOH
V [14].
n-BuOH-H
2
0-CH
3
COOH
(4:5:1)
TT: acid boric 10%- acid
oxalic 10% (2:1)
Vt màu xanh phát
/UV [14].
n-BuOH- EtOAc-H
2
0-
CH
3
COOH (4:3:2:1)
TT: valilin/acid phosphoric
50%

Các vt màu xanh tím
m [14].
Toluen-EtOAc- HCOOH
(8:2:0,1)
TT: dd NaOH 5%

Các vt màu/UV
254nm [24].
* Định tính bằng HPLC: nh tính nhóm Anthranoid.
- Ct: C18 (150×4,6; 5µm)
- ng: Dung môi A: MeOH
Dung môi B: Acid acetic 1%
- Nhi ct: 30
0
C
- T dòng: 1ml/phút
- Detector: 280nm [22]
Gradient:
11



Thi gian (phút)
Dung môi A (%)
Dung môi B (%)

0-25
55% -75%
45%-25%
Kết quả: Trên s có các a 5 anthranoid: alizarin-1-methylether,
1,2-dimethoxy-3-hydroxyanthraquinone,1-hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone,
rubiadin-1-methylether and anthragallol-2-methylether. (Hình 1.5)



1.2.   (HPLC)

1.2.1. 
    



               
[3], [1].

. 

[1].
Hình 1.5. Định tính bằng HPLC 5 anthranoid .

12



t nhi c làm nhim v tách mt hn
hp cht phân tích. Nó là nhng cht rn, xc ht rt nhng kính t 3 
10 m, din tích b mt hng t 50  500 m
2
/g [1], [16].
1.2.2. Detector dùng trong HPLC
* Phát hiện chất phân tích có thể dựa vào:
-               

- 

* Detector cần đáp ứng các yêu cầu :
- 

- 
p.
- V
- Kh
- Í

- DAD: là detector có
g  


 
[3],[1],[16].
1.2.3. 
* Hệ số phân bố K (Partition coefficient) [1]
T di chuyn ca chc nh bi h s phân b K
K=C
s
/C
M

C
s
, C
M
: lt là n mol ca chng
13



Ái li ca cht tan vi 2 pha s ng giá h s K. Tr s K càng

ln, s di chuyn ca chm. Nu các cht trong hn hp
có hng s K khác nhau càng nhiu thì kh n ra càng d 
* Thời gian lưu t
R
(Retention time): là khong thi gian t lúc tiêm mu vào cn
n detector. T di chuyn ca nó bng t di chuyn ca các phân
t ng [1].
* Thời gian chết t
0
: là thi gian ca các ch [1].
* Thời gian lưu hiệu chỉnh t
R

R
 t
0
* Hệ số dung lượng k’ (Capacity factor) [1].
Biu th kh  ca chng vi sc cha ca ct,
tc là t s ging chng chng 
thm cân bng .
0
00
'
'
R
R
tt
t
k
tt





Cn chn cm trong khong t
* Hệ số chọn lọc α (Selectivity factor)
'
'
B RB
A RA
kt
kt



c   m
 tách riêng 2 chng ch
* Hiệu lực cột N
Hiu lc cng thông s: S t N ca ct
2
16
R
t
N
W




hoc

2
12
5,54
R
t
N
W






t
R
: th
 r

* Độ phân giải R
s
(resolving power)
Biu th  tách ca các cht ra khi nhau trong mu kin sc ký 
14



 
2
WW
RB RA

s
AB
tt
R




Hoc
 
   
1 2 1 2
1,18
WW
RB RA
s
AB
tt
R




t
R
: th
 r
Khi: R = 0,75 hai pic không tách tt
R= 1 hai pic tách khá tt
R= 1,5 hai pic tách gn hoàn toàn

Yêu cu R > 1, t

1.3. Monotropein

Hình 1.6. Công thức của Monotropein
Tên khoa hc: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)-1,4a,7,7a-
tetrahydro-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid.
*  
-2 (COX-
---
 
-
---
            
  
- CTPT: C
16
H
22
O
11

- TLPT: 390.34
- .
- 
- 235 nm.
15

-


- 
[15],[17].[26].
























16


2.1. 
2.1.1. 
Mc liu và dch chit Ba kích do VKNTTW cung cc kim tra
t tiêu chuc liu vào.
2.1.2. 


Hình 2.1. Máy HPLC Agilient Technologies 1200
- Máy HPLC Agilient Technologies 1200.
- Ni cách thy, ni ct quay.
- B lc dung môi, màng lc 0,45m.
- Pipet chính xác và các dng c thy tinh cn thit khác.
- Máy lc siêu âm.
- Cân phân tích.
- T sy, t ht.
- Bình nón 500 ml.
- B dng c sinh hàn.
* Hóa cht, thuc th:
t tiêu chuc cung cp bi VKNTTW:
- Ethanol tuyi.