Khảo sát hiệu quả lên men từ chủng saccharomyces cerevisiae được cố định trên giá thể ca alginate

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ LÊN MEN TỪ CHỦNG
saccharomyces cerevisiae ĐƯỢC CỐ ĐỊNH TRÊN
GIÁ THỂ CA-ALGINATE

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Trung Tín
MSSV

: 1711544052

GVHD

: ThS. Nguyễn Trung Hiếu

TP. HCM, 2020


ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ LÊN MEN TỪ CHỦNG
saccharomyces cerevisiae ĐƯỢC CỐ ĐỊNH TRÊN
GIÁ THỂ CA-ALGINATE

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Trung Tín
MSSV

: 1711544052

Chun Ngành

: Cơng nghệ sinh học

GVHD

: ThS. Nguyễn Trung Hiếu

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH
Khoa Công nghệ Sinh học

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Nguyễn Trung Tín

MSSV: 1711544052

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Lớp: 17DSH1A

1. Đầu đề luận văn:
Khảo sát hiệu quả lên men từ chủng Saccharomyces cerevisiae được cố định trên
giá thể Ca-Alginate.
2. Mục tiêu

-

Chọn được nồng độ natri – alginate và CaCl2 cho hiệu quả lên men cao từ S.
cerevisiae cố định
Chọn được nồng độ S. cerevisiae cố định cho hiệu quả lên men tốt nhất

-

Xác định được số lần tái sử dụng hạt Ca – alginate cố định S. cerevisiae

-

3. Nội dung:
-

Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natri – alginate và CaCl2 lên hiệu quả lên men của S.
cerevisiae cố định
Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men
Khảo sát số lần tái sử dụng hạt Ca - alginate cố định S. cerevisiae
4. Thời gian thực hiện: tháng 6/2020 đến tháng 9/2020
5. Người hướng dẫn chính: ThS. Nguyễn Trung Hiếu

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.
TP. HCM, ngày…… tháng……năm20…
Khoa/Bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Nguyễn
Tất Thành đã tạo điều kiện cơ sở vật chất tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và
gắn bó tại trường. Cám ơn quý Thầy Cô Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học đã
truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian học tập tại khoa.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy Nguyễn Trung Hiếu đã
tận tình hướng dẫn em để hồn thành khóa luận này, Thầy đã truyền đạt những kiến thức
và kinh nghiệm mà em cịn thiếu sót, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em hồn thành khóa
luận của mình.
Cảm ơn cha mẹ và gia đình đã ln ở cạnh, ủng hộ, chăm sóc và tạo mọi điều kiện
tốt nhất cho con được ăn học như ngày hôm nay.
Cảm ơn đến tất cả các anh chị, bạn bè đang nghiên cứu và làm việc tại phịng thí

nghiệm Sinh hóa - Sinh dược - Ký sinh trùng, đã nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ, chỉ dạy cho
em trong thời gian hồn thành khóa luận tại đây.
Tập thể 17DSH1A, đã ln gắn bó, sát cánh bên tơi 4 năm trên giảng đường đại
học, luôn quan tâm giúp đỡ khi tôi gặp khó khăn, rất vui khi được học chung cùng các
bạn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Nguyễn Trung Tín
Khoa Cơng nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT .................................................................................................................. iv
SUMMARY ..................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH................................................................................ vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. ix
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................1
1.1 Đại cương về Saccharomyces cerevisiae.................................................................1
1.1.1 Cấu tạo nấm men Saccharomycescerevisiae .......................................................1
1.1.2 Quá trình biến dưỡng của nấm men .....................................................................2
1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men ..........................................3
1.1.4 Hình thức sinh sản của nấm men ..........................................................................4
1.2 Đại cương về cố định tế bào trên giá thể .................................................................5
1.2.1 Các phương pháp cố định tế bào ..........................................................................5

1.2.2 Đặc tính của Na - alginate ....................................................................................6
1.2.3Phương pháp tạo giá thể Ca - alginate ...................................................................6
1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................................................9
1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................9
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước.................................................................................10
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................12
2.1 Nơi thực hiện .........................................................................................................12
2.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................12
2.2.1 Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................12
ii


2.2.2 Đối tượng nghiên cứu .........................................................................................12
2.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị .....................................................................................12
2.3.1 Dụng cụ...............................................................................................................12
2.3.2 Hóa chất ..............................................................................................................12
2.3.3 Thiết bị ................................................................................................................13
2.4 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................13
2.4.1 Nhân sinh khối nấm men ....................................................................................13
2.4.2 Phương pháp cố định S. cerevisiae bằng calcium alginate ................................14
2.4.3 Phương pháp xác định hiệu quả lên men ............................................................14
2.5 Bố trí thí nghiệm ....................................................................................................14
2.5.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natri – alginate và CaCl2 lên hiệu quả lên men của S.
cerevisiae cố định ........................................................................................................14
2.5.2 Khảo sát sự ảnh hưởng nồng độ S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men.....15
2.5.3 Khảo sát số lần tái sử dụng hạt Ca - alginate cố định S. cerevisiae ...................16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................17
3.1 Kết quả sự ảnh hưởng nồng độ S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men .........19
3.2 Kết quả sự khảo sát quá trình tái sử dụng hạt Ca - alginate cố định S. Cerevisiae23
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................26

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................27
PHỤ LỤC ...................................................................................................................29

iii


TÓM TẮT
Đề tài: “Khảo sát hiệu quả lêm men từ chủng Saccharomyces cerevisiae được
cố định trên giá thể Ca-Alginate” được thực hiện từ tháng 06/2020 đến 09/2020 tại
Phịng thí nghiệm Sinh hóa – Sinh dược – Ký sinh trùng, thuộc khoa CNSH, Trường
Đại học Nguyễn Tất Thành nhằm mục đích đánh giá hiệu quả lên men của nấm men S.
cerevisiae khi cố định trên giá thể Ca - alginate.
Đề tài có ba nội dung là: khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na – alginate và
CaCl2 lên hiệu quả lên men của nấm men S. cerevisiae cố định, khảo sát sự ảnh hưởng
của nồng độ nấm men S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men, khảo sát số lần tái sử
dụng nấm men S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men. Các thí nghiệm được bố trí
theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên.
Những kết quả đạt được sau 3 tháng nghiên cứu:
-

Nồng độ Na – alginate 2% và 3% với nồng độ CaCl2 1,5M và 2M cho hạt
có độ cứng và độ bền thích hợp nhất

-

Nồng độ Na – alginate 2%, CaCl2 2M và nấm men S. cerevisiae 8.108
CFU/ml gel cho hiệu quả lên men cao nhất và có độ bền và độ cứng thích
hợp.

-

Hạt Ca - alginate sau khi lặp lại thì hiệu quả lên men có phần giảm nhẹ sau
mỗi lần lên men. Sau khi hạt lặp lại 3 lần sẽ bắt đầu mềm và dễ vỡ, sau khi
lặp lại 4 lần hạt bắt đầu xuất hiện những lông tơ xung quanh hạt, sau khi lặp
lại 5 lần hạt sẽ bắt đầu nát.

.

iv


SUMMARY
The topic: "Investigation of the effectiveness of yeast from a strain of
Saccharomyces cerevisiae fixed on Ca-Alginate substrate" was conducted from May
June 2020 to September 2020 at the Laboratory of Biochemistry - Biopharmaceutical Parasitology, Department of Biotechnology, Nguyen Tat Thanh University with the aim
of creating more uses and reducing costs when using yeast S. cerevisiae.
The thesis three has contents: investigating the effect of the concentration of Na
- alginate and CaCl2 on the fermentation efficiency of fixed yeast S. cerevisiae,
Investigating the effects of the concentration of fixed S. cerevisiae yeast on fermentation
efficiency, investigating the number of times of reuse of the fixed S. cerevisiae yeast on
fermentation efficiency. The experiments were arranged in a completely randomized
fashion.
Results achieved after 3 months of study:
-

Alginate concentration of 2 % and 3 % with CaCl2 concentration of 1.5 M
and 2M for the most suitable hardness and strength.

-

The alginate concentration of 2 %, CaCl2 2 M with the concentration of S.
cerevisiae 8.108 CFU/ml, the gel has the appropriate durability, the highest
hardness and temperature.

-

Ca - alginate seeds, after repeating, the fermentation effect is somewhat
reduced after each fermentation. After 3 times, the seeds will start to soften
and break easily. After 4 times, the seeds will appear fluff around the seeds.

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu tạo Saccharomyces cerevisiae ...................................................................1
Hình 1.2 S. cerevisiae được xem dưới kính hiển vi điện tử ...........................................2
Hình 1.3 Quá trình lên men ethanol ................................................................................3
Hình 1.4 Chu trình sinh sản của nấm men S. cerevisiae .................................................5
Hình 1.5 Phương pháp tạo gel khuếch tán (diffusion gelation) ......................................8
Hình 1.6 Phương pháp tạo gel nội (internal gelation) .....................................................9
Hình 2.1 hình ảnh các tế bào nấm men được soi dưới kính hiển vi ..............................13
Hình 2.2 Hệ thống lên men thu kết tủa ..........................................................................16
Hình 3.1 Đồ thị hiệu quả lên men của các nồng độ alginate và CaCl2..........................19
Hình 3.2 Hiệu quả lên men của S. cerevisiae với nồng độ khác nhau ..........................20
Hình 3.3 Hiệu quả lên men của S. cerevisiae với nồng độ khác nhau ..........................21
Hình 3.4 Hiệu quả lên men của S. cerevisiae với nồng độ khác nhau ..........................22

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Thành phần tạo hạt Canxi – alginate các nồng độ để đánh giá hiệu quả lên
men của S. cerevisiae cố định........................................................................................15
Bảng 3.1 Bảng đánh giá độ cứng của hạt Ca - alginate với nồng độ Na - alginate và
CaCl2 khác nhau ............................................................................................................17
Bảng 3.2 Bảng đánh giá hiệu quả lên men của các nồng độ alginate và CaCl2 ............18
Bảng 3.3 Bảng đánh giá quá trình tái sử dụng các hạt alginate ....................................23

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
OD

Mật độ quan phổ (Optical Density)

UV – VIS

Phổ tử ngoại – Khả kiến (Ultraviolet - Visible)

HL

Hàm lượng

ĐC:

Đối chứng

ctv

Cộng tác viên

TB

Trung bình

ANOVA

Phân tích phương sai (Analysis of variance – also)

SAS

Hệ thống phân tích thống kê (Statistical Analysis Systems)

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
S. cerevisiae là một phần thiết yếu của nền văn minh nhân loại vì được sử dụng
rộng rãi trong lên men thực phẩm và đồ uống, trong đó nó có ý nghĩa thương mại
cao. Trong ngành cơng nghiệp men Châu Âu, có khoảng 1 triệu tấn được sản xuất hàng
năm và khoảng 30% trong số đó được xuất khẩu trên toàn cầu. Tốc độ tăng trưởng hàng
năm của thị trường toàn cầu là 8,8% từ 2013-2018 1.
Liên quan đến ngành công nghiệp đồ uống, S. cerevisiae tham gia vào việc sản
xuất nhiều loại đồ uống lên men như rượu, bia và rượu táo; hoặc đồ uống lên men chưng
cất như rượu Rum, rượu Vodka, rượu Whisky, rượu mạnh và rượu Sake; các loại đồ
uống có cồn khác trên tồn thế giới cũng có sự tham gia của S. cerevisiae 2. Q trình
lên men có thể diễn ra từ sự phát triển tự phát của hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên
liệu, hoặc từ việc cấy nấm men tinh khiết 3.
Trong số các chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men cồn

thì Ca-alginat được sử dụng rộng rãi nhất do gel có độ xốp cao cho phép cơ chất và sản
phẩm lên men đi vào, đi ra được dễ dàng tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất. Sự khuếch
tán của glucoza và ethanol vào và ra khỏi mạng lưới gel rất cao khoảng 90 % so với
trong nước và do tính tương thích sinh học rất tốt cho phép các tế bào sống duy trì hoạt
động sống khi được cố định trên mạng lưới gel. Đồng thời, Ca-alginat thường không
độc, không gây ức chế hoạt động sống của tế bào nấm men. Khi lên men bằng nấm men
cố định sẽ cho năng suất ổn định cao giữa các lô, sản phẩm lên men thường khơng phải
qua q trình tách men.
Mục tiêu nghiên cứu:
Đánh giá hiệu quả lên men của nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trên
giá thể Ca-alginate.

ix


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1

Đại cương về Saccharomyces cerevisiae

1.1.1 Cấu tạo nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một loại nấm đơn bào, có dạng hình cầu
hay hình trứng, kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách nảy chồi, khi
chồi non tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập thì nơi đó để lại sẹo và khơng có khả năng
tạo chồi mới nữa. Ngồi ra, S. cerevisiae cịn có hình thức sinh sản bằng cách tạo bào
tử. Cấu trúc tế bào gồm vỏ tế bào bao quanh màng nguyên sinh chất, nguyên sinh chất
có chứa các ty lạp thể, nhân tế bào, không bào, bộ máy golgi, hạt volutin, ribosome, hạt
chất béo và bầu mơ 4.

Hình 1.1Cấu tạo Saccharomyces cerevisiae (nguồn: internet)
Bộ gen nấm men S. cerevisiae dài 12068 kilobase (kb), phân bố trên 16 nhiễm sắc
thể khác nhau 5. Bộ gen của nó đã được giải trình tự hoàn toàn bởi Goffeau và đồng
nghiệp vào năm 1996 và được phát hiện có chứa khoảng 6000 gen; trong đó, khoảng
5570 gene được dự đốn có thể mã hóa protein 6.
S. cerevisiae là một sinh vật mơ hình thường được sử dụng cho các nghiên cứu cơ
bản. Không giống như các sinh vật mẫu khác như Escherichia coli, hoặc Caenorhabd
1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
elegans. S. cerevisiae được xem là một lồi có giá trị nhất cho nhiều ứng dụng cơng
nghiệp. Một lý do chính cho tính năng này là một phần trong phong cách sống của nó,
được gọi là ‘make-accumulate-consume’ 7. Tính năng này dựa trên hiệu ứng Crabtree.
1.1.2 Quá trình biến dưỡng của nấm men
Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của S. cerevisiae là sử dụng các loại đường như:
glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon. Ngoài ra, chúng cịn sử
dụng axit amin và muối amơn như nguồn cung cấp nitơ 4.

Hình 1.2 S. cerevisiae được xem dưới kính hiển vi điện tử (nguồn:
/>
Trong điều kiện hiếu khí S. cerevisiae không sử dụng bộ máy hô hấp để chuyển
hóa đường saccharide và thúc đẩy tăng trưởng sinh khối nấm men, nhưng thay vào đó
là q trình tạo ra ethanol và các hợp chất hai carbon khác thông qua pyruvate . Điều đó
dẫn đến việc S. cerevisiae có thể dễ dàng tích lũy ethanol gây độc với hầu hết các loài
vi sinh vật cạnh tranh khác với các hợp chất đường, từ đó có thể lên men và thúc đẩy
tăng trưởng 1.
Trong điều kiện yếm khí, S. cerevisiae sử dụng glycolysis để dị hóa đường đạt đến
bước hình thành axit pyruvic. Sau đó, axit pyruvic được chuyển hóa tiếp bằng pyruvate

decarboxylase thành acetaldehyd và carbon dioxide, sau đó được khử thành ethanol nhờ
dehydrogenase và giải phóng NAD + cùng một lúc. Do đó, các phản ứng bước cuối cùng
dẫn đến ethanol là rất quan trọng và tạo thành cơ sở cho các ngành cơng nghiệp lên men
chính 8.
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.3 Quá trình lên men ethanol (nguồn:
/>pdf)

Sản phẩm chính của q trình lên men là ethanol và khí cacbonic. Khi nổng độ của
ethanol trong mơi trường lên men tích tụ đến một giá trị nhất định thì các tế bào nấm
men bất đầu bị ức chế. Đối với nấm men tự do, khi nồng độ cồn dưới 2% thì các hoạt
động của nấm men vẫn xảy ra bình thường; nhưng khi vượt quá 2% thi khả năng nảy
chồi của nấm men bắt đầu giảm. Khi nồng độ ethanol tăng lên dến 5% thì khả năng nảy
chổi của nấm men chấm dứt nhưng quá trình lên men vẫn tiếp diễn 9.
1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men
Nồng độ cơ chất và áp suất thẩm thấu của môi trường: Áp suất thẩm thấu của môi
trường phụ thuộc vào hàm lượng đường và các chất hịa tan khác có trong mơi trường.
Khi nồng độ cơ chất cao kéo theo áp suất thẩm thấu cũng cao thì sự tích tụ nấm men
càng nhanh. Tuy nhiên, nếu áp suất thẩm thấu quá cao sẽ xảy ra hiện tượng co nguyên
sinh chất của tế bào 4.
Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu của sinh trưởng và phát triển của nấm men trong khoảng
25-30 oC. Khi nhiệt độ giảm, tốc độ phát triển sinh khối của nấm men giảm dần và hoàn
toàn bị ức chế với nhiệt độ dưới 5oC. Khi nhiệt độ tăng quá cao sinh trưởng của nấm
men cũng bị ức chế, và nấm men sẽ bị chết khi nhiệt độ trên 60 OC 4.

3

Chương 1. Tổng quan tài liệu
pH của môi trường: pH phù hợp cho nấm men phát triển trong khoảng 4-5, pH<2
hay pH >7,5 thì nấm men sẽ bị ức chế và ngừng phát triển 4.
1.1.4 Hình thức sinh sản của nấm men
Nấm men có hình thức sinh sản vơ tính theo kiểu này chồi. Ở điều kiện thuận lợi
nấm men S. cerevisiae sinh sôi nảy nở nhanh. Khi một chồi xuất hiện, các enzyme thủy
phân xuất hiện làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra
khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ huy động đến chồi làm chồi phình to lên,
xuất hiện một vách ngăn giữa chồi và tế bào mẹ. Chồi tách ra khỏi tế bào mẹ và hình
thành tế bào mới.
Nấm men S. cerevisiae có hai dạng tế bảo đơn bội là a và 𝛼 có thể tồn tại độc lập
nhờ sinh sản vơ tính qua ngun phân (mitosis).
Khi hai dạng a và 𝛼 gặp nhau bắt cặp, rồi phối hợp tế bào và hợp nhân tạo 1 tế bào
lưỡng bội (2n). Tế bào lưưng bội có thể sinh sản vơ tính vơ hạn và đây là dạng thường
sử dụng trong sản xuất. Trong những điều kiện nhất định, tế bào lưỡng bội (2n) sinh sản
hữu tính qua giảm phân tạo nang có bốn bao tử ( 2a và 20𝛼 ), mà sự kết hợp a và 𝛼 tạo
tế bào 2n lập lại chu trình 10.

4


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.4 Chu trình sinh sản của nấm men S. cerevisiae (nguồn:
/>
1.2 Đại cương về cố định tế bào trên giá thể
1.2.1 Các phương pháp cố định tế bào
Kĩ thuật cố định các xúc tác sinh học nói chung và kĩ thuật cố định tế bào nói riêng

đã có nhiều ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống. Các loại
hình kĩ thuật này đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế thiết thực và nhanh chóng đi vào
thực tế. Cố định tế bào được hiểu là sự giam giữ các tế bào trong một không gian phản
ứng và vẫn giữ được tính chất xúc tác và có thể được tái sử dụng nhiều lần hoặc liên tục
để sản xuất những sản phẩm theo mong muốn. Nói cách khác cố định tế bào nhằm hạn
chế mọi sự vận động vật lí của các tế bào bằng cách cố định chúng trên các vật thể gọi
là chất mang bằng nhiều phương pháp như hấp thụ, liên kết ion, liên kết nguyên tử, bọc
trong gel mà khơng ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của chúng 11.
Đối với phương pháp bao trong gel thì tế bào được bao bọc trong các chất polyme
tự nhiên hay tổng hợp có khả năng gel hóa. Hình dáng bề ngoài của các chất xúc tác
sinh học đã được cố định theo phương pháp bọc gel có thể thay đổi theo u cầu ví dụ
hình cầu, hình trụ, sợi mảnh hay màng mỏng, nhưng dạng hình cầu là thông dụng nhất.
Các chất mang thường được sử dụng là alginat, k-carrageenan, pectin, agar, gelatin...
Đây là các polyme tự nhiên khơng độc, dễ tạo gel và khơng có hại cho tế bào. Một trong
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu
các chiến lược cải tiến quá trình lên men etanol là áp dụng kĩ thuật cố định tế bào để thu
được quá trình lên men có năng suất và hiệu suất cao 12.
Trong số các chất mang trong kĩ thuật cố định tế bào ứng dụng trong lên men cồn
thì Ca-alginat được sử dụng rộng rãi nhất do gel có độ xốp cao cho phép cơ chất và sản
phẩm lên men đi vào, đi ra được dễ dàng tạo thuận lợi cho việc trao đổi chất. Sự khuếch
tán của glucoza và etanol vào và ra khỏi mạng lưới gel rất cao khoảng 90 % so với trong
nước và do tính tương thích sinh học rất tốt cho phép các tế bào sống duy trì hoạt động
sống của mình khi cố định trên mạng lưới gel, không độc, không gây ức chế hoạt động
sống của tế bào 13.
1.2.2 Đặc tính của Na - alginate
Alginate thường được sản xuất dưới dạng các dẫn xuất của muối tan như sodium
alginate, potassium alginate. Khi các muối này được cho tiếp xúc với các ion kim loại

đa hóa trị như Ca2+, Zn2+, Pb2+,… các ion kim loại đa hóa trị sẽ thay thế các ion ban đầu
trong phân tử alginate hình thành liên kết ngang giữa các lớp trong cấu trúc mạng phân
tử alginate và tạo thành cấu trúc gel. Khả năng tạo gel của alginate với các ion kim loại
đa hóa trị giảm dần theo trình tự: Pb2+, Cu2+, Cd2+, Ba2+, Sr2+, Ca2+,Co2+,… Acid
gulurunic dược ưu tiên liên kết với các ion đa hoá trị bằng liên kết ion. Trong ngành
công nghe thực phẩm, ion Ca2+ được sử dụng làm tác nhân tạo gel alginate vì hầu hết
ion cịn lại có thể ảnh hưởng khơng tốt đến sức khoẻ của người sử dụng và có khả năng
gây độc cho nấm men 14.
1.2.3 Phương pháp tạo giá thể Ca - alginate
Calcium alginate được hình thành từ phản ứng giữa sodium alginate với Ca 2+
theo phản ứng trao đổi ion và tạo thành một dạng biocomposite không tan trong nước
và dễ dàng tạo hạt hoặc màng.
Phản ứng xảy ra như sau : 2Na(alginate) + Ca2+ → Ca(Alginate)2 + 2Na+
Ngồi Ca2+ có khả năng phản ứng với sodium alginate thì các ion như Ba2+ và
Sr2+ tạo thành biocomposite có tính chất tương tự như calcium alginate. Riêng Mg2+
cũng có khả năng phản ứng với sodium alginate nhưng sản phẩm tạo thành

6


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Mg(Alginate)2 lại tan trong nước. Calcium alginate gồm một hệ thống matrix và chính
hệ thống này là yếu tố cơ bản để bẫy các hợp chất sinh học và tế bào 15.
Có 2 phương pháp tạo gel alginate là phương pháp tạo gel khuếch tán (diffusion
gelation) và phương pháp tạo gel nội (internal gelation).
 Phương pháp tạo gel khuếch tán: (diffusion gelation)
-

Nguyên tắc: khuếch tán các ion Ca2+ từ bên ngoài vào trong dung dịch alginate.
Các ion Ca2+ sẽ thay thế các ion kim loại ban đầu trong muối alginate và tạo

thành các liên kết ngang, hình thành cấu trúc khơng gian cho mạng gel.

-

Phương pháp thực hiện: đây là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất trong kĩ thuật
cố định tế bào, hỗn hợp dung dịch alginate trong nước và huyền phù nấm men
nhỏ giọt vào dung dịch chứa Ca2+ thường là CaCl2 để tạo thành các hạt gel có
chứa nấm men bên trong. Q trình tạo gel bắt đầu từ mặt ngồi của giọt
alginate. Khi tiếp xúc với ion Ca2+ trong dung dịch, bề mặt ngồi của giọt
alginate lập tức bị gel hóa. Do gel có cấu trúc xốp nên các ion Ca2+ tiếp tục
khuếch tán vào bên trong giọt alginate làm cho các phân tử bên trong tiếp tục bị
gel hóa. Vì sự khuếch tán ion Ca2+ đi từ ngoài hạt gel đến tâm hạt gel nên mật
độ alginate bề mặt hạt gel cao hơn nhiều lên so với tâm hạt gel, do đó tính đồng
thể của hạt gel khơng cao.

-

Ưu điểm: phương pháp đơn giản dễ thực hiện, không tốn thời gian, chi phí thấp.

-

Nhược điểm: tính đồng nhất của hạt gel thấp, hình dạng của hạt gel chỉ có thể
là hình cầu 16.

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.5 Phương pháp tạo gel khuếch tán (diffusion gelation)

(nguồn: /> Phương pháp tạo gel nội (internal gelation)
-

Nguyên tắc: khuếch tán đều ion Ca2+ ở dạng vô hoạt trong hỗn hợp dung dịch
alginate trong nước và huyền phù nấm men, sau đó hoạt hóa giải phóng ra các
ion Ca2+. Q trình gel hố diễn ra bên trong hạt alginate.

-

Phương pháp thực hiện: người ta thường sử dụng các muối vô cơ không tan của
calcium như CaCO3, CaSO4, hay một vài muối hữu cơ không tan của canxi như
Ca-EDTA, calcium citrate,… Các muối trên được trộn đều trong hỗn hợp dung
dịch alginate trong nước và huyền phù nấm men. Sau đó hỗn hợp này có thể
được cho vào khn để hạt gel có được hình dạng mong muốn. Sử dụng một số
tác nhân acid hóa như D-glucono-o-lactone (GDL) nhằm làm giảm pH của dung
dịch. Khi pH giảm, ion Ca2+ dược giải phóng dần và tham gia vào q trình tạo
gel với alginate.

-

Ưu diểm: hạt gel có tinh đồng nhất cao, độ bền của hạt gel tốt hơn khi tạo gel
bằng phương pháp khuếch tán.

-

Nhược diểm: Khó thực hiện, chi phí cao, tốn nhiều thời gian 16.

8

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.6 Phương pháp tạo gel nội (internal gelation)
(nguồn: />1.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước
Johansen và Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phần tử
alginate đến độ bền gel và khả năng lên men của nấm men cố định. Kết quả thực nghiệm
cho thấy độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén ép) tăng đáng
kể khi tăng độ nhớt dung dịch alginate ban đầu từ 5- 70 Centipoise (cP), nhưng khi độ
nhớt tăng cao hơn nữa (250 - 600CP) thì độ bền gel tăng rất ít 17.
Yamagiwa và cộng sự. (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng đo alginate
đến độ bền gel và khả năng lên men của nấm men cố định. Họ cho rằng độ bền của gel
tăng khi tăng nồng dộ dung dịch alginate sử dụng để tạo gel và nồng độ alginate thích
hợp để cố định nấm men khoảng 2% 17.
Theo Yamagiwa và cộng sự (1995), pH thích hợp của dung dịch alginate cho q
trình tạo gel khoảng 6- 8. Các phân tử alginate sẽ bị thay đổi hình dạng khi pH của dung
dịch nằm ngồi khoảng trên. Điều này làm cho độ bền gel giảm. Mặt khác, nhiệt độ
thích hợp cho q trình tạo gel không được vượt quá 25 oC 17.
Patkova và cộng sự (2000) đã nghiên cứu khả năng sống sót của nấm men cố
định trong gel Ca-alginate dưới tác động của các nồng độ ethanol tao thành khác nhau
khi lên men dịch nha 12 – 30%. Kết quả cho thấy rằng khả năng sống sót của nấm men
cố dịnh trong suốt quá trình lên men dịch nha nống độ 12 - 24% không thấp hơn 95%
khi nổng độ ethanol trong bia non trên 10%(v/v). Họ cho rằng hạt gel đã có tác dụng
bảo vệ tế bào 18.

9


Chương 1. Tổng quan tài liệu
Năm 2009, G-A-Junter và đồng đội đã nghiên cứu được đặc tính giãn nở của Caalginate chứa các tế bào nấm men. Kết quả cho thấy một hạt alginate 2,0% (w/v) có thể

chứa từ 0,1 - 5.0%, (w / v) số lượng tế bào nấm men 19.
Năm 2014, J. Augusto R. Coleues đã đăng tải về tác dụng của các tế bào bất động
trong hạt Ca-alginate trong quá trình lên men rượu. Kết quả cho thấy các hạt Ca-alginate,
Ca-chitosan có chứa các tế bào S. cerevisiae khi nghiên cứu lên men glucose và sucrose
có thể sản xuất ethanol. Quá trình lên men mẻ được thực hiện trong máy lắc theo quỹ
đạo và được đánh giá bằng cách theo dõi nồng độ cơ chất sản phẩm bằng HPLC. Sự cố
định tế bào trong các hạt Ca-alginate và hạt Ca-alginate phủ thêm chitosan cho phép tái
sử dụng các hạt trong tám chu kỳ lên men liên tiếp, mỗi lần cách nhau 10 tiếng 20.
1.3.2 Các nghiên cứu trong nước
Năm 2009, Trần Văn Phong đã sử dụng tế bào nấm men S. cereviciae được cố
định trong gel alginate để lên men, từ đó tiến hành khảo sát 1 số thơng số có thể ảnh
hưởng đến q trình lên men và chất lượng sản phẩm, kết quả cho thấy thời gian lên
men càng dài thì nồng độ ethanol càng cao nhưng nếu không bảo quản kĩ lưỡng sản
phẩm sẽ bị nhiễm vi sinh vật gây hư hỏng.
Năm 2012, Nguyễn Thị Hương và cộng sự đã sử dụng Na-alginate để cố định tế
bào nấm men ứng dụng trong lên men cồn từ rỉ đường. Kết quả cho thấy điều kiện cố
định tế bào là nồng độ chất mang Na-alginate là 3%, nồng độ dung dịch tạo gel CaCl2
là 2%, tỉ lệ giống thích hợp trong dịch chất mang là 109 tế bào/ml gel cho khả năng giam
giữ tế bào trong hạt gel cao, tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định cho hệ thống tạo
hạt 24 kim (đường kính hạt 0,5 cm) là 200 ml/phút 15.
Năm 2007, Mai Ngọc Dũng đã thủy phân saccharose bằng invertase cố định trên
hạt calcium alginate. Kết quả thu nhận như sau: nồng độ tối ưu cố định là alginate 3,5%
với hoạt độ riêng = 3,62 UI/mg-Pr, hiệu suất hoạt độ riêng cố định = 39,14%, hiệu suất
protein–enzym cố định = 64,27%, tái sử dụng là 20 lần, khả năng chịu nhiệt khi thủy
phân saccharose 7% là 72 giờ liên tục 13.
Năm 2017, Ngô Thị Phương Dung và cộng sự đã lên men ethanol từ rỉ đường sử
dụng nấm men chịu nhiệt, kết quả cho thấy sáu chủng nấm men chịu nhiệt được tuyển
10

Chương 1. Tổng quan tài liệu
chọn do lên men tốt ở 37°C với hàm lượng ethanol đạt được 5,54- 6,40% (v/v), trong
đó chủng Y81 có hàm lượng ethanol cao nhất ở 37o C và 40o C lần lượt đạt 6,40% và
3,17% (v/v). Sáu chủng nấm men được xác định thuộc các loài S. serevisiae, C. glabrata
và T. globosa. Điều kiện lên men ethanol từ rỉ đường của chủng S. serevisiae Y81 ở
37°C được xác định là: Hàm lượng đường ban đầu 186 g/l (26,21°Brix), mật số giống
chủng 107 tế bào/ml, lên men 6 ngày, hàm lượng ethanol đạt 7,36% (v/v). Thử nghiệm
lên men với 1 l dịch rỉ đường trong các điều kiện thích hợp cho thấy tiềm năng ứng dụng
chủng nấm men chịu nhiệt trong lên men ethanol ở nhiệt độ cao từ nguồn nguyên liệu
phụ phẩm như rỉ đường.
Năm 2002, Phạm Trọng Khoa đã Nghiên cứu quá trình lên men cồn bằng nấm
men cố định trong gel alginate, kết quả cho thấy so với nấm men tự do, nấm men cố
định cho thời gian lên men dài hơn, nồng độ cơ chất cịn sót thấp hơn, Nồng độ cồn có
thể đạt 8.4-11.7%v/v cao gấp đơi so với dùng nấm men tự do 16.

11


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nơi thực hiện
Đề tài được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Sinh hóa – Sinh dược – Ký sinh trùng,
thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nội dung nghiên cứu
-

Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na – alginate và CaCl2 lên hiệu quả lên men
của nấm men S. cerevisiae cố định.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nấm men S. cerevisiae cố định lên hiệu quả
lên men.

-

Khảo sát số lần tái sử dụng nấm men S. cerevisiae cố định lên hiệu quả lên men.

2.2.2 Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm men S. cerevisiae được phân lập từ chế phẩm Angel Active Dry Yeast
(No.AN19VNKV04) được phân phối bởi công ty Algel Yeast Co., LTD.
2.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị
2.3.1 Dụng cụ
-

Ống nghiệm

-

Falcon

-

Khn lego

-

Đĩa petri

-

Đũa thủy tinh

-

Giá Effendorf

-

Ống đong

-

Giá ống nghiệm

-

Chai nuôi cấy mơ

-

Pipetman

-

Becher

- Effendorf

-

Chai trung tính nắp xanh

-

Đầu tip nhựa

2.3.2 Hóa chất
- Sodium alginate (Trung Quốc)

- C6H12O6 (Trung Quốc)

- Ca(OH)2 (Trung Quốc)

- Dịch chiết khoai tây

- CaCl2 (Trung Quốc)

12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.3 Thiết bị
-

Tủ mát

-

Tủ cấy

-

Cân phân tích

-

Tủ sấy

-

Nồi hấp vơ trùng

-

Bể ủ nhiệt

-

Máy do OD (UV – VIS)

-

Máy đo pH

2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Nhân sinh khối nấm men
Cân 0,5g nấm men khơ hịa tan vào 1 mL nước muối sinh lý. Dùng que cấy phân

lập trên đĩa petri đã trải sẵn môi trường PGA (dịch chiết khoai tây 4 g/l, dextrose 20g/l,
agar 15 g/l) vô trùng, ủ ở nhiệt độ 37oC/ 2 ngày. Chọn 1 khuẩn lạc riêng lẻ xem dưới
kính hiển vi để xác định hình thái nấm men, sau đó dùng que cấy vịng cấy khuẩn lạc
này vào bình erlen có chứa sẵn 200 mL mơi trường PGA lỏng đã hấp vơ trùng, đem ni
cấy lắc 150 vịng/ phút ở 37oC/ trong 2 - 3 ngày. Sau đó, ly tâm 1500 vòng/ phút trong
5 phút để thu sinh khối nấm men, nấm men thu được được hòa tan trong nước cất và
đem đo nồng độ ở bước sóng 600nm. Hòa tan nấm men vào 10 mL nước thành các nồng
độ như trong thí nghiệm. Các dung dịch này được dùng cho các thí nghiệm.

Hình 2.1 hình ảnh các tế bào nấm men được soi dưới kính hiển vi

13