Establishment of protocol and development of PCR kit for detection of y chromosomal microdeletions in men with azoospermia

MỤC LỤC

TÓM TẮT ............................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................................ v
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... vi
BÁO CÁO TĨM TẮT TÌNH HÌNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN ...............................vii
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Bệnh Azoospermia ..................................................................................................... 1

1.1.1. Khái niệm Azoospemia .......................................................................................................... 1
1.1.2. Phân loại ..................................................................................................................................... 1
1.1.3. Nguyên nhân di truyền gây bệnh Azoospermia .............................................................. 2
1.1.4. Nhân tố azoospermia và các kiểu đột biến vi mất đoạn phổ biến ............................. 3
1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán phát hiện ............................................................................. 4
1.1.6. Phương pháp điều trị .............................................................................................................. 6
1.2.

Multiplex polymerase chain reaction......................................................................... 7

1.2.1. Polymerase chain reaction (PCR) ....................................................................................... 7
1.2.2. Multiplex-PCR......................................................................................................................... 8
1.2.3. Ứng dụng................................................................................................................................... 8
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
2.1.

Vật liệu ....................................................................................................................... 9

2.1.1. Dụng cụ - Thiết bị ................................................................................................................... 9
2.1.2 Vật liệu sinh học ........................................................................................................................ 9
2.1.3 Mơi trường và hóa chất .......................................................................................................... 11
2.2.

Phương pháp ............................................................................................................ 11

2.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1963,
pHT1964, pHT1965. ......................................................................................................................... 11
2.2.1.1 Thu nhận các trình tự sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 v.v ............................. 11
2.2.1.2 Thực hiện phản ứng cắt mở vòng plasmid pBluescript II KS (+) ........................ 13
2.2.1.3 Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp ............................................................ 13
2.2.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli OmniMAX......................................................... 13


2.2.1.5 Sàng lọc dòng E. coli OmniMAX mang các vector mục tiêu. .............................. 14
2.2.2 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng Multiplex-PCR phát hiện vi mất
đoạn với mồi được thiết kế mới. .................................................................................................... 17
2.2.2.1 Khảo sát khả năng hoạt động và tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế mới 17
2.2.2.2 Khảo sát nồng độ phức hợp mồi A và B .................................................................... 17
2.2.2.3 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi ........................................................................................ 17
2.2.2.4 Khảo sát sơ bộ nồng độ Mg2+......................................................................................... 17
2.2.2.5 Khảo sát nồng độ khuôn DNA....................................................................................... 18
2.2.2.6 Khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng................................................ 18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1.

Tạo dòng các vector tái tổ hợp mang trình tự DNA marker của NST Y ................. 19

3.1.1. PCR thu nhận các trình tự DNA marker của NST Y .................................................. 19

3.1.2. Sàng lọc sơ bộ các khuẩn lạc E. coli OmniMAX mang các vector tái tổ hợp bằng
kháng sinh và X-gal........................................................................................................................... 19
3.1.3. Sàng lọc các khuẩn lạc E. coli OmniMAX mang các vector tái tổ hợp bằng PCR
khuẩn lạc .............................................................................................................................................. 20
3.1.4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR đặc hiệu........................................ 21
3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn .............................................. 22
3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng Multiplex-PCR phát hiện vi
mất đoạn trên NST Y với mồi được thiết kế mới ............................................................... 23
3.2.1. . Kết quả khảo sát khả năng hoạt động và tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế
mới .... .............................................................................................................................. 24
3.2.2 Kết quả khảo sát nồng độ từng mồi trong trong phức hợp mồi A và B ................. 24
3.2.3 Kết quả khảo sát sơ bộ nồng độ Mg2+ ............................................................................. 25
3.2.4 Kết quả khảo sát dãy nhiệt độ bắt cặp mồi .................................................................... 26
3.2.5 Kết quả khảo sát nồng độ khuôn DNA ........................................................................... 26
3.2.6 Kết quả khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng .................................... 27
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ
4.1.

Kết luận .................................................................................................................... 28

4.2.

Đề nghị ..................................................................................................................... 28


TÓM TẮT
Vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể (NST) Y là một trong những nguyên nhân gây vô sinh ở
nam giới, chiếm tỉ lệ từ 2-10% và xảy ra thường xuyên tại 3 vùng AZFa, AZFb, AZFc
(nhân tố azoospermia) thuộc cánh dài nhiễm sắc thể (NST) Y. Hiện nay việc chẩn đoán vi
mất đoạn trên NST Y hầu như là bắt buộc trước khi tiến hành lựa chọn các phương pháp

điều trị hay hỗ trợ sinh sản tiếp theo tại các bệnh viện và trung tâm điều trị vô sinh hiếm
muộn. Để phát hiện vi mất đoạn trên 3 vùng AZF, SRY, ZFY của NST Y hiện nay phải sử
dụng kỹ thuật Multiplex – PCR do European Academy of Andrology/European Molecular
Genetics Quality Network (EAA/EMQN) đưa ra. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp
này là sản phẩm Multiplex – PCR có kích thước tương đương nhau nên vạch điện di rất
gần nhau, gây khó khăn cho thao tác chẩn đốn. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã
thiết kế lại các cặp mồi cũng bắt cặp trên vùng gene được EAA/EMQN khuyến cáo nhưng
sản phẩm PCR có kích thước khác biệt rõ rệt, vạch DNA điện di phân tách xa nhau nhằm
tạo thuận lợi cho cơng tác chẩn đốn. Bên cạnh đó, chúng tơi cũng đã tạo được những
plasmid tái tổ hợp có mang các gene cần kiểm tra để làm mẫu đối chứng cho bộ kit.

i


ABSTRACT
Microdeletions on the Y chromosome is one of the causes that makes men infertile,
accounting for 2-10% of all infertility cases, and occurs frequently at 3 regions of the Ychromosome long arm namely AZFa, AZFb and AZFc (azoospermia factor). Currently,
the diagnosis of microdeletions on the Y chromosome is almost mandatory in institutes
and centers for infertility diseases before selecting treatment or assisting methods. To
detect microdeletions in AZF, SRY and ZFY regions, the current approach is a Multiplex –
PCR assays offering by European Academy of Andrology/European Molecular Genetics
Quality Network (EAA/EMQN). However, the drawback of this method is the PCR
products were similar in size and then the DNA electrophoresis bands ran very closely on
gels that makes it difficult to manipulate the diagnosis. Therefore, in this study, we have
redesigned primer pairs matching with genes also be recommended by EAA/EMQN but
the PCR products are distinctly different in sizes, making the DNA electrophoresis bands
take apart further to facilitate the diagnosis. Besides, we also have created recombinant
plasmids carrying the marker genes for the control sample in kits.

ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase Chain Reaction

CFTR

Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator

AZF

Azoospermia Factor

LH

Luteinizing Hormone

FSH

Follicle - Stimulating Hormone

TEX 101

Testis Expressed 101

ECM1

Extracellular Matrix Protein 1

TESE

Testicular Sperm Extraction

NST

Nhiễm Sắc Thể

IVF

In Vitro Fertilisation

dNTP
ICSI

deoxy Nucleotide Triphosphate
Intra-Cytoplasmic Sperm Injection

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Trình tự các mồi oligonucleotide cho các phản ứng PCR …...…..…....…..10
Bảng 2.2. Kích thước sản phẩm dự kiến và mồi dùng cho PCR thu các trình tự
marker…........................................................................................................................12
Bảng 3.1. Kích thước sản phẩm cắt giới hạn kiểm tra các plasmid tái tổ hợp……..…22
Bảng 3.2. Nồng độ từng cặp mồi sử dụng trong phức hợp mồi A và B………………24

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Sơ đồ minh họa vị trí của 3 vùng gene AZF trên cánh dài nhiễm sắc thể Y .. 3
Hình 1.2. Kết quả chẩn đoán phát hiện vi mất đoạn AZF trên NST Y theo phương
pháp multiplex-PCR do EAA/EMQN khuyến cáo. ........................................................ 6
Hình 1.3. Cơ chế của một phản ứng PCR điển hình ...................................................... 8
Hình 2.1. Thang DNA (ZipRulerTM Express DNA Ladder Set – Fermentas).............. 11
Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thu DNA marker dành cho tạo dòng .... 12
Hình 2.3. Sơ đồ vị trí tương ứng của mồi ON1267 và ON1268 trên các vector mục
tiêu ................................................................................................................................. 15
Hình 2.4. Tóm tắt qui trình tạo dịng vector pHT1959................................................. 16
Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR thu các trình tự DNA
marker trên NST Y ........................................................................................................ 19
Hình 3.2. Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào E. coli OmniMAX và sàng lọc trắng
xanh trên môi trường LB-agar-Amp-Xgal. ................................................................... 20
Hình 3.3. Kết quả điện di các sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc pHT1959, pHT1960,
pHT1961, pHT1962, pHT1964. .................................................................................... 21
Hình 3.4. Kết quả điện di các sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc pHT1963, pHT1965.
....................................................................................................................................... 21
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu kiểm tra từng plasmid tái tổ hợp .. 22
Hình 3.6: Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng EcoRI và BamHI. ................. 23
Hình 3.7. Kết quả điện di các sản phẩm PCR với từng cặp mồi riêng lẻ ..................... 24
Hình 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgCl2 ......................................... 25
Hình 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp mồi ................................. 26
Hình 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ khuôn DNA. ............................. 27
Hình 3.11. Kết quả khảo sát nồng độ phức hợp plasmid làm đối chứng ..................... 28

v

LỜI CẢM ƠN

Chân thành cảm ơn Cơ quan chủ quản Đại học Quốc Gia TP. HCM và Cơ quan chủ trì Đại học Khoa
học Tự nhiên TP. HCM đã tài trợ kinh phí, cung cấp cơ sở vật chất cho chúng tôi thực hiện đề tài này.
Chân thành cảm ơn Phịng Khoa học Cơng nghệ, Phịng Tài vụ, Phịng Quản trị thiết bị, Ban Chủ
Nhiệm khoa Sinh Học đã giúp đỡ chúng tôi trong công tác giấy tờ và hậu cần.
Chân thành cảm ơn các thầy cô và các bạn sinh viên của Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian qua.
Chân thành cảm ơn các thành viên trong nhóm nghiên cứu đã ln đồng hành và hỗ trợ lẫn nhau trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.

vi


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.1. Bệnh Azoospermia
1.1.1. Khái niệm Azoospemia
Azoospermia là một thuật ngữ dùng để chỉ tình trạng y học của một người đàn ơng khơng có hoặc
có rất ít tinh trùng trong tinh dịch. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản, thậm chí
có thể dẫn đến vô sinh. Tuy nhiên, nhiều dạng azoospermia, nhất là các dạng không do yếu tố di
truyền, hiện nay đã có thể được điều trị y tế thành công. Ở người, azoospermia ảnh hưởng đến
khoảng 1% tổng số nam giới [11] và chiếm 20% tổng số nguyên nhân gây vơ sinh nam [10].
1.1.2. Phân loại
Azoospermia có thể được phân loại thành 4 nhóm chính dựa vào mức độ ảnh hưởng đến

q trình sinh tinh và tính nghiêm trọng, bao gồm:
Pretesticular azoospermia
Nhóm bệnh nhân azoospermia này đặc trưng bởi sự phát triển khơng đầy đủ của tinh hồn
hoặc ống sinh dục do hoạt động rất thấp của hormone kích thích nang (Follicle-stimulating
hormone – FSH), dẫn đến tinh trùng được sản xuất khơng đầy đủ, chưa trưởng thành, có ít hoặc
khơng có tinh trùng. Ngun nhân điển hình gây ra trình trạng này bao gồm suy tuyến yên
(hypopituitarism), thừa prolactin (hyperprolactinemia) hoặc sự ức chế FSH bởi testosterone ngoại
sinh [3]. Pretesticular azoospermia chiếm khoảng 2% tổng số các trường hợp mắc azoospemia trên
thế giới [10] và có thể điều trị bằng cách thu nhận tế bào mầm, biệt hóa và thụ tinh in vitro.
Testicular azoospermia
Trong trường hợp này, tình trạng tinh hồn khơng bình thường, teo hoặc khơng có tinh
hồn, dẫn đến việc sản xuất tinh trùng bị ảnh hưởng nghiêm trọng và khiến cho hoạt động của
FSH có xu hướng tăng cao (hypergonadotropic) do cơ chế điều hòa bị gián đoạn. Testicular
azoospermia chiếm khoảng 49% - 93% tổng số trường hợp mắc azoospermia trên toàn thế giới
[10] với nguyên nhân chủ yếu do các rối loạn di truyền bẩm sinh như hội chứng Klinefelter, đột
biến vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể (NST) Y [8] hoặc các nguyên nhân khách quan như nhiễm
trùng, phẫu thuật hay xạ trị. Nhìn chung, đối với các bệnh nhân azoospermia thuộc nhóm này, việc
điều trị khá phức tạp do một số trường hợp có thể khơng thu nhận được tế bào mầm [12]. Ngồi
ra, các phân tích sai hỏng di truyền cũng là điều kiện chẩn đoán bắt buộc trước khi đưa ra phác đồ
điều trị thích hợp.
Posttesticular azoospermia
1


Chương 1: Tổng quan tài liệu

Bệnh nhân thuộc nhóm này vẫn có cơ chế sinh tinh bình thường nhưng khơng được xuất ra
ngồi trong q trình xuất tinh. Hiện tượng này ảnh hưởng khoảng 7% - 51% tổng số đàn ông mắc
bệnh azoospermia [10]. Nguyên nhân chủ yếu bởi các chướng ngại vật lý ở vùng sinh dục nằm
ngoài tinh hoàn (posttesticular) như tắc nghẽn ống dẫn tinh do nhiễm trùng hay phẫu thuật, hoặc

bởi các rối loạn như hiện tượng bất sản ống dẫn tinh bẩm sinh. Ngoài ra, xuất tinh ngược cũng
được xếp vào nhóm bệnh posttesticular azoospermia. Việc điều trị đối với nhóm bệnh nhân này
khá đơn giản do dễ dàng thu được tinh trùng đã trưởng thành từ người bệnh.
Idiopathic azoospermia
Idiopathic azoospermia bao gồm các trường hợp khơng có tinh trùng trong tinh dịch nhưng
chưa biết rõ nguyên nhân. Nó có thể là kết quả tổng hợp của nhiều yếu tố nguy cơ như tuổi tác và
trọng lượng cơ thể. Một nghiên cứu năm 2013 đã quan sát thấy có một mối liên hệ mật thiết giữa
tình trạng thừa cân ở người và tình trạng ít tinh trùng trong tinh dịch, tuy nhiên cơ chế gây bệnh
hiện vẫn chưa được giải thích rõ ràng [13].
1.1.3. Nguyên nhân di truyền gây bệnh Azoospermia
Hầu hết các dạng azoospermia bao gồm pretesticular, testicular và posttesticular đều có thể
liên quan đến các sai hỏng di truyền. Tần suất xuất hiện các đột biến trên DNA bộ gene tỷ lệ
nghịch với số lượng tinh trùng được sản xuất. Do đó, nam giới mắc azoospermia được coi là có
nguy cơ cao nếu có từ 10% - 20% sai hỏng di truyền so với dưới 1% đối với nam giới bình thường
[10].
Các sai hỏng dẫn đến sự suy giảm hoạt động của hormone GnRH hoặc gornadotropin là
nguyên nhân di truyền phổ biến nhất dẫn đến pretesticular azoospermia. Trong khi đó, testicular
azoospermia lại chắc chắn xảy ra ở những bệnh nhân mắc hội chứng Klinefelter (XXY) và XX
male, là những hội chứng liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính. Ngồi ra, một nghiên cứu cũng đã
chỉ ra rằng 13% đàn ông mắc bệnh azoospermia có nguyên nhân liên quan đến các vi đột biến trên
nhiễm sắc thể giới tính Y [8]. Một vùng trên cánh dài NST Y được gọi là Azoospermia factor
(AZF) được chia thành các vùng nhỏ hơn là AZFa, AZFb và AZFc [16]. Những sai hỏng trên các
vùng này, phổ biến là các đột biến vi mất đoạn, có thể dẫn đến tình trạng ít tinh trùng hoặc khơng
có tinh trùng trong tinh dịch [7]. Đối với posttesticular azoospermia, nguyên nhân di truyền được
xác định chủ yếu là một số đột biến điểm trên gene cystic fibrosis transmembrane conductance

2


Chương 1: Tổng quan tài liệu

regulator (CFTR), dẫn đến các bất thường trong q trình hình thành và biệt hóa ống dẫn tinh, gây
ra hiện tượng bất sản ống dẫn tinh bẩm sinh [6].
Việc chẩn đoán di truyền là một trong những điều kiện bắt buộc trước khi tiến hành điều trị
đối với những bệnh nhân mắc bệnh azoospermia nhằm tầm sốt kịp thời các sai hỏng, từ đó đưa ra
phương pháp điều trị thích hợp như sinh con gái theo ý muốn hoặc xin tinh trùng từ ngân hàng,
tránh tình trạng các sai hỏng đó có thể được phát tán sang thế hệ tiếp theo.
1.1.4. Nhân tố azoospermia và các kiểu đột biến vi mất đoạn phổ biến
Azoospermia factor (AZF) được đưa ra bởi HUGO Gene Nomenclature Committee
(HGGNC) nhằm chỉ chung một tập hợp các gene nằm trên NST Y, chịu trách nhiệm mã hóa
những protein chức năng quan trọng trong quá trình sinh tinh. Những đột biến trên vùng này có
thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự hình thành tinh trùng và dẫn đến vô sinh. AZF được chia
thành các vùng nhỏ hơn bao gồm AZFa, AZFb, AZFc (Hình 1.1) [16].

Hình 1.1. Sơ đồ minh họa vị trí của 3 vùng gene AZF trên cánh dài nhiễm sắc thể Y [5]
Vi mất đoạn trên 3 vùng gene này được biết đến lần đầu tiên trong nghiên cứu của Vogt và
cộng sự (1992) [15]. Theo đó, mỗi vùng gene bị mất đoạn có thể có kiểu hình với các mức độ
thiếu hụt tinh trùng khác nhau. Mất đoạn AZFa chỉ hình thành đến tế bào Sertoli, mất đoạn AZFb
tinh trùng chỉ phát triển đến giai đoạn thứ ba của sự phân bào (pachytene) và mất đoạn AZFc tinh
trùng chỉ phát triển đến giai đoạn tinh tử (spermatid) [16]. Phần lớn các cơng trình nghiên cứu liên
quan đều cho thấy vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở bệnh nhân vô sinh nam xảy ra ở một trong
ba vùng gene này, trong đó AZFc là vùng phổ biến nhất. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa kiểu vi mất
đoạn trên vùng AZF và kiểu hình cụ thể vẫn chưa được chứng minh một cách thống nhất trong các
nghiên cứu khác nhau.
3


Chương 1: Tổng quan tài liệu

1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán phát hiện

Azoospermia được xem là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây vơ sinh nam và do
đó thường được tiến hành chẩn đoán trước tiên.
Phương pháp sơ khởi nhất là đếm tinh trùng dưới kính hiển vi nhằm đánh giá số lượng tinh
trùng trong tinh dịch thu ở hai thời điểm xuất tinh khác nhau. Việc đánh giá này được thực hiện
kèm theo các khảo sát về lịch sử gia đình; tình trạng sức khỏe và thể chất; các yếu tố tâm lý như
stress, trầm cảm; các thói quen không lành mạnh như hút thuốc, uống rượu; lịch sử sử dụng thuốc
hay các can thiệp y tế trước đây, đặc biệt là phẫu thuật đường sinh dục hoặc các liệu pháp sử dụng
hormone sinh dục nếu có. Việc đánh giá này về cơ bản sẽ tìm ra nguyên nhân gây vơ sinh có phải
do azoospermia hay khơng. Tuy nhiên, đây chỉ là những kết luận ban đầu mang tính sàng lọc và
tham khảo, cần phải tiến hành thêm các chẩn đoán sâu hơn cơ chế gây azoospermia, nhất là các sai
hỏng trên cơ quan sinh dục, hoạt động của các hormone cũng như có sự tham gia của các yếu tố di
truyền hay không.
Đối với các sai hỏng trên cơ quan sinh dục, sự vắng mặt bẩm sinh của các ống dẫn tinh có
thể được phát hiện bằng siêu âm qua trực tràng, sau đó được kiểm chứng di truyền có phải do đột
biến gene CFTR hay khơng [17]. Phương pháp siêu âm còn cho phép phát hiện các bất thường về
mặt giải phẫu học của các ống dẫn tinh cũng như các tắc nghẽn nếu có. Hiện tượng xuất tinh
ngược có thể được phát hiện bằng cách khảo sát sự hiện diện của tinh trùng trong nước tiểu.
Về mặt nội tiết, nồng độ thấp của các hormone LH và FSH đi kèm với nồng độ thấp hoặc
bình thường của testosterone là chỉ thị cho pretesticular azoospermia, trong khi đó nồng độ cao
của gonadotropin là chỉ thị cho testicular azoospermia. Tuy nhiên, sự khác biệt này thường không
rõ ràng và khó khăn trong chẩn đốn. Ngồi ra, các protein trong tinh dịch như TEX101 và ECM1
gần đây cũng được chứng minh cho phép chẩn đoán và phân loại các dạng azoospermia, đồng thời
cũng cho phép dự đốn có tinh trùng trong tinh hồn hay khơng [2], từ đó có thể áp dụng phương
pháp TESE trong việc điều trị.
Đặc biệt, những bệnh nhân azoospermia do suy tuyến yên hoặc phát hiện thấy sự phát triển
bất thường của tinh hoàn (testicular azoospermia) thường liên quan đến các sai hỏng di truyền, do
đó được khuyến cáo tiến hành ngay các xét nghiệm như karyotype và chẩn đoán vi mất đoạn trên
NST Y [17].
4

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chẩn đoán các đột biến vi mất đoạn trên NST Y được thực hiện thông qua việc tách chiết
DNA bộ gene từ các tế bào bạch cầu trong máu người bệnh, sau đó trộn với một số cặp mồi đặc
hiệu tương ứng với một số marker trong khoảng hơn 300 marker di truyền đã biết trên NST Y liên
quan đến azoospermia và tiến hành phản ứng polymerase chain reaction (PCR) và điện di trên gel
agarose nhằm phát hiện sự khuếch đại các đoạn DNA marker mục tiêu, từ đó kết luận có sự mất
đoạn trên các vùng trình tự của NST Y tương ứng với các marker đó hay khơng [18]. Tuy nhiên,
phương pháp này chỉ được thực hiện trên một vùng rất nhỏ trong tổng số 20 triệu cặp base của
NST Y. Do đó, độ nhạy và độ chính xác phụ thuộc rất lớn vào việc lựa chọn marker cũng như số
lượng các marker trong một thử nghiệm.
Năm 1999, EAA/EMQN (European Academy of Andrology (EAA) và European
Molecular Genetics Quality Network) đã công bố một danh sách chi tiết các quy trình cũng như
hướng dẫn và khuyến nghị nhằm nâng cao chất lượng các xét nghiệm chẩn đốn vi mất đoạn.
Trong đó, quy trình cơ bản phát hiện vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y ở vùng AZF được chứng
minh cho độ chính xác và độ nhạy cao [14]. Ngày nay, tuy sự hiểu biết cũng như các thành tựu
trong nghiên cứu về trình tự và cơ chế gây đột biến vi mất đoạn trên NST Y đã gia tăng đáng kể
nhưng quy trình chẩn đoán năm 1999, dựa trên 2 phản ứng Multiplex-PCR khuếch đại các marker
trên cả 3 vùng AZF (Hình 1.2), vẫn cịn ngun giá trị trong cơng tác chẩn đốn bệnh
azoospermia do yếu tố di truyền. Tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đốn đột biến gene, trong đó có
đột biến vi mất đoạn trên NST Y gây bệnh azoospermia, là giải trình tự DNA. Tuy nhiên, phương
pháp này hiện tại vẫn tốn khá nhiều chi phí và vẫn chưa được sử dụng rộng rãi trong các xét
nghiệm lâm sàng.

5


Chương 1: Tổng quan tài liệu

Hình 1.2. Kết quả chẩn đoán phát hiện vi mất đoạn AZF trên NST Y theo phương pháp
multiplex-PCR dưa trên hai bộ mồi multiplex A và multiplex B do EAA/EMQN khuyến cáo.
(1): thang phi X-Healll; (2): nước, (3): DNA nữ; (4): DNA nam giới bình thường; (5): DNA
nam giới mất đoạn AZFb; (6): DNA nam giới mất đoạn AZFc [14].
1.1.6. Phương pháp điều trị
Pretesticular và posttesticular azoospermia có thể được điều trị tương đối đơn giản. Trong
khi đó testicular azoospermia phải điều trị phức tạp hơn, một số trường hợp chưa có phương pháp
can thiệp hiệu quả.
Đối với pretesticular, các nguyên nhân trực tiếp gây ra azoospermia như thừa prolactin hay
tăng hấp thu testosterone ngoại sinh được phát hiện và can thiệp trực tiếp bằng thuốc, protein trị
liệu hoặc thay đổi thói quen ăn uống. Trong những trường hợp này, nếu tinh hoàn vẫn phát triển
bình thường, việc sử dụng liệu pháp hormone có thể được xem xét sử dụng nhằm kích hoạt lại q
trình sinh tinh.
Ngoài ra, sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ trong những năm gần đây đã phổ
biến rộng rãi phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) với kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào
tương noãn (ICSI) cho phép thụ tinh thành công ngay cả với những tinh trùng chưa được phát
triển hoàn chỉnh. Điều này đã mở ra hy vọng cho hàng triệu cặp vợ chồng vơ sinh trên tồn thế
giới mà ngun nhân do người nam mắc bệnh testicular azoospermia. Việc thu nhận tinh trùng,
trưởng thành hoặc chưa trưởng thành, có thể được thực hiện theo nhiều cách tiếp cận khác nhau
tùy từng trường hợp cụ thể. Tuy nhiên, việc khơng có tinh trùng ở mức độ nặng do tinh hoàn
6


Chương 1: Tổng quan tài liệu

khơng bình thường hoặc khơng có tinh hồn, việc thu nhận tinh trùng rất khó khăn và hầu như
hiện nay chưa thực hiện được.
Đối với nhóm bệnh posttesticular azoospermia, việc điều trị có thể được tiến hành theo
phương pháp phẫu thuật can thiệp vào đường ống sinh dục giúp tinh trùng được xuất ra ngoài, q
trình thụ tinh diễn ra bình thường mà khơng phải tiến hành IVF. Tuy nhiên, tùy mức độ cũng như

bản chất bệnh mà một số trường hợp phải tiến hành chọc hút tinh hoặc TESE (testicular sperm
extraction) để thu nhận tinh trùng và vẫn phải tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm.

1.2. Multiplex polymerase chain reaction
1.2.1. Polymerase chain reaction (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm
nhân bản in vitro một đoạn DNA đã biết trình tự từ một hoặc một vài bản sao lên hàng triệu bản
sao mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng nhiều
trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như nhận dạng, phát
hiện các bệnh di truyền, chẩn đốn những bệnh nhiễm trùng, tạo dịng gene hay xác định huyết
thống …
Phương pháp này dựa trên một chu trình luân nhiệt và hoạt động tổng hợp DNA của một
enzyme DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt như Taq hay Pfu. Phản ứng PCR diễn ra khi hỗn
hợp chứa DNA mạch khuôn, mồi, dNTP tự do và enzyme DNA polymerase được đun nóng và
làm nguội lặp lại nhiều lần một cách liên tục theo ba giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất, khi nhiệt độ
tăng cao, toàn bộ các đoạn DNA mạch đôi tách ra thành mạch đơn. Giai đoạn thứ hai, khi giảm
nhiệt độ, các mạch đơn bắt cặp bổ sung với nhau. Tuy nhiên, do mồi chỉ là các đoạn DNA mạch
đơn ngắn nên dễ dàng bắt cặp bổ sung với mạch khn hơn so với mạch khn cịn lại. Giai đoạn
thứ ba, ở nhiệt độ thích hợp, DNA polymerase gắn vào đầu 3’ của đoạn mồi và sử dụng dNTP tự
đo để tổng hợp mạch mới theo chiều 5’- 3’, từ đó tạo ra nhiều bản sao cho đoạn DNA mục tiêu. Sơ
đồ mơ tả q trình xảy ra trong một phản ứng PCR được minh họa trong Hình 1.3.

7


Chương 1: Tổng quan tài liệu

Hình 1.3. Cơ chế của một phản ứng PCR điển hình (nguồn: Wikipedia)
1.2.2. Multiplex-PCR
Multiplex polymerease chain reaction (Multiplex-PCR) là phương pháp ứng dụng kĩ thuật

PCR để nhân bản đồng thời nhiều đoạn DNA hoặc gene mục tiêu khác nhau trong cùng một phản
ứng. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế tối ưu nhằm hoạt động
hiệu quả trong một cùng một chu trình luân nhiệt và tạo ra những đoạn khuếch đại có kích thước
khác nhau. Sự khác nhau này phải đủ lớn để hình thành các vạch điện di khác biệt trên gel, giúp dễ
dàng quan sát và phân tích kết quả. Bằng cách nhân bản nhiều đoạn DNA đặc hiệu cùng lúc, các
thơng tin cần thiết có thể được thu nhận chỉ trong một thử nghiệm duy nhất thay vì phải mất nhiều
thời gian, cơng sức và nguyên vật liệu để tiến hành nhiều thí nghiệm khác nhau. Do đó, hướng tiếp
cận này ngày càng chứng tỏ tiềm năng ứng dụng to lớn đối với công tác chẩn đoán và xét nghiệm
di truyền.
Hiện nay, các kit thương mại cho multiplex-PCR với nhiều mục đích khác nhau đã được
phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, trong đó có cả chẩn đốn phát hiện
đột biến vi mất đoạn trên nhiễm sắc thể Y liên quan đến bệnh azoospermia.
1.2.3. Ứng dụng
Multiplex-PCR được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1988 trong một nghiên cứu phát hiện
đột biến mất đoạn trên gene mã hóa dystrophin ở người [4]. Sau đó, nó cũng được sử dụng đối với
8


Chương 1: Tổng quan tài liệu

gene steroid sulfatase [1]. Đến năm 2008, multiplex-PCR đã được ứng dụng khá rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt trong hoạt động phân tích các microsatellite và SNPs trên DNA
bộ gene của nhiều sinh vật với hiệu suất cao và dung lượng phân tích rất lớn [9].
Ngồi ra, một số ứng dụng khác của multiplex-PCR bao gồm: xác định cùng lúc nhiều tác
nhân gây bệnh, phân tích nhiều loại đột biến trong cùng một mẫu DNA, định lượng sự biểu hiện
đồng thời của nhiều gene, xác định huyết thống...

9

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

2.1. Vật liệu
2.1.1. Dụng cụ - Thiết bị
Ngoài các dụng cụ cơ bản của phịng thí nghiệm, cịn có các thiết bị sau:
 Máy lắc (Pol-Eko)
 Tủ ấm (Pol-Eko)
 Nồi hấp Autoclave (SS325 – TOMY)
 Máy vortex (Biocote)
 Máy ly tâm (Eppendorf)
 Máy đo quang phổ (Boeco)
 Máy đo quang phổ chuyên dụng vi thể tích (GE Healthcare)
 Máy đo pH (TRANS instruments)
 Máy PCR (Eppendorf)
 Tủ lạnh sâu -80°C (Telstar)
 Tủ mát 4°C (Lucland Fukusima)
 Bộ điện di protein (BioRad)
 Bộ điện di agarose (Cleaver)
 Bộ nguồn (Cleaver)
 Máy khuấy từ gia nhiệt (Benchmark)
 Máy heat nhiệt (Benchmark)
 Máy đọc Elisa (BioTek-Thermo)
2.1.2 Vật liệu sinh học
Các vật liệu sinh học sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung tâm Khoa học và Công nghệ
Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, bao gồm:
 Genome nam giới bình thường

9


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

 E. coli OmniMAX
hsdRMS-mcrBC)

TM

(F´ {proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrA Δ(mrr-

Φ80lacZΔM15

Δ(lacZYA-argF)

U169 endA1recA1 supE44 thi-

1 gyrA96 relA1 tonA panD) (Invitrogen)
 Plasmid pBluescript II KS+ (Invitrogen)
 Mồi cho phản ứng PCR (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Trình tự các mồi oligonucleotide cho các phản ứng PCR dùng trong đề tài
Mồi

Trình tự mồi

Gene/DNA bắt cặp

ON1315

TTTCGAACTCTGGCACCTT

SRY

ON1316

GCCAATGTTACCCGATTGTC

SRY

ON1319

TTGCATGATTTGTGGGAAGA

ZFY

ON1320

TTGTGGACAGCCACATGTTT

ZFY

ON1324

GCCTACTACCTGGAGGCTTC

sY84

ON1325

AGGCATGTGGACACTCACAG

sY84

ON1327

GTCTGCCTCACCATAAAACG

sY134

ON1328

ACCACTGCCAAAACTTTCAA

sY134

ON1329

GTTACAGGATTCGGCTGTAT

sY255

ON1332

GACAGGAAGGGTTGGAGACA

sY255

ON1334

ACACACAGAGGGACAACCCT

sY86

ON1335

TCTGCAGGGGTCGAAGTATT

sY86

ON1337

GGCTCACAAACGAAAAGAAA

sY127

ON1338

CTGCAGGCAGTAATAAGGGA

sY127

ON1339

GGGTGTTACCAGAAGGCAAA

sY254

ON1340

GAACCGTATCTACCAAAGCAGC

sY254

ON1267

CACTATAGGGCGAATTGGAGC

10

pBluescript II KS+


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

0N1268

GCGCAATTAACCCTCACTAAAG

pBluescript II KS+

2.1.3 Môi trường và hóa chất
-

Mơi trường: LB (5 g/l Yeast extract; 10 g/l Trypton; 5 g/l NaCl), LB – Agar (5 g/l Yeast
extract; 10 g/l Trypton; 5 g/l NaCl; 20 g/l agar)

-

Enzyme: Pfu DNA polymerase 5 U/µl (Fermentas), Taq DNA polymerase 5 U/µl
(Fermentas), EcoRV 10 U/µl (Fermentas), BamHI 10 U/µl (Fermentas), EcoRI 10 U/µl
(Fermentas), T4 DNA ligase 5 U/µl (Fermentas)

-

Hóa chất điện di agarose: UltraPure Agarose (Invitrogen), SYBR® Safe DNA Gel Stain
(Invitrogen), dung dịch TAE 50X pH 8,0 (Tris-acetate 40mM; EDTA 0,1 M pH 8,0), dung
dịch nạp mẫu 6X (Bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol 40%).

-

Kháng sinh: Ampicillin 200 mg/ml

-

Thang chuẩn DNA (Fermentas) (Hình 2.2)

Hình 2.1. Thang DNA (ZipRulerTM Express DNA Ladder Set – Fermentas)Phương pháp
2.2.1

Tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1963, pHT1964,

pHT1965.
2.2.1.1 Thu nhận các trình tự sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 sY255, SRY, ZFY

11


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

Các trình tự marker trên NST Y lần lượt được nhân bản bằng phản ứng PCR với các cặp mồi
đặc hiệu và khuôn là DNA bộ gene của nam giới bình thường. Thành phần phản ứng gồm: Pfu
buffer 1X; dNTP 200 µM mỗi loại; mồi xi 0,25 pmol/µl; mồi ngược 0,25 pmol/µl; DNA bộ
gene 250 ng; enzyme Pfu 2 U; H2O vừa đủ 100 µl. Chương trình chạy PCR như được mơ tả trong
sơ đồ bên dưới, mồi và kích thước các sản phẩm PCR được thể hiện trong Bảng 2.2.

Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thu DNA marker dành cho tạo dịng

Bảng 2.2. Kích thước sản phẩm dự kiến và mồi dùng cho PCR thu các trình tự marker:
STS marker

Mồi

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

sY84

ON1324-ON1325

396

sY86

ON1334-ON1335

506

sY134

ON1327-ON1328

303

sY127

ON1337-ON1338

274

sY254 sY255

ON1329-ON1339

1756

SRY

ON1326-ON1331

694

ZFY

ON1319-ON1336

956

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kích thước và tinh sạch bằng kit

QIAquick PCR Purification (QIAGEN).
12


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

2.2.1.2 Thực hiện phản ứng cắt mở vòng plasmid pBluescript II KS (+)
Plasmid pBluescript II KS (+) được xử lý mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV để tạo
đầu bằng. Vị trí nhận biết của enzyme này là duy nhất và nằm trong vùng MCS. Với thành phần
phản ứng bao gồm: Red buffer 1X; plasmid pBluescript II KS (+) 1 µg; enzyme EcoRV 10 U;
H2O vừa đủ 100 µl. Ủ 2 giờ ở 37oC sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết
quả cắt mở vòng plasmid và tinh sạch sản phẩm cắt bằng kit QIAquick PCR Purification

(QIAGEN).
2.2.1.3 Thực hiện phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp
Marker sY84, sY86, sY134, sY127, sY254 sY255, SRY, ZFY được nối vào plasmid pBluescript
II KS+ đã mở vòng nhằm tạo vector tái tổ hợp pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962,
pHT1963, pHT1964, pHT1965. Phản ứng nối được thực hiện bằng T4 DNA ligase (Fermentas)
với các thành phần như sau: T4 DNA ligase buffer 1X; gene marker 150 ng; pBluescript II KS (+)
150 ng; enzyme T4 DNA ligase 2 U; PEG 5%; H2O vừa đủ 20 µl và ủ ở 25oC trong 1 giờ.
2.2.1.4 Biến nạp sản phẩm nối vào E. coli OmniMAX
Chuẩn bị tế bào E. coli OmniMAX khả nạp
 Nuôi E.coli OmniMAX trên môi trường LB agar ở 37oC, qua đêm.
 Cấy chuyền 1 khuẩn lạc đơn vào 20 ml môi trường LB, lắc 37oC, qua đêm.
 Cấy chuyền sang 300 ml môi trường LB, lắc ở 37oC.
 Khi OD600 đạt 0,6 tiến hành thu sinh khối (ly tâm 6000 rpm, 2 phút).
 Tiến hành các bước tiếp theo trong bồn đá lạnh.
 Huyền phù sinh khối thu được trong 20 ml CaCl2 100 mM lạnh.
 Ly tâm 6000 rpm, thu lấy tủa.
 Thêm 6 ml CaCl2 100 mM lạnh và 600 µl glycerol 100%, huyền phù nhẹ.

 Chia nhỏ mẫu với thể tích 300 µl vào các epp 1,5 ml. Bảo quản ở -80oC.
Quy trình biến nạp
Sản phẩm nối được biến nạp vào E. coli theo phương pháp hóa biến nạp và nuôi cấy trên môi
trường đĩa thạch chọn lọc bằng kháng sinh và X-gal với quy trình như sau:

13


Chương 2: Vật liệu – Phương pháp

 Cho 100 µl tế bào khả nạp E. coli OmniMAX vào eppendorf 1,5 ml chứa 10 µl sản phẩm nối.
Ủ lạnh trong đá 20 phút
 Sốc nhiệt 42oC trong 90 giây
 Tiếp tục ủ lạnh trong đá 5 phút
 Thêm 1 ml LB, lắc đều ở 37oC trong 1h
 Ly tâm 6000 rpm trong 1 phút, loại bỏ một phần dịch nổi
 Huyền phù sinh khối với phần dịch nổi còn lại rồi đem trải lên đĩa thạch LB-Agar có chứa
ampicillin nồng độ 100 µg/ml, X-gal 20 µg/ml
 Ủ đĩa ở 37oC, qua đêm.
2.2.1.5 Sàng lọc dòng E. coli OmniMAX mang các vector mục tiêu.
Sàng lọc trên môi trường kháng sinh và X-gal
Plasmid pHT1959, pHT1960, pHT1961, pHT1962, pHT1963, pHT1964, pHT1965 và cả
plasmid gốc pBluescript II KS+ đều có mang gen kháng ampicillin, do đó, những khuẩn lạc mọc
trên mơi trường thạch LB-Agar-Amp là các dòng E. coli OmniMAX đã được biến nạp thành công
chứa một trong các plasmid trên. Tuy nhiên, các khuẩn lạc mang plasmid gốc pBluescript II KS+
do còn gene β-galactosidase nên phân cắt được X-gal tạo cơ chất màu xanh, trong khi các khuẩn
lạc mang các plasmid tái tổ hợp do khơng cịn đặc tính này nên có màu trắng và được sàng lọc
thông qua màu sắc khuẩn lạc.
PCR khuẩn lạc
Chọn các khuẩn lạc E. coli màu trắng mọc trên mơi trường LB-Agar có chứa ampicillin và Xgal cho phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON1267/ON1268 nhằm sàng lọc những dòng mang

đúng vector mục tiêu. Phản ứng được thực hiện bởi enzyme Taq DNA polymerase (Trung tâm
Khoa học và Công nghệ sinh học) với các thành phần như sau: Taq buffer 1X; dNTP 200 µM mỗi
loại; mồi xi 0,25 pmol/µl; mồi ngược 0,25 pmol/µl; enzyme Taq 2 U; H2O vừa đủ 100 µl.
Chương trình chạy PCR như được mô tả trong mục 2.2.1.1.
Cặp mồi ON1267/ON1268 bắt cặp đặc hiệu với trình tự trên plasmid pBluescript II KS+
nằm ở hai đầu vùng MCS. Như vậy, các vector tái tổ hợp được sàng lọc dựa trên kích thước của
sản phẩm PCR khuẩn lạc tùy theo đoạn DNA marker được chèn vào vùng MCS. Cụ thể:
-

pHT1959 cho sản phẩm PCR có kích thước 566 bp
14