Ứng dụng chỉ thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền một số giống vú sữa (chrysophyllum cainito) ở việt nam

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SCOT ĐÁNH GIÁ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG
VÚ SỮA (Chrysophyllum cainito) Ở VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện :

Nguyễn Thị Tuyền

MSSV

:

1600001822

GVHD

:

ThS. Nguyễn Thị Nhã

TP. HCM, 2020

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SCOT ĐÁNH GIÁ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG
VÚ SỮA (Chrysophyllum cainito) Ở VIỆT NAM

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Tuyền

Mã số sinh viên

: 1600001822

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Nhã

TP. HCM, 2019


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Nguyễn Thị Tuyền

MSSV: 1600001822

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Lớp: 16DSH1A

1. Đầu đề luận văn:
Ứng dụng chỉ thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền một số giống vú sữa
(Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam
2. Mục tiêu
-

Đánh giá đa dạng di truyền 14 mẫu giống vú sữa dựa trên kỹ thuật PCR – SCoT.

-

Xây dựng cây phát sinh cho 14 mẫu giống vú sữa.
3. Nội dung:

-

Thu thập 20 mẫu giống, sau đó chọn 14 mẫu giống làm vật liệu nghiên cứu

-

Tách chiết thành công 14 mẫu giống vú sữa bằng bộ Kit BIOLINE

-

Đánh giá tính đa hình của 46 mồi SCoT, trong đó sàng lọc được 9 mồi đa hình.

-

Thực hiện 161 phản ứng PCR-SCoT cho 14 mẫu giống và 9 mồi có tính đa hình,
ghi nhận số băng khuếch đại, băng đa hình.

-

Phân nhóm di truyền 14 mẫu giống bằng NTSYSpc thành hai nhóm
4. Thời gian thực hiện: tháng 11/2019 đến tháng 7/2020
5. Người hướng dẫn chính: ThS. Nguyễn Thị Nhã

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ mơn.
TP. HCM, ngày 07 tháng 07 năm 2020
BỘ MƠN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình vì đã ln bên tơi, ủng hộ và luôn
cho tôi niềm tin, động viên, hỗ trợ tôi mọi mặt từ vật chất đến tinh thần để tôi có thể
hồn thành khóa luận.
Tơi xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Nhã là người đã hướng dẫn tận tình, động viên
tôi và truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm trong q trình suốt q trình
thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến các thầy cô, anh, chị trong Khoa Công nghệ Sinh
học đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Nguyễn Thị Tuyền
Khoa Công nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN..................................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................................... ii
TÓM TẮT..........................................................................................................................iv
SUMMARY ........................................................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ........................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU.............................................................................................. vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................... viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................ix

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 1
1.1 Giới thiệu về họ vú sữa ...................................................................................................1
1.2 Giới thiệu về cây vú sữa .................................................................................................1
1.2.1 Tên khoa học và vị trí phân loại của vú sữa .................................................................1
1.2.2 Đặc đểm hình thái........................................................................................................2
1.2.3 Đặc điểm sinh thái .......................................................................................................2
1.2.4 Các giá trị của vú sữa ..................................................................................................3
1.3 Các giống vú sữa ở Việt Nam ......................................................................................... 3
1.3.1 Vú sữa tím Bắc Thảo ...................................................................................................4
1.3.2 Vú sữa trắng ................................................................................................................ 4
1.3.3 Vú sữa tím Mica .......................................................................................................... 5
1.3.4 Vú sữa Bơ Hồng .......................................................................................................... 6
1.3.5 Vú sữa Lò Rèn ............................................................................................................ 6
1.4 Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu ................................................................................. 8
1.4.1 Giới thiệu chỉ thị DNA ................................................................................................ 8
ii


1.4.2 Các loại chỉ thị DNA ...................................................................................................8
1.5 Tình hình nghiên cứu về chỉ thị phân tử SCoT và ứng dụng chỉ thị phân tử trên vú sữa 10
1.5.1 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SCoT ..................................................................... 10
1.5.2 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trên vú sữa ................................................. 11
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 13
2.1 Nơi thực hiện................................................................................................................ 13
2.2 Nội dung nghiên cứu .................................................................................................... 13
2.3 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................................. 13
2.3.1 Phương pháp thu mẫu lá vú sữa ................................................................................. 13
2.3.2 Tách chiết DNA ........................................................................................................ 13
2.3.3 Sàng lọc, thử nghiệm đánh giá một số mồi SCoT đa hình .......................................... 15
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 19

3.1 Thu thập mẫu lá nghiên cứu ......................................................................................... 19
3.2 Tách chiết DNA tổng số ............................................................................................... 20
3.3 Sàng lọc mồi đa hình và PCR khuếch đại các band DNA đa hình cho 14 mẫu vú sữa ... 21
3.4 Phân tích đa dạng di truyền 14 mẫu vú sữa ................................................................... 22
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 26
PHỤ LỤC ......................................................................................................................... 28

iii


TÓM TẮT
Đề tài: “Ứng dụng chỉ thị SCoT đánh giá đa dạng di truyền một số giống vú
sữa (Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam” được thực hiện từ tháng 10/2019 đến tháng
4/2020 tại phòng Sinh học Phân tử Thực vật, Khoa Công nghệ Sinh học thuộc trường
Đại học Nguyễn Tất Thành với mục tiêu phân nhóm di truyền các mẫu vú sữa dựa trên
kĩ thuật PCR-SCoT. Đề tài có nội dung: Thu thập xử lý các mẫu; Tách chiếc DNA tổng
số các mẫu nghiên cứu; Lựa chọn, đánh giá một số mồi SCoT đa hình; Thực hiện phương
pháp PCR khuếch đại các đoạn DNA với các mồi đa hình và ghi nhận sự hiện diện của
các băng sản phẩm; Phân tích dữ liệu bằng phần mềm NTSYSpc. Những kết quả đạt
được sau 6 tháng nghiên cứu:
1. Thu thập 20 mẫu vú sữa, sau đó chọn 14 mẫu làm vật liệu nghiên cứu.
2. Tách chiết thành công 14 mẫu vú sữa bằng bộ Kit BIOLINE.
3. Đánh giá tính đa hình của 16 mồi SCoT, trong đó sàng lọc được 9 mồi đa hình.
4. Thực hiện 161 phản ứng PCR-SCoT cho 14 mẫu vú sữa và 9 mồi có tính đa
hình, ghi nhận số băng khuếch đại, băng đa hình.
5. Phân nhóm di truyền 14 mẫu vú sữa bằng NTSYSpc thành 2 nhóm.

iv

SUMMARY
The research " Genetic diversity of star apple (Chrysophyllum cainito) in Vietnam
with Start Codon Target " was carried out in Molecular lab of Biotechnology
Department in Nguyen Tat Thanh University with the aim to classifying studied
cultivars of star apple based on PCR-SCoT. The content involves: Collecting leaves
samples of star apples; extracting total DNA of samples; Screening and amplifying the
polymorphic SCoT primers; conducting PCR reaction between DNA samples of star
apples and SCoT markers; analysing data with NTSys program.
Results:
1. Collecting 20 leaves samples, choosing 14 of 20 as materials using in this study.
2. Extracting DNA of 14 start apple cultivars.
3. Screening the polymorphism of 16 SCoT primers, 9 SCoT primers with high
polymorphism were scored.
4. Carried out 161 PCR-SCoT reactions of 14 DNA samples and 9 polymorphic SCoT
markers.
5. Clustering 14 cultivars of star apples into 2 main groups base on UPGMA method.

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1

Vú sữa tím Bắc Thảo ............................................................................ 4

Hình 1.2

Vú sữa trắng ......................................................................................... 5

Hình 1.3

Vú sữa Mica ......................................................................................... 5

Hình 1.4

Vú sữa Bơ Hồng .................................................................................. 6

Hình 1.5

Vú sữa Lị Rèn ...................................................................................... 7

Hình 2.1

Số liệu sau khi nhập vào Exel ............................................................. 18

Hình 2.2

Ma trận tương đồng ............................................................................ 19

Hình 2.3

Kết quả thống kê độ tương đồng của các mẫu ..................................... 19

Hình 3.1

Kết quả DNA tổng số 14 mẫu vú sữa trong nghiên cứu....................... 22

Hình 3.2

Sản phẩm PCR của các mồi SCoT04, SCoT02, SCoT06, SCoT08 trên 14
mẫu vú sữa ......................................................................................... 23

Hình 3.3

Ma trận tương đồng của 14 mẫu vú sữa với 9 mồi SCoT đa hình dựa trên
hệ số SM............................................................................................. 25

Hình 3.4

Sơ đồ quan hệ di truyền của 14 mẫu vú sữa với 9 mồi SCoT đa hình .. 26

vi


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1

Các giống vú sữa phổ biến ở Việt Nam ................................................... 7

Bảng 2.1

Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu ....................................... 16

Bảng 2.2

Thành phần phản ứng PCR ................................................................... 16

Bảng 2.3

Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ..................................................... 17

Bảng 3.1

Danh sách các mẫu vú sữa dùng trong nghiên cứu ................................ 21

Bảng 3.2

Kết quả nồng độ OD của các mẫu DNA sử dụng trong nghiên cứu ....... 22

Bảng 3.3

Danh sách các mồi đa hình được ghi nhận ............................................ 24

vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid

SCoT

Start Codon Target

UPGMA

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean

Rnase

Ribonuclease

PLS

Plant Lysis buffer

PBB

Plant Binding buffer

PWB

Plant Wash buffer

EB

Elution Buffer

OD

Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

UV

Ultraviolet

TBE

Tris ̶ Borate − EDTA

viii


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Vú sữa (Chrysophyllum cainito) có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ và
đảo Antilles, được trồng chủ yếu ở các nước Ấn Độ, Campuchia, Thái Lan, Việt Nam...,
nhưng hầu hết chỉ được tiêu thụ ở khu vực nội địa. Việt Nam là nước duy nhất trên thế
giới chọn trái vú sữa làm hàng hóa xuất khẩu do giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế mà
nó mang lại. Ở Việt Nam có một số giống điển hình như: vú sữa Lò Rèn, vú sữa Vĩnh
Kim, vú sữa bách thảo nâu, vú sữa trắng...Bên cạnh việc lựa chọn và bảo tồn những cá
thể mang tính trạng tốt thì việc phân loại để có hướng khai thác và phát triển nguồn tài
nguyên này là rất cần thiết.
Tuy nhiên, hiện tại chưa có hệ thống phân loại các giống vú sữa hồn chỉnh nhằm
phục vụ cho việc khai thác các gen quý, xác định và truy nguyên nguồn gốc các giống
vú sữa đang được bày bán trên thị trường. Ngoài ra, việc nhận diện các giống vú sữa
dựa vào đặc điểm hình thái, chất lượng, màu sắc, hình dạng quả cịn nhiều khó khăn do
chúng có sự tương đồng cao và phụ thuộc chủ yếu vào kinh nghiệm, lịch sử lai tạo, cắt
ghép, khu vực điạ lí... Đồng thời các nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử trên cây vú
sữa đã được thực hiện nhưng vẫn chưa phổ biến.

Kỹ thuật chỉ thị phân tử đặc biệt là chỉ thị DNA càng lúc càng được ứng dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu về di truyền. Trong số các chỉ thị DNA, chỉ thị phân tử ScoT
(Start Codon Target) là một kỹ thuật có lợi thế nổi bật trong việc ứng dụng trực tiếp vào
chọn giống. Chỉ thị SCoT là một kỹ thuật đơn giản dựa trên phương pháp PCR nhân
vùng trình tự chứa bộ ba mở đầu ATG. Chỉ thị SCoT được biết đến như khả năng cho
đa hình cao, có thể thực hiện phản ứng PCR ngay cả khi không biết rõ thơng tin trình tự
đoạn gen mục tiêu, có thể sử dụng trong việc đánh dấu gen phục vụ nghiên cứu chuyên
sâu về các gen chức năng và có liên quan trực tiếp đến gen mã hóa tính trạng.
Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Ứng dụng chỉ thị SCoT đánh giá đa dạng
di truyền một số giống vú sữa (Chrysophyllum cainito) ở Việt Nam” được thực hiện.

ix


2. Mục tiêu của đề tài
Đánh giá đa dạng di truyền 14 mẫu vú sữa dựa trên kỹ thuật PCR – SCoT.
Xây dựng cây phát sinh cho 14 mẫu vú sữa.

x


Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về họ vú sữa
Họ vú sữa (danh pháp khoa học Sapotaceae) là một họ thực vật hạt kín thuộc về
bộ Ericales. Hệ thống phân loại Cronquist và Dhalgren đã xếp họ này trong bộ Ericales.
Nhiều loài trong họ này có quả ăn được và có giá trị kinh tế cao, ví dụ như hồng
xiêm (Manilkara zapota), vú sữa (Chrysophyllum cainito), lê ki ma (Pouteria lucuma),
cây thần kỳ (Synsepalum dulcificum).

Họ Sapotaceae là các loài thân gỗ và cây bụi có nhựa mủ 1, ưa ẩm vừa phải, lá đơn
thường xanh, mọc so le, bóng như da, có cuống lá. Phiến lá nguyên, hoa lưỡng tính, mọc
đơn độc hay thành cụm hoa, cụm hoa mọc ở nách lá (đôi khi trên các cành già). Bao hoa
với đài hoa và tràng hoa riêng biệt. Quả dày cùi thịt, dạng quả mọng. Hạt có nội nhũ
hoặc khơng, nội nhũ chứa dầu. Phôi phân biệt rõ và không chứa diệp lục.
Họ này có sự phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới. Họ này có lẽ có bắt nguồn khoảng
100 triệu năm trước ở khu vực Đơng Nam Á

2,3

. Có khoảng 1.100 lồi được phân bố

trong hơn 50 chi. Tại Việt Nam hiện nay ghi nhận có khoảng 16 chi với 40 lồi khác
nhau. Trong đó đáng chú ý hơn cả là vú sữa (Chrysophyllum cainito).
1.2 Giới thiệu về cây vú sữa
Ở Việt Nam, cây vú sữa được trồng nhiều ở miền Nam, nhất là ở tỉnh Tiền Giang.
Loại cây này hiện có nhiều giống như vú sữa trắng, vú sữa Bơ Hồng, vú sữa Nâu, vú
sữa Bắc Thảo, vú sữa Hoàng Kim, trong đó vú sữa Lị Rèn được trồng tại xã Vĩnh Kim,
tỉnh Tiền Giang là nổi tiếng nhất và được trồng nhiều nhất bởi trái có vỏ mỏng, sáng
bóng, nhiều thịt, vị ngọt và thơm.
1.2.1 Tên khoa học và vị trí phân loại của vú sữa
Giới (Kingdom):

Pantae

Ngành (Phylum):

Spermatophyta

Phân ngành (Subphylum):

Angiospermae

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Lớp (Class):

Dicotyledonae

Bộ (Order):

Ebenales

Họ (Family):

Sapotaceae

Chi (Genus):

Chrysophyllum

Loài (Species):

Chrysophyllum cainito

Chi Chysophyllum thuộc họ Sapotaceae, chứa khoảng 70 loài có nguồn gốc từ
Châu Phi và Châu Á. Cây vú sữa hoang dã được tìm thấy với mật độ thấp trong các khu

rừng nhiệt đới đặc biệt ở miền trung Panama, Antilles, Mexco 4.
1.2.2 Đặc đểm hình thái
Cây vú sữa thường cao từ 10 đến 20 m, thân hình trụ thẳng, vỏ màu nâu sần sùi và
nứt nẻ không đều. Cành non có màu đỏ nâu và có nhiều lơng tơ 5.
Lá: lá mọc so le, hình ơ van đơn, mép liền, dài 5 – 15 cm, mặt trên xanh và bóng,
mặt dưới màu vàng và phủ một lớp lơng tơ 5.
Hoa: các hoa nhỏ có màu trắng ánh tía và có mùi thơm ngát. Đây là loại cây lưỡng
tính (tự thụ phấn). Hoa mọc từ nách lá thành cụm gồm 2 – 12 hoa nhỏ 6.
Quả: quả vú sữa trịn và bóng, đường kính khoảng 5 – 10 cm, có lớp vỏ màu đỏ
tía, tím đen hoặc xanh nhạt tuy vào giống. Vỏ có nhiều mủ nhựa khơng ăn được. Loại
quả vỏ màu tía có lớp vỏ dày hơn và cùi thịt đặc hơn còn loại quả vỏ màu nâu lục có vỏ
mỏng và nhiều cùi thịt nhão 7.
Hạt: một quả vú sữa có từ 3 đến 11 hạt có hình bầu dục, hạt dẹp, cứng, dầu nhọn,
dài khoảng 2 cm, rộng khoảng 1,25 cm và dày khoảng 6 mm. Hạt được bao bọc trong
một lớp màng đặc sệt. Khi bổ đôi trái vú sữa, các hạt tỏa đều từ lõi trái tạo nên một hình
ngơi sao nhiều cánh 5.
1.2.3 Đặc điểm sinh thái
Cây vú sữa trồng được ở hầu hết các vùng đất ở Việt Nam, tuy nhiên cây vú sữa
được trồng nhiều ở miền Nam do phù hợp với khí hậu ở đây, nhất là ở các tỉnh Tiền
Giang, Đồng Tháp, Bến Tre, Cần Thơ, Cà Mau. Cây vú sữa phù hợp với điều kiện nhiệt
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

đới nhiệt độ 22 – 34℃, cây chỉ ra hoa tốt trong điều kiện có hai mùa mưa nắng phân biệt
và khơng chịu được gió to do cây có tán lá dày và rễ nơng, cây phát triển tốt nhất trên
đất phù sa ven sông, đất thịt nhẹ, thốt nước tốt, ít chua, pH 5,5 – 6,5, cao độ không quá
400 m. Cây vú sữa được trồng bằng cách chiết nhánh hoặc ghép cành. Khi được chăm
bón cẩn thận thì khoảng sau 3 năm sau có thể thu hoạch được. Cây vú sữa khi đậu trái

đến khi thu hoạch mất khoảng thời gian từ 180 – 200 ngày 5.
1.2.4 Các giá trị của vú sữa
Giá trị dinh dưỡng: khi chín, trái vú sữa có vị ngọt, thơm ngon đặc biệt. Khi ăn
nên nắn bóp nhẹ trái, cắt làm đơi và dùng thìa để xúc phần thịt quả, khơng nên xúc q
gần vỏ vì có nhiều mủ. Vỏ và hạt vú sữa không ăn được. Vú sữa có khá nhiều dinh
dưỡng, trong 100 g thịt quả cung cấp khoảng 67 kcal, canxi 14,65 mg, phốt pho 73,23
mg, kali 67,2 mg, magiê 3,3 mg, sắt 2,33 mg, protein 2,33 g, chất xơ 3,3 mg 5. Nhiều bộ
phận của cây có thể được dùng làm thuốc như lá, vỏ và hạt 8. Ở một số nơi lá vú sữa
được dùng như chè và được dùng để trị tiểu đường và viêm khớp. Vỏ cây vú sữa có
chứa chất bổ và nước sắc vỏ cây được dùng để trị ho.
Giá trị kinh tế: hiện nay Việt Nam là quốc gia duy nhất trên thế giới chọn trái vú
sữa làm hàng hóa xuất khẩu. Các nước khác như Campuchia, Philippines, Ấn Độ, Thái
Lan, đều có trồng cây vú sữa nhưng họ khơng chọn làm hàng hóa để xuất khẩu mà chỉ
tiêu thụ nội địa. Ở Mỹ giá của vú sữa có thể lên tới 15 USD/kg. Để xuất khẩu ra nước
ngoài, vú sữa Việt Nam phải đạt tiêu chuẩn GlobalGAP (tức là tiêu chuẩn Thực hành
nơng nghiệp tốt tồn cầu). Điều này đã được Hợp tác xã vú sữa Lò Rèn Vĩnh Kim (Tiền
Giang) thực hiện thành công. Lô vú sữa đầu tiên ở Tiền Giang chính thức được nhập
vào thị trường Mỹ với số lượng trên 170 tấn.
Ngoài ra cây vú sữa còn được trồng làm cảnh, gỗ còn làm giá thể cho các loại hoa
lan.
1.3 Các giống vú sữa ở Việt Nam
Cây vú sữa được người Việt Nam trồng và sử dụng từ hàng trăm năm trước, tuy
nhiên nguồn gốc của cây vú sữa đầu tiên ở Việt Nam thì vẫn chưa rõ. Vú sữa ở Việt
Nam có khá nhiều giống, tuy nhiên người ta chỉ phân biệt các giống với nhau qua màu
3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

sắc của trái vú sữa như trắng, tím, vàng hay nâu. Chỉ có một số giống vú sữa đã được

đặt tên vì sự thơm ngon đặc trưng của nó như vú sữa tím Bắc Thảo, vú sữa Bơ Hồng,
vú sữa Lị Rèn.
1.3.1 Vú sữa tím Bắc Thảo
Cây vú sữa tím Bắc Thảo hiện nay được chọn trồng bởi trái vú sữa Bắc Thảo bán
được giá và đang thu hút ở thị trường. Đặc điểm nổi bật của trái vú sữa tím Bắc Thảo là
trái to, chín sớm có màu sắc bắt mắt, có tuổi thọ cao. Vì có vỏ cứng lợi thế cho việc vận
chuyển xa sẽ khơng bị dập, ít mủ, ít hột, thịt dai giịn và ngọt. Hiện nay giống vú sữa
tím Bắc Thảo đang được trồng ở nhiều nơi.

Hình 1.1 Vú sữa tím Bắc Thảo
1.3.2 Vú sữa trắng
Vú sữa trắng là một giống vú sữa được trồng ở khắp tất cả các vùng ở Việt Nam,
đây là giống vú sữa không đặc trưng cho vùng miền nào ở Việt Nam. Vú sữa trắng có
trái nhỏ, khi chín quả có màu xanh lục và quả có nhìu mủ. Vì thế vú sữa trắng khơng
được ưu chuộng trên thị trường nên khơng có giá trị cao như các loại vú sữa khác. Vú
sữa trắng chỉ được trồng số lượng ít để làm kiểng.

4


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.2 Vú sữa trắng
1.3.3 Vú sữa tím Mica
Vú sữa MiCa là một giống vú sữa mới, có đặc điểm khác với những giống vú sữa
trên thị trường hiện nay, thân cây lùn và nhỏ nhưng cho trái rất say. Khi cịn nhỏ trái có
màu xanh, khi chín vỏ trái sẽ có màu tím than. Trái to trọng lượng trái lên đến 700g –
800g một trái. Vỏ mỏng ăn giòn, khi ăn rất thơm vị ngọt thanh, ít hạt, khơng giống với
loại vú sữa thơng thường, đặc biệt là ăn được luôn cả vỏ. Loại vú sữa này đặc biệt ít bị
sâu bệnh. Hiện nay loại vú sữa này đang được trồng ở tại Bến Tre.

Hình 1.3 Vú Sữa MiCa
5


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.3.4 Vú sữa Bơ Hồng
Vú sữa Bơ hồng cũng là một loại giống cây mới có năng suất rất cao,trái to và thân
cây rất khỏe khoắn. Giống vú sữa Bơ Hồng có lá hơi bầu, bóng, trái trịn, khi chín vỏ
trái chuyển sang màu ửng hồng bóng láng, tỉ lệ thịt rất cao, thịt có màu sữa trắng, khơng
nhão, có vị ngọt thanh và có mùi bơ sữa, nên được gọi là vú sữa Bơ Hồng. Giống vú sữa
này có ưu điểm là ít bị sâu bệnh. Theo đánh giá các nhà vườn, thì vú sữa Bơ Hồng là
giống có triển vọng phát triển và xuất khẩu cao cùng với giống vú sữa MiCa. Tuy nhiên,
hạn chế của nó là số lượng cây cho trái còn khiêm tốn nên hiện nay vẫn tiêu thụ chủ yếu
trong nước, chưa đủ số lượng để xuất khẩu.

Hình 1.4 Vú sữa Bơ Hồng
1.3.5 Vú sữa Lò Rèn
Khi nhắc đến vú sữa thì khơng ai là khơng biết đến vú sữa Lị Rèn. Sở dĩ có tên
gọi này là do người Vĩnh Kim, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang muốn ghi nhớ công
ơn của ông thợ rèn đã nhân giống loại vú sữa ngon cho vùng đất này. Vú sữa lò rèn Vĩnh
Kim trở thành thương hiệu độc quyền của tỉnh Tiền Giang nói riêng và của Đồng Bằng
Sơng Cửu Long nói chung. Giống vú sữa này tuy trái khơng to nhưng có vỏ mỏng, hạt
nhỏ, ruột dày. Trên thị trường thế giới quả vú sữa Lò Rèn của nước ta đang được xuất
khẩu rất mạnh.
6


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Hình 1.5 Vú sữa Lị Rèn
Bảng 1.1 Các giống vú sữa phổ biến ở Việt Nam
STT

1

Tên loại

Đặc điểm quả

Vỏ mỏng, hạt nhỏ ruột dày, khi
chín thoang thoảng hương
Vú sữa Lị Rèn
thơm, xẻ ra có ruột màu trắng
sữa, ngọt thanh và mát dịu

Phân bố
Tiền Giang, Bến Tre,
Đồng Tháp, Vĩnh Long

2

Vú sữa Bơ
Hồng

Trái khá to, tròn khá đồng đều,
lúc chín màu vỏ ửng hồng,
bóng rất đẹp

Tiền Giang, Bến Tre,
Đồng Tháp, Vĩnh
Long...

3

Vú sữa Bắc
Thảo

Trái to, thịt ngọt, dai, giịn, ít
mủ, ít hột

Tiền Giang, Bến Tre,
Đồng Tháp, Vĩnh Long

4

Vú sữa trắng

Trái nhỏ, khi chín có màu xanh
lục và quả có nhiều mủ

Tiền Giang, Bế3 giống bản địa Jamrukhiyo, Chappaniyo và Sopari gần như khác 12 giống bản
địa còn lại về kích thước quả, lượng đường, acid ascorbic và carotenoid trong quả.
Tương tự, các giống xoài phổ biến Jamadar và Kesar cũng khác với các giống Alphonso,
Dasheri và Neelum trong phân tích PCoA. Kết quả này khẳng định tính ứng dụng hữu
10


Chương 1. Tổng quan tài liệu

ích của hệ thống chỉ thị SCoT trong việc xác định giống và phân tích đa dạng di truyền
dựa trên các đặc điểm sinh học của chúng 20.
Năm 2017 tại Ấn Độ, Atika Agarwal và ctv đã nhận thấy sự đa dạng các giống hoa
hồng về màu sắc, hình dạng và kích thước do các giống trải qua nhiều quá trình lai tạo
khác nhau, cũng như sự phân bố địa lý và đa bội cũng gây khó khăn hơn trong cơng tác
nghiên cứu chọn giống hoa hồng. Do đó, họ thực hiện nghiên cứu trên 29 giống hoa với
các chỉ thị SCoT nhằm đưa ra các bản mô tả và xác định các biến dị di truyền của 29
giống này. Trong 36 chỉ thị SCoT được sử dụng trong nghiên cứu, có 32 chỉ thị có tính
đa hình cao với khoảng khuếch đại dao động từ 150 bp đến 1.2kb. Trong nghiên cứu
này, Atika Agarwal và cộng sự đã thu được tổng cộng 299 băng, với số băng dao động
từ 4 đến 19 băng và số băng trung bình là 9,34 băng. Hàm lượng thơng tin đa hình (PIC)
dao động từ 0,42 đến 0,92 với giá trị trung bình 0,78. Các nhánh cây phả hệ được xây
dựng để thiết lập mối quan hệ di truyền giữa 29 giống khác nhau bằng cách sử dụng kết
hợp hệ số Neighbor-join và Nei-Li. Từ đó kết luận rằng chỉ thị SCoT hiệu quả cao trong
việc phân tích đa hình nhằm giúp đỡ phục vụ cho cơng tác cải thiện các giống hoa hồng,
mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn 21.
Năm 2019, Lê Thị Thanh Nga (khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học
Nguyễn Tất Thành) thực hiện đề tài: ứng dụng chỉ thị phân tử SCoT (Start Codon
Targeted) đánh giá đa dạng di truyền các giống xoài (Mangifera) trồng tại Duyên Hải
Nam Trung Bộ và Nam. Kết quả đã tách chiếc DNA được 30 giống xoài, chọn lọc và
khuếch đại được 22 mồi SCoT đa hình. Đánh giá được di truyền trên 30 giống xoài. Xây
dựng được cây phát sinh lồi và phân chia thành 2 nhóm: nhóm 1 các giống xồi có tiềm
năng xuất khẩu, nhóm 2 các giống xoài địa phương.
1.5.2 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trên vú sữa
Trên cây vú sữa, Petersen và cộng sự đã dùng phương pháp microsatellite (SSR)
để tìm hiểu nguồn gốc của giống cây vú sữa thuần hóa ở châu Mỹ là từ vùng Isthmus
của Panama, góp phần vào bộ dữ liệu ít ỏi của các nghiên cứu về nguồn gốc cây trồng.
Sau đó họ lại tiếp tục dùng 10 mồi đa hình microsatellite (SSR) được thiết kế từ thư viện
DNA bộ gen của loài vú sữa Chrysophyllum cainito để so sánh các cây vú sữa trồng ở

11


Chương 1. Tổng quan tài liệu

hai vùng khác nhau Jamaica và Panama. Kết quả cũng cho thấy có các băng đa hình thể
hiện sự khác nhau trên các cây thu được giữa hai vùng địa lý này 22.
Năm 2012, Jennifer J. Petersen và cộng sự đã sử dụng vùng trình tự ITS để nghiên
cứu về nguồn gốc và đa dạng phát sinh loài giữa các loài trong chi vú sữa
(Chrysophyllum) ở Nam Mỹ. Kết quả cho thấy cây vú sữa (C. cainito) nằm cùng một
nhánh trong cây phát sinh loài với C. argenteum và các phân loài tại Panama. Nghiên
cứu đã kết luận cây vú sữa là loài đặc chủng của Nam Mỹ và chính xác là ở Panama 4.

12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nơi thực hiện
Thời gian: 6 tháng, bắt đầu từ tháng 10/2019 đến tháng 4/2020.
Địa điểm: phòng Sinh học Phân tử thực vật, khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại
học Nguyễn Tất Thành.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Tách mẫu DNA 14 mẫu vú sữa
- Sàng lọc và khuếch đại 9 mồi SCoT từ 16 mồi SCoT
- Phân tích đa dạng di truyền 14 mẫu vú sữa
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp thu mẫu lá vú sữa
Mẫu lá: chọn mẫu lá vú sữa khỏe mạnh, không chứa mầm bệnh, không quá non

cũng không quá già, cịn tươi, khơng dập hay bị khơ héo.
Mẫu thu được bỏ vào túi zip, ghi chú thời gian, địa điểm thu mẫu, tên mẫu. Trong
trường hợp di chuyển đường dài thì mẫu được bỏ vào thùng xốp có đá khơ lạnh giữ nhiệt
tránh tình trạng lá bị héo ảnh hưởng đến chất lượng DNA.
Xử lý mẫu: rửa sạch mẫu dưới vịi nước máy để loại bỏ bụi bẩn có trên lá, làm khơ
trong điều kiện phịng. Dùng bơng thấm cồn 70℃ lau sạch hai bề mặt lá nhằm loại bỏ
khuẩn sau đó tiếp tục làm khơ trong điều kiện phịng.
Lưu giữ mẫu trong túi zip và trữ đơng ở -21℃ nếu chưa sử dụng.
2.3.2 Tách chiết DNA
2.3.2.1 Tách chiết DNA tổng số
DNA được tách bằng bộ Kit ISOLATE II Plant DNA Kit (50 Preps) của hãng
BIOLINE, Cat No. BIO-52069. Lot No. IS506-B054260.
Quy trình tách DNA có sẵn trong bộ kit, quy trình tách kit thực hiện theo các bước:

13


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Bước 1: Cân 0,1g mẫu tươi hoặc 0,02g mẫu khô. Sử dụng chày để nghiền mẫu
trong nitơ lỏng.
Bước 2: Ly giải
Đưa mẫu đã nghiền ở bước 1 vào epp mới, thêm 400 µl Lysis Buffer PA1 và lắc
trộn đều.
Thêm 10 µl RNase A, mix nhẹ và đem đi ủ 65℃ trong 10 phút.
Bước 3: Lọc dịch thủy phân
Đặt ống ISOLATE II Filter (màu tím) vào một ống 2 ml và hút chuyển mẫu từ
bước 2 vào.
Ly tâm 11.000 vòng trong 2 phút.
Thu lấy dịch, bỏ cặn và chuyển sang một epp 1,5 ml khác.

Bước 4: Tủa DNA
Thêm 450µl Binding Buffer PB, mix lên xuống nhẹ bằng pipette 4 đến 5 lần hoặc
lắc nhẹ.
Bước 5: Thu tủa DNA
Đặt ống ISOLATE II Plant DNA Spin Column (màu xanh lá) vào ống 2 ml và bơm
mẫu vào (lơn nhất 700µl).
Ly tâm 11.000 vịng trong 1 phút, bỏ dịch và thu cột.
Bước 6: Rửa tủa DNA
Thêm 400µl Wash Buffer PAW1, ly tâm 11.000 vịng trong 1 phút, bỏ dịch.
Thêm 700µl Wash Buffer PAW2, ly tâm 11.000 vịng trong 1 phút, bỏ dịch.
Thêm 200µl Wash Buffer PAW2, ly tâm 11.000 vòng trong 2 phút, bỏ dịch và để
khô màng silica.
Bước 6: Thu DNA
Đặt cột silica vào một epp 1,5 ml mới.
Thêm 50µl Elution Buffer PG (đã ủ ở 65℃), nhỏ tử từ vào giữa màng silica.
14


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Ủ ở 65℃ trong 5 phút.
Ly tâm 11.000 vòng trong 1 phút.
Lặp lại bước này vào cùng một epp 1,5 ml.
Đem mẫu DNA đi bảo quản.
2.3.2.2 Định lượng và định tính DNA tổng số
Định tính DNA tổng số bằng phương pháp điện di gel Agarose cơ bản 0.8% với
màu nhuộm là gel red 6X. Trên gel điện di xuất hiện các băng sáng biểu thị cho DNA
tổng số.
Định lượng DNA tổng số bằng phương pháp đo OD: Các phản ứng định lượng
DNA tổng số được tiến hành với 3 µl/ 1 tube. Kết quả OD được tính tốn theo cơng thức

và được điền vào bảng.
2.3.3 Sàng lọc, thử nghiệm đánh giá một số mồi SCoT đa hình
Thực hiện phản ứng khuếch đại 16 mồi SCoT tham khảo từ các nghiên cứu của
Lou, Gajera, Yan và Yong

14,20

với 14 mẫu vú sữa. Các mồi có kết quả đa hình được

chọn để phân tích.
Bảng 2.1 Danh sách các mồi SCoT sử dụng trong nghiên cứu
Tên
Primer

Trình tự (5' to 3')

Tham
khảo

Tên
Primer

Trình tự (5' to 3')

SCoT1

CAACAATGGCTACCACCA

Luo

SCoT9

CAACAATGGCTACCAGCA

SCoT2
SCoT3
SCoT4
SCoT5
SCoT6
SCoT7
SCoT8

CAACAATGGCTACCACCC
CAACAATGGCTACCACCG
CAACAATGGCTACCACCT
CAACAATGGCTACCACGA
CAACAATGGCTACCACGC
CAACAATGGCTACCACGG
CAACAATGGCTACCACGT

Gajera
Luo
Yan
Gajera
Gajera
Yan
Yong

SCoT10
SCoT11

SCoT12
SCoT13
SCoT14
SCoT15
SCoT16

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR

1

Thành phần

Thể tích

DNA Tag mix 2X

7,5 µl
15

Luo

CAACAATGGCTACCAGCC
Yan
AAGCAATGGCTACCACCA
Yong
ACGACATGGCGACCAACG
Yong
ACGACATGGCGACCATCG
Yan
ACGACATGGCGACCACGC Gajera

ACGACATGGCGACCGCGA
Yong
ACCATGGCTACCACCGAC Gajera

Thành phần phản ứng PCR 20 khuếch đại trình tự mồi theo bảng 2.2.

STT

Tham
khảo