Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến quá trình tích lũy dược chất trong protocorm lan thạch hộc thiết bì (dendrobium offcinale kimura et migo)

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến quá trình tích lũy dược chất
trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
Số hợp đồng: 2017.01.55/HĐ-KHCN
Chủ nhiệm đề tài: Mai Thị Phương Hoa
Đơn vị công tác: Đại Học Nguyễn Tất Thành
Thời gian thực hiện: 04/2017 - 04/2018

TP. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 04 năm 2018


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016

Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến quá trình tích lũy dược chất
trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo)
Số hợp đồng: 2017.01.55/HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Mai Thị Phương Hoa
Đơn vị công tác: Đại Học Nguyễn Tất Thành
Thời gian thực hiện: 04/2017 - 04/2018

Các thành viên phối hợp và cộng tác:

STT

Họ và tên

1
2

Mai Thị Phương Hoa
Đỗ Tiến Vinh

Chuyên
ngành
CNSH
CNSH

Cơ quan công tác
Khoa CNSH và Môi trường
Khoa CNSH và Môi trường

2

Ký tên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề .................................................................................................................................9
2. Mục đích..................................................................................................................................10
3. Nội dung..................................................................................................................................10
4. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................................10
Chương 1. TỔNG QUAN..........................................................................................................11
1.1. Thạch Hô ôc Thiết Bi..............................................................................................................11
1.1.1. Phân bố sinh thái ...............................................................................................................11
1.1.2. Đă ôc điểm hinh thái.............................................................................................................11
1.1.3. Thành phần hóa học...........................................................................................................12
1.1.4. Công dụng.........................................................................................................................13
1.1.5. Các công trinh nghiên cứu.................................................................................................16
1.1.5.1. Các công trinh nghiên cứu Trong nước..........................................................................16
1.1.5.2. Các công trinh nghiên cứu trên thế giới ........................................................................16
1.2. Giới thiệu về protocorm.......................................................................................................18
1.3. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào........................................................................................18
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................21
2.1. Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu..........................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................................21
Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro....................................................21
Công việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi................................................................21
Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro...........................................21
Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi .........................................21
Cơng việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống cơ bản nuôi cấy tạo protocorm...................................21
Công việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin đến quá trinh nuôi cấy tạo protocorm...............22

Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/cytokinin đến quá trinh nhân protocorm...........22
Công việc 2.4: Khảo sát sự ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trinh nhân sinh khối
protocorm............................................................................................................................22
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến sự tích lũy dược chất trong quá trinh nuôi
cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi...............................................................................23
Công việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của elicitor đến quá trinh tổng hợp dược chất trong protocorm
lan Thạch Hộc Thiết Bi......................................................................................................23

3


Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trinh tổng hợp dược chất trong
protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi ....................................................................................23
Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bổ sung elicitor đến quá trinh tổng hợp dược chất
trong protocorm Thạch Hộc Thiết Bi..................................................................................23
2.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu.................................................................................24
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................................25
3.1. Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro.............................................25
3.1.1. Công việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi......................................................25
3.1.2. Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro.................................26
3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi...................................27
3.2.1. Công việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống cơ bản ni cấy tạo protocorm.........................27
3.2.2. Công việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin đến quá trinh nuôi cấy tạo protocorm.....28
3.2.3. Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/cytokinin đến quá trinh nhân protocorm
............................................................................................................................................30
3.2.4. Công việc 2.4: Khảo sát sự ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trinh nhân sinh
khối protocorm....................................................................................................................31
3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến sự tích lũy chất thứ cấp trong quá
trinh nuôi cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi..............................................................33
3.3.1. Công việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của elicitor đến quá trinh tổng hợp dược chất trong

protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi.....................................................................................33
3.3.2. Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trinh tổng hợp dược chất
trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi............................................................................35
3.3.3. Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bổ sung elicitor đến quá trinh tổng hợp
dược chất trong protocorm Thạch Hộc Thiết Bi..................................................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................................38
BÁO CÁO SỬ DỤNG KINH PHÍ..............................................................................................39

4


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA:

benzyladenine

CTV:

cộng tác viên

CW:

coconut water (nước dừa)

DNA:

deoxyribonucleic acic

IBA:

indolebutyric acid

KPT:

khơng phân tích

LV:

mơi trường Litvay 1985

MS:

mơi trường Murashige-Skoog 1962

Môi trường thạch: môi trường có bổ sung agar 8 g/l
NAA:

α-Naphthalene acetic acid

NT:

nghiệm thức

TN:

thí nghiệm

5

DANH SÁCH BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 1.1: Các bài thuốc sử dụng Dendrobium làm dược liệu (Chinese Traditional Patent
Medicine số 29 - 2007).................................................................................................15
Bảng 3.1: Kết quả vô trùng mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bi........................................................27
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng đến khả năng tạo protocorm
của cây lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro.......................................................................28
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng đô ô auxin lên quá trinh tạo protocorm của
cây lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro..............................................................................29
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của BA và NAA lên quá trinh nhân sinh khối
protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro...................................................................31
Bảng 3.5 : Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến quá trinh nhân sinh
khối protocorm lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro..........................................................32
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của elicitor đến quá trinh tổng hợp dược chất trong
protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi................................................................................34
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trinh tổng hợp dược
chất trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi................................................................35
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bổ sung elicitor đến quá trinh tổng hợp
dược chất trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi........................................................36

6


DANH SÁCH HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 1.1: Lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi...........................................................................................11
Hình 1.2: Cấu trúc của một số alkaloit chính được phân lập từ các giống lan Dendrobium. . .13
Hình 3.1: Lan Thạch Hộc Thiết Bi trồng tại Cao Bằng...........................................................26
Hình 3.2: Lan Thạch Hộc Thiết Bi sau khi vô trùng mẫu 2 t̀n ............................................27
Hình 3.3: Lan Thạch Hộc Thiết Bi ni cấy trên mơi trường C..............................................28
Hình 3.4: Protocorm lan Thạch Hơ ơc Thiết Bi trên mơi trường có bổ sung auxin....................29
Hình 3.5: protocorm Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi in vitro trên mơi trường thí nghiệm bổ sung BA
0,1 mg: A sau khi cấy 10 ngày; B sau khi cấy 30 ngày.................................................31
Hình 3.6: protocorm Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi trên môi trường bổ sung nước dừa 10%.........33

7


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sản phẩm thực đạt được

Sán phẩm đăng ký tại thuyết minh

- 01 quy trinh nuôi cấy prorocorm lan Thạch - 01 quy trinh nuôi cấy prorocorm lan Thạch
Hộc Thiết Bi

Hộc Thiết Bi

- Đào tạo 01 sinh viên ngành công nghệ sinh - Đào tạo 01 sinh viên ngành công nghệ sinh
học

học

- 01 bài báo đăng trên tạp chí đại học Nguyễn - 01 bài báo đăng trên tạp chí/ kỷ yếu khoa
Tất Thành

Thời gian đăng ký : từ ngày

học trong nước

đến ngày

Thời gian nộp báo cáo: ngày

8


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác định ở Trung Quốc
có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch Hộc, Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô,
Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông trùng hạ thảo, trong đó Thạch Hộc xếp đầu
bảng vi giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng giúp
lợi phổi sinh tân từ lâu đời.
Cây Thạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thành phần gồm có
alkaloid dendrobin, nobilonin; G-hydroxydendrobin; polysaccharides (23%) (Huang và ctv,
1994), alkaloid (0,02% - 0,04%) (Zhu và ctv, 2010), các axit amin (133 mg/g khô) (Huang và
ctv, 1994) và các nguyên tố vi lượng như Fe 292 mg/g, Zn 12 mg/g, Mn 53 μg/g, Cu 3,6 μg/g
(Weng, 2003).
Thạch Hộc Thiết Bi có khả năng chống ung thư, kéo dài tuổi thọ, chống lão hóa, tăng
sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, gây mê và giảm sốt, có tác
dụng tăng lượng glucose trong máu, với liều cao làm yếu hoạt động của tim, làm giảm huyết
áp - khó thở được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng và trong các bài thuốc được thị trường đón

nhận (Ji, 1999; The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010; Liu và ctv, 2011).
Ngoài ra, Thạch Hộc còn được sử dụng làm thực phẩm chức năng an toàn, bổ dưỡng
và giá trị kinh tế cao trên cả thị trường trong nước và quốc tế như các quốc gia Đông Nam Á,
Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, châu Âu và châu Mỹ. Với khả năng mang lại nguồn ngoại
tệ lớn nhưng hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về lồi lan này vẫn cịn rất hạn chế, chỉ có
Trung Quốc là đang phát triển loài lan này.
Dendrobium officinale Kimura et Migo phân bố rất phân tán và không liên tục do các
hoạt động đốn gỗ, khai thác rừng quá mức đã tàn phá môi trường sống khiến cho giống lan
này cịn gần ít trong tự nhiên, trở thành loài bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên cần được bảo
tồn và nhân giống nguồn gen quý này (Gu, 2007).
Tại Chiết Giang sản lượng công nghiệp của D. officinale đã lên đến 2 tỷ nhân dân tệ
trong năm 2011 dự kiến tăng tới 4 tỷ nhân dân tệ năm 2015. Sản lượng đưa ra thị trường
khiêm tốn, hiện nay giá của mỗi kg thạch Hộc thành phẩm trên thị trường quốc tế vào khoảng
1000 USD. Nhu cầu rất lớn trong khi các loài Dendrobium khác có đặc điểm hinh thái tương
tự như D. devonianum, D. aphyllum và D. gratiosissimum có giá thấp (dưới 1/4 giá trị của D.
officinale). D. officinale lại có sự tương đồng về hinh thái rất lớn với các loài lân cận. Phương
pháp quan sát hinh thái thông thường khó phân biệt được, đã làm cho các sản phẩm giả xuất
hiện ngày càng nhiều trên thị trường do sự chênh lệch lớn về giá cả giữa chúng. Vi vậy, việc
phân biệt loài lan này về mặt di truyền để có được nguồn cây giống đảm bảo chất lượng làm
nguyên liệu sản xuất dược liệu có ý nghĩa rất quan trọng.

9


Hiện nay, nguồn cung cấp cây giống lan Thạch Hộc từ tự nhiên là rất ít. Lượng cây
giống ni cây mô được sản xuất theo phương pháp truyền thống cũng chỉ đáp ứng được nhu
cầu hiện tại. Do đó, để giải quyết được vấn đề nhu cầu cây giống ngày càng tăng cần có
những nghiên cứu sâu hơn về công nghệ nhân giống loại lan này. Trong đó, phương pháp nuôi
cây phôi với hệ số nhân giống rất cao, cây con đảm bảo sạch bệnh, chất lượng đồng nhất được
xem là phương pháp khả thi nhất và cần thiết phải được nghiên cứu (Trần Văn Minh, 2013)

Bên cạnh việc chủ động nguồn cây giống có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu trong nước cũng
như xuất khẩu thi khâu nuôi trồng loài lan này ở Việt Nam nói chung và khu vực phía Nam
nói riêng cũng là một vấn đề rất cần được quan tâm nghiên cứu. Với mục tiêu xây dựng một
quy trinh hồn chỉnh về ni cấy tạo sinh khối tế bào có chứa hàm lượng dược chất cao.
Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến quá trinh tích lũy dược
chất trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo)”.
2. Mục tiêu đề tài
- Xây dựng quy trinh nhân sinh khối lan Thạch Hộc Thiết Bi thông qua nuôi cấy
protocorm
- Đào tạo công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật cho sinh viên khoa NNCNC và CNSH.
3. Nội dung
- Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bi in vitro
- Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến sự tích lũy dược chất trong quá trinh nuôi cấy
protocom lan Thạch Hộc Thiết Bi
4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trên quy mơ phịng thí nghiệm

10


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thạch Hơ ơc Thiết Bì
Tên La tinh:

Dendrobium officinale Kimura et Migo

Lồi:

Dendrobium

Chi:

Dendrobium

Phân tơ ơc:

Dendrobinae

Tơ ơc:

Dendrobieae

Phân họ:

Epidendrodeae

Họ:

Orchidaceae

Bơ ô:

Asparagales

Lớp:

Liloopsida

Ngành:

Magnoliophyta

Giới:

Plantae

Hình 1.1: Lan Thạch Hô ôc Thiết Bi
(Dendrobium officinale Kimura et Migo)

1.1.1. Phân bố sinh thái
Dendrobium officinale Kimura et Migo là một trong những loài thảo dược truyền
thống của Trung Quốc, phân bố chủ yếu ở một số vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Trung Quốc
như Vân Nam, Quảng Tây, Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Đông, Phúc Kiến và Hồ Nam. Loài
cây này đã được dùng trong các bài thuốc thảo dược ở nhiều nước Châu Á từ hàng trăm năm
nay. D. officinale Kimura et Migo là một loài thực vật biểu sinh thường sống bám trên những
vách đá hay lủng lẳng trên các thân cây to phủ đầy mùn và rêu ở độ cao khoảng từ 800 m đến
1500 m so với mực nước biển. Do sống ở môi trường đặc biệt như thế nên D. officinale
Kimura et Migo trở nên rất nhạy cảm khi lãnh địa của chúng bị tàn phá.
Hiện nay D. officinale Kimura et Migo phân bố rất phân tán và không liên tục do hậu
quả của sự tàn phá môi trường sống bởi các họat động đốn gỗ và khai thác quá mức của con
người. Tất cả đã khiến cho D. officinale Kimura et Migo đứng trên bờ vực tiệt chủng, trở
thành loài có nguy cơ, liệt vào danh sách các loài cần được bảo vệ. Một số cuộc điều tra gần
đây cho thấy rất nhiều quần thể D. officinale Kimura et Migo trước kia đựơc ghi nhận thi đến
nay đã hoàn toàn biến mất.
1.1.2. Đă ơc điểm hình thái
Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc”. Họ Lan
(Orchidaceae) là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30 - 50 cm, thường mọc thành
bụi. Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5 - 3 cm, có vân dọc. Lá

11


mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân, thuôn dài, hầu như không cuống, đầu lá hơi cuộn hinh
mỏng, có 5 gân dọc, dài 12 cm, rộng 2,3 cm, cụm hoa ở kẽ lá. Hoa to màu hồng, mọc thành
chùm trên những cuống dài, mang 2 - 4 hoa có cánh môi hinh bầu dục nhọn, cuốn thành phễu
trong hoa, ở họng hoa có những điểm màu tím. Quả nang hơi hinh thoi, khi khô tự mở. Hạt
nhiều, mùa hoa: tháng 2 - 4, mùa quả: tháng 4 - 6. Cây mọc hoang ở rừng núi, trên cây gỗ và
được trồng làm cảnh ở Việt Nam.
1.1.3. Thành phần hóa học
Thạch Hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch Hộc tía giàu
polysaccarit, alkaloit, các axit amin và nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng,
titan và nhiều nguyên tố vi lượng. Trong đó, polysaccarit Thạch Hộc tới 22%, hàm lượng các
axit amin như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng axit amin. Ngồi ra,
Thạch Hộc tía cịn có những hợp chất đặc thù như phenanthryn, bibenzyl, keton, ester và các
chất nhầy, hợp chất amidon.
Trong thân Thạch Hộc tía có hàm lượng alkaloit sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó
những chất amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine,
dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-methyldendrobium, 8-epidendrobine, các chất này có vị hơi đắng. Thân Thạch Hộc có dầu bay hơi,
trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%.
Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại, trong Thạch Hộc tía đã phân lập được 72
hợp chất đơn thể, trong đó đã giám định được 63 hợp chất và phát hiện thêm 18 hợp chất mới
gồm các loại: Hợp chất loại Bibenzil và các dẫn xuất gồm 27 loại: Thạch Hộc tía (gọi tắt là
THT) A, THT.B, THT.C, THT.D, THT.E, THT.S, THT.G, THT.H, THT.I, THT.J, THT.K,
THT.L, THT.M, THT.N, THT.O, THT.P, THT.Q, …v.v.
Hợp chất Phenol có 12 loại; hợp chất Lignanoid có 4 loại; hợp chất lacton có 2 loại;
hợp chất dihydroflavon có 2 loại; các hợp chất khác có 16 loại và 18 hợp chất mới. Giám định
hoạt tính kháng oxy hóa và kháng u bướu, đã phát hiện phần lớn các hợp chất loại bibenzil
đều có hoạt tính kháng oxy hóa, có 2 loại hợp chất Bibenzil có hoạt tính kháng u bướu.

Các thành phần hóa học chính có trong các lồi Dendrobium là các alkaloit
sesquiterpene. Dendrobine là một trong những thành phần alkaloit được tách ra và xác định
cấu trúc đầu tiên. Khung sesquiterpene của dendrobine và hầu hết các alkaloit từ Dendrobium
được xác định là dendrobane. Các alkaloit khác cũng đã được tách chiết và xác định cấu trúc hóa
học là nobiline, dendroxine, dendramine (6 - hydroxydendrobine), dendrine, 8 hydroxydendroxine, 3 - hydroxy - 2 oxodendrobine và 6 - hydroxydendroxine.

12


Hình

1.2:

Cấu

trúc

của

một

số

alkaloit

chính

được

phân

lập

từ các giống lan Dendrobium. Me: gốc methyl. (Vũ Hồng Vân, 2015)
Denbinobin là một hợp chất phenanthraquinone tách chiết từ D. nobile làm giảm mức độ
biểu hiện của decoy receptor - 3 phối hợp với Fas ligand gây ra sự tự hủy tế bào ung thư tuyến
tụy. Denbinobin có thể được sử dụng như 1 loại tá dược kết hợp với các liệu pháp tiêu diệt tế
bào ung thư phụ thuộc vào decoy receptor để tránh khỏi sự giám sát miễn dịch của cơ thể.
Denbinobin ức chế tiềm tàng sự hoạt hóa NF - kappa - B bởi TNF - alpha và PMA và làm suy
yếu sự phosphoryl hóa và phân hủy IkappaBalpha bằng cách làm giảm hoạt động của TAK1,
một hoạt động đầu mối của sự hoạt hóa IKK. Denbinobin gây các hiệu ứng tự hủy tế bào, gồm
sự rối loạn chức năng màng ty thể, hoạt hóa các caspase và phân hủy các enzyme poly (ADP ribose) polymeza (Ng và cs., 2012).
1.1.4. Công dụng
- Làm thuốc: Thạch Hộc tía có giá trị độc đáo và cơng năng bảo vệ sức khỏe, đã trở
thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời. Nghiên cứu về dược lý hiện đại, Thạch Hộc tía có thể
dùng đơn độc hoặc phối trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch Hộc
được thị trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch Hộc nhưng tốt
nhất vẫn là Thạch Hộc tía.
Tăng cường cơng năng miễn dịch: Thạch Hộc rỉ sắt có công năng tư âm dưỡng huyết
“Dược tính luận” đời nhà Thanh của Trung Quốc cho biết, Thạch Hộc rỉ sắt bổ thận, tích tinh,
dưỡng vị âm, dưỡng khí lực. Với hàm lượng polysaccarit phong phú có công năng tăng cường

13


miễn dịch. Nghiên cứu về dược lý hiện đại cho biết, Thạch Hộc rỉ sắt có thể nâng cao năng
lực ứng thích, có tác dụng tốt về chống mệt mỏi và chống chịu ngạt oxy.
Thạch Hộc tía ích vị sinh tân: trong “Thần nông bản thảo kinh”, “Bản thảo tái tân” đã
ghi nhận Thạch Hộc tía là thuốc trường vị, chữa trị đau dạ dày, đau bụng. Y học hiện đại cho
rằng, Thạch Hộc có tác dụng kiềm chế bệnh sán trùng, viêm dạ dày co bóp, nước Thạch Hộc

xúc tiến bài tiết dịch dạ dày, gia tăng năng lực bài khí của dạ dày, có lợi cho tiêu hóa.
Hộ gan lợi mật: Thạch Hộc có tác dụng lợi mật. Xưa nay giới y học đều cho rằng,
Thạch Hộc có tác dụng tư dưỡng can âm, là dược thảo tốt điều trị các bệnh gan, mật, chữa trị
viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật.
Kháng phong thấp: vào tuổi trung niên sức khỏe bắt đầu suy giảm, cơng năng xương cốt
thối hóa, Thạch Hộc có khả năng tư dưỡng âm dịch, bôi trơn các khớp, giúp cho gân cốt khỏe,
khớp nối thanh thoát, có hiệu quả tăng cường kháng phong thấp.
Giảm đường huyết, mỡ máu: Thạch Hộc dưỡng âm thanh nhiệt, thuận táo, là thảo
dược chuyên dụng để điều trị bệnh tiểu đường. Kết quả nghiên cứu lâm sàng cho biết Thạch
Hộc khơng những có hoạt tính tăng cường Insulin, đồng thời có khả năng giảm đường huyết
giúp cho máu hoạt động binh thường, xúc tiến tuần hoàn, giãn huyết quản, giảm cholesterol
và triglyceride.
Kháng u bướu: Thạch Hộc rỉcó khả năng tiêu diệt một số tế bào ác tính của ung thư
phổi, ung thư buồng trứng, bệnh máu trắng với hoạt tính kháng ung thư tương đối mạnh.
Trong lâm sàng sử dụng Thạch Hộc rỉ sắt làm thuốc điều trị bổ sung các bệnh ung thư ác tính,
cải thiện tính trạng của người bệnh, giảm nhẹ tác dụng phụ của các liệu pháp xạ trị, hóa trị,
tăng sức miễn dịch, nâng cao chất lượng cuộc sống, kéo dài tuổi thọ.
Bảo hộ thị lực: Thạch Hộc rỉ sắt có công năng dưỡng âm, dưỡng mục, là thảo mộc quý
bảo vệ mắt, có hiệu quả tương đối tốt để chữa bệnh lòa của tuổi già, bảo vệ mắt cho trẻ em.
Kháng suy não: Thạch Hộc rỉ sắt là thần dược có tác dụng trẻ hóa cơ thể. Trong Thạch
Hộc rỉ sắt có nhiều nguyên tố vi lượng quý có tác dụng chống lão hóa tốt hơn nhiều so với các
loại thuốc khác.
- Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp với hồng
sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra, có thể nấu cháo Thạch Hộc, trà Thạch Hộc
và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây công năng làm thực phẩm chức năng đã được
khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an tồn và bổ dưỡng. Thạch Hộc tía có vị hơi ngọt
hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư âm, thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu,
miệng khô.
Hiệu quả kinh tế: Thạch Hộc trồng một lần có thể thu hoạch 6 năm, đầu tư ban đầu có thể tốn
kém, nhưng năm thứ 2 có thể thu hồi vốn, từ năm thứ 3 có lãi. Trong điều kiện thâm canh,

14


năng suất tươi khoảng 5 tấn/ha/năm với giá bán khoảng 3 triệu đồng/kg, doanh thu đạt 15 tỷ
đồng/ha/năm. Thị trường tiêu thụ là khả quan, nếu chế biến sâu, thị trường càng lớn và hiệu
qủa càng cao, bao gồm thị trường nội địa, thị trường Đông Nam Á, Trung Quốc, Hàn Quốc,
Nhật Bản và châu Âu, châu Mỹ. Hiện tại, chỉ có Trung Quốc đang phát triển loại cây này
nhưng sản lượng đưa ra thị trường còn rất khiêm tốn, sau mấy năm nữa sản lượng có thể tăng
lên nhiều, giá bán có thể giảm xuống, nhưng hiệu quả vẫn cao hơn nhiều so với nhiều cây
trồng khác.
Các polisaccarit thể hiện các hoạt tính điều biến miễn dịch và bảo vệ gan. Các alkaloit
có hoạt tính chống oxi - hóa, chống ung thư và bảo vệ hệ thần kinh (Ng và cs, 2012).
Bảng dưới đây liệt kê một số bài thuốc thảo dược truyền thống của người Trung Quốc
dùng cây lan làm dược liệu. Một trong số đó là bài thuốc có tên là ‘Shihu’ đang được bán rộng
rãi với các thành phần dược liệu làm từ các giống lan Dendrobium. Bài thuốc này được giới
thiệu là có thể trị bệnh khó tiêu hóa, bổ sung nước, hạ sốt, tăng hàm lượng bạch cầu trong
máu và giảm lo lắng, bồn chồn. Ngồi ra, người Trung Quốc cịn dùng bài thuốc này để chữa
bệnh ung thư dạ dày và phổi.
Bảng 1.1: Các bài thuốc sử dụng Dendrobium làm dược liệu (Chinese Traditional Patent
Medicine số 29 - 2007)

Tên bài thuốc

Dược liệu

Các hợp chất chức

chính

năng

Điều trị
Nourish stomach ( kích thích nhu

Shihu (herba

Dendrobiu

Dendrobii)

m spp.

Shihu Yeguang

Dendrobiu

Wan

m spp.

Dendrobine, Nobilonine,động và tăng tiết dịch dạ dày); Bổ
Dendrine,
sung dịch cơ thể ( chữa khô lưỡi,
Dendroxime,…

sốt,…
Dendrobine, Nobilonine,Hạ
Chữa
chứng giả cận thị; Mắt mỏi;

Dendrine,

chứng giảm sức nhin; viêm võng

Dendroxime,…

mạc trung tâm

Dendrobiu
Moscatilin

mloddiges

khát, lưỡi đỏ);

Chống tụ tiểu cầu (ở động vật);
Moscatilin

Chống ung thư (các dòng tế bào

ii

ung thư phổi và dạ dày)

1.1.5. Các cơng trình nghiên cứu
1.1.5.1. Các cơng trình nghiên cứu Trong nước

15

Đã có các tác giả trong và ngoài nước nhân giống lan Dendrobium sp. bằng phương
pháp gieo hạt lan trên nền môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (Luan et al., 2006).
Nguyễn Văn Song (2011) cũng nhân nhanh in vitro loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng với
nguồn nguyên liệu ban đầu là gieo hạt trên môi trường MS + 15% đường sacarose + 2,0 mg/l
BA. Trong 3 năm gần đây Viện Sinh học Nông nghiệp đã thành công khi áp dụng công nghệ
nuôi cấy mô nhân giống một số loài lan bản địa làm dược liệu thuộc chi Hoàng Thảo có nguy
cơ bị tuyệt chủng (Nguyễn Thị Sơn và cs., 2012; 2013; Vũ Ngọc Lan và cs., 2013).
Lan Dendrobium officinale Kimura et Migo. (Thạch Hộc Thiết bi) là giống lan quý
được sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng chữa bệnh tiểu đường và các bệnh nan y
đang được thương mại hóa rộng rãi trên thế giới. Theo Nguyễn Thị Sơn và cộng sự 2014 đã
nhân giống vơ tính Dendrobium officinale Kimura et Migo (Thạch Hộc Thiết bi) in vitro bằng
phương pháp gieo hạt khử trùng mẫu quả của các giống lan. Nhân nhanh giống lan Hoàng
thảo Thạch Hộc (D. nobile Lind) bằng hệ thống Bioreactor" do nhóm nghiên cứu của TS.
Nguyễn Thị Lý Anh, Viện Sinh học Nông nghiệp, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam được thực
hiện năm 2012. Nghiên cứu áp dụng hệ thống ni khí canh cho nhân giống Thạch Hơ ơc (Trần
Thế Mai và cs, 2012).
Bên cạnh đó, cũng có nhiều nghiên cứu về di truyền và hoạt tính của dược chất có trong
lan thạch hộc như: Viện Di truyền Nông nghiệp cũng có nghiên cứu đánh giá đa dạng di
truyền tập đoàn hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium spp.) bản địa bằng chỉ thị phân tử (Trần
Duy Dương và cs, 2013); Viện Dược liệu cũng có nghiên cứu nhân giống in vitro giống D.
nobile, nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hoàng Thảo (D.nobile) (Tạp chí Dược liệu, tập 15,
số 2/2010); Nghiên cứu về tiềm năng của Dendrobium officinale Kimura et Migo trong viê ôc
chống thiếu máu cục bô ô cơ tim ở ch ơt.
1.1.5.2. Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu nhân giống các loài Dendrobium được tiến hành sớm và nhiều nhất ở
Trung Quốc. Quy trinh nhân nhanh in vitro cũng đã được xây dựng trên nhiều lồi
Dendrobium là thành phần dược liệu chính của các bài thuốc nổi tiếng như Shihu. Hầu hết các
nghiên cứu này được cơng bố trên các tạp chí tiếng Trung. Một số nghiên cứu cũng được cơng
bố trên tạp chí tiếng Anh. Theo Li X và cộng sự (2008) phân tích đa dạng di truyền và bảo tồn
của thảo mộc đặc hữu Dendrobium officinale Kimura et Migo (Orchidaceae) có nguy cơ tuyệt

chủng ở Trung Quốc bằng phương pháp AFLP. Đã xác định mức độ đa dạng di truyền và mô
hinh cấu trúc di truyền quần thể của loài Dendrobium officinaleKimura et Migo
(Orchidaceae) có nguy cơ tuyệt chủng. Phân tích 12 lồi lân cận đánh giá sự đa dạng và cấu
trúc di truyền của nó, sử dụng các phương pháp khuếch đại đa hinh các trinh tự (AFLP). Một
mức độ cao của sự đa dạng di truyền đã được phát hiện (H (E) = 0,269) với POPGENE. Phân

16


tích ANOVA, đã có sự thay đổi vừa phải giữa các cặp của các quần thể với giá trị khác nhau
0,047-0,578 và các biến dị di truyền trung binh 26,97%. Giữ một môi trường ổn định là rất
quan trọng cho in situ bảo tồn và quản lý thực vật quý hiếm và nguy cấp này, ex situ lưu trữ
bảo tồn ngân hàng tế bào mầm.
Yan L và cộng sự (2014) đã nghiên cứu giải trinh tự genome của Dendrobium officinale
truyền thống ở Trung Quốc cho biết Dendrobium officinale Kimura et Migo xác định được
trinh tự bộ gen của D. officinale 1.35 Gb bằng cách kết hợp thế hệ thứ hai Illumina Hiseq
2000 và công nghệ PacBio. Giải trinh tự gen lan và một số gen đã được cụ thể hoá. Phân tích
con đường sinh tổng hợp các thành phần dược tính của D. officinale và tim ra con đường tổng
hợp alkaloid của cây tạo thuận lợi cho nghiên cứu tiến hóa của lan, cũng như nghiên cứu về
các thành phần dược và di truyền của dendrobe.
Theo Guo X và cộng sự (2013) phân tích quá trinh phiên mã của Dendrobium officinale
xác định gen sinh tổng hợp alkaloid và các marker di truyền. Thân Dendrobium officinale
Kimura et Migo (Orchidaceae) có chứa thành phần alkaloid. Tuy nhiên, quá trinh sinh tổng
hợp alkaloid không được biết đến vi số lượng hạn chế trên GenBank. Phân tích RNA đã phân
lập từ thân của D. officinale cách sử dụng một nửa chạy trên GS FLX Titanium nền tảng
Roche 454 để tạo ra 553.084 ESTs với chiều dài trung binh của 417 base. Tổng cộng có
69,97% của các chuỗi phân tử tham gia sinh tổng hợp alkaloid của cây. Xác nhận rằng mức độ
biểu hiện của 5 gen mã hóa enzyme chính tham gia vào quá trinh tổng hợp alkaloid là
Cytochrome P450s, aminotransferase, methyltransferases, multidrug resistance protein
(MDR) và các yếu tố dịch mã tham gia vào tổng hợp alkaloid. Cung cấp cho các nghiên cứu

về gen di truyền và chức năng phân tử của loài này.
Nai-dong chena và cộng sự (2015) phân biệt và đánh giá mức độ tương đồng của lồi
lan ni cấy mơ và Dendrobium hoang dã bằng cách sử dụng thay đổi ánh sáng hồng ngoại.
So sánh sự khác biệt của giống nuôi cấy mô và giống từ tự nhiên. Nghiên cứu cho thấy các
biến thể của các chất chuyển hóa thứ cấp trong quá trinh nuôi cấy.
Tăng quá trinh nảy mầm hạt giống in vitro Dendrobium officinale bằng cách sử dụng
nấm rễ (Tulasnella sp.) ở Trung Quốc bởi Xiao Ming Tana năm 2013. Hoa lan nhiệt đới xuất
hiện thường kết hợp với các loại nấm rễ Tulasnella (nấm đảm Basidiomycota) giúp cho quá
trinh nảy mầm hạt giống, nghiên cứu phân lập nấm Tulasnella từ rễ của Dendrobium
officinale Kimura et Migo. Kết quả Tulasnella có vai trò quan trọng khác nhau tùy thuộc vào
vòng đời của D. officinale in vitro. Sự nảy mầm và phát triển của cây được đánh giá lên đến
11 tuần và 7 tuần sau khi tương tác với Tulasnella. Trong nghiên cứu này, hai chủng
Tulasnella (JC-02 và JC-05) được phân lập; Dendrobium Nobile Lindl (Orchidaceae) thu thập

17


từ tỉnh Vân Nam, Trung Quốc có tỷ lệ nảy mầm là 98,47% và 99,05%, cao hơn so với đối
chứng (81,05%).
Ngoài ra, Ding G (2005) nghiên cứu đa dạng di truyền, mối quan hệ ở mức độ phân tử 8
quần thể Dendrobium officinale hoang dã bằng các marker RAPD. Có sự khác biệt di truyền
và đa dạng di truyền trong các quần thể hoang dã. Marker RAPD là một công cụ thơng tin
hữu ích cho sự đa dạng di truyền, đánh giá quần thể của Dendrobium officinale hoang dã.
Nghiên cứu hoa và khả năng đậu quả của lan Thạch Hộc (Dendrobium officinate
Kimura et Migo.) bởi Xin qian và cộng sự (2013). Nghiên cứu sản xuất hoa in vitro và hạt
giống D. officinate trên Murashige & Skoog (MS) vừa với 0,2 mg L-1 benzyladenine (BA) và
0,05 mg L-1 α-naphthalene acetic acid (NAA). Nhiều chồi được tái tạo bằng phương pháp
protocorm-like (PLBs). Các cây con chiều cao 2-4 cm, ra hoa, và các mức giá cao (83,2%) và
cây binh thường (73,6%). Phân tích mơ học cho thấy nguồn gốc của hoa kỳ sơ khai và hinh
thái học của phấn hoa và noãn.

Khảo sát quá trinh vi nhân giống Dendrobium officinale của Bihua Chen (2014). D. officinale
được ni cấy trên mơi trường ½ Murashige và Skoog (MS) với 2,0 mg L-1 benzyladenine
(BA) + 0,1 mg L-1 acid naphthaleneacetic (NAA) + 100 g L-1 bổ sung khoai tây. Quá trinh
nuôi cấy tạo rễ trên mơi trường MS ½ + 0,2 mg L-1 BA + 1,0 mg L-1 NAA cung cấp 100%
rễ.
1.2. Giới thiệu về protocorm
Protocorm là những cấu trúc tế bào nhỏ, và được phát triển từ phôi hoặc từ nuôi cấy
đỉnh chồi sau vài tuần. Protocorm thường ở dạng hinh cầu đường kính 1 - 2 mm, có màu xanh
và dễ dàng được tách ra để nhân giống in vitro. Protocorm chủ yếu được dùng để nhân giống
in vitro để hinh thành phôi soma, protocorm và có thể còn được nhân giống để tạo thành cây
con.
1.3. Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào
Những biểu hiện về cơ chế kiểm soát quá trinh sinh trưởng và phát triển của thực vật
là những kiến thức cơ bản được áp dụng rỗng rãi. Để phân tích những cơ chế này, chúng ta
cần thiết lập một chương trinh biệt hóa cho một mẫu thí nghiện có sẵn trong nuôi cấy in
vitro trước khi cố gắng giải thích câu hỏi: làm thế nào để một chương trinh biệt hóa được
thực hiện, ví dụ như trong cơ thể thực vật.
Từ giai đoạn phôi đến giai đoạn trưởng thành, sự biệt hóa tế bào thực vật trải qua
nhiều sự kiện liên kết với nhau, và cuối cùng tạo thành những hinh dạng, chức năng, cấu
trúc phức tạp. Tất cả các sự kiện này xảy ra trong một mối liên quan hệ thống rất nhạy cảm
với các nhân tố môi trường. Những tác động này thống nhất trên toàn bộ cơ thể sinh vật.
Tuy nhiên, trong đó những hiểu biết hết về sự kích thích, tiến trinh, vận chuyển của chúng

18


đến các tế bào đích khơng thể dùng để nghiên cứu, mặc dù hiện nay những kỹ thuật về sinh
học phân tử rất mạnh.
Các khái niệm về mạng lưới ức chế, trong đó sự tăng trưởng, phát triển và lão hóa
bắt nguồn từ mối tương quan có thể điều chỉnh giữa: i) cơ quan, mô, tế bào, ii) các cụm tế

bào khác nhau, iii) các bào quan trong tế bào đã đưa Lê Kim Ngọc đến với khái niệm hệ
thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 thế kỷ XX.
Với hệ thống này Lê Kim Ngọc (1970) cố gắng tách một hoặc một vài lới trong tế
bào; và cố gắng chương trinh hóa lại chúng trong nuôi cấy in vitro, trong đó “biệt hóa” là
một tiêu chí quan trọng. Tất cả các quá trinh biệt hóa đó được kiểm soát một cách riêng biệt
hoặc tái chương trinh hóa theo trinh tự thời gian hoặc không gian tùy theo người nghiên cứu
và không bị áp đặt bởi quá trinh phát triển cá thể.
Hệ thống lát mỏng tế bào - thin cell layer - TCL bao gồm các mẫu cấy có kích thước
nhỏ được cắt ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận
của hoa, lá mầm, phôi). Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được
cắt theo chiều ngang gọi là tTCL. Các lTCL (1 mm x 0,5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mô
như lớp đơn của tế bào biểu bi hoặc một vài lớp (3 - 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các
tTCL (dày khoảng 0,2/0,5 mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mô khác nhau
(mô biểu bi, mô vỏ, thượng tầng, mô ruột hay tế bào nhu mô) (Trần Thanh Vân và Gendy,
1996). tTCL và lTCL có đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đóng vai trò quan trọng
vi các phân tử đánh dấu sự biệt hóa có thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế
bào đáp ứng. Quá trinh định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong
muốn (Trần Thanh Vân, 2002).
Khi cắt mẫu, mô thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh
ra rất cần cho quá trinh cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Trần Thanh Vân
và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL
là chúng có mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách
tế bào mới và nơi phóng thích của oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng các yếu tố khác
bên trong mơi trường để “kiểm sốt” sự phát sinh hinh thái. Tuy nhiên, cũng bởi vi lý do đó
có thể nói chúng khá phụ thuộc vào môi trường, lát mỏng có ưu điễm là đồng nhất, nên dễ
phản ứng một các đồng nhất với môi trường. Ngược lại các mẫu cấy lớn hơn (như thân hoặc
các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với môi trường và có thể chứa các
hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trưởng thực vật nên chúng không phụ
thuộc nhiều vào môi trường.
Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như trên những tổ chức

không gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau

19


khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hinh thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không
gian và thời gian khác biệt với sự tổ chức trước khi tiến hành quá trinh tách ra từ mô hay cơ
quan cho. Hơn nữa hầu hết các trường hợp trong quá trinh phát triển của tế bào đơn hay tế
bào trần có sự hinh thành mô sẹo, phôi sinh dưỡng trộn lẫn tế bào không phải là phôi như
các tế bào ống và rễ. Ngược lại, hệ thống TCL có sự hinh thành phần đó với số lượng lớn
hơn. Không những chúng được tiếp xúc trực tiếp với môi trường mà còn được chương trinh
hóa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với không gian và thời gian (Trần Thanh
Vân, 1973).
Việc giản số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào có ý nghĩa quan trọng
vi ảnh hưởng đến quá trinh phát triển hoặc các chương trinh biệt hóa mô, cơ quan. Bên cạnh
đó, khoảng thời gian để quá trinh phát sinh hinh thái xuất hiện tương đối ngắn (trung binh
khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng. Như
trên mẫu lTCL của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) có kích cỡ 1 x 10 mm bao gồm 3 - 6
lớp tế bào biểu bi và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây đươc biệt hóa trực tiếp
trên bề mặt TCL (mà không trài qua quá trinh mô sẹo trng gian): i) 50 hoa trong chương
trinh hoa, ii) 500 - 700 chồi trong chương trinh chồi, iii) 15 - 20 rễ trong chương trinh rễ.
Các tính chất mong muốn khác có được trong phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào
là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền, và có thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật.
Tuy nhiên điều kiện môi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL cịn phụ
thuộc vào lồi và phải thử nghiệm lại tất cá các điều kiện in vitro gồm chất dinh dưỡng, chất
điều hòa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ (Trần Thanh Vân, 1980).

20

Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu
- Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 04 năm 2018.
- Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật Khoa Công nghệ
sinh học và Môi Trường Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành.
- Vật liệu: lan Thạch Hộc Thiết Bi
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nội dung 1: Tạo nguyên liệu lan Thạch Hộc Thiết Bì in vitro
Công việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bì
Mục tiêu: tim hiểu giá trị dược liệu có trong Lan Thạch Hộc nhằm chọn được cây
giống chất lượng cao phục vụ cho việc nhân giống in vitro.
- Nguyên liệu: Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Phương pháp thực hiện: thu mẫu tại các địa điểm thí nghiệm dựa trên các chỉ tiêu hinh thái
và bảo quản
- Thời gian thí nghiệm: 30 ngày.
- Địa điểm thực hiện: Khoa Công nghệ Sinh học và môi trường trường đại học
Nguyễn Tất Thành
Công việc 1.2: Tạo nguồn vật liệu lan Thạch Hộc Thiết Bì in vitro
- Mục tiêu: xác định thời gian, nồng độ javel thích hợp cho q trinh vơ trùng mẫu
- Nguyên liệu: Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MS có bổ sung đường sucrose (30 g/l).
- Phương pháp thực hiện: tiến hành vô trùng mẫu trong chất khử trung javel (50 - 75 100%) với các khoảng thời gian (10 - 20 phút)
- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu vô trùng (%), tỷ lệ mẫu tạo chồi (%).
- Thời điểm thu số liệu: 25 ngày sau khi vô mẫu.
Nội dung 2: Nghiên cứu nuôi cấy lát mỏng lan Thạch Hộc Thiết Bì
Cơng việc 2.1: Khảo sát mơi trường khống cơ bản ni cấy tạo protocorm
- Mục tiêu: xác định mơi trường khống thích hợp cho sự phát sinh hinh thái mẫu nuôi
cấy
- Nguyên liệu: Lan Thạch Hộc Thiết Bi.

- Môi trường nuôi cấy: môi trường vaccine and went, MS, knudson C có bổ sung sucrose
(30 g/l), NAA (2 mg/l).
- Phương pháp thực hiện: lan thạch Hộc thiết bi được cắt lát với độ dày 0,5 mm sau đó đặt
lên môi trường nuôi cấy (10 mẫu/chai)

21


- Chỉ tiêu khảo sát: tỷ lệ phát sinh protocorm (%), thời gian phát sinh protocorm (ngày),
đặc điểm mẫu nuôi cấy
- Thời gian thí nghiệm: 40 ngày.
Cơng việc 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin đến quá trình nuôi cấy tạo protocorm
- Mục tiêu: xác định nồng độ 2,4-D; NAA thích hợp cho quá trinh tạo protocorm
- Vật liệu: lá Lan Thạch Hộc Thiết Bi.
- Môi trường nuôi cấy: thí nghiệm được thực hiện trên mơi trường thạch với thành
phần khống theo kết quả của cơng việc 2.1, bổ sung 2,4-D, NAA với các nồng độ khác nhau
(0,5 - 1,0 - 2,0 - 4 - 5 mg/l) đường sucrose (30 g/l).
- Tiến hành: lan thạch Hộc thiết bi được cắt lát với độ dày 0,5 mm. Cấy 5 mẫu lá vào mỗi
binh mơi trường ni cấy. Mẫu thí nghiệm sau đó được đặt trong điều kiện tối hoàn toàn, nhiệt
độ 24°C ± 2.
- Chỉ tiêu khảo sát: tỷ lệ phát sinh protocorm (%), thời gian phát sinh protocorm (ngày),
đặc điểm mẫu nuôi cấy
- Thời gian khảo sát: 40 ngày.
Công việc 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/cytokinin đến quá trình nhân protocorm
- Mục tiêu: xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho
quá trinh nhân protocorm
- Nguyên liệu: protocorm Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: được bổ sung NAA (0,5 mg/l) kết hợp với BA (0,1 - 0,5 - 1 - 2 mg/l).
- Phương pháp thực hiện: protocorm lan thạch Hộc thiết bi được đặt lên môi trường nuôi cấy
(1 g/chai)

- Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối tươi protocorm (g), đặc điểm protocorm
- Thời gian thí nghiệm: 40 ngày.
Công việc 2.4: Khảo sát sự ảnh hưởng của các thành phần hữu cơ đến q trình nhân sinh
khới protocorm
- Mục tiêu: xác định được nồng độ khoai tây và nước dừa thích hợp cho sự phát sinh
hinh thái mẫu nuôi cấy
- Nguyên liệu: protocorm Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: được bổ sung, nước dừa (5 - 10 - 15 - 20%), dịch chiết khoai tây (50 100 - 150 - 200 g/l)
- Phương pháp thực hiện: protocorm lan thạch Hộc thiết bi được đặt lên môi trường nuôi cấy
(1 g/chai)
- Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối tươi protocorm (g), đặc điểm protocorm
- Thời gian thí nghiệm: 40 ngày.

22


Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của elicitor đến sự tích lũy dược chất trong q
trình ni cấy protocom lan Thạch Hộc Thiết Bì
Cơng việc 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của elicitor đến quá trình tổng hợp dược chất trong
protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì
- Mục tiêu: xác định elicitor thích hợp cho quá trinh tích lũy polysaccharides.
- Vật liệu: protocorm Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: môi trường tốt nhất theo kết quả của nội dung 2. Bổ sung thêm
yeast extract, Casein hydroxylase theo các nồng độ thí nghiệm (50 - 100 - 150 - 200 mg/l).
Thể tích mơi trường ni cấy 50 ml.
- Tiến hành: protocorm lan thạch Hộc thiết bi được đặt lên môi trường nuôi cấy (1 g
mẫu/chai)
- Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối tươi protocorm (g), hàm lượng dược chất
- Thời gian khảo sát: 40 ngày.
Công việc 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ni cấy đến q trình tổng hợp dược chất

trong protocorm lan Thạch Hộc Thiết Bì
- Mục tiêu: xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối protocorm có hoạt chất cao nhất
- Vật liệu: protocorm Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: môi trường tốt nhất theo kết quả của công việc 3.1.
- Tiến hành: protocorm lan thạch Hộc thiết bi được đặt lên môi trường nuôi cấy (1 g
mẫu/chai), theo dõi và thu mẫu ở các thời điểm 30 - 60 - 90 ngày sau khi cấy
- Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối tươi protocorm (g), hàm lượng dược chất
- Thời gian khảo sát: 60 ngày.
Công việc 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bổ sung elicitor đến quá trình tổng hợp
dược chất trong protocorm Thạch Hộc Thiết Bì
- Mục tiêu: xác định được thời điểm bổ sung elicitor thích hợp cho q trinh tích lũy dược
chất trong mẫu ni cấy
- Vật liệu: protocorm Lan Thạch Hộc Thiết Bi
- Môi trường nuôi cấy: môi trường tốt nhất theo kết quả của công việc 3.1.
- Tiến hành: protocorm lan thạch Hộc thiết bi được đặt lên môi trường nuôi cấy (1 g
mẫu/chai) và bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy ở các thời điểm (10 - 15 - 20) ngày trước khi
thu mẫu)
- Chỉ tiêu khảo sát: sinh khối tươi protocorm (g), hàm lượng dược chất
- Thời gian khảo sát: 40 ngày.
2.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
2.4.1. Phương pháp thu thập số liệu
- Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) = (tổng số mẫu vô trùng/tổng số mẫu ban đầu) x 100.
- Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = (tổng số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu vô trùng) x 100.
- Sinh khối tươi (g) = khối lượng protocorm thu được khi kết thúc thí nghiệm - 1

23


- Sinh khối khô = protocorm thu được khi kết thúc thí nghiệm đem sấy đến khối lượng
khơng đổi ở 70°C.

2.4.2. Xử lý kết quả
Các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Số liệu thu được ở các thí nghiệm được xử lý
thống kê bằng phần mềm SAS 9.1

24


Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nội dung 1: Tạo ngun liệu lan Thạch Hộc Thiết Bì in vitro
3.1.1. Cơng việc 1.1: Thu thập mẫu lan Thạch Hộc Thiết Bì
Để có thể chọn lọc được loài thạch học thiết bi có giá trị dược liệu cao, dễ trồng, sinh
trưởng nhanh, năng suất cao. Chúng tôi tiến hành tim kiếm dữ liệu về thành phần dược chất
cũng như đặc điểm hinh thái của từng loải để phục vụ cho công tác thu thập mẫu. Kết quả cho
thấy: Trên thế giới họ Lan có 1.400 loài, Trong đó, nhiều loài có giá trị dược liệu cao, đặc biệt
chi Thạch Hộc đã được nghiên cứu và xác định có nhiều thành phần dược liệu quý. Ở Trung
Quốc chi Thạch Hộc có 14 loài và 12 loài phụ, trong đó chỉ có 11 loài làm thuốc và Thạch
Hộc tía là loại làm thuốc tốt nhất, được bán với giá cao nhất trên thị trường. Ở nước ta các
loài Thạch Hộc thường thấy là: (1) Thạch Hộc tía có tên khoa học Dendrobium officinale
Kimura et Migo, thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae). Tên Việt Nam: Thạch Hộc rỉ
sắt. Với đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía, là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, sống bám vào
cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát,
có giá trị độc đáo về dược phẩm. (2) Thạch Hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý
Châu, Vân Nam, Quảng Châu ở độ cao 600 - 1.700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc
vách đá ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma, Thái
Lan, Việt Nam. Rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao, cũng có tác dụng nhất định về
công năng dược liệu. (3) Thạch Hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi,
phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công dụng làm
thuốc chữa một số bệnh. (4) Thạch Hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ
rừng độ cao 750 - 1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cành. (5) Thạch Hộc Cổ chùy là

cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng
thưa, độ cao 500 - 1.600 m, phân bố ở Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam. (6) Thạch
Hộc Hooc sơn phân bố ở huyện Hooc Sơn, An Huy - Trung Quốc, có công dụng làm dược
liệu để chữa một số bệnh.
Lan Thạch Hộc hiện nay đang được trồng nhiều nhất ở tỉnh Cao Bằng, một địa điểm có
nhiều tán rừng nguyên sinh, nhiệt độ mát mẻ, độ ẩm cao. Nơi tập trung rất nhiều vườn lan
thạch hộc đã được tuyển chọn và nhân giống. Việc thu thập mẫu được thực hiện dựa trên sự
quan sát về hinh thái lá, thân. Kết quả khảo sát thu thập mẫu cho thấy Thạch Hộc Thiết bi là
loài được nhân giống và trồng chính tại cao bằng. Cây sinh trưởng phát triển mạnh, năng xuất
ổn định, cây con nuôi cấy mô sau khi trồng 18 tháng có thể thu hoạch lần 1 và việc thu hoạch

25