Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ đất tại TP HCM

NTTU-NCKH04
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019
Tên đề tài: Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ đất tại TPHCM
Số hợp đồng: 2019.01.62

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 04-12/2019

TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 11 năm 2019


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019
Tên đề tài: Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ đất tại TPHCM
Số hợp đồng: 2019.01.62

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Ngọc Yến
Đơn vị công tác: Khoa Dược
Thời gian thực hiện: 04-12/2019

Các thành viên phối hợp và cộng tác:
STT

Họ và tên

Chuyên ngành

Cơ quan công tác

Ký tên


M C

C

Trang
M C

C................................................................................................................... iii

DANH MUC CAC CHƯ VIÊT TĂT......................................................................... iv
DANH MUC HINH......................................................................................................v
DANH MUC BANG................................................................................................... vi
TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 8

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI IỆU...................................................................... 2
1.1. TỔNG QUAN XẠ KHUẨN................................................................................. 2
1.2. PHÂN OẠI XẠ KHUẨN................................................................................... 4
1.3. VAI TRỊ CỦA XẠ KHUẨN............................................................................... 4
1.3.1. Vai trị của xạ khuẩn trong tự nhiên...................................................................4
1.3.2. Vai trị xạ khuẩn trong cơng nghiệp và ngành dược..........................................5
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN..........................................................6
1.4.1. Ngoài nước......................................................................................................... 6
1.4.2. Trong nước......................................................................................................... 7
1.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ẬP XẠ KHUẨN........................................................7
1.5.1. Thu nhận và tiền xử lý mẫu................................................................................7
1.5.2. Phân lập xạ khuẩn...............................................................................................8
1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG ỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT.....9
1.6.1. Phương pháp đường vạch đối kháng..................................................................9
1.6.2. Phương pháp thỏi thạch......................................................................................9
1.6.3. Phương pháp giếng khuếch tán.......................................................................... 9
1.7. XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH Ý VÀ SINH HÓA CỦA XẠ
KHUẨN........................................................................................................................ 9
1.7.1. Đặc điêm hinh thai..............................................................................................9
1.7.2. Đăc điêm sinh ly va sinh hoa........................................................................... 10


1.8. ÊN MEN THU KHÁNG SINH........................................................................ 13
1.8.1. Môi trường lên men..........................................................................................13
1.8.2. Khao sat thơi điêm thu hoach dich lên men.....................................................13
1.8.3. Tách chiết phân đoạn có hoạt tính................................................................... 13
1.8.4. Hiện hình sinh học các dịch chiết có hoạt tính................................................ 14
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 15
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN IỆU....................................................................15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................15

2.1.2. Vi sinh vật thử nghiệm..................................................................................... 15
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ........................................................................................... 15
2.1.4. Hóa chất và môi trường....................................................................................15
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................16
2.2.1. Thu nhận mẫu và tiền xử lý..............................................................................17
2.2.2. Phân lập và thuần khiết hóa chủng...................................................................18
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật................................................................ 18
2.2.4. Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa............................................ 18
2.2.5. Giải trình tự gen 16S rDNA............................................................................. 21
2.2.6. Khảo sát môi trường lên men thu kháng sinh.................................................. 21
2.2.7. Xác định thơi điêm thu dich nuôi cây.............................................................. 21
2.2.8. Khảo sát dung môi chiết chất kháng sinh........................................................ 21
2.2.9. Khảo sát phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn................................................ 22
2.2.10. Phân lập phân đoạn có hoạt tính sinh học từ dịch ni cấy.......................... 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO UẬN.............................................................24
3.1. PHÂN ẬP XẠ KHUẨN................................................................................... 24
3.2. SÀNG ỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT..........................................25
3.3. XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH Ý VÀ SINH HÓA..................27
3.3.1. Đăc điêm hinh thai............................................................................................27
3.1.2. Khao sat đăc điêm sinh ly................................................................................ 32
3.1.3. Khao sat đăc điêm sinh hoa..............................................................................32
ii


3.4. ĐỊNH DANH GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S rDNA............................................. 35
3.5. KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG ÊN MEN THU KHÁNG SINH........................36
3.6. KHẢO SÁT DUNG MÔI CHIẾT CHẤT KHÁNG SINH................................ 37
3.7. KHẢO SÁT PHÂN ĐOẠN CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT..........38
3.7.1. Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng................................................................ 38
3.7.2. Xac đinh muc tiêu băng hiên hinh sinh hoc.....................................................38

3.7.3. Phân lập phân đoạn có hoạt tính sinh học từ dịch ni cấy............................ 39
CHƯƠNG 4. KẾT UẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................. 42
4.1. KẾT UẬN......................................................................................................... 42
4.2. KIẾN NGHỊ.........................................................................................................42
TAI IÊU THAM KHAO............................................................................................ 2
PH

C..................................................................................................................... 5

Phu luc 1. Thanh phân môi trương...............................................................................5
Phụ lục 2. Địa điểm lấy mẫu........................................................................................ 7
Phụ lục 3. Đặc điểm các chủng xạ khuẩn phân lập......................................................8

iii


DANH M C CÁC CH

VIẾT T T

STT Từ viết tắt

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

1

ADN

Axit deoxyribonucleic

2

ARN

Axit ribonucleic

3

ATCC

American type culture collection

4

BMVKST

5

EA

6

ISP

7

KTCC

Khuẩn ty cơ chất

8

KTKS

Khuẩn ty khí sinh

9

MHA

10

MIC

11

MRSA

12

MSSA

13

Chủng vi sinh vật chuẩn
Hoa Kỳ
Bộ môn Vi sinh - Ký sinh
tr ng

Ethyl acetate

Ethyl acetat

International

Streptomyces Chương trình phân loại xạ

Project

khuẩn Quốc tế

Muller Hinton Agar

Thạch Muller Hinton

Minimum

inhibitory

concentration
Methicillin
Staphylococcus aureus
Methicillin

Nồng độ ức chế tối thiểu

resistant Tụ
cầu

methicillin

susceptible Tụ

cầu

đề

kháng

nhạy

cảm

Staphylococcus aureus

methicillin

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng khuếch đại gen

14

Pseu

Pseudomonas aeruginosa

15

SC

Starch casein Agar

Pseudomonas aeruginosa
Môi trường tinh bột -

17
18

Strep
TCA

Streptococcus pyogenes
Trichloroacetic

Streptococcus faecalis

19

TSA

Tryptic Soy Agar

Thạch TSB

casein

iv


DANH M C H㽨NH
Hình 1.1 . Đặc điểm hình thái của bào tử [29].............................................................3
Hình 1.2 . Sự sinh bào tử trong nang bào tử [29]........................................................ 3
Hình 1.3 . Vịng đời và sự sinh bào tử của xạ khuẩn [11]........................................... 4
Hình 1.4 . Các kháng sinh được sản xuất bởi xạ khuẩn [9].........................................5
Hình 2.1 . Sơ đơ bơ tri thi nghiêm..............................................................................17
Hình 2.2 . Bản đồ khu vực lấy mẫu............................................................................17
Hình 3.1 . Một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ các khu cơng nghiệp.............. 24
Hình 3.2 . ượng chủng thu được từ các phương pháp tiền xử lý khác nhau...........24
Hình 3.3 . Số lượng chủng xạ khuẩn ức chế các vi sinh vật thử nghiệm (Ec: E. coli,
Kp: K. pneumoniae, Pa: P. aeruginosa, MRSA: S. aureus đề kháng methicillin, Sf:
S. faecalis, Ca: C. albicans)....................................................................................... 25
Hình 3.4 . Hình thái hiển vi sau khi nhuộm Gram của chủng CNC05......................31
Hình 3.5 . Các phản ứng dương tính của chủng CNC05........................................... 34
Hình 3.6 . Đường kính vịng kháng khuẩn của các loại dịch chiết chủng CNC05... 38
Hình 3.7 . Sắc ký đồ của dịch chiết EA của chủng CNC05 với hệ dung mơi có
NH4OH (bên trái) và khơng có NH4OH (bên phải)................................................... 39
Hình 3.8 . Thư nghiêm hiện hình sinh học các vết sắc ký của chủng CNC05..........39
Hình 3.9 . Khả năng kháng khuẩn của cao ethyl acetat và phân đoạn F6 có hoạt tính
sinh học....................................................................................................................... 40
Hình 3.10 . Sắc ký đồ của phân đoạn F6....................................................................41
Hình 3.11 . Phổ 3D của phân đoạn F6....................................................................... 41

v


DANH M C BẢNG

Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật d ng trong thử nghiệm.......................................... 15
Bảng 3.1. Tỷ lệ xạ khuẩn phân lập được tại các khu công nghiệp phân theo nhóm
màu..............................................................................................................................24
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn theo phương pháp
thỏi thạch (mm).......................................................................................................... 26
Bảng 3.2. Đăc điêm hinh thai của xa khuân trên các môi trương............................. 29
Bảng 3.3. Khả năng tạo sắc tố của các chủng xạ khuẩn............................................ 31
Bảng 3.4. Nhiêt đô va pH tăng trương tôi ưu............................................................ 32
Bảng 3.5. Nông đô muôi tăng trương tôi ưu..............................................................32
Bảng 3.6. Sư dung nguôn nitơ....................................................................................33
Bảng 3.7. Phản ứng đơng tụ và pepton hóa sữa.........................................................33
Bảng 3.8. Thư nghiêm kha năng san xuât enzym và các sản phẩm trao đổi chất.....34
Bảng 3.10. So sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng CNC05 với một
số chủng xạ khuẩn [41].............................................................................................. 35
Bảng 3.11. Đương kinh vong khang khuân trên ISP2 và YIM61 của chủng CNC05
.....................................................................................................................................37
Bảng 3.12. Chương trình gradient rửa giải cột HP C...............................................40

vi


TÓM T T KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sản phẩm đạt được

Sản phẩm đăng ký tại thuyết minh

Xác định được 01 chủng xạ khuẩn Xác định chủng xạ khuẩn có hoạt tính
CNC05 có hoạt tính kháng vi sinh vật kháng vi sinh vật cao
cao nhất. Dựa vào kết quả khảo sát hình
thái, sinh hóa và giải trình tự gen 16S

rDNA đã kết luận được rằng chủng trên
thuộc chi Streptomyces sp..
01 bài báo đã nộp Tạp chí Khoa học 01 bài báo đáp ứng yêu cầu của 1 công
công nghệ Đại học Nguyễn Tất Thành

trình khoa học

Hướng dẫn sinh viên Đinh Thị an inh Đào tạo 1 Dược sĩ đại học
làm khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại
học năm học 2018-2019.

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình hình đề kháng kháng sinh trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày
càng gia tăng. Việc nghiên cứu tìm kháng sinh mới ln được các nhà khoa học
quan tâm. Chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính trị liệu có thể được tạo ra bởi nhiều
loại vi sinh vật như vi khuẩn, nấm, thực vật. Trong số đó xạ khuẩn là một nhóm
quan trọng do sự đa dạng cao và khả năng tạo ra nhiều loại hợp chất mang hoạt tính
sinh học có giá trị thương mại cao.
Thành phần xạ khuẩn trong đất vô c ng phong phú, tuy nhiên trong khoảng 50 năm
qua, sự b ng nổ của các nghiên cứu sàng lọc xạ khuẩn từ đất khiến các chủng loài
mới, cũng như kháng sinh mới từ nguồn cơ chất này chạm ngưỡng bão hoà.
Thu thập mẫu đất từ những v ng địa lý, thổ nhưỡng có tính chất đặc biệt hơn là một
trong những chiến lược tìm kiếm lồi mới, kháng sinh mới từ xạ khuẩn. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi chọn các mẫu đất và nước thu thập từ khu vực ô nhiễm
quanh các khu công nghiệp tại thành phố Hồ Chí Minh như một yếu tố tạo áp lực
chọn lọc các biến chủng có tiềm năng.
Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ

đất tại TPHCM” với các nội dung như sau:
 Phân lập xạ khuẩn từ các khu công nghiệp ở TP. Hồ Chí Minh
 Sàng lọc xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật, tuyển chọn một chủng tiềm
năng.
 Khảo sát yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy và thời điểm thu hoạch đối
với chủng xạ khuẩn hoạt tính cao.
 Khảo sát điều kiện chiết xuất kháng sinh.
 Xác định mục tiêu chất kháng khuẩn bằng kỹ thuật hiện hình sinh học trên
sắc ký lớp mỏng.

viii


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI IỆU
1.1. TỔNG QUAN XẠ KHUẨN
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn gram dương, có hàm lượng G-C cao, phân bố
rộng rãi trong đất và nước [35]. Mặc d xạ khuẩn là sinh vật nhân sơ nhưng trưởng
thành dưới dạng sợi và tạo thành các bào tử.
Có hai dạng khuẩn ty là khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Sợi bám chặt vào bề
mặt thạch gọi là khuẩn ty cơ chất, cịn sợi nhơ lên bề mặt khơng khí là khuẩn ty khí
sinh. Các sợi nấm liên kết vào nhau tạo thành khuẩn lạc nhỏ gọn hình chóp nón trên
mơi trường ni cấy.
- Khuẩn ty cơ chất: các khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn khác nhau về kích thước,
hình dạng và độ dày. Màu sắc trải từ trắng hoặc gần như không màu đến vàng,
nâu, đỏ, hồng, cam, xanh hoặc đen.
- Khuẩn ty khí sinh: các khuẩn ty khí sinh thường dày hơn khuẩn ty cơ chất. Đây
được coi là một trong những tiêu chí quan trọng nhất để phân loại chi
Streptomyces thành các lồi, bao gồm cấu trúc (bơng, nhung hoặc bột), sự hình
thành vịng hoặc các v ng đồng tâm và sắc tố.
- Về hình thức sinh sản thì xạ khuẩn có thể sinh sản bằng cách phân đơi hoặc tạo

ra các bào tử trần hay bào tử đính [9].
- Chuỗi bào tử: xạ khuẩn phát triển đến một giai đoạn nhất định sẽ có sự khác biệt
ở khuẩn ty khí sinh, có khả năng sinh sản được gọi là sợi sinh bào tử. Chuỗi bào
tử có thể được chia theo chiều dài và số lượng bào tử: “di- hoặc bi-sporous” với
hai bào tử, oligosporous với một vài bào tử và polysporous với nhiều bào tử
[26]. Chiều dài, hình dạng, vị trí, màu sắc chuỗi bào tử xạ khuẩn là cơ sở quan
trọng để phân loại xạ khuẩn.
- Bào tử: sự phân chia sợi nấm và tạo thành bào tử bắt đầu với sự hình thành vách
ngăn. Đặc điểm của bào tử đóng vai trị rất quan trọng trong việc mơ tả loài.
Các bào tử được sản sinh riêng lẻ hoặc trong các chuỗi ngắn sẽ dày hơn sợi nấm,
trong khi những bào tử được tạo ra trong chuỗi dài thường có c ng đường kính
với sợi . Các bào tử dày khoảng 1 đến 2 µm, thay đổi về hình dạng và bề mặt.
Hình thái bào tử phổ biến là dạng hình cầu, hình trứng, dạng que, dạng niệu
nang và dạng thận. Một số dạng bào tử có roi, bề mặt mịn, x xì, có hạt cơm
hoặc u nhỏ.

2


Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của bào tử [29]
Hình dạng chung của bào tử: (A) Hình cầu, (B) Hình trứng, (C) Dạng vại, (D) Dạng
que, (E) Dạng niệu nang, (F) Dạng thận. oại có roi: (G) ơng roi đơn, (H) ông
roi rải rác, (I) Nhiều lông roi, (J) Nhiều lông roi đơn cực (K) Nhiều lông roi phân
cực, ( ) nhiều lông roi dưới cực. Bề mặt: (M) Mịn, (N) Có vân khơng đều, (O) Có
vân song song, (P) Hạt cơm, (Q) Hạt nhỏ, (S) Gai, (T) ông.
-

Nang bào tử: một số bào tử nằm trong túi gọi là nang bào tử, trong đó bào tử
được phát triển và giữ lại cho đến khi giải phóng để lại túi rỗng. Nang bào tử đa
dạng về hình dạng và kích thước. Chúng có đường kính từ 2-50 µm và kích

thước phổ biến nhất là 10 µm. Nang bào tử phát sinh từ khuẩn ty cơ chất hoặc
khuẩn ty khí sinh [25].

Hình 1.2. Sự sinh bào tử trong nang bào tử [29]
Nang bào tử phát triển trên khuẩn ty cơ chất. (A) Actinoplanes (gồm Ampullariella):
polysporous, (1) Hình cầu, (2) Hình trụ, (3) Dạng th y, (4) Bán cầu, (5) Không đều;
(B) Pilimelia: (6) Hình trứng, (7) Hình chng, (8) Hình trụ; (C)
Dactylosporangium: oligosporous, hình ch y. Nang bào tử phát triển trên khuẩn ty
khí sinh. (D) Planomonospora: monosporous, hình ch y; (E) Planobispora:
disporous,

hình

trụ;

(F)

Planobetraspora:

tetrasporous,

hình

trụ;

(G)

Planopolyspora: polysporous, hình ống; (H) Spirillospora: polysporous, hình cầu;
(I) Streptosporangium: polysporous, hình cầu.
3

Hình 1.3. Vịng đời và sự sinh bào tử của xạ khuẩn [11]

1.2. PHÂN OẠI XẠ KHUẨN
Xạ khuẩn có thể được phân loại theo nhiều cách. Dựa vào các đặc điểm như mơi
trường sống, hình thái học, sinh lý học, đặc điểm sinh hóa và đặc tính gây bệnh,
người ta có thể phân loại xạ khuẩn thành các nhóm khác nhau. Ví dụ như theo mơi
trường sống có các loại xạ khuẩn ưa nhiệt, xạ khuẩn acid, xạ khuẩn ưa muối, xạ
khuẩn nội sinh thực vật, xạ khuẩn cộng sinh, xạ khuẩn nội cộng sinh, xạ khuẩn
đường ruột…
Hiện nay phân loại xạ khuẩn chủ yếu dựa vào phân tích trình tự nucleotid, đặc biệt
là gen 16S rDNA [27]. Tuy nhiên, đặc tính của một lồi mới nên được xác định từ
kiểu gen đến kiểu hình, vì kể cả giải trình tự tồn bộ gen cũng rất khó để dự đốn
đặc điểm kiểu hình của một lồi. So sánh kiểu hình là cách so sánh gián tiếp vì

enzym, protein là sản phẩm của gen, biểu hiện ra ngoài [39]. Các đặc điểm kiểu
hình cổ điển của xạ khuẩn bao gồm hình thái, đặc điểm sinh lý và sinh hóa [25].

1.3. VAI TRỊ CỦA XẠ KHUẨN
1.3.1. Vai trị của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn đóng vai trị quan trọng trong tự nhiên, chúng phân hủy các chất hữu cơ
như cellulose, polysaccarid, protein, chất béo và axit hữu cơ [9]. Bên cạnh đó, xạ
khuẩn cịn cải thiện hàm lượng của các chất dinh dưỡng và khoáng chất, tăng cường
sản xuất chất chuyển hóa [12]. Ngồi ra, xạ khuẩn có khả năng kết hợp với các vi
sinh vật đất khác thực hiện quá trình cố định đạm, thối giáng các hợp chất phức tạp
như polyme trong đất ơ nhiễm giúp duy trì cân bằng sinh học, cải thiện cho đất [9].
Chúng cũng chịu trách nhiệm trong chu trình chuyển hố các hợp chất hữu cơ, ức
chế sự phát triển của một số mầm bệnh thực vật trong rễ cây, phân hủy hỗn hợp
4

polyme phức tạp trong xác động thực vật và nấm nhờ hệ enzym ngoại bào phong
phú.
Nhiều lồi xạ khuẩn có thể được sử dụng để xử lý chất thải nông nghiệp và rác thải
đơ thị thành các hóa phẩm có giá trị cao. Xạ khuẩn có vai trị quan trọng trong
ngành công nghệ sinh học thực vật nhất là các chủng có tính đối kháng chống lại
mầm bệnh thực vật rất hữu ích trong việc kiểm sốt sinh học [9].

1.3.2. Vai trị xạ khuẩn trong cơng nghiệp và ngành dược
Xạ khuẩn tạo ra các chất chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp có nhiều ứng dụng trong các
lĩnh vực khác nhau. Một số ứng dụng quan trọng của xạ khuẩn trong các ngành
công nghiệp như: sản xuất kháng sinh, enzym, chất hoạt động bề mặt sinh học,
probiotic, tổng hợp các hạt nano, chất diệt cỏ, chất diệt côn tr ng và các sắc tố [9].

1.3.1.1. Enzym
Nhiều enzym có hoạt tính sinh học được sản xuất bởi xạ khuẩn biển và xạ khuẩn đất.
Một lượng lớn các enzym như amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase,
inulinase, dextranase và keratinase có vai trị quan trọng trong ngành cơng nghiệp.
Hơn nữa, nhờ có được dữ liệu trình tự gen và protein của xạ khuẩn đã giúp cho việc
sàng lọc các chủng sinh tổng hợp enzym năng suất cao [33].

1.3.1.2. Kháng sinh
Gần 80% kháng sinh trên thế giới được biết đến có nguồn gốc từ xạ khuẩn, chủ yếu
từ các loài thuộc chi Streptomyces và Micromonospora [18], [21].

Hình 1.4. Các kháng sinh được sản xuất bởi xạ khuẩn [9]
Đặc biệt, các loài Streptomyces sản xuất khoảng 7600 hợp chất, phần lớn là các chất
chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng sinh mạnh [21], [32]. Vì vậy, trong công
nghiệp dược Streptomyces được xem là vi sinh vật chính sản xuất kháng sinh. Các

kháng sinh từ xạ khuẩn được chia thành nhiều lớp cấu trúc chính như
5


aminoglycosid (streptomycin và kanamycin), ansamycin (rifampin), anthracyclin
(doxorubicin), β-lactam (cephalosporin), macrolid (erythromycin) và tetracyclin.
Một trong những kháng sinh đầu tiên được sử dụng là streptomycin sản xuất bởi
Streptomyces griseus (S. griseus).
Các xạ khuẩn tạo ra nhiều loại kháng sinh khác nhau về bản chất hóa học, hoạt tính
kháng khuẩn và độc tính đối với động vật. Một số loại kháng sinh được phân lập từ
xạ khuẩn là các chiết xuất thô, trong khi một số khác có khả năng kết tinh, xác định
đầy đủ các tính chất hố lý như actinomycin, micromonosporin, streptothricin,
streptomycin và mycetin. Một số xạ khuẩn tạo ra nhiều hơn một kháng sinh
(S.griseus), cũng như c ng một kháng sinh có thể được tạo ra bởi nhiều loại xạ
khuẩn khác nhau (actinomycin, streptothricin) [9].

1.3.1.3. Kháng ung thư
Việc tìm kiếm các loại thuốc điều trị ung thư mới được ưu tiên do tác dụng phụ và
độc tính cao của các thuốc hoá trị hiện tại. Các hợp chất chuyển hóa từ xạ khuẩn có
khả năng chống ung thư thuộc một số nhóm cấu trúc như anthracyclin, enediyn,
indolocarbazol, isoprenoid, macrolid, peptid non-ribosom và các nhóm khác [31].

1.4. T㽨NH H㽨NH NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN
1.4.1. Ngoài nước
Việc phát hiện ra penicillin vào năm 1928 bởi Alexander Fleming và streptomycin
phân lập từ S. griseus bởi Selman A. Waksman vào năm 1943 đánh dấu một kỷ
nguyên trong việc tìm kiếm các kháng sinh mới từ tự nhiên.
Một ví dụ nổi bật là việc phân lập Streptomyces avermitilis vào đầu những năm
1970 bởi Satoshi Omura và nhóm nghiên cứu của ơng từ mẫu đất sân gôn.
S. avermitilis được biết đến nhiều với khả năng sản xuất ra avermectin [20].

Một ví dụ khác là phân lập Saccharopolyspora erythraea sản xuất ra erythromycin
vào năm 1949 bởi Abelardo Aguilar [17].
Năm 2006, Marinomycins A-D, kháng sinh thuộc lớp cấu trúc mới từ chi xạ
khuẩn biển “Marinispora” được Kwon và cộng sự phát hiện cho thấy hoạt tính
kháng khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn gây bệnh đề kháng thuốc và gây độc tính
với tế bào ung thư chọn lọc chống lại sáu trong số tám dòng tế bào khối u ác tính
[22].
Năm 2007, Yoo và cộng sự đã phân lập được Streptomyces sp. CS684 sản xuất
kháng sinh laidlomycin có hoạt tính kháng khuẩn tốt với MRSA và enterococci
kháng vancomycin [41].
Năm 2010, Eienstein và cộng sự đã khám phá ra daptomycin – kháng sinh được
chấp thuận điều trị các bệnh nhiễm tr ng da, viêm da phức tạp gây ra bởi vi khuẩn
6


gram dương từ Streptomyces roseosporus phân lập từ các mẫu đất của Ararat, Thổ
Nhĩ Kỳ [14].
Nhiều loại thuốc kháng sinh có sẵn trên thị trường được sản xuất bởi các xạ khuẩn
hiếm gồm có rifamycin bởi Amycolatopsis mediterranei, vancomycin bởi
Amycolatopsis orientalis, erythromycin bởi Saccharopolyspora erythraea,
teicoplanin bởi Actinoplanes teichomyceticus, và gentamicin bởi Micromonopsora
purpurea.
Các chất chuyển hóa vi sinh vật cũng có ý nghĩa quan trọng đối với hóa trị liệu ung
thư. Actinomycin D phân lập được từ Streptomyces sp. là chất chuyển hóa thứ cấp
lâu đời nhất được sử dụng cho điều trị ung thư [38].

1.4.2. Trong nước
Ở Việt Nam các đề tài về xạ khuẩn được quan tâm nghiên cứu khá nhiều.
- Năm 2011, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự đã điều tra, nghiên cứu một
số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ

khuẩn [2].
- Năm 2012, Nguyễn Văn Hiếu và cộng sự đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn H D
3.16 có hoạt tính kháng khuẩn và khả năng sinh một số enzym ngoại bào như:
amylase, cellulase và protease phân lập từ v ng ven bờ biển Việt Nam [3].
- Năm 2016, Phan Thị Huyền và cộng sự đã nghiên cứu về nguồn kháng sinh tiềm
năng đối kháng MRSA của xạ khuẩn phân lập từ đất v ng ven Thành phố Hồ Chí
Minh [1].
Hiện nay, nhiều trong số các kháng sinh sử dụng trên lâm sàng là sản phẩm trực tiếp
của tự nhiên hoặc các dẫn xuất bán tổng hợp từ xạ khuẩn được phát hiện thơng qua
quy trình sàng lọc kháng khuẩn tồn bộ tế bào. Do đó, việc sàng lọc chủng xạ khuẩn
ở nước ta có thể giúp tìm kiếm những chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi
sinh vật cũng như mở ra cơ hội xác định chất có hoạt tính kháng khuẩn mạnh từ
dịch nuôi cấy tế bào.

1.5. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ẬP XẠ KHUẨN
1.5.1. Thu nhận và tiền xử lý mẫu
Các mẫu phân lập xạ khuẩn thường là mẫu đất, nước, trầm tích đáy sơng, biển, thực
vật. Mỗi loại mẫu có những đặc tính và hệ vi sinh vật riêng biệt. Do đó, để phân lập
được xạ khuẩn thuần khiết, hạn chế việc bỏ sót chủng từ mẫu cần chọn lựa các biện
pháp tiền xử lý mẫu thích hợp.
Giai đoạn tiền xử lý thường được thực hiện sớm nhất sau khi thu thập mẫu, nhằm
hạn chế hoặc loại bỏ một phần các vi sinh vật khác, đôi khi làm giàu phần lớn hoặc
một vài nhóm xạ khuẩn nhất định. Q trình tiền xử lý có thể sử dụng các tác nhân
vật lý, hố học khác nhau được liệt kê ở bảng 1.1.
7


Bảng 1.1. Tiền xử lý nhiệt ứng với mục tiêu phân lập [6]
Tiền xử lý

Mục tiêu
Microbispora

Sấy khô đất 120°C 1 giờ

Streptosporangium

Sấy khô đất ở 100°C 15 phút

Actinomadura spp.

Nước hoặc huyền dịch đất 45°C hoặc 50°C trong 10 phút

Streptomyces spp.

Nước hoặc huyền dịch đất 60°C trong 30 phút

Micromonospora spp.
Dactylosporangium

Sấy khô đất ở 120°C trong 1 giờ

spp.
Streptosporangium spp.

Để khô đất ở 28°C trong 7 ngày

Herbidospora cretea

Xử lý nhiệt huyền dịch đất 110°C trong 1 tiếng

Microtetraspora glauca

Dựa trên khả năng kháng vi sinh vật của bào tử xạ khuẩn thì có thể xử lý với các
loại hóa chất khác nhau chẳng hạn như benzethonium clorid, chlorhexidin gluconat,
phenol, natri dodecyl sulfat (SDS), các kháng sinh kháng gram âm và kháng nấm.
Xử lý với các tác nhân này trong 30 phút ở 30°C có thể tiêu diệt các vi khuẩn Gram
âm hiếu khí, Bacillus và Pseudomonas, nội bào tử vi khuẩn, tăng tỷ lệ xạ khuẩn [6].

1.5.2. Phân lập xạ khuẩn
Kỹ thuật pha loãng nhiều cấp: Từ các mẫu thu được, 1 g mẫu đất được thêm vào
ống nghiệm chứa 9 ml nước cất và lắc đều. Từ hỗn dịch này tiến hành pha loãng
nhiều cấp đến nồng độ thích hợp cho tất cả các mẫu đất [4].
Sau khi pha loãng nối tiếp, 0,1 ml ống pha loãng được trải lên đĩa thạch. Các đĩa
được ủ ở 28 °C, và quan sát từ ngày thứ 5 trở đi trong 25 ngày. Sau khi ủ, các chủng
xạ khuẩn được phân biệt với các vi khuẩn khác bởi các đặc tính như khuẩn lạc bề
mặt khơ, có màu sắc hay vịng đồng tâm, có phần bám chặt vào thạch. Các chủng
nghi ngờ là xạ khuẩn sẽ được cấy riêng vào mơi trường thích hợp.
Phương pháp màng lọc: Trên các mơi trường đã chuẩn bị trước đó, các màng lọc có
kích thước lỗ 0,45 μm được đặt vơ tr ng. Mẫu đất (2-3 mg) được rắc lên màng lọc.
Tiến hành ủ ở 28°C trong 4 ngày sau đó màng lọc được lấy ra. Các đĩa được ủ tiếp
trong 2-3 tuần. Các khuẩn lạc xạ khuẩn xuất hiện trên đĩa được ni cấy riêng trong
mơi trường thích hợp để thu chủng xạ khuẩn thuần khiết [7].
Phương pháp cấy trực tiếp: Mẫu đất (2-3 mg) được rải trực tiếp trên môi trường
nuôi cấy. Tiến hành ủ ở 28°C trong 5-25 ngày. Các khuẩn lạc có các đặc điểm xạ
khuẩn điển hình được ni cấy trên mơi trường thích hợp để thu chủng xạ khuẩn
thuần khiết [5].
8

1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG ỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH
VẬT
Hoạt tính kháng vi sinh vật được đánh giá thơng qua một số phương pháp sàng lọc
nhanh. Có nhiều phương pháp tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh khác nhau với
ưu nhược điểm riêng.

1.6.1. Phương pháp đường vạch đối kháng
Nguyên tắc: phương pháp đường vạch được sử dụng để sàng lọc nhanh vi sinh vật
có hoạt tính đối kháng [24]. Chủng vi sinh vật nghiên cứu được vạch một vệt duy
nhất ở trung tâm đĩa thạch. Sau một thời gian, các vi sinh vật chỉ thị được vạch
vng góc với vệt trung tâm. Ủ thêm thời gian thích hợp, hoạt tính kháng khuẩn
được phân tích bằng cách quan sát kích thước v ng ức chế [10].
Ưu điểm: nhanh chóng, dễ thực hiện.
Nhược điểm: mơi trường ni cấy có thể khơng thích hợp với vi sinh vật đang được
nghiên cứu.

1.6.2. Phương pháp thỏi thạch
Nguyên tắc: Vi sinh vật cần nghiên cứu sẽ được ni cấy trên mơi trường thạch
thích hợp. Trong quá trình tăng trưởng, chất kháng vi sinh vật tiết ra môi trường và
khuếch tán trong môi trường thạch. Sau một thời gian, thỏi thạch được cắt và đặt
lên đĩa thạch được trải vi sinh vật thử nghiệm. Chất có hoạt tính sẽ khuếch tán từ
thỏi thạch vào mơi trường. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm được phát hiện nhờ
sự xuất hiện của v ng ức chế xung quanh thỏi thạch [10].
Ưu điểm: có thể lựa chọn mơi trường thích hợp cho vi sinh vật cần nghiên cứu.
Nhược điểm: chất thử không khuếch tán vào bản thạch sẽ cho kết quả sai lệch.

1.6.3. Phương pháp giếng khuếch tán
Nguyên tắc: Vi sinh vật thử nghiệm được trải đều lên bề mặt mơi trường thạch. Sau
đó đục các lỗ hình trụ đường kính 6-8 mm. Chất nghiên cứu được pha ở nồng độ
thích hợp, nhỏ vào giếng với thể tích 20-100 l, tuỳ thể tích giếng. Đĩa thạch được ủ

trong điều kiện thích hợp với vi sinh vật thử nghiệm. Chất thử khuếch tán vào mơi
trường quanh giếng, nếu có sự ức chế vi sinh vật thử nghiệm sẽ cho vòng kháng
khuẩn sau thời gian ủ [10].
Ưu điểm: có thể thực hiện với hầu hết mọi chất.
Nhược điểm: cần thăm dò để tìm ra dung dịch đệm và mơi trường để chất thử
nghiệm khuếch tán tốt nhất.

1.7. XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM H㽨NH THÁI, SINH
CỦA XẠ KHUẨN
1.7.1. Đ c đi m hình thái
9

Ý VÀ SINH HÓA


Khảo sát các đặc điểm nuôi cấy thường tiến hành trên 4 đến 6 loại môi trường, ủ 7
đến 14 ngày ở 28°C theo các hướng dẫn nghiêm ngặt của International
Streptomyces Project (ISP) [36]. Đôi khi, các môi trường khác có thể được chọn,
chẳng hạn như thạch dinh dưỡng và mơi trường Czapek. Màu sắc của mơi trường,
sợi khí sinh và sắc tố hòa tan được xác định bằng cách so sánh với biểu đồ màu
ISCC-NBS.
Việc xác định màu sắc phải được thực hiện cho màu của bề mặt khóm xạ khuẩn đã
phát triển, tức là màu của khuẩn ty khí sinh, màu của khuẩn ty cơ chất nhìn từ mặt
trái đĩa petri và màu của bào tử. Màu này sẽ được so sánh với màu theo bảng hệ mã
màu RA quốc tế.
- Xác định màu khuẩn ty khí sinh: Các quan sát nên được giới hạn trong v ng có sự
tăng trưởng hồn chỉnh với bề mặt thường nhơ lên cao. Xác định màu theo bảng
hệ mã màu RA quốc tế bằng cách so sánh màu khối xạ khuẩn nhô lên cao với các
mã màu.
- Màu của khuẩn ty cơ chất: Màu sắc của khuẩn ty cơ chất được xác định bằng cách

quan sát mặt trái (dưới) của khóm xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau và so
sánh với bảng hệ mã màu RA quốc tế.
- Màu của bào tử: Màu của bào tử được xác định bằng cách so sánh màu của khối
bào tử trưởng thành trên các mơi trường thích hợp với bảng hệ mã màu RA quốc
tế.
- Các màu hòa tan khác với sắc tố melanoid: Nếu các màu hòa tan khác với màu nâu
hoặc đen được tạo ra trên bất kỳ môi trường nào thì ghi lại mơi trường và ghi lại
màu sắc.

1.7.2. Đ c đi m inh lý và inh h㬈a
Một số đặc điểm kiểu hình của xạ khuẩn có tầm quan trọng hàng đầu để mơ tả chi
hoặc lồi [25].

1.7.2.1 Nhiệt độ tăng trưởng và nhiệt độ lý tưởng
Phạm vi nhiệt độ được thử nghiệm thường là từ 0°C đến 75°C. Nói chung, các thí
nghiệm nhiệt độ sử dụng mơi trường rắn thay vì mơi trường lỏng sẽ giúp quan sát
mức độ tăng trưởng của xạ khuẩn tốt hơn. Môi trường thường sử dụng là môi
trường Bennett’s hoặc YIM38 hay môi trường dinh dưỡng.

1.7.2.2. Khoảng pH tăng trưởng và pH tối ưu
Phần quan trọng trong mô tả đặc điểm sinh lý của xạ khuẩn nào là khoảng giá trị pH
tăng trưởng, cũng như giá trị pH tối ưu cho sự tăng trưởng. Khảo sát trên môi
trường Bennett’s hoặc YIM38 hay môi trường dinh dưỡng ở các giá trị pH khác
nhau. Việc lựa chọn hệ đệm là rất quan trọng [16], [25]. Thường kiểm tra sự tăng
10


trưởng của xạ khuẩn Actinobacteria từ pH 4,0 đến 13,0 và xác định phạm vi pH
tăng trưởng thích hợp cũng như giá trị pH tối ưu [40].

1.7.2.3. Khoảng nồng độ muối và giá trị tối ưu
Các thí nghiệm dung nạp muối kiểm tra khả năng chịu đựng của sinh vật đối với
NaCl hay các muối khác và xác định nồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng. Pha môi
trường chất lỏng chứa một dãy nồng độ NaCl, thường là 0-30% (kl/tt) và ghi nhận
sự tăng trưởng bằng phương pháp đo độ đục. Mơi trường Bennett’s hoặc mơi
trường YIM38 có thể được sử dụng làm môi trường nền cho thử nghiệm này.

1.7.2.4. Sử dụng nguồn nitơ
Môi trường cơ bản trong khảo sát sẽ được bổ sung các nguồn nitơ khác nhau ở nồng
độ 0,5% và cố định nguồn carbon ph hợp. Nguồn nitơ kém bền nhiệt nên được khử
tr ng bằng cách lọc hoặc khử tr ng bằng ether. Thực hiện thử nghiệm kèm chứng
âm (khơng có nguồn nitơ).

1.7.2.5. Khả năng sản xuất enzym
Khảo sát hoạt tính enzym có vai trị quan trọng trong việc mơ tả đến chi hoặc lồi
xạ khuẩn Actinomycetes.
a) Thử nghiệm catalase
Catalase xúc tác cho phản ứng: 2H2O2 → 2H2O + O2, do đó giúp ngăn ngừa sự tích
lũy H2O2 oxy hóa gây tổn thương tế bào. Phản ứng dương tính khi có sự sủi bọt khí
khi khuẩn lạc tiếp xúc với oxy già.
b) Thử nghiệm urease
Thử nghiệm urease xác định khả năng sản xuất enzym ngoại bào urease. Urease xúc
tác phản ứng (NH2)2CO + H2O → 2NH3 + CO2. Amoniac được hình thành sẽ kiềm
hóa mơi trường: NH3 + H2O → NH4+ + OH-. Độ kiềm có thể được phát hiện thơng
qua chỉ thị pH. Mơi trường Christensen’s sẽ được sử dụng làm môi trường nền cho
thử nghiệm này và bổ sung dung dịch ure đã lọc tiệt tr ng để tạo ra nồng độ cuối
c ng là 2%, có thể thực hiện trong mơi trường rắn hoặc lỏng [13].
c) Thử nghiệm lipase
Hoạt tính của enzym lipase có thể được thể hiện bằng khả năng sử dụng Tween, ví
dụ Tween 80 (polyetylen monoreatan, ester của acid oleic), Tween 40 (ester của

acid palmitic) và Tween 20 (ester của acid stearic). Các sinh vật phân giải lipid tách
acid béo và muối canxi của acid béo tạo ra các v ng mờ đục xung quanh các khuẩn
lạc.
d) Thủy phân gelatin
Các thử nghiệm thủy phân gelatin kiểm tra khả năng phá vỡ protein gelatin (có
nguồn gốc từ collagen). Gelatin làm cho môi trường dày lên, đặc biệt là ở nhiệt độ
lạnh (dưới 28°C). Nếu vi sinh vật phóng thích enzym gelatinase, gelatin bị phá vỡ
11


hoặc hóa lỏng. Kiểm tra hoạt tính gelatinase trong khoảng một tuần sau khi cấy và ủ
ở nhiệt độ phòng. Các ống nghiệm được đặt trên đá lạnh trong vài phút và nếu môi
trường không đông đá, thử nghiệm là dương tính. Các phương pháp thơng thường
địi hỏi thời gian khảo sát kéo dài và khó đọc kết quả. Ngày nay, có thể bổ sung acid
trichloroacetic (TCA) để đọc kết quả nhanh chóng và nhạy hơn [28].
e) Đơng tụ và pepton hóa sữa
Thử nghiệm đơng tụ và pepton hóa sữa kiểm tra khả năng sản xuất protease của xạ
khuẩn. Sự đông tụ xảy ra khi protein bị phân hủy thành các mảnh lớn bởi vi sinh vật.
Sự phân hủy tiếp tục thành các mảnh nhỏ hơn nữa là quá trình peptone hóa. Hiện
tượng đơng đặc sữa là hiện tượng sữa hóa rắn, đặc lại. Khi cục đơng đặc bị ly giải
thành lỏng trở lại, gọi là hiện tượng pepton hóa. Sữa pepton hóa sẽ là mờ, xuất hiện
sau sự đơng đặc.
f) Thủy phân tinh bột
Thử nghiệm thủy phân tinh bột kiểm tra khả năng sản xuất một số enzym ngoại bào
như amylase và oligo-1,6-glucosidase có khả năng phân giải tinh bột. Các phân tử
tinh bột quá lớn để đưa vào tế bào vi khuẩn, vì vậy một số vi khuẩn tiết ra enzym để
phân giải tinh bột thành các tiểu đơn vị mà sau đó vi sinh vật có thể sử dụng được.
Phát hiện sự phân giải tinh bộ bằng thuốc thử ugol, tinh bột nhuộm màu xanh với
iod, và những v ng không màu xung quanh khuẩn lạc là sự dương tính.
g) Thủy phân cellulose

Thử nghiệm thủy phân cellulose kiểm tra khả năng sản xuất enzym cellulase. Các
chủng vi khuẩn có chứa enzym β-(1-4),(1-3)-D-glucanohydrolase, β-(1-4)-Dglucanohydrolase và β-(1-3)-D-glucanohydrolas sẽ thủy phân cellulose tạo thành
các glucan. Sự thủy phân cellulose tạo ra vịng trong suốt quanh khóm vi khuẩn
[37].

1.7.2.6. Sản phẩm trao đổi chất
a) Thử nghiệm MR (Methyl đỏ)

Quá trình lên men có thể dẫn đến sự hình thành hỗn hợp acid như acid formic,
acid acetic, acid lactic, acid succinic, ethanol, CO2 và H2 trong mơi trường
đệm trung tính. Sự có mặt của các acid trong quá trình lên men làm giảm độ
pH của nuôi cấy dưới 4,2 và phát hiện bằng thuốc thử chỉ thị pH [23].
b) Xét nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Một số sinh vật lên men dị hóa glucose theo con đường butanediol, trong đó acetoin
(acetylmethylcarbinol) được tạo ra như một chất trung gian trong quá trình hình
thành 2,3-butanediol. Với sự hiện diện của KOH và O2, acetoin bị oxy hóa thành
diacetyl, do đó phản ứng với nhóm guanidine liên kết với arginine và các phân tử
12


khác được cung cấp bởi peptone trong môi trường để tạo thành sản phẩm có màu
hồng. Thuốc thử α-naphthol tăng cường màu hồng này cho việc quan sát dễ hơn
[23].
c) Phân hủy Tryptophan (sản xuất indol)
Các sinh vật có enzym tryptophanase có thể thực hiện phản ứng: -tryptophan →
indol + acid pyruvic + NH3. Indol có thể được phát hiện bởi khả năng phản ứng với
thuốc thử p-dimethy‐laminobenzaldehyd để tạo thành hợp chất màu đỏ tím là
quinoidal [23].

1.8. ÊN MEN THU KHÁNG SINH

1.8.1. Môi trường lên men
Môi trường lên men thu kháng sinh cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cho
xạ khuẩn phát triển đến một mức độ nhất định và đảm bảo các cơ chất, các đồng
yếu tố cho hệ enzym chuyển hoá thứ cấp tạo kháng sinh.
Theo hướng dẫn thiết kế môi trường sinh chất thứ cấp của Nisbet 1982 [15], nguồn
carbon, nitơ, photpho, oxy cần thiết kế ở giới hạn ph hợp tránh gây ra sự ức chế vi
khuẩn; mỗi nguồn dinh dưỡng cần được khảo sát dưới các dạng cung cấp khác nhau
để chọn dạng tối ưu (ví dụ glucose, lactose, manitol); tránh sử dụng nguồn carbon,
nitơ dễ đồng hoá; thêm các đồng yếu tố ph hợp như Co3+, Mg2+, Mn2+, Fe2+; sử
dụng đệm điều chỉnh về pH thích hợp.
Dựa trên các nguyên tắc này, môi trường nuôi cấy xạ khuẩn thường sử dụng nguồn
carbon từ glucose, lactose, tinh bột, glycerol, cám lúa mì, trong đó phổ biến nhất là
tinh bột và glucose. Nguồn nitơ thường được sử dụng là hỗn hợp axit amin, cao
nấm men, cao men bia, nước thải ngâm bắp [19], [30], [34].
Q trình lên men tạo kháng sinh cịn chịu ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, pH,
thơng khí. Hầu hết các xạ khuẩn có nhu cầu oxy cao cho việc tăng trưởng sinh khối
và tổng hợp chất chuyển hoá.

1.8.2. Khảo át thời đi m thu hoạch dịch lên men
Khả năng sản xuất hoạt chất có tính kháng khuẩn của xạ khuẩn ở mỗi thời điểm
khác nhau sẽ có sự biến đổi. Vì vậy phải tiến hành khảo sát thời điểm thu dịch lên
men, cũng chính là thời điểm xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất.

1.8.3. Tách chiết phân đoạn c㬈 hoạt tính
Phần lớn các vi sinh vật sản sinh kháng sinh tách ra khỏi sinh khối và tiết vào môi
trường xung quanh nhưng một số trường hợp chỉ tiết một phần vào mơi trường lên
men, phần cịn lại nằm trong sinh khối. Ngược lại cũng có chủng vi sinh vật sau quá
trình lên men kháng sinh lại chỉ tích tụ trong sinh khối.

13

Các kỹ thuật sắc ký (đặc biệt là sắc ký trao đổi ion), chiết xuất lỏng-lỏng hoặc lỏngrắn bằng cột nhựa resin thường được sử dụng để chiết xuất và tinh khiết các kháng
sinh phổ biến từ dịch nuôi cấy.
Trong số các kỹ thuật này, được sử dụng nhiều nhất là chiết lỏng-lỏng bằng dung
mơi hữu cơ, ví dụ như ethyl acetat, n-hexan, cloroform, methanol. Chiết xuất lỏnglỏng là một kỹ thuật hữu ích với chi phí thấp.
Đối với chiết kháng sinh từ dịch ni cấy lỏng, thì phải tiến hành lọc hay ly tâm để
loại sinh khối và các thành phần khơng có lợi trong dịch lên men. Khi tách chiết
kháng sinh từ sinh khối, sinh khối được rửa với nước để loại bớt thành phần môi
trường. Các chất kháng sinh thường bị mất hoạt tính trong điều kiện nhiệt độ cao,
axit hoặc kiềm mạnh. Vì vậy khi tách chiết và tinh sạch cần sử dụng các điều kiện
thích hợp để kháng sinh giữ hoạt tính.

1.8.4. Hiện hình inh học các dịch chiết c㬈 hoạt tính
Phương pháp tự sinh đồ được sử dụng để hiện hình sinh học các phân đoạn dịch
chiết có hoạt tính. Phương pháp này dựa trên khả năng khuếch tán, chất thử được
chấm lên bản mỏng sắc ký, triển khai sắc ký đồ bằng hệ dung mơi thích hợp. Đặt
bản sắc ký lên bề mặt thạch đã trải vi khuẩn thử nghiệm. Chất thử khuếch tán từ bản
mỏng ra mơi trường, cho vịng ức chế tương ứng với vị trí của chất kháng khuẩn
trên sắc ký đồ.
Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện.
Nhược điểm: chất thử được hấp phụ trên bản mỏng với lực tương tác khá mạnh, do
đó nhiều trường hợp âm tính giả do chúng khơng khuếch tán được ra khỏi bản
mỏng.
Nhìn chung, tự sinh đồ là một kỹ thuật đơn giản, hiệu quả và rẻ tiền cho việc xác
định mục tiêu tách hỗn hợp phức tạp, trực quan hoá các thành phần có hoạt tính trên
bản mỏng sắc ký. Do đó, nó có thể được thực hiện cả trong các phịng thí nghiệm
hiện đại và các phịng thí nghiệm nhỏ hạn chế về thiết bị. Mặc d , ngày nay sắc ký
lỏng hiệu năng cao kết hợp các thử nghiệm sinh học đã trở thành phương pháp lựa
chọn phổ biến cho việc tinh sạch các phân đoạn chiết để thu được hợp chất tinh

khiết, nhưng sắc ký lớp mỏng – hiện hình sinh học là một kỹ thuật nhanh chóng để
sàng lọc số lượng mẫu lớn có hoạt tính sinh học và đối với phân đoạn có hoạt tính
sinh học. Nó có thể được sử dụng để phát hiện các kháng sinh trong các mẫu mơi
trường và thực phẩm cũng như tìm kiếm các loại thuốc kháng khuẩn mới.

14


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN IỆU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu đất và nước lấy từ các khu vực ô nhiễm xung quanh khu cơng nghiệp Tân Bình
(TB), khu cơng nghệ cao (CNC).

2.1.2. Vi inh vật thử nghiệm
Vi khuẩn chỉ thị trong các thử nghiệm kháng khuẩn là các chủng ATCC được lưu
trữ ở điều kiện -80  C tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh tr ng, Khoa Dược, Đại học
Nguyễn Tất Thành. Chủng được cấy chuyền ít nhất hai lần sau khi rã đông từ ống
chủng.
Bảng 2.1. Các chủng vi sinh vật d ng trong thử nghiệm
Tên vi sinh vật

Mã số

Nơi lưu trữ

Escherichia coli

ATCC 25922

BMVKST

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

ATCC 33591

BMVKST

Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus ATCC 29213

BMVKST

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

BMVKST

Streptococcus pyogenes

ATCC 29212

BMVKST

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong đề tài là thiết bị sẵn có tại đơn vị thực hiện,
Bộ môn Vi sinh - Ký sinh tr ng, Khoa Dược - Đại học Nguyễn Tất Thành.
Thiết bị: Nồi hấp Hirayama (HV110), tủ sấy Memmert (WBU 45 - UM 500), bếp
cách thủy Memmert (WNB 29), cân phân tích (Precisa XB 220A), tủ cấy (AVC 4A1), tủ ấm (Memmert INB 500), tủ hút (BS - 122), máy ly tâm (Hermle), máy
vortex (3412EU), máy đo quang Genequant (UV - 1280), máy cô quay (R210S),

máy đông khô (BenchTop Pro), máy lắc ổn nhiệt (IKA KS 4000i).
Dụng cụ: đĩa petri, que cấy, tăm bông tiệt tr ng, đèn cồn, giấy lọc Whatman 41 và
các dụng cụ thủy tinh thơng thường trong phịng thí nghiệm. Dụng cụ d ng trong
thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được hấp tiệt tr ng ở 121°C trong 20 phút trước
khi sử dụng.

2.1.4. H㬈a chất và mơi trường
2.1.4.1. Hóa chất
Ethyl acetat (Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc),
dimethyl sulfoxid (Trung Quốc), n-hexan (Trung Quốc), diclomethan (Trung Quốc),
cloroform (Trung Quốc), bản silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ 230-400 mesh
(Merck).
15


2.1.4.2. Mơi trường
Mơi trường thử hoạt tính kháng vi sinh vật: MHA với vi khuẩn thử nghiệm, TSA sử
dụng cho việc hoạt hố, tăng sinh vi khuẩn thử nghiệm.
Mơi trường nuôi cấy xạ khuẩn: các môi trường sử dụng trong phân lập và nuôi cấy
xạ khuẩn gồm môi trường tinh bột – casein (SC), ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP7 và
YIM61.
Thành phần môi trường được liệt kê trong phụ lục 1.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm thực hiện trong đề tài được bố trí theo sơ đồ như Hình 2.1. Qua năm
giai đoạn nghiên cứu chính.
 Giai đoạn 1: ấy mẫu đất
 Giai đoạn 2: Tiền xử lý, phân lập và thuần chủng
 Giai đoạn 3: Mô tả đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa.
 Giai đoạn 4: Sàng lọc chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật.

 Giai đoạn 5: Định danh chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật cao.
 Giai đoạn 6: Khảo sát yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy và thời điểm thu
hoạch đối với chủng xạ khuẩn hoạt tính cao.
 Giai đoạn 7: Chiết, tách được phân đoạn có tính kháng khuẩn.
ấy mẫu đất
Tiền xử lý, phân lập và thuần

Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật

Xác định đặc điểm hình
thái, sinh lý và sinh hóa

Chủng tiềm năng
Định danh bằng giải trình tự gen
Khảo sát điều kiện lên men
ên men thu kháng sinh
Thu phân đoạn có hoạt tính
16